CN106133149A

CN106133149A - 微生物分析

Info

Publication number: CN106133149A
Application number: CN201480066991.1A
Authority: CN
Inventors: G·施蒂比格; O·贝勒卡塞姆
Original assignee: Cleto J Analysis Ltd
Current assignee: Cleto J Analysis Ltd; Kratos Analytical Ltd
Priority date: 2013-10-09
Filing date: 2014-10-09
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2034-10-09
Also published as: EP3055420B1; US20160237469A1; US10655157B2; GB201317837D0; JP2016533715A; GB201800188D0; GB2558426B; JP2020038208A; CN106133149B; GB2524854B; GB2558425A; GB201800190D0; EP3456838A1; GB2524854A; WO2015052525A1; EP3456838B1; GB2558425B; GB201417899D0; GB2558426A; EP3055420A1

Abstract

本发明涉及识别微生物菌株(例如，从细胞培养物)，该方法包括的方法；ⅰ)脂质提取步骤，包括适当地使用提取组合物从微生物中提取磷脂，所述提取组合物包含大于50体积％甲醇；ⅱ)样品制备步骤，包括制备结合有所提取的脂质的MALDI样品；ⅲ)数据采集步骤，包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，和iv)微生物识别步骤，包括对质谱数据进行分析从而表征或识别微生物菌株。适当地，该方法还包括从所述微生物中提取蛋白质和使用基于MALDI的质谱分析所提取的蛋白质，从而不仅获得脂质m/z数据，而且还获得蛋白质m/z数据。

Description

微生物分析

技术领域

本发明涉及分析微生物的方法。所述分析是基于脂质谱，并且可以用于微生物识别。

背景技术

理想的是迅速且简单、可靠地识别微生物。可靠的识别允许微生物样本的致病性和/或其它特性可以被识别。确定微生物的生物分子组成可以协助识别继而诊断。

质谱可用于分析生物分子，一般使用软电离技术。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)-MS是这样的技术之一，并已被广泛地应用于大型生物分子包括蛋白质的分析。蛋白质指纹图谱使得MALDI-MS可以应用到微生物识别和诊断中。

然而，蛋白质指纹图谱无法可靠地区分在同种的不同菌株。需要血清学检测或PCR分析，以测试样品的致病性。

已知脂质对细胞内的结构很重要，并且它是细胞膜和其它亚细胞结构的主要组成部分。它们在主要细胞机制中是活跃的，并影响蛋白质的性质和功能。

US2012/0197535描述了从细菌样本中提取糖脂类(糖脂saccharolipid)。采用质谱技术(包括MALDI)分析糖脂组成使得可以识别细菌菌株。这种技术利用细菌外部细胞壁糖脂结构(例如脂质A、脂磷壁酸)的特异性。然而，该方法是开发用于并定制用于这些糖脂的特定提取，并且发明人已经发现，其不能广泛适用。例如，它不能被用来测定其它不含这些糖脂的微生物有机体(例如酵母或真菌)的识别。

不同属(如细菌、酵母、丝状真菌)之间，即使是一个属的不同种级别中，微生物的细胞结构可以变化非常大。例如，取决于细胞结构特征，原核生物(如细菌)分成两大类，革兰氏阳性和革兰氏阴性。然而，尽管原核生物和真核生物(如酵母和真菌)的细胞结构的完全不同的构造，它们都具有细胞质膜。

磷脂(PLs)(特别是甘油磷脂和鞘磷脂)已知是许多微生物的主要膜脂质。事实上，磷脂的生物合成的组分和磷脂本身是膜表面，并作为其它细胞膜组分的前身。[1]

例如，阳离子磷脂酰胆碱(PC)，在真核生物中占总膜脂质的约50％，并且磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)作为次要组分。两性离子磷脂酰乙醇胺(PE)、阴离子磷脂酰甘油(PG)和/或心磷脂(CL)代表大多数已知细菌的主要膜脂质(例如大肠杆菌中有高达80％的PE)[2]。其它显著磷脂是PG的氨基酸酯(例如赖氨酰-，丙氨酰-，或鸟氨酰-PG)[14]。

一些其它中性脂质(NLs)(或非极性脂质)，例如二酰基甘油(DAGs)，三酰基甘油(TAGs)和胆固醇酯(CEs)，已知在细胞膜的功能中起重要作用。虽然在原核生物(例如细菌)中很少发现CEs，它们是真核生物(即酵母、真菌和哺乳动物细胞)中更常见的脂质成分。这些脂质分子含有酯化到甘油或甾醇骨架的1-3个脂肪酸。NLs的一个重要的分组是糖基甘油二酯(例如双半乳糖基二酰甘油酯，DGDG)，其主要见于革兰氏阳性菌(如芽孢杆菌)[14]。

PLs(和NLs)对细胞膜的重要性，是指脂质组成的体内平衡对于维持微生物细胞细胞膜的完整性和功能(例如，跨膜信号传导、细胞间相互作用、能量代谢、细胞增殖等)，以及它们在不同环境中的生存是非常重要的[13]。公知的，细胞磷脂组合物的改变将导致微生物暴露于环境压力，如极端温度、有毒物质、食品添加剂和抗生素[4][5][6][7]。

因此，微生物细胞具有非常特色的、基于进化的磷脂组合物，其可被用于化学分类的目的，由此，潜在地磷脂谱的微小差异可以用于菌株水平的区分。这允许可以识别具有特定特征的菌株，包括那些致病性和对抗生素产生抗药性的菌株。

