CN106811510A - 基于高通量测序的动物源成分鉴别方法及其应用 - Google Patents

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陶飞
曲勤凤
徐琼
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胡雪莲
赵燕
张清平
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Abstract

本发明提供了一种基于高通量测序的动物源成分鉴别方法及其应用，包括如下步骤：以高通量测序得到的DNA序列为分析对象，以公开DNA序列数据库为参照，考察分析对象与参照序列数据匹配数量，用于反映某特定类别的有无或多少。本发明操作步骤简单，准确度高。特定种类动物成分检出限可达1%，物种鉴别种类理论上可涵盖所有物种。因此，利用本发明方法进行样本中动物成分鉴定，能分析未知成分样本中的动物成分，简化操作流程，在动物成分鉴定方面具有广阔的应用前景。

Description

基于高通量测序的动物源成分鉴别方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于动物源成分鉴别的方法及其应用。
背景技术
肉类食品是人们获取高质量蛋白的主要渠道，肉类食品的质量与人类健康密切相关。据报道，2012年全世界人类每年消耗的肉类产品约2.84亿吨，我国肉类年消耗量约占全世界消耗量的四分之一，其中加工和半加工肉类食品占4％，且这些数字呈逐年大幅升高的趋势，人们对肉制品的需求日益提高。而近年来，在国内及国际贸易中牛、羊肉中搀杂价格便宜的猪肉，以次充好的欺骗行为屡见不鲜，在清真肉品种掺猪肉以代替牛羊肉更是严重冒犯了广大具有伊斯兰教信仰的消费者，影响民族团结，这些掺假行为极大损害了消费者的利益。
DNA是一切物种的遗传信息，随着分子生物学和生物信息学手段的发展，以DNA为基础的物种鉴别发展迅速。动物物种进化的分子生物学研究对象涉及从门到种的各类生物，为深加工肉制品鉴别，特别是的非常规肉源的鉴别，提供借鉴。通过现有的分子生物学分类和进化研究提供了大量与生物分类进化相关的目的序列。
目前常用于动物物种进化研究的序列有以下几种：线粒体DNA(mtDNA)、细胞核内的小卫星DNA、微卫星DNA、单拷贝DNA及核糖体DNA(rDNA)。其中线粒体DNA(mtDNA)是共价闭合的环状双链DNA，分子量小，拷贝数高，基因组结构简单，较易于纯化，并具有保守区和变异区，既可以有效地用于种内不同种群及近缘种的研究，又可用于较高分类阶元分析。mtDNA用于目水平上的亲缘关系分析，与染色体核酸分析基本吻合。而且现有的线粒体数据库为开放性数据库，目前具有约几千个物种的线粒体序列，随着测序技术的提高该数据库将不断扩充。
20世纪80年代，国外开始了基于DNA的肉的种属鉴定研究，采用的方法主要有DNA杂交、免疫扩散和等电点聚焦等。这些方法大都存在着成本高，工作量大，检测对象要求高等缺点。目前，针对掺假行为的检测研究主要基于核酸扩增的聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)方法，检测速度快，灵敏和特异性强。但目前以DNA为基础的物种鉴别研究主要关注寻找不同物种的特异基因进行种及以上水平物种鉴别。当前的研究已能够高效鉴别差异很小的物种。而且该方法对同时鉴别多种肉类较为局限。1999年MeatScience期刊53卷题为《一种快速简单的PCR检测方法用于肉品种及肉产品的鉴别》(Aquick and simple method for the identification of meat species and meat productsby PCR assay)中，Matsunaga等建立了多重PCR技术,通过7种按适当比例混合的引物,用多重PCR，也仅能同时对食品中的6种肉——牛肉、猪肉、鸡肉、山羊、绵羊和马肉中限制性DNA片段进行检测。
