JP7310694B2

JP7310694B2 - 微生物分析方法

Info

Publication number: JP7310694B2
Application number: JP2020076956A
Authority: JP
Inventors: 裕子福山
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2023-07-19
Anticipated expiration: 2040-04-23
Also published as: JP2021173613A

Description

本発明は、微生物の分析方法に関する。

質量分析におけるイオン化法の１つであるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法は、レーザ光を吸収しにくい物質やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光で吸収し易く且つイオン化しやすいマトリックス物質を分析対象物質と混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。一般にマトリックス物質は溶液として分析対象物質と混合される。そして、溶液中の溶媒を気化させることにより乾燥させ、分析対象物質を含んだ結晶を形成する。これにレーザ光を照射すると、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して急速に加熱され、気化する。その際、分析対象物質もマトリックス物質とともに気化し、その過程で分析対象物質がイオン化される。

こうしたＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）は、タンパク質などの高分子化合物をあまり解離させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、生命科学の分野で広く利用されている。生命科学分野におけるＭＡＬＤＩ－ＭＳの利用の一つに、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物の同定がある。これは、被検微生物を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物の同定を行う方法であり、短時間で分析結果を得ることができることから、簡便且つ迅速な微生物の同定が可能である。

例えば食中毒の代表的な原因細菌の一つに、グラム陰性通性嫌気性桿菌の腸内細菌科に属するサルモネラがある。サルモネラ属にはSalmonella （以下「S.」と略す）enterica、S. bongori及びS. subterraneaの３つの菌種が属し、さらにS. entericaは６つの亜種に分類される。食中毒を引き起こす病原性サルモネラの多くは S. entericaに属し、その亜種は更に多数の血清型に分類される。サルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、食中毒の感染経路の解明及び感染防止に重要であることから、近年、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いたサルモネラ属菌の識別が試みられている。

Appl. Microbiol. Biotechnol., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.101, No.23-24, pp.8557-8569, 2017

ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるサルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、菌種や亜種、血清型が異なる菌体の間で、マススペクトル上での位置(質量電荷比、m/z値)や高さ（ピーク強度、mV値）が異なるピーク、すなわちバイオマーカーピークを検出することにより行う。細菌をはじめとする微生物の判別では、バイオマーカーピークとしてタンパク質のピークが用いられることが多い（非特許文献１）。

一般的に近縁の微生物の場合、多くのタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zは同じであるか、或いは近似する。従って、サルモネラ属菌を血清型のレベルで正確に判別するためには、バイオマーカーピークとして１種類のタンパク質由来のピークを選出するだけでは足りず、血清型の種類に応じた適切な、複数のタンパク質由来のピークを選出する必要がある。

例えば非特許文献１には、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いて質量分析することにより得られるマススペクトルから１２種類のタンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比の値を読み取り、それらの値から該試料に含まれる微生物がサルモネラ属菌の血清型のいずれであるかを判別することが記載されている。

ところで、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳで質量分析した場合、質量電荷比m/z の値が大きい高質量領域では感度が低く、マススペクトルの信頼性、正確性が低くなることが知られている。例えば上述した１２種類のタンパク質の場合、最も高質量分子であるSodA（m/z 23000）に由来するピークは、その他のピークに比べるとブロードになったりピーク割れが生じたりする等、ピーク形状に異常がみられることが多い。このようなピーク形状の異常は、ピークの位置から読み取られる質量電荷比の値にずれを生じさせることになり、血清型の誤判別につながる。

本発明が解決しようとする課題は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物分析方法において、サルモネラ属菌の特定の血清型を正確に識別できるようにすることである。

上記課題を解決するために成された本発明の微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１２種類のタンパク質であるgns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodAのそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記１２種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれる微生物が、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種類の血清型であるエンテリティディス（Enteritidis）、リッセン（Rissen）、プローラムガリナルム（Pullorum_Gallinarum）、アボニー（Abony）、コレレスイス（Choleraesuis）、パキスタン（Pakistan）のいずれの菌を含むかを識別するステップを有し、
前記SodAに由来するピークが、該SodAがイオン化して生じる多価イオンに由来するピークであるものである。