微生物的磷脂组合物是非常复杂的，并且其通常使用质谱(MS)来分析，因为它允许同时检测一个单独MS谱中的多个个体分子种类。使用MS对微生物进行分类的第一个例子是使用气体色谱(GC)-MS[8]。因为良好的色谱分离潜力，GC-MS被用于细胞脂肪酸分析[9]。然而，脂质需要被分解成组成性脂肪酸分子进行分析，因此不能测定细胞内的磷脂组合物。

磷脂的功能分析表明，结构特性(如头部、链长、不饱和度)是膜功能的主要原因[10]。磷脂被分解成构成性脂肪酸时，该信息也会丢失。

因此，在分析期间保存完整的磷脂结构的检测技术更适合化学分类的目的。一些报道已经显示完整的脂质谱对于，使用软电离技术，例如快原子轰击(FAB)[11]和电喷雾电离(ESI)-MS来区分细菌的作用[12]。

然而，MALDI-MS通常是优选的软电离技术。可以简单和快速地获得数据，并且它是相对简单的分析，因为在对基质包埋的样品进行激光激发后，所述分子几乎被专一地检测为单电荷离子。。而且采用的仪器是稳健的和可靠的，其允许分析原始(即未纯化的)样品。因此，MALDI-MS已发展成基于“蛋白质指纹图谱”的微生物诊断的一个常规的技术[13]。

最近，MALDI-MS已被报告为一种用于细菌磷脂分析的方法[14][15]。然而，可靠的样品制备步骤和仪器仪表技术的缺乏阻止了这些方法的广泛应用。通过使用MALDI-MS的磷脂分析进行常规细菌的识别，对关系紧密的细菌是不可能的，这阻碍了其在分类学中的使用。此外，目前在其他类型的微生物(如酵母和真菌)中，尚没有脂质MALDI-MS的成功分析的报道，它们仍必须通过使用光学显微镜观察细胞形态、基因分型、和/或蛋白质指纹图谱来识别。

此外，使用基于MALDI-MS的磷脂分析来区分微生物菌株(在一个物种内)尚未见报道。也没有用于酵母或真菌的基于MALDI-MS的脂质谱(lipid profile)。

发明内容

最基本地，本发明提供微生物分析的方法，可使用基于组成性脂质分析来区分微生物菌株。该方法使用MALDI质谱法。在一些情况下，该方法分析了微生物磷脂。任选的，该方法还分析微生物蛋白质。因此，“蛋白质指纹图谱分析”和“脂质指纹图谱分析”可以在同一微生物中进行。事实上，可以使用同样的提取处理来获得提取的脂质和提取的蛋白质。这有利于后续的MALDI-MS分析，并且该分析可以包括合并来自脂类和蛋白质m/z范围的数据。

分析的数据可以用来简单、可靠地识别微生物菌株。

在第一方面，本发明提供了识别微生物菌株的方法，该方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取磷脂；

ⅱ)样品制备步骤，包括制备结合有所提取的磷脂的MALDI样品；和

ⅲ)数据采集步骤，包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，

ⅳ)微生物识别步骤，包括对质谱数据进行分析以表征或识别微生物菌株。

与现有技术的方法相比，可以识别菌株水平的微生物。相似的，可以使用由本申请发明人设计的方法来区分关系紧密的微生物。

现有技术中描述的通过脂质谱识别细菌的早期过程[14]表明脂质：“在给定的细菌中，其组成和相对含量取决于环境条件”，并认为“这可能对使用脂质谱来分类和区分非常相似的细菌种类造成困难”。它指出，脂质分析可以用于“区分显著不同的组，如从革兰氏阴性细菌中区分革兰氏阳性细菌”。

在这方面的进一步的工作还注意到，脂质组成的变化源自于环境条件，例如培养基[15]。进一步工作力图提高集中于不同的步骤以加快细菌识别的早期方法。

与现有技术相比，发明人发现，脂质谱可用于识别微生物菌株。发明人已确定，在一定的时间点(例如24后或72小时后)由细菌细胞培养物中记录的脂质谱，或者使用特定培养介质(如血液或基本琼脂)记录的脂质谱允许细菌菌株的可靠区分。因此，本发明要求保护的方法允许在亚种水平的化学分类识别，并且除其它因素外，其已经被设计用于增加信噪比和质谱再现性。

本发明所保护的方法简单、快速、方便和可靠。

该方法是在临床/医院环境中非常有用，其进行大量的测试(以识别微生物信息)，以及高可信度的结果是很重要的。

下面将更详细地讨论，适当地，该方法包括获得蛋白质以及脂质(如磷脂)的质谱分析数据。也就是说，适当地，该方法包括“蛋白质指纹图谱”以及“脂质指纹图谱”以区别微生物菌株。

本发明人已经发现，一个单独的提取步骤便于脂质(适当地包括磷脂)和蛋白质的提取。如在本文实施例中所述，借助合适的基质，可以使用含有脂质和蛋白质的被提取的材料用于脂质分析(通常m/z＝100至3000，例如200至2000)和蛋白质分析(通常m/z＝2000至20000)。这种“全合一”的方式提供了一种可靠、简单、快速、低成本用于得到有价值的亚种信息的方法。

适当地，提取步骤i)包括从微生物中提取蛋白质。适当地，使用相同的提取组合物(如甲醇或甲醇/水)提取脂质和蛋白质。如下面所讨论的，由于为了得到脂质信息和蛋白质信息只需要一种提取组合物，这便于高通量分析。