中国肉类食品综合研究中心周彤等于2015年6月发表了一种基于多重实时荧光PCR溶解曲线的鉴别肉或肉制品中动物源成分的方法(中国专利申请号201510061793.2)。该方法设计5对特异性引物用于多重实时荧光PCR扩增，以鉴别肉及肉制品中的猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐或貉共9种动物源成分。现有PCR检测方法都只针对某种动物源成份进行分析。在检测复杂动物源成份的样品时，需要对可能的成分逐一分析。而且受引物种类的局限，所得到的物种结果也非常有限。而且研究发现，随着多重PCR引物的增多，容易出现非特异性扩增，引物间相互作用易造成假阴性，检出率大大降低。随即扩增多态性(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)-PCR技术可以通过未知成分模版随机扩增的产物条带图谱，反映样本成份组成。在文献《基于PCR的指纹图谱技术用于肉制品中动物种类的快速鉴别》(PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection ofanimal species in meat products)(Meat Science,2004，66:659-665)中，Saez等就利用RAPD-PCR为基础的PCR指纹图谱技术,对5种不同的肉类进行了鉴定。但该方法由于需要预先建立指纹图库，对于不常见的肉源成份无法及时给出确切结果。所以目前传统PCR扩增的方法不能对混合动物源成分和未知动物源成分进行有效鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高通量测序的动物源成分鉴别方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足相关领域应用的需要。
本发明的方法，包括如下步骤：
以高通量测序得到的DNA序列为分析对象，以公开DNA序列数据库为参照，考察分析对象与参照序列数据匹配数量，用于反映某特定类别的有无或多少，匹配次数有无或多少代表样品中某动物成分的有无或多少；
所述的DNA序列为样本中总DNA；
所述的公开DNA序列数据库，为动物线粒体数据库，具体的为对已公开动物线粒体数据库，其中：所述的已公开动物线粒体数据库为，针对不同用途(如：食用畜肉)进行分类的，公共开放的动物线粒体数据库中的动物线粒体全基因组序列及相应物种信息；
优选的，本发明的方法，包括如下步骤：
(1)首先对样本总DNA进行直接提取，不经过核酸扩增的步骤；
(2)对提取的总DNA进行高通量测序，不需要拼接，测序结果包含了样品中动物源成分原始DNA短序列信息；
(3)最后把测序得到的短序列信息与分析用动物分类数据库中的线粒体序列进行序列匹配分析，得到提取DNA的特异性序列的分类信息，从而对样本中成分进行鉴别和定量。
所述的分析用动物分类数据库为开放性数据库，本领域的技术人员可通过网络公开数据库，如：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/mitochondrion等，获得该数据库中的线粒体序列；
所述的总DNA是指：将样本进行常规或改良基因组提取方法后获得的DNA，包括染色体DNA和线粒体DNA，所得的总DNA浓度≥100ng；
所述的高通量测序是指：把提取总DNA随机片段化后建库，使用比传统测序费用更低、通量更高、速度更快的边合成边测序的高通量测序技术，比如Illumina的Solexa平台、Roche的454平台和ABI的SOLID平台；
所述的序列匹配分析是指：对开放数据库的线粒体基因组信息进行分类，建立动物种类鉴别参照用特定类别数据库。把测序得到的序列信息，与数据库中的序列信息进行比较，与库中相似度达到80％-100％的序列记为命中序列，在库中的分类单元下统计样品中每个物种分类被命中个数，以库中各分类单元的命中次数有无及多少，表征某类动物成分的有无及含量；
所述的总DNA片段化建库指：通过超声波或酶处理，将提取得到的DNA片段随机破碎，使用琼脂糖凝胶电泳或磁珠筛选或专用试剂盒选择100-400bp的片段，采用高通量测序系统配套的常规建库试剂盒，如Illumina公司的TruSeq DNA Sample Preparation试剂盒，或其他可用于高通量测序的其他品牌常规建库试剂盒，建立高通量测序用DNA文库。
