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Abstract

本发明涉及人参检测技术领域，特别涉及林下山参的鉴别方法和即时检测系统。该鉴别方法包括如下步骤：提取人参样本的RNA，反转录为cDNA，将cDNA采用第四代测序技术进行测序，得到人参样本cDNA序列；将人参样本cDNA序列与功能基因组数据库中的功能基因序列进行比对，检测相似度；根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参。本发明采用第四代测序技术鉴别林下山参，该方法可准确鉴定出林下山参和园参，且简便快捷，可实现现场的即时检测。

Description

林下山参的鉴别方法和即时检测系统
技术领域
本发明涉及人参检测技术领域，特别涉及林下山参的鉴别方法和即时检测系统。
背景技术
人参是世界公认的多靶点药物和天然补品。70％人参产自中国，中国人参80％产自吉林省。但是基础研究日本领先，市场价值韩国高丽参占有绝对优势。中国大量优质人参沦为廉价的原料供应国。因此在创新时代我国人参必须找到一个优势品系作为突破口，把中国人参在高科技创新基础上打造世界优质品牌，从而带动整个人参产业的振兴。
林下山参就是一个优势品系，作为打造中国优势品牌的一张王牌，2005年新版的《中华人民共和国药典》里，将人参产品分为林下山参和园参(林下山参最初称：林下参，2006年5月公告修订为林下山参)。由人工选择天然林地，采用撒播或点播，或穴播后生长的人参，称为林下山参。
林下山参不毁林，无污染，不需要人工干预，成活的参苗具有很强的抗灾害和抗病虫害的能力，因此内在质量及药用价值也远远优于园参(包括高丽参)，是打入国际市场的优势品种。既往的研究证明其有较高的人参皂甙含量，较多的单体种类和一些特有的成分，药效学也优于园参，由于其生长在山林环境下而形体与野山参接近，通过表观遗传学研究证明其与野山参的功能基因组相近。国家已经将生长期超过15年的林下山参视同野山参。目前我国原生态野山参年产量尚不足2公斤，野山参也不再适合作为商品出售。因此林下山参在一定程度上是取代野山参的理想品种。从目前资料看，林下山参的种植面积我国在全世界领先，因此具有很大的国际竞争力。作为中国人参在国际上获得优势品种具有很大的市场扩增空间，同时也会更好的发挥中医药在世界医学独特药效学及临床疑难病种的治疗上的重要作用。
但是目前还没有简便特异性林下山参鉴定方法，其保健、医疗作用的性价比研究就会失去国际竞争价值，因此提供一种林下山参的简便鉴别方法是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了林下山参的鉴别方法和即时检测系统。该鉴别方法可准确鉴别林下山参和园参，简便快捷。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种林下山参的鉴别方法，包括如下步骤：
提取人参样本的RNA，反转录为cDNA，将cDNA采用第四代测序技术进行测序，得到人参样本cDNA序列；
将人参样本cDNA序列与功能基因组数据库中的功能基因序列进行比对，检测相似度；
根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参。
纳米孔测序技术(又称第四代测序技术)，其是一种单分子、实时测序的新一代测序方法，其原理是以单分子DNA通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。第四代测序技术是最近三年兴起的新一代测序技术，该技术于2014年开始商业化，其研发过程中经历了三个主要的技术革新：一、单分子DNA从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的MinION纳米孔测序仪。它的特点是单分子测序，测序读长长(超过150kb)，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。而第四代测序仪的突出特点就是便携性，与前几代测序仪器都是基于庞大的多通道荧光测序技术进行，进而机器都是必须固定在相关研究科室中(1m×1.5m×1m)，所选样品需经过相关专业人员大量处理后在测序仪器上进行分析，耗时从24小时到72小时不等，而第四代测序仪从开发到应用就本着高效便携的目的发展，最终推出了MinION第四代测序仪，其大小仅10cm×1cm×2cm，一只手掌即可携带，同时配合高效实时的测序云计算技术，可以将结果在10分钟内进行反馈，充分实现了现场检测，实时回复的设计目的。
一、表观遗传学模型建立
表观遗传变化是基于多种基因调控因子和DNA修饰变化引起的。近些年来，随着生物信息分析方法的发展，MinION测序reads成功比对参考基因组的比例已经提升至92％。
1.林下山参、野山参与园参之间的表观遗传学差异：通过第二代是高通量测序(NGS)测序技术将不同的人参样品的多种表观遗传学标记(包含H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K79me2等)进行高通量大规模分析。
2.利用生物信息学手段利用得到的NGS数据结合部分目前数据库中已有的数据进行基因富集分析(GO-analysis)，KEGG pathway研究，进一步进行差异表观遗传标记的信号通路分析，同时应用GESS、MISO等计算生物学软件对差异表达进行进一步筛选分析。
3.通过对分析得到的相关通路进行进一步研究，进行相关转录因子的表观遗传学实验，如ChIP-seq(染色体免疫共沉淀技术)结合NGS测序进行全基因组或特定功能基因的表观遗传学分析，包括对基因的启动子，增强子区域的组蛋白修饰组合(包含H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K79me2等)——即表观遗传学中“组蛋白密码组合”的解析，阐明表观遗传学的在野山参、林下山参、园参之间的变化规律，并通过机器学习和隐马尔可夫模型(HMM模型)建立转录因子与组蛋白密码组合，通过表观遗传学的研究提出人参作为高效药性的关键分子秘钥。
4.通过整合实验结果数据与信息分析数据进行计算机二次模拟，最终筛选出最佳相关分子组合，提出可以对林下山参分析鉴定的关键表观遗传指标和相关检测技术。