适当地，样品制备步骤ii)包括a)制备结合有所提取的脂质的MALDI样品，以及b)制备结合有所提取的蛋白质的MALDI样品。通常步骤ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基质材料。

适当地，数据采集步骤iii)包括从所提取的脂质获得质谱数据以及从所提取的蛋白质获得质谱数据。在实施方案中，脂质的质谱数据和蛋白质的质谱数据可以被组合/合并。

在第二方面，本发明提供一种分析微生物的方法，所述方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取脂质；

ⅱ)样品制备步骤，包括制备结合所提取的脂质的MALDI样品；和

iii)数据采集步骤，包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析。

第二方面允许不同微生物获得不同质谱。

以与第一方面相同的方式，适当地，提取步骤i)包括从微生物中提取蛋白质。适当地，使用相同的提取组合物提取脂质和蛋白质。

并且类似地，样品制备步骤ⅱ)可以包括a)制备结合所提取的脂质的MALDI样品，b)制备结合所提取的蛋白质的MALDI样品。通常步骤ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基质材料。

再次，适当地，数据采集步骤iii)包括获得所提取的脂质的质谱数据和获得所述提取的蛋白质的质谱数据。在实施例中，脂质的质谱数据和蛋白质的质谱数据可以被组合/合并。

在第三方面，本发明提供一种分析微生物的方法，该方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，其包含向微生物中添加提取组合物以提取脂质，其中提取组合物包含大于50体积％的醇或大于50体积％的醚；

ⅱ)样品制备步骤，包括制备结合有所提取的脂质的MALDI样品；和

在第三方面中所使用的基于醇或醚的溶剂允许获得脂质MS谱，其中所有微生物类型均可以可靠地达到亚种分辨率。优选地，提取组合物包含大于50体积％的醇。

相比之下，现有技术的方法[14][15]，使用Folch试剂进行磷脂提取。Folch试剂包含体积比为3:1到1:1的三氯甲烷和甲醇。Folch法是在脂质分析领域中是最常用的脂质提取技术。然而，发明人已经发现，所得到的MALDI质谱是不可再现的，并且不能检测到亚种质谱之间的微小差异。本发明第三方面中所要求的醇基的溶剂提取技术提高了质谱的再现性，并且背景噪音低。因此，亚种分辨率是可能的。出人意料的是，当不仅执行脂质分析而且执行蛋白质分析时，也能够实现。因此，即使当m/z范围包括脂质(通常m/z＝100至3000，例如200至2000)和蛋白质(通常m/z＝2000到20000)时，本发明第三方面的定制溶剂系统可以适当地提供了低背景噪音和良好的再现性。

US2012/0197535使用Folch试剂提取糖脂，并描述后续亚种区分。然而，如以上所讨论的，糖脂不存在于所有微生物中。本发明人的醇基溶剂提取被设计为允许从所有微生物中提取脂质，其中所提取的脂质的MS谱允许后续亚种分辨率。

另外，在脂质提取步骤中使用的醇基溶剂也将溶解基质材料，以允许样品制备。这避免了额外的试剂，从而降低了成本，并导致更清洁、可再现性更好的谱，其中亚种可被区分。换句话说，与Folch试剂相比，脂质提取中使用的醇基溶剂与基质材料更兼容。

从图2可以看出，利用Folch试剂返回的质谱具有非常差的信噪(S/N)比，由于Folch试剂(特别是氯仿)与MALDI基质材料兼容性较差。该噪声水平使得亚种分辨是不可能的。

在一个优选的情况中，脂质提取步骤中提取磷脂。在提取步骤中使用的醇基溶剂已经专门定制为这个目的，即，允许磷脂提取，这种方式允许亚种分辨。

如上所述，定制的溶剂系统不仅可以有效地提取脂质(特别是磷脂)，而且可以有效地提取蛋白质。这使得蛋白质指纹图谱和脂质指纹图谱可以使用相同的提取。

以与第一方面相同的方式，适当地，提取步骤i)包括从微生物中提取蛋白质。适当地，使用相同的提取组合物提取脂质和蛋白质。任选地，提取步骤i)包括向微生物添加水(例如添加到培养基)。这可以是添加提取组合物之前的先行步骤。可替代地或附加地，提取组合物可包含水。例如，可以使用醇/水或醚/水混合物。在实施方案中，在第一(先行)步中向微生物中添加水，随后在第二步中添加醇(适当地为甲醇)。

类似地，样品制备步骤ⅱ)可以包括a)制备结合有所提取的脂质的MALDI样品和b)制备结合有所提取的蛋白质的MALDI样品。通常地，步骤ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基质材料。

在第四方面，本发明提供一种分析微生物的方法，该方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取脂质；

其中；

脂质提取步骤包括向微生物中添加甲醇溶液或甲醇/丙酮混合物，和/或

样品制备步骤包括向所提取的脂质中添加9AA或ATT基质材料，和/或

在数据采集步骤中，在MS1质谱中扫描的m/z范围是从约100至约3000。

如本文中所讨论的，(脂质和蛋白质)提取步骤可以包括依次添加水和醇(适当地选自甲醇或乙醇，优选甲醇)(适当地水优先)，或作为水-醇混合物添加。

类似地，样品制备步骤ⅱ)包括a)制备结合有所提取的脂质的MALDI样品和b)制备结合有所提取的蛋白质的MALDI样品。通常步骤ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基质材料。在一些实施方案中，CHCA基质材料用于所提取的蛋白质。即，样品制备步骤(例如步骤ii)b))包括向所提取的蛋白质中添加CHCA基质材料。