本発明によれば、試料に含まれる微生物が、サルモネラ属菌の所定の６種類の血清型のいずれの菌であるかを正確に識別することができる。

本発明に係る微生物の分析方法に用いられる微生物分析システムの概略的な全体構成図。微生物分析方法の手順の一例を示すフローチャート。サルモネラ属菌のS. Enteritidisの同じ株（GTC00131）のSodAに由来する１価イオンのピーク付近を示す2つのマススペクトル。図３における２価イオンのピーク付近を示すマススペクトル。サルモネラ属菌のS. Abonyの同じ株（NBRC100797）のSodAに由来する１価イオンのピーク付近を示す2つのマススペクトル。図５における２価イオンのピーク付近を示すマススペクトル。

本発明の微生物分析方法は、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１２種類のタンパク質であるgns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodAのそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記１２種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれる微生物が、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるEnteritidis、Rissen、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Pakistanのいずれの菌を含むかを識別するステップを有しており、
前記SodAに由来するピークが、該SodAがイオン化して生じる多価イオンに由来するピークであることを特徴とする。

上記の６種類の血清型であるエンテリティディス（Enteritidis）、リッセン（Rissen）、プローラムガリナルム（Pullorum_Gallinarum）、アボニー（Abony）、コレレスイス（Choleraesuis）、パキスタン（Pakistan）を含む非特許文献１に示される２２種類の血清型の多価イオンのピーク検出状況とピークのm/z値を表１に示す。本発明においては、上記６種の血清型に対し、１２種類のタンパク質（マーカータンパク質）中のSodAの検出状況の確認に、表１の１価イオンの代わりに２価イオン又は３価イオンのm/z値を用いることで、血清型を判別する。

６種の血清型の菌体のいずれかが試料に含まれる場合、その試料について得られたマススペクトルには１２種類のタンパク質由来のピークが含まれることが分かっており、且つ、各ピークの質量電荷比の範囲は既知である。従って、まずは試料について得られたマススペクトル上に１２種類のタンパク質のそれぞれに対応する各質量電荷比範囲にピークが存在するか否かを判断する。

本発明の微生物識別方法では、１２種類のタンパク質のうち、そのピーク形状に異常が見られることが多かったSodAに由来するピークとして、該SodAがイオン化して生じる多価イオンに由来するピークを採用したことにより、マーカーピークの質量精度が高まり、血清型を高精度に識別することができる。

本発明の微生物分析方法に用いられる質量分析装置としては、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）が好ましい。また、ＭＡＬＤＩ－ＭＳとしては、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳは測定可能な質量電荷比の範囲が非常に広いため、微生物の構成成分であるタンパク質のような高質量分子の分析に適したマススペクトルを取得することができる。

次に、本発明に係る微生物分析方法に用いられる微生物分析システムの一実施形態について説明する。
図１は、微生物分析システムの概略的な全体構成を示している。このシステムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。

ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。

微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び血清型決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４及び第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５によりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。

図１においては、血清型決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、及び血清型判定部３９が示されている。これはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が血清型決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、血清型決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物識別を行うプログラム等を利用することができる。

また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び血清型決定プログラム３５、第１データベース３４、及び第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理及び／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。

記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法及び質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。

前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を4,000～30,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。そして、抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養環境を規格化しておくことが望ましい。

記憶部３０の第２データベース３６には、既知微生物を種よりも下位の分類である血清型で識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。なお、第２データベース３６には、血清型以外の下位の分類（例えば亜種、病原型、株）などで識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されていてもよい。

本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物がサルモネラ属菌である場合にその血清型が６種類の血清型（Enteritidis、Rissen、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Pakistan）のいずれであるかを判定するための１２種類のマーカータンパク質（gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA）に由来するピークとして、上記マーカータンパク質がイオン化して生じる１価イオンに由来するピークの質量電荷比の値（非特許文献１参照）が記憶されている。また、１２種類のマーカータンパク質の一つであるSodAについては、該SodAがイオン化して生じる２価又は３価のイオンに由来するピークの質量電荷比の値が記憶されている。

第２データベース３６に記憶されるマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ－末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ－末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。