二、林下山参基于表观遗传学鉴定系统的开发
利用第四代测序技术，将林下山参的表观遗传学分析方法进行小型化，高效化制备。在特定的生理状态下用甲醛交联活细胞内蛋白质和DNA，通过超声手段将染色质切成若干小片段，再利用抗体结合靶蛋白，使与目标蛋白结合的DNA片段随免疫复合体同时沉淀。经过解交联后纯化，得到相互作用的DNA片段，建立测序所需文库，进行高通量测序。
对于林下山参的表观遗传学的测序鉴定分析，实时获取和分析DNA/RNA序列是一件很重要的事情。对于传统的NGS测序，做到这一点非常不易，但对于MinION，实现起来相对容易。这不仅是因为MinION体积小，易操作等，更是因为在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以检测并识别，实时测序监控对于MinION针对特定目标序列测序有重要的应用：当DNA片段通过纳米孔时，如果电流变化呈现与目标序列一样的趋势，则通过纳米孔。如果DNA片段与目标序列呈现不同的电流变化趋势，则不能通过纳米孔。通过这样的方式，实现目标序列的富集，从而显著减少测序时间，对于在野外和即时检测方面有重要意义。
MinION测序方法提供的是一种全新的体验，该测序方法可以在多种简易环境下进行目标分子的检测，而MinION在测序读长、携带的方便性、检测时长方面具有NGS不可比的优势。文献记载从样品准备到发现致病菌只需要6小时时间，而从样品放置机器到发现致病菌只需要4分钟。文章列举了截至目前用MinION测序仪涉及研究的物种及详细描述了西非爆发埃博拉病毒时，MinION测序方法在病毒检测过程中起到的重要作用。而逆转录和PCR扩增会导致很多RNA自身信息的丢失，所以目前ONT公司和一些研究机构正在尝试用纳米孔技术进行RNA直接测序。之前的研究已经为此奠定了基础，比如研究表明可以对tRNA进行单通道和固态纳米孔(solid-state nanopore)检测，且纳米孔可以检测DNA和tRNA的碱基修饰。
作为优选，功能基因为GAMTA、FAR1、GATA、RAV、WOX、LSD中的一种或几种。但本发明中功能基因并非限定于此，可实现本发明技术方案的功能基因均在本发明的保护范围之内。
在本发明中的一实施例中，根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与GAMTA基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与GAMTA基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
在本发明中的另一实施例中，根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与FAR1基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与FAR1基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
在本发明中的另一实施例中，根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与GATA基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与GATA基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
在本发明中的另一实施例中，根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与RAV基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与RAV基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
在本发明中的另一实施例中，根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与WOX基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与WOX基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
在本发明中的另一实施例中，根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与LSD基因序列的相似度小于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与LSD基因序列的相似度大于50％，则人参样本为园参。
作为优选，RNA的浓度为50～150ng/μL。
优选地，RNA的浓度为100ng/μL。
本发明还提供了一种林下山参的即时检测系统，该即时检测系统包括功能基因数据存储模块、功能基因相似度检测模块、判断模块和判断结果显示模块。
在该即时检测系统中，功能基因相似度检测模块检测人参样本的cDNA与功能基因数据存储模块中某一功能基因的相似度，相似度结果传输到判断模块进行判断，将判断结果传输到判断结果显示模块。
本发明提供了林下山参的鉴别方法和即时检测系统。该鉴别方法包括如下步骤：提取人参样本的RNA，反转录为cDNA，将cDNA采用第四代测序技术进行测序，得到人参样本cDNA序列；将人参样本cDNA序列与功能基因组数据库中的功能基因序列进行比对，检测相似度；根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参。本发明具有的技术效果为：
本发明采用第四代测序技术鉴别林下山参，该方法可准确鉴定出林下山参和园参，且简便快捷，可实现现场的即时检测。
附图说明
图1示4株林下参和4株园参的转录组表达对比结果；
图2示不同的功能基因在林下参和园参中的表达差异；
图3示本发明检测方法的精度验证。
具体实施方式
本发明公开了林下山参的鉴别方法和即时检测系统，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的林下山参的鉴别方法和即时检测系统中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例林下山参与园参的鉴定方法包括如下步骤：