本发明使用的高通量测序的分析动物成分的方法，对样本中总DNA片段化后，直接进行高通量测序分析，不受PCR多增偏好的影响，测序结果无需拼接，在保证足够数据量的同时，提高信息获取速度。后续分析方法采用测序结果逐一比对，命中记录的分析方法，算法简单高效。比对用分类数据库信息来自于开放式线粒体数据库，可根据需求进行合理的数据分类，使得分类数据库数据信息全面、数据实时更新、分类方式灵活多变。该方法操作步骤简单，准确度高。特定种类动物成分检出限可达1％，物种鉴别种类理论上可涵盖所有物种。因此，利用本发明方法进行样本中动物成分鉴定，能分析未知成分样本中的动物成分，简化操作流程，在动物成分鉴定方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为高通量测序数据分析方法和流程示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。本发明的保护范围涉及发明方法、步骤或条件的修改或替换，包括但不限于下述的实施例。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
主要仪器设备：第高通量测序分析系统(Applied Biosystems SOLID system，美国)(Illumina Genome Analyzer system，美国)、高速台式离心机(Eppendorf 5417R，德国)、微量移液器(10μl，100μl，1000μl)、微量分光光度计(Nanodrop，美国)；主要试剂：CTAB裂解液、SDS裂解液、饱和醋酸钠、氯仿：异戊醇(24:1)、Tris饱和酚
高通量测序数据分析方法和流程见图1：
首先访问公共数据库，下载动物线粒体DNA序列信息；
然后按照物种不同分类整理为不同大类；
然后使用软件Bowtie把高通量测序的短序列与不同物种线粒体DNA数据库进行匹配，输出SMA格式文件；
再对SMA格式文件进行检索，统计每个物种的线粒体所能够匹配的段序列数目，扣除共有匹配；
最后计算不同动物源成分在样品中的比例。
具体的，本发明所述的所述方法，包括如下步骤：
(1)总DNA提取：对样品进行斩切、搅拌后，采用物理或化学的裂解方法裂解细胞，使用总DNA提取常规方法或总DNA提取试剂盒进行提取。
(2)高通量测序：总DNA片段化建库，使用高通量测序分析系统，测序读长100-400bp，读长个数50万-500万，测序深度达到(5-15)×。
(3)物种分类数据库建立：分析公开的开放数据库里已提交线粒体序列及物种信息，以样品分析所需分类方式对开放数据库中的数据进行分类。
(4)测序结果与分类数据库比对：测序结果依次与已建好分类数据库中的序列进行比较，当相似度达到80-100％时记为命中，在命中序列所在类别中记命中数1。未命中的类别表明测序结果中没有相似序列，即样品中不含该种类DNA，样品不含该种类动物成分；命中率越高的类别表明测序结果中相似序列越多，即样品中含该种类DNA较多，样品中含该类动物成分较多；反之较少。
实施例1
称取新鲜羊肉2g，均质，加入CTAB裂解液及蛋白酶50℃条件下，孵育2h，取裂解液1ml，12000g离心10min，取上清，加入等体积(氯仿：异戊醇：饱和酚)(24：1：25)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清，加入(氯仿：异戊醇)(24：1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清，加入2倍冰无水乙醇，或0.6倍异丙醇，放置30min，12000g离心10min，使用70％乙醇清洗两遍，室温自然风干，加入ddH2O 100uL。使用Nanodrop分析提取DNA浓度和质量为DNA(ng/μL)：356.05，OD(260/280)：1.88，OD(260/230)：2.17。
取样本用纯水稀释，使用Covaris S220超声破碎DNA，电泳回收200bp片段，TruSeqDNASample Preparation试剂盒建库，Illumina Genome Analyzer system高通量测序分析系统对该样本进行测序分析，400reads，45万reads数。
结合食用禽畜肉的分类和NCBI线粒体数据库中的分类属名，建立食用禽畜肉分类数据库，用于二代测序结果的比对分析(表1)。使用软件Bowtie，把测序结果与建好的线粒体数据库进行匹配，分析中使用相似度参数为80％。得到分析结果与制备的混合样品1比较(表2)，可见成分有无与实际样本基本一致。
表1食用禽畜肉分类数据库建库类别
表2混合样本各成分DNA浓度、百分含量和测序命中数、预测含量对照表
实施例2