再次，适当地，数据采集步骤iii)包括获得所提取的脂质的质谱数据和获得所提取的蛋白质的质谱数据。在一些实施方案中，脂质的质谱数据和蛋白质的质谱数据可以被组合/合并。

这些方法允许获得高可再现性、低噪音、高信息含量的脂质谱。因此可以区分关系紧密的微生物，包括同一物种的分离菌株的质谱。在一个优选的情况中，脂质提取步骤至少提取磷脂。

在一些实施方案中，数据采集步骤进一步包括在MS1质谱中扫描从约2000至约20000的m/z范围。因此，适当地扫描的m/z范围用于蛋白质分析以及用于脂质分析。

如本文中所讨论的，数据采集步骤可以包括1)对根据步骤ii)a)制备的MALDI样品执行MALDI-MS，和2)对根据步骤ii)b)制备的MALDI样品执行MALDI-MS。因此，在一些实施方案中，对相同的微生物样品进行处理(提取、MALDI样品制备)，以便得到脂质组成和蛋白质组成的m/z数据。这使得微生物(如培养物)亚种信息的分配具有甚至更高的可信度和可靠性。

在第五方面，本发明提供一种分析非细菌微生物的方法，该方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取脂质；

类似地，样品制备步骤ⅱ)可以包括a)制备结合有所提取的脂质的MALDI样品和，b)制备结合有所提取的蛋白质的MALDI样品。通常步骤ⅱ)a)和ii)b)使用不同的MALDI基质材料。

再次，适当地，数据采集步骤iii)包括获得所提取的脂质的质谱数据和获得所提取的蛋白质的质谱数据。在实施方案中，脂质的质谱数据和蛋白质的质谱数据可以被组合/合并。

在第六方面，本发明提供了一种分析微生物的方法，该方法包括：

ⅰ)提取步骤，包括从微生物中提取脂质和蛋白质；

ⅱ)样品制备步骤，包括制备一个或多个结合有所提取的脂质和/或所提取的蛋白质的MALDI样品；和

ⅲ)数据采集步骤，包括对一个或多个MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以便获得微生物的脂质组成的质谱数据和微生物的蛋白质组成的质谱数据。

在实施方案中，脂质的质谱数据和蛋白质的质谱数据可以被组合/合并。

适当地，该方法包括ⅳ)微生物识别步骤，包括对质谱数据进行分析来表征或识别微生物，优选微生物菌株。适当地，任何此类分析是针对合并后的质谱数据进行的。

如本文中所讨论的，样品制备步骤ii)典型地包括制备用于蛋白质分析(使用例如CHCA作为基质材料)的MALDI样品，和用于脂质分析的(不同的)MALDI样品(使用例如ATT或9AA作为基质材料)。适当地，从提取步骤中获得的组合物(通常是悬浮液)用于制备用于蛋白质分析(例如，通过添加适当的基质材料如CHCA)的MALDI样品和用于脂质分析的MALDI样品(例如，通过添加适当的基质材料例如ATT或9AA)。

优选地，在本发明的上述每个方面，所述脂质提取步骤包括磷脂提取。在一些情况下，所提取的脂质中的至少约20体积％、优选40体积％、50体积％、60体积％、70体积％或80体积％是磷脂。在一些情况下，样品中至少约20体积％、优选40体积％、60体积％或80体积％的磷脂被提取。

优选，在本发明的上述每个方面，所述脂质提取步骤包括蛋白质提取。

优选，在本发明的上述每个方面中，数据采集步骤包括获得脂质的质谱数据(典型地通过扫描100到3000的m/z范围，例如200到2000)和蛋白质的质谱数据(通常通过扫描2000至20000的m/z范围)。

任选地，本发明第二、第三、第四和第五方面的方法可以进一步包括微生物识别步骤，包括分析质谱数据以表征或识别微生物。任选地，所述微生物识别步骤包括蛋白质质谱数据(通常包括从2000到20000的一些或所有m/z范围获得的数据)的分析以及脂质质谱数据(通常包括从100到3000、通常为200至2000的一些或所有m/z范围获得的数据)的分析。本发明的发明人已经发现，通过同时使用脂质m/z数据与蛋白质m/z数据，微生物种类和亚种信息的识别是更加可靠的，以及该信息有更高的置信度。基于该信息，这对于基于该信息进行诊断的后续治疗的诊所/医院是特别相关的。

任选地，任一方面的方法可进一步包括另外的、最初的、微生物培养步骤。

本发明的另一个方面涉及用于实施之前的任一方面的方法的试剂盒。所述试剂盒包括实施所述方法所需的试剂，以及解释所述方法中每个步骤的详细说明。

适当地，试剂盒包括一种或多种：

(ⅰ)MALDI基质材料，和任选的共基质(co-matrix)材料

(ii)样品板，

(ⅲ)阳离子和阴离子磷脂标准品(适当地冻干的)的校准混合物和

(ⅳ)一组用于完成如此处所述方法的指令。

优选的基质材料选自ATT、THAP和9AA，和/或可选的共基质材料选自DAHC、GUA和醋酸钠或醋酸锂，和/或包括两个或更多的样品板(例如16个样品板)，其中每个板是48孔靶玻片(slide)(例如FlexiMassTM–DS靶玻片)，和/或包括用于脂质提取和/或基质材料溶解的有机溶剂。

在蛋白质被提取和分析的实施方案中，MALDI基质材料适当地选自a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)和阿魏酸(FA)。优选CHCA。因此，试剂盒可以包括用于脂质分析的第一基质材料和用于蛋白质分析的第二基质材料(与第一基质材料不同)。