1、标准化采集技术
不同品质人参样品的采集，RNA提取(RNA是基因最小组成的核糖核酸，在遗传学中只有在新鲜活体生物中提取，标本干燥或细胞死亡就会失活)，所有人参样品皆取自同一所属地，采用同样流程进行RNA提取，RNA提取浓度均大于50ng/μL(推荐浓度100ng/μL)并逆转录为cDNA，建立测序文库Library，实现人参转录组学的高通量测序。
2、高通量人参系统生物学测序技术
人参转录组和表观遗传标记大规模测序：
首先针对不同品质人参样品进行转录组学和表观遗传学的高通量测序，对8株林下参和园参的转录组表达进行对比，见图1。将所得测序结果与人参表达基因组学数据库进行比对，并利用生物信息学技术找出不同年份、种属人参的差异指纹谱，从4万2千个基因中筛选到1752个表达差异基因，将差异基因变化进行了全基因组成面的系统化阐述，发现了其中1157基因表达上调，595基因表达下调，建立了大数据的人参基因数据库，用以对目标样品的四代测序结果的分析提供数据支撑。
3、第四代测序仪测定10个相关指纹基因，其中得到6个基因表达差异变化(见图2和表1，林下参中5个表达上调具体是GAMTA、FAR1、GATA、RAV、WOX，1个表达下调是LSD，与数据库中数据比对，褐色深度表示正相关强度，蓝色深度表示负相关强度)可以验证林下参的特异性表达，成功鉴定林下参与园参之间的遗传差异，对于林下参产品品牌的建立提供科学手段。
表1林下参与园参的6个差异表达基因
4、同时应用传统qPCR进行验证性检测，多项结果与四代测序仪均吻合，验证了新方法的稳定性和可靠性。
试验例1精度验证
精度验证是一种测定本申请RNA检测的准确性，图3左侧4条主线代表林下山参-兰红灰黄，都很高表示相关性好；右侧四个主线都较低也表示负相关性。精度验证方法是根据在基因检测过程中所测定某组基因碱基排序的相思度(0-100)大于50以上者为界限列出精度验证表达高度。
关于DNA在林下山参与园参的鉴别不能显现的原因是：在生物的遗传性在有遗传的稳定性和遗传的变异性这两个特性，既可以维持种系传代对物种的不变化(例如不管是林下山参和园参都是人参PANAX GINGSNE)，但是由于生存环境的变化导致物种为适应环境而产生的变化，主要是RNA的改变。本申请测定两种人参的DNA都是4万1千多基本没有区别，而RNA有1752个改变。
实施例2林下山参与园参的表观遗传学现场检定
开发利用以上结果得到的表观遗传标记组合和第四代测序仪的测序结果，进行检测软件的开发，结合后台云计算形成数据输入，结果直出的可视化界面，进而可以现场检测与结果对接的高效表转化流程，免去中间分析比较过程，让实际使用用户更为直观。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种林下山参的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取人参样本的RNA，反转录为cDNA，将所述cDNA采用第四代测序技术进行测序，得到人参样本cDNA序列；
将人参样本cDNA序列与功能基因组数据库中的功能基因序列进行比对，检测相似度；
根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述功能基因为GAMTA、FAR1、GATA、RAV、WOX、LSD中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与GAMTA基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与GAMTA基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
4.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与FAR1基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与FAR1基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
5.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与GATA基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与GATA基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
6.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与RAV基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与RAV基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
7.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与WOX基因序列的相似度大于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与WOX基因序列的相似度小于50％，则人参样本为园参。
8.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述根据相似度结果判断人参样本是否为林下山参具体为：
人参样本cDNA序列与LSD基因序列的相似度小于50％，则人参样本为林下山参；
人参样本cDNA序列与LSD基因序列的相似度大于50％，则人参样本为园参。
9.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述RNA的浓度为50～150ng/μL。
10.一种林下山参的即时检测系统，其特征在于，所述即时检测系统包括功能基因数据存储模块、功能基因相似度检测模块、判断模块和判断结果显示模块。
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