次に、上記の微生物分析システムを用いたサルモネラ属菌の血清型の分析手順についてフローチャートを参照しつつ説明を行う。

まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。

スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップ１０１）。

次に、種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップ１０２）。種決定プログラム３３は、続いてステップ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物が属する生物種を特定する（ステップ１０３）。そして、この生物種がサルモネラ属菌でなかった場合（ステップ１０４でNoの場合）は、該生物種を被検微生物の生物種として表示部２３に出力し（ステップ１０９）、分析処理を終了する。一方、前記生物種がサルモネラ属菌であった場合（ステップ１０４でYesの場合）は、続いて血清型決定プログラム３５による分析処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中にサルモネラ属菌が含まれることが判定されている場合は、マススペクトルを用いた種決定プログラムを利用せずに、血清型決定プログラム３５に進めばよい。

血清型決定プログラム３５では、被検微生物のマススペクトル上のピークの質量電荷比を第２データベースに収録されている１２種類のタンパク質（gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA）に由来する１価イオンの質量電荷比の値と照合し、被検微生物の血清型を判別する（ステップ１０５）。具体的には、まず血清型判定部３９がマーカータンパク質である１２種類のタンパク質（gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA）に由来する１価イオンの質量電荷比範囲をそれぞれ第２データベース３６から読み出す。続いてスペクトル取得部３７が、ステップ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された１価イオンの質量電荷比範囲に現れるピークを各マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る。

その後、血清型判定部３９がこの質量電荷比と第２データベース３６から読み出した各マーカータンパク質（１価イオン）の質量電荷比の値を照合し、６種類の血清型のいずれかであると判定する（ステップ１０６）。

続いて、血清型判定部３９は１２種類のマーカータンパク質に由来する２価又は３価イオンの質量電荷比を第２データベース３６から読み出し、マススペクトル上において、これら２価又は３価イオンの質量電荷比範囲に現れるピークを選出し、その質量電荷比を第２データベース３６から読み出した質量電荷比と照合する（ステップ１０７）。照合した結果、質量電荷比の値が６種類の血清型の質量電荷比の値のいずれかと一致した場合には、その一致状況に基づいて被検微生物の血清型が６種類の血清型のいずれであるか判定し（ステップ１０８）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップ１０９）。

なお、ステップ１０４において、被検微生物の生物種がサルモネラ属菌であると判定された後の照合処理として、第２データベースに収録されている１２種類のタンパク質に由来する１価、あるいは２価又は３価の質量電荷比と、マススペクトル上のピークの質量電荷比を照合するようにしても良い（ステップ１１０）。そして、照合した結果、質量電荷比の値が６種類の血清型の質量電荷比の値のいずれかと一致した場合には、その一致状況に基づいて被検微生物の血清型が６種類の血清型のいずれであるかを判定し（ステップ１０８）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップ１０９）。この場合は、被検微生物の種の決定から帰属の決定までの工程を少なくすることができる。
また、予め他の方法で試料に含まれるサルモネラ属菌が６種類の血清型のいずれかであると判定されている場合は、ステップ１０５－１０７、あるいはステップ１１０の処理を省略しても良い。

以下、本発明に係る微生物分析方法の効果を実証するために行った実験について説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．サルモネラ属菌の培養
以下に示す６種類の血清型を含むサルモネラ属菌（Salmonella enterica）等、非特許文献１および表１に示される２２種類の血清型からなる１０５菌株のサルモネラ属菌を、ＬＢ寒天培地を用いて３７℃で２０時間培養した。１０５菌株は、非特許文献１に示される１１５菌株のうち血清型unknownの株を除く菌株にあたる。

＜６種類の血清型のサルモネラ属菌＞
S. Enteritidis、
S. Rissen、
S. Pullorum_Gallinarum、
S. Abony、
S. Choleraesuis、
S. Pakistan

２．マトリックス溶液の作製
以下の２種類のマトリックス溶液を作製した。
(2-1) エタノールにマトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－１」とする。
(2-2) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）及び０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％、界面活性剤であるデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ、それぞれ含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－２」とする。
マトリックス溶液ＳＡ－１及びＳＡ－２に用いたＳＡは富士フイルム和光純薬工業株式会社製、ＭＤＰＮＡ及びＤＭＰはシグマアルドリッチジャパン合同会社製のものを用いた。