适当地，试剂盒包括存放试剂和/或其它成分的容器或外壳。

在本申请中，液体体积(体积％)百分比的计算是基于混合前组成元素的体积总和。

现在讨论上述各种步骤，包括可选的和优选的特征。此处将公开本发明各个方面兼有的每种可选的和优选的特征，以及它们的组合，如同每个特征和每个组合单独地并明确地被引用。

脂质提取

虽然现有技术的一些方法(例如，蛋白质生物分型)已经阐述了通过MALDI-MS直接分析活细胞，本申请所要求保护的方法中使用的有机溶剂提取步骤提供了几个重要的优点。包括：

a)灭活微生物细胞，以及破坏细胞结构。这便于样本易于处理(例如，在制备和运输的过程中)，甚至当处理与病原菌种类时，也是如此。

b)生产均质脂质溶液，最小化原始细胞结构对所得质谱的影响。质谱具有更可再现性。

c)便于储存。脂质可以存储很长一段时间(例如，在约-20℃至约-80℃)，而不表示显著劣化。与此相反，活细胞不能被存储相同的时间。便于储存允许分析可以容易地再次运行，以确认结果。

一般地，可以使用任何能够保存脂质、优选至少磷脂使其完整的脂质提取技术。这保留了全部的生物信息内容。

在一些方面，脂质提取步骤包括从微生物细胞中提取脂质。

在其它方面，脂质提取技术包括从微生物细胞中提取磷脂。在这些方面中，优选还提取中性脂质。

典型地，脂质提取步骤包括向微生物中添加有机提取组合物。有机提取组合物优选包含一种或多种有机溶剂。在一些情况下，有机提取组合物优选包含一种或多种醇。有机提取组合物优选包含大于约50体积％的醇，更优选至少约51体积％、52体积％、53体积％、54体积％、55体积％、60体积％、70体积％、80体积％、或90体积％的醇。优选短链醇，如C_1-4醇，其中乙醇和甲醇是尤其有利的，因为已发现它们可以有效地从所有类型的微生物细胞(即细菌、酵母和真菌)中提取磷脂，与细胞结构无关。在一些情况下，提取组合物包含至多100体积％的醇，优选至多95体积％、90体积％、85体积％、80体积％、75体积％或70体积％的醇。

作为另外一种选择或额外地，有机提取组合物包括酮、酯、和/或醚(如甲基叔丁基醚(MTBE)、丁醇(DIPE))，或它们的混合物。

这些溶剂是优选的，因为它们是与样品制备步骤中使用的MALDI基质材料是相容的(即它们容易溶解)。出于这个原因，基于醇的溶剂(其包含至少约50体积％的醇)是特别有利的。作为相容性的结果，这些溶剂在所得质谱中产生相对较小的背景噪音信号。脂质(特别是磷脂)提取是有效的和可靠的，这允许获得可再现的质谱。此外，不需要额外的试剂，节约成本。

提取组合物的另一个优选的特征是，它不是双相的。换句话说，它完全包含极性溶剂或非极性溶剂。因此不需要分离步骤，这减少了处理时间并提高工作量。换句话说，所述脂质提取步骤简单地包括向样品中添加溶剂，即它是一个一步提取方法。相比之下，使用Folch试剂需要在提取脂质之后，分离极性和非极性组分相。

在一些情况下，提取组合物不包括任何卤代有机溶剂。即，氯仿(CHCl₃)特别不是提取组合物的一部分。在其它情况下，提取组合物包含小于5体积％、优选小于4体积％、3体积％、2体积％、1体积％、0.5体积％、0.4体积％、0.3体积％、0.2体积％或0.1体积％任何卤代有机化合物或溶剂(包括氯仿)。

在一些情况下，有机提取组合物优选包含醇或由醇组成，因为它们导致在最小的谱噪音。优选C_1-4醇，特别优选甲醇。有机溶剂可能基本上由甲醇组成。

在其它情况下，有机提取组合物优选包括醇/酮混合物或由醇/酮混合物组成，所述醇/酮混合物优选体积比为约70:30或75:25至约85:15或90:10。在优选的情况下，有机提取组合物包含在上述比例范围内的C_1-4醇和C_3-4酮混合物。在特别优选的情况下，有机提取组合物包括上述比例范围内的甲醇/丙酮混合物。最优选地，有机提取组合物由体积比为约70:30或75:25至约85:15或90:10的甲醇/丙酮混合物组成。这些混合物是特别优选的，因为它们有效地提取具有不同的极性(包括阳离子和阴离子磷脂、和中性脂质)的各种各样的脂质，同时可以最小化谱噪音并允许获得可再现的质谱。

可替代地，有机提取组合物包含大于50体积％的醚、优选为至少约55体积％、60体积％、70体积％、80体积％、或90体积％的醚。优选C_1-4醚(我们是指，在醚键任一侧的碳链中包含1至4个碳原子)。优选地，醚体积包含或由二异丙醚(DIPE)组成。醚基有机提取组合物可额外地包含醇、酮和/或酯，或它们的混合物。

如下面讨论的，包括蛋白质提取的方法中，提取步骤可以包括使用水，其中水作为提取组合物的一部分或作为向微生物中添加水的先行步骤。

优选地，处理所提取的样品以除去污染物，如蛋白质。这提高了所得质谱的可重复性和清晰度。自然地，在包括蛋白质提取和分析的方法中，此可选污染物去除处理或者不进行或进行调整，以保存(或至少最小化除去的)蛋白质。