分别称取猪(市售)、牛(市售)、羊(市售)、鸡(市售)、兔(市售)、鼠(实验室来源)均质好的肉样品2g，加入SDS裂解液及蛋白酶55℃条件下，孵育2h，取裂解液1ml，12000g离心10min，取上清，加入等体积(氯仿：异戊醇：饱和酚)(24：1：25)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清，加入(氯仿：异戊醇)(24：1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清，加入2倍冰无水乙醇，或0.6倍异丙醇，放置30min，12000g离心10min，使用70％乙醇清洗两遍，室温自然风干，加入ddH2O 100uL。使用Nanodrop分析提取DNA浓度和质量(表3)。
表3提取肉样本DNA浓度和质量
DNA(ng/μL) OD(260/280) OD(260/230)
猪(A) 328.69 1.84 2.30
牛(B) 386.04 1.85 2.05
羊(C) 498.05 1.89 2.07
鸡(D) 544.62 1.91 2.05
兔(E) 120.35 1.85 2.01
鼠(F) 136.78 1.82 2.10
混合A、B、C、D、E、F为混合样本I，使用Covaris S220超声破碎DNA，电泳回收150bp片段，TruSeq DNA Sample Preparation试剂盒建库，使用Applied Biosystems SOLIDsystem高通量测序分析系统对该样本进行测序分析，150reads，45万reads数。
结合食用禽畜肉的分类和NCBI线粒体数据库中的分类属名，建立食用禽畜肉分类数据库，用于二代测序结果的比对分析(表4)。使用软件Bowtie，把测序结果与建好的线粒体数据库进行匹配，分析中使用相似度参数为90％。得到分析结果与制备的混合样品1比较(表5)，可见成分含量与实际混合样本I各成分含量基本一致。
表4食用禽畜肉分类数据库建库类别
表5混合样本各成分DNA浓度、百分含量和测序命中数、预测含量对照表
实施例3
分别称取猪(市售)1.05g、牛(市售)10.12g、羊(市售)20.36g、鸡(市售)5.29g，均质混匀后，称取该混合样品5g，加入SDS裂解液及蛋白酶55℃条件下，孵育过夜，取裂解液1ml，12000g离心10min，取上清，加入等体积(氯仿：异戊醇：饱和酚)(24：1：25)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清，加入(氯仿：异戊醇)(24：1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清，加入2倍冰无水乙醇，或0.6倍异丙醇，放置30min，12000g离心10min，使用70％乙醇清洗两遍，室温自然风干，加入ddH2O 100uL。使用Nanodrop分析提取DNA浓度和质量DNA(ng/μL)：541.78；OD(260/280)：1.78；OD(260/230)：2.02。该样本称为混合样本II。
使用Covaris S220超声破碎DNA，电泳回收200bp-300bp片段，TruSeq DNA SamplePreparation试剂盒建库，使用Applied Biosystems SOLID system高通量测序分析系统对该样本进行测序分析，200reads，50万reads数。
结合食用禽畜肉的分类和NCBI线粒体数据库中的分类属名，建立食用禽畜肉分类数据库，用于二代测序结果的比对分析(表1)。使用软件Bowtie，把测序结果与建好的线粒体数据库进行匹配，分析中使用相似度参数为85％。得到分析结果与制备的混合样品II比较(表6)，可见成分含量与实际混合样本II各成分含量基本一致。
表6混合样本II各成分百分含量和测序命中数、预测含量对照表
实施例4
称取未知动物成分的调制加工肉馅样本5g，均质，使用组织提取试剂盒提取总DNA。使用Nanodrop分析提取DNA浓度和质量DNA(ng/μL)：354.87；OD(260/280)：1.90；OD(260/230)：2.15。
使用Covaris S220超声破碎DNA，电泳回收150bp-200bp片段，TruSeq DNA SamplePreparation试剂盒建库，使用Applied Biosystems SOLID system高通量测序分析系统对该样本进行测序分析，150reads，50万reads数。