３．マトリックス・微生物懸濁液の調製
(3-1) ＬＢ寒天培地で培養した１０５菌株のサルモネラ属菌をそれぞれ約１mgずつ微量天秤で秤量してチューブに入れ、そこにマトリックスＳＡ－２溶液を加えて菌濃度が１mg/0.075mL（１×１０^７個/ Ｌ）になるように調製し、それをニードルで懸濁した。
(3-2) チューブに１分間、超音波振動を与え、得られた懸濁液を遠心分離（12000rpm、５min）して遠心上清液を得た。

４．ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる分析
(4-1) ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬずつ滴下した（プリコート）。
(4-2) 続いて、マトリックス溶液ＳＡ－１がプリコートされた各ウェルに、上記の遠心上清液を１μＬずつ滴下し、自然乾燥させた。
(4-3) (4-2)で得られたＭＡＬＤＩ用サンプルプレートを、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（AXIMA Performance, 株式会社島津製作所製）に挿入し、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。各血清型について４個の試料を用意し（n=4）、それぞれの試料について得られた測定データは全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。

５．ピークの抽出
測定データに対してサルモネラ属菌の自己キャリブレーションを適用し（具体的には、サルモネラ自身の幾つかの帰属済みのピークを内部標準として用いてキャリブレーションを行い）、得られたマススペクトルについて、非特許文献１で示される１２種類のマーカータンパク質に由来するピークの質量電荷比の値を読み取り、それらの値から該試料に含まれる微生物がサルモネラ属菌の血清型のいずれであるかを判別した。このとき、１２種類のマーカータンパク質のうちSodAにおいては、６種の血清型であるEnteritidis、Rissen、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Pakistanに対し、上記の表１に示す多価イオン（主に２価イオン）のピークの質量電荷比を読み取った。

６．結果
上記６種の血清型を含む２２種類の血清型の菌株に対し、１２種類のマーカータンパク質中のSodAの１価およびに２価イオンのピーク検出状況を確認すると、表１の検出状況が確認された。表２は、表１に示されている血清型のうち１価イオン、２価イオン及び／または３価イオンのピークの質量精度を示している。この結果、２価イオン及び３価イオンのピークは１価イオンのピークに比べると質量精度が高いことが確認された。

以下に、６種の血清型のサルモネラ属菌のうちS. Enteritidis及びS. Abonyを含む試料について得られたマススペクトルに基づき血清型を識別した具体例について説明する。

(1) S. Enteritidis
図３の（ａ）、（ｂ）は、同じ株（GTC00131）のS. Enteritidisを含む４個（n=4）の試料のうち２個の試料について得られたマススペクトルである。図３（ａ）、（ｂ）は、いずれもSodA由来の１価イオンのピークを示しているが、それらのピークから読み取られた質量電荷比m/zの値が異なっていた。具体的には、図３（ａ）に示されるピークから読み取られた質量電荷比はS. PakistanのSodA由来の１価イオンピークの理論質量値に近かったため、SodAを含む１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比m/zによって同定された血清型はS. Enteritidis、または、S. Pakistanとなった（同率一位）。

一方、図３（ｂ）に示されるピークから読み取られた質量電荷比はS. EnteritidisのSodA由来の１価イオン由来のピークの理論質量値に近かったため、SodAを含む１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比m/zによって、試料に含まれるサルモネラ属菌はS. Enteritidisであることが同定（単独一位で同定）された。

図４（ａ）、（ｂ）は、それぞれ図３（ａ）、（ｂ）に示されているピークを含むマススペクトルのうち、SodA由来の２価イオンのピーク付近を示している。２価イオンの場合は、１価イオンのピークに比べると高い質量精度でピークが検出された。また、図４（ａ）、（ｂ）のいずれであっても、ピークから読み取られる質量電荷比はほぼ同じで且つ、S. EnteritidisのSodA由来の２価イオン由来のピークの理論質量値に近かった。このため、SodAを含む１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比m/zによって、試料に含まれるサルモネラ属菌はS. Enteritidisであることが同定（単独一位で同定）された。