在蛋白质污染物(至少)的情况下，这些优选从提取的溶液中沉淀出来，并通过离心去除。

蛋白质提取

本申请发明人已经发现，令人惊讶地，此处所讨论的涉及蛋白质提取的提取方法和溶剂系统，也能有效地用于从微生物中提取蛋白质和允许通过MALDI质谱分析提取的蛋白质。

此外，本申请发明人已确定，在蛋白质m/z数据结合脂质m/z数据可以增加所得物种的精确度和置信度，特别是亚种识别。

本申请的发明人已经发现，除了提取组合物中的醇/醚成分，使用水能协助促进用于随后的MALDI-MS分析蛋白的可用度。这可以通过将水和微生物(例如和细胞培养物)进行组合/混合来实现。这可以在与醇/醚成分进行结合/混合之前在第一步/先行步骤中完成，和/或通过向醇/醚提取组合物中添加水来完成。

本申请人已发现水的使用可以协助制备(微生物材料的)混悬液，其有利于形成具有良好质量的MALDI样品。因此，水的使用可以协助增大和/或扩散和/或分散微生物(例如培养基中的细胞)，特别是在结合/混合醇/醚之前的第一/先行步骤中。

通常情况下，在与水和/或提取组合物结合/混合的步骤之后，将得到的材料进行超声处理。通常(超)声波处理进行至少1分钟，合适地至少2分钟，优选至少5分钟。典型地，超声处理进行不超过约20分钟，通常不超过15分钟。特别优选的范围为5至10分钟。

任选地，包括所提取的脂质和/或蛋白质的组合物可以被冷却，例如至<20℃，例如至<10℃，例如至<5℃。这可以通过将样品(在合适的容器/器皿中)放在冰上/里而容易地实现。本申请发明人已经发现，这可以进一步增强用于随后MALDI-MS分析的提取物质量。任何这样的冷却步骤的持续时间通常为至少10分钟、合适地至少20分钟、优选至少25分钟。通常地，所述冷却步骤不超过60分钟，一般不超过45分钟，优选不超过35分钟。在实施方案中，冷却进行约30分钟。

可选地，涡旋包括提取的脂质和/或蛋白质的组合物。通常这是和上述冷却步骤同时进行的或在其完成之后进行的。再次，已经发现，这可以进一步改善混悬液的均一性，所述混悬液是通过向微生物中添加提取组合物而形成的，这反过来又提高了MALDI-MS谱的质量。

以这种方式中使用水以及醇/醚，适当地同时超声处理，可以促进生成亲水性和疏水性组分(包括细胞蛋白和膜脂质)的均匀悬浮液。这允许从相同的样品中，使用MALDI-MS对蛋白质和脂质均进行有效的分析。

样品制备

样品制备步骤包括向基质材料中添加所提取的脂质。在执行蛋白质分析的实施方案中，样品制备步骤包括向基质材料中添加所提取的蛋白质。如下面所讨论的，用于脂质分析的基质材料可以与用于蛋白质分析的基质材料不同。

在MALDI-MS中使用的基质a)作为脂质分子的电离促进剂和b)作为电离减速剂，以防止相对不稳定的脂质分子的分裂。对于基质的选择没有特别限定，只要其能实现该功能即可。2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)、2，4-二羟基苯甲酸(2，4-DHB)、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)、9-氨基吖啶(9AA)和2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)都是合适的基质材料。即，在一些情况下，基质材料包括这些化合物中的一种或多种。

所使用的基质取决于质谱仪是否是在正离子或负离子模式下操作的。即，脂质是否被正离子化或负离子化。

当与磷脂(和中性脂质，当它们也被提取时)一起工作，下面讨论的一些示例性的基质材料是特别优选的。

在使用正离子模式操作的系统中，优选2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)基质。当掺杂乙酸钠或乙酸锂(电离启动子)时，(2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)基质)是特别优选的，其通过形成带正电荷的钠加合离子允许检测到中性脂质(参见图3)。掺杂的盐的浓度范围优选为约1-50mM，优选10-20mM。在这些水平的掺杂使得可以完全抑制MALDI质谱中的其它不期望的碱性反离子。

在正离子模式操作时，6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)是一种优选的基质材料。这对于检测阳离子磷脂是特别好的。ATT导致比THAP较软的电离，并导致较不明显的碎片产物，因此所得的质谱是容易分析的。当掺杂柠檬酸二氢铵(DAHC)时，特别优选ATT，其抑制混合碱加合物(例如Na或K)的形成，并且允许检测到专一质子化的磷脂(参见图3)。掺杂的盐浓度范围优选为约1-100mM、更优选10-50mM。在这些水平的掺杂使得允许专一地检测到MALDI质谱中质子化的分子离子。

注意，ATT优选于THAP，因为ATT可以和具有更大范围波长的电离激光共同使用(即ATT与更大范围的激光是兼容的)。

在以负离子模式操作时，9-氨基吖啶(9AA)是一种优选的基质材料。这对于检测阴离子磷脂是特别好的。特别特选掺杂有盐酸胍(9AA-GUA)或吡啶(9AA-PYR)的9AA，因为检测的灵敏度得以增加，并且清楚、可再现的图谱结果(见图3)。9AA-GUA优选包含约3mM或4mM至约6mM或7MM的胍，最优选约5mM。9AA-PYR优选包含约0.3体积％或0.4体积％至约0.6体积％或0.7体积％的吡啶，最优选约0.5体积％的吡啶。