结合食用禽畜肉的分类和NCBI线粒体数据库中的分类属名，建立食用禽畜肉分类数据库，用于二代测序结果的比对分析(表1)。使用软件Bowtie，把测序结果与建好的线粒体数据库进行匹配，分析中使用相似度参数为90％。得到未知样本成分与现有实时荧光定量PCR方法比较(表7)，可见未知成分样本各成分含量与实时荧光定量PCR方法检出结果基本一致。
表7未知成分样本测序命中数、预测含量与实时荧光定量PCR结果比较
实施例5
称取未知动物成分的狗粮样本5g，均质，使用组织提取试剂盒提取总DNA。使用Nanodrop分析提取DNA浓度和质量DNA(ng/μL)：169.45；OD(260/280)：2.03；OD(260/230)：1.90。
使用Covaris S220超声破碎DNA，电泳回收300bp-400bp片段，TruSeq DNA SamplePreparation试剂盒建库，使用Applied Biosystems SOLID system高通量测序分析系统对该样本进行测序分析，150reads，50万reads数。
结合食用禽畜肉的分类和NCBI线粒体数据库中的分类属名，建立食用禽畜肉分类数据库，用于二代测序结果的比对分析(表1)。使用软件Bowtie，把测序结果与建好的线粒体数据库进行匹配，分析中使用相似度参数为90％。得到未知样本成分与现有实时荧光定量PCR方法比较(表7)，可见未知成分样本各成分含量与实时荧光定量PCR方法检出结果基本一致。
表9未知成分狗粮样本测序命中数、预测含量与实时荧光定量PCR结果比较

Claims (9)

1.一种基于高通量测序的动物源成分鉴别方法，其特征在于：
以高通量测序得到的DNA序列为分析对象，以公开DNA序列数据库为参照，考察分析对象与参照序列数据匹配数量，用于反映某特定类别的有无或多少。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，匹配次数有无或多少代表样品中某动物成分的有无或多少。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA序列为样本中总DNA。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述的公开DNA序列数据库，为动物线粒体数据库，具体的为对已公开动物线粒体数据库，其中：所述的已公开动物线粒体数据库为，针对不同用途进行分类的，公共开放的动物线粒体数据库中的动物线粒体全基因组序列及相应物种信息。
5.基于高通量测序的动物源成分鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）首先对样本总DNA进行直接提取；
（2）对提取的总DNA进行高通量测序，测序结果包含了样品中动物源成分原始DNA短序列信息；
（3）最后把测序得到的短序列信息与分析用动物分类数据库中的线粒体序列进行序列匹配分析，得到提取DNA的特异性序列的分类信息，从而对样本中成分进行鉴别和定量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的总DNA是指：将样本进行常规或改良基因组提取方法后获得的DNA，包括染色体DNA和线粒体DNA，所得的总DNA浓度≥100ng。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的高通量测序是指：把提取总DNA随机片段化后建库，使用边合成边测序的高通量测序技术。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的序列匹配分析是指：对开放数据库的线粒体基因组信息进行分类，建立动物种类鉴别参照用特定类别数据库，把测序得到的序列信息，与数据库中的序列信息进行比较，与库中相似度达到80%-100%的序列记为命中序列，在库中的分类单元下统计样品中每个物种分类被命中个数，以库中各分类单元的命中次数有无及多少，表征某类动物成分的有无及含量。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的总DNA片段化建库是指：通过超声波或酶处理，将提取得到的DNA片段随机破碎，使用琼脂糖凝胶电泳或磁珠筛选或专用试剂盒选择100-400 bp的片段，采用高通量测序系统配套的建库试剂盒，建立高通量测序用DNA文库。
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