(2) S. Abony
図５の（ａ）、（ｂ）は、同じ株（NBRC100797）のS. Abonyを含む４個の試料のうち２個の試料について得られたマススペクトルである。図５（ａ）、（ｂ）は、いずれもSodA由来の１価イオンのピークを示しているが、それらのピークから読み取られた質量電荷比m/zの値が異なっていた。具体的には、図３（ａ）に示されるピークから読み取られた質量電荷比はS. Enteritidis等のSodA由来の１価イオンピークの理論質量値に近かったため、SodAを含む１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比m/zによって同定された血清型はS. Enteritidis、または、S. Abonyとなった（同率一位）。

一方、図５（ｂ）に示されるピークから読み取られた質量電荷比はS. AbonyのSodA由来の１価イオン由来のピークの理論質量値に近かったため、SodAを含む１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比m/zによって、試料に含まれるサルモネラ属菌はS. Abonyであることが同定（単独一位で同定）された。

図６（ａ）、（ｂ）は、それぞれ図５（ａ）、（ｂ）に示されているピークを含むマススペクトルのうち、SodA由来の２価イオンのピーク付近を示している。２価イオンの場合は、１価イオンのピークに比べると高い質量精度でピークが検出された。また、図６（ａ）、（ｂ）のいずれであっても、ピークから読み取られる質量電荷比はほぼ同じで且つ、S. AbonyのSodA由来の２価イオン由来のピークの理論質量値に近かった。このため、SodAを含む１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比m/zによって、試料に含まれるサルモネラ属菌はS. Abonyであることが同定（単独一位で同定）された。

さらに、１２種類のマーカータンパク質に由来するピークによるサルモネラ属菌の１０５菌株の判別率を評価した結果を表３及び表４に示す。表３及び表４は、サルモネラ属菌１０５菌株について、SodAの１価イオンを使用したとき、２価イオンを使用したときの判別率をそれぞれ示している。

これらの表より、４個の試料のうち３個（７５％）以上の確率で単独同定される場合の判別率は１価イオンを用いた場合の７９％に対し、SodAの２価イオンを用いた場合は８３％、４個の試料のうち２個（５０％）以上の確率で単独同定される場合の判別率は１価イオンを用いた場合の９０％に対し、２価イオンを用いた場合は９３％と、数％向上した。大幅な向上に至らなかった理由は、表１に示すように、多くの血清型でSodAの多価イオンのピークが、ピークの重複などの理由で未検出だったためであると思われる。SodAの多価イオンのピークを検出することさえできれば、SodAに由来する多価イオンは、確実に血清型の判別率の向上に寄与することが推測された。

［態様］
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様の微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１２種類のタンパク質であるgns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodAのそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記１２種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれる微生物が、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるEnteritidis、Rissen、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Pakistanのいずれの菌を含むかを識別するステップを有し、
前記SodAに由来するピークが、該SodAがイオン化して生じる多価イオンに由来するピークである。

第１項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれる微生物が、前記６種の血清型のいずれの菌を含むかをより精度良く識別することができる。

（第２項）第１項に記載の微生物分析方法において、
前記多価イオンが２価イオン又は３価イオンである。

第２項に記載の微生物分析方法によれば、前記６種の血清型のいずれの菌を含むかをより精度良く識別することができる。

（第３項）第２態様は、コンピュータに上述した第１項又は第２項に記載の各ステップを実行させるためのプログラムである。

Claims

微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１２種類のタンパク質であるgns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodAのそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記１２種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれる微生物が、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種類の血清型であるEnteritidis、Rissen、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Pakistanのいずれの菌を含むかを識別するステップを有し、
前記SodAに由来するピークが、該SodAがイオン化して生じる多価イオンに由来するピークである、微生物分析方法。
請求項１に記載の微生物分析方法において、
前記多価イオンが２価イオン又は３価イオンである、微生物分析方法。
コンピュータに請求項１又は２に記載の各ステップを実行させるためのプログラム。