在上述系统中，掺杂剂(DAHC、GUA、PYR)各自调节碱盐加合物在所得质谱中的贡献，并促进[M+H]⁺和[M-H]^-分别在正离子和负离子模式中的检测。

在一些情况下，向基质材料中添加所提取的脂质溶液。在这种情况下，脂质溶液优选具有约0.5或1至约10或20μΜ的脂质浓度，以提供最佳质谱质量和再现性。

在其他情况下，将基质材料溶液直接添加到微生物样品中。用于溶解基质材料的溶剂从微生物样品中提取脂质，然后与基质材料形成MALDI样品。这种技术允许所谓的“无目标”脂质提取；即，对MALDI样品板进行脂质提取。这是一个更快的处理工艺，因此允许更高的分析工作量。

在任一种情况下，基质材料相对脂质的摩尔比适当地为约50000：1至约2500：1。

在关于蛋白质被提取和分析的实施方案中，MALDI基质材料适当地选自a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)和阿魏酸(FA)。优选CHCA。

MALDI样品体积优选为约0.5至约1.5μL，最优选约1μL。

优选地，样品是在聚合的或塑料的MALDI样品板上制备的，而不是传统的钢靶(steel target)。这可以最小化背景噪音，尤其是大多数脂质可被检测到的低质量范围(即m/z<1000)的背景噪音。例如，可使用48孔FlexiMass^TM-DS(岛津)靶玻片。

数据采集

可以通过以正离子模式操作(样品的正电离)和/或负离子模式(样品的负电离)操作质谱仪来采集数据。

微生物中的阳离子和阴离子磷脂种类的存在意味着，两种模式对于评估细胞膜中的所有脂质都是必要的。然而，发明人已经发现，单一模式下采集的数据足以获得可靠的结果，并提供一种允许微生物识别的脂质指纹图谱。

基于以下原因，优选负离子模式：

(a)阴离子磷脂在大多数细菌和其它微生物的细胞膜中是普遍的。所得质谱中含有更多的信号，由此允许更容易分析和微生物识别。

(b)脂肪酸(FAs)可以在负离子模式中被检测到，这显著地增加了质谱信息微生物识别质谱信息内容和助剂进行检测。这些被检测为羧酸根阴离子。

FA是脂质的重要结构成分，并且其已经被用于化学分类的目的[16]。额外的信息内容协助区分微生物菌株。

(c)来自污染物的噪音通常是较低的。特别是，本申请发明人发现，来自典型的培养基的污染物(如血液琼脂)含有阳离子磷脂，其在正离子模式可被检测到，而在负离子模式下检测不到。

扫描的m/z范围优选为约100至约3000。这种宽范围允许检测到完整的脂质(通常m/z>500)和脂肪酸残基(m/z通常<500)。因此，该方法的特征在于所述m/z范围包括范围<500，例如约100至<500。更优选的m/z的范围可以是从约200、300、400或450至约1500、1800、2000、2500或2800。在实施方案中，所述m/z范围包括约100至约500约100的范围内，适当地至100至<500，优选约100至约450，更优选约100至约400。

在现有技术的方法中，由于高噪音水平，通常不扫描此范围(m/z<500)内的下限。然而，本申请发明人已发现脂肪酸的检测可以改善质谱的信息内容。

如本文中所讨论的，在蛋白质被提取和分析的实施方案中，本申请所述方法的数据采集步骤包括：为蛋白质信息扫描下述m/z范围，典型地为约2000至20000。典型地，这是作为一个单独步骤完成的，即在MALDI-MS实验，例如，在实施方案中，数据采集步骤包括两个阶段-一个是为脂质(以及优选地还有脂肪酸)扫描m/z范围，一个为蛋白质扫描m/z范围。

通过从相同微生物获取蛋白质和脂质组合物信息(指纹图谱)，借助在此讨论的样品制备技术，可以获得更多的可用于微生物(种和亚种)识别的数据。这可以提供更精确的微生物识别，其结果具有更高的置信水平。

可以结合/合并脂质的质谱数据和蛋白质的质谱数据。这可以将蛋白质和脂质的数据集导出到一个电子表格如Micorsoft Excel和并合并它们来实现。然后可以进行如此处所讨论的聚类和/或其它分析。

在低质量范围内(即m/z<1000)最小化背景噪音，在优选的情况下使用聚合的或塑料的MALDI样品板(而不是传统的金属靶)。

以与背景信号类似的质量范围，检测到质谱中的脂质峰。因此，优选使用高分辨率的仪器和技术。

这样，可以在数据采集步骤中使用下述一个或多个质谱技术：

a)四极离子阱(QIT)

b)飞行时间测量(TOF)

c)反射式飞行时间测量(RTOF)

d)轨道阱质谱

e)傅里叶变换质谱仪(FTMS)

f)串联质谱(MS/MS)。

也可以使用低或高能碰撞诱导解离(CID)来改善脂肪酸FA的信息内容。

通常，这些技术提高了质谱的可再现性，这对实现可靠的微生物识别是非常重要的。它们也可以增加记录的数据点的数量。

这些技术是相对使用简单的，并且具有一个或多个以下优点；

-提高质量准确度；

-提高质谱分辨率；

-降低质谱噪音；

-增加信息内容。

最优选QIT-TOF，使用多级串联质谱(MSn)。

MSn还允许MS1模式的脂质谱和主要在MS2或MS3模式的单独脂质种类的结构解析。

微生物识别

在该步骤中，分析采集的数据采集，以识别或表征微生物菌株。

其可包括与现有的数据库中的数据进行比较。这些库可以包含用于微生物菌株的脂质质量指纹图谱和/或蛋白质质量指纹图谱。

在一些情况下，微生物菌株明确被识别。

在其它情况下，微生物可以根据它的脂质谱并且还优选其蛋白质谱来进行表征。可以预测或确定某些性能，如对抗生素的敏感性和致病性。

微生物培养

在脂质提取之前培养微生物。

已知微生物脂质组成随时间而改变。在微生物被识别或表征的方面，优选所述培养步骤根据如下固定程序进行。

在某些情况下，微生物菌株可以在液体中或在固体培养基上进行培养。或者，它们可以使用血液琼脂或基本培养基(例如LB琼脂)进行培养。血液琼脂为细菌细胞培养基优选的介质，因为它包含了所有必要的营养和细菌生长更快。在这种情况下，优选使用负电离模式，以最小化源自培养基的噪音信号。

在一些情况下，酵母菌株可以在GYP(葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨)的培养基上生长。

在一些情况下，丝状真菌可以在麦芽提取物琼脂上生长。

优选培育期和环境条件优选与用于所得到的任何比较数据的样品培养相同。

培养可以持续一段固定的时间段。这可以是12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或更长的时间。时间的精确长度不是特别重要。

培养过程中，环境条件优选如下；从约15℃或20℃至约25℃或37℃。培养优选发生在空气中。

附图说明

参照附图详细说明本发明的特征，其中：

图1比较了6种不同的有机溶剂(NL＝中性脂质；PL＝磷脂)的相对脂质提取效率。

图2示出了向金黄色葡萄球菌施用三种不同的脂质提取溶剂，在负电离模式下得到的三种脂质MALDI-MS谱(顶部曲线＝Folch，中间曲线＝丙酮，和底部曲线＝甲醇)。

图3示出了采用三种不同基质物质优化对NLs(THAP-Na基质)、阳离子PLs(ATT-DC基质)和阴离子PLs(9AA-GUA基质)的检测而得到的MALDI-MS谱。

图4比较了使用三种不同基质物质在(A)正电离模式和(B)负电离模式下不同脂类所得到的相对信号强度。

图5示出从血液琼脂获得的两种脂质MALDI-MS谱，一个在正电离模式(下部曲线)获得，以及一个在负电离模式(上部曲线)获得。

图6A示出了在负电离模式检测大肠杆菌菌株获得的脂质MALDI-MS谱。这是m/z范围为500-800代表完整PLs数据的MS1质谱。插图示出了在m/z范围为240-310的相同谱显示为FA碎片离子的代表性数据。

图6B示出了图6A中使用的相同的大肠杆菌菌株在m/z范围为688、702和716的三种主要脂类的MALDI-MS/MS谱。该数据通过串联质谱法得到。这些都是MS2谱，其允许单独的脂质被识别。

图7A表明在正离子模式下获得的4种不同微生物的脂质MALDI-MS谱(上部曲线-金黄色葡萄球菌，第二个曲线＝大肠杆菌，第三条曲线＝酵母菌(酵母)，下部曲线＝青霉菌(丝状真菌)。

图7B示出在负离子模式下获得的相同的4种不同微生物的脂质MALDI-MS谱(曲线顺序与图7A相同)。

图8A示出表1中列出的所有微生物基于正离子模式的MALDI-MS的数据的聚类分析。

图8B示出表1中列出的所有微生物基于负离子模式的MALDI-MS的数据的聚类分析。

图9示出了表1中列出的4种大肠杆菌菌株在负离子模式下的MALDI质谱，其显示为(A)m/z范围为240-310和(B)650-800。

图10示出表1中列出的细菌菌株基于负离子模式的MALDI-MS的数据的聚类分析。

图11示出了说明表1中列出的细菌菌株之间相对相关性的最小生成树(MST)。

图12A至C分别表示四个独立的针对以下的MALDI-MS测量的脂质谱，A)在正离子模式中检测NLs，B)在正离子模式检测阳离子PLs，和C)在负离子模式检测阴离子PLs。

图13是“多合一”微生物识别方法的示意图，包括从相同的微生物(细胞培养)制备用于脂质分析的MALDI样品和用于蛋白质分析的MALDI样品，和随后两个样品的MALDI-MS的测量。

图14A显示了革兰氏(-)大肠杆菌DH5D：9AA基质的(-)MALDI-MS谱(上部曲线为超声5-10分钟之后；下部曲线为冷却涡旋之后)。

图14B显示了革兰氏(+)金黄色葡萄球菌：9AA基质的(-)MALDI-MS谱(上部曲线为超声5-10分钟之后；下部曲线为冷却涡旋之后)。

图14C显示了金黄色葡萄球菌：ATT基质的(+)MALDI-MS谱(上部曲线为超声5-10分钟之后；下部曲线为冷却涡旋之后)。

图15显示了肺炎克雷伯菌采用不同提取溶剂的(-)MALDI-MS谱(上部曲线为乙醇；中部曲线为甲醇；和底部曲线为Folch)。

图16示出了肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的蛋白质分型结果，(A)使用本申请的提取方法；和(B)直接使用细胞培养物。

图17示出了不同大肠杆菌菌株的(-)MALDI-MS谱(使用MALDI-QIT-TOF检测)(上部曲线为EPEC E2347，第二曲线为EIEC E35990，第三曲线为12M050679[大肠杆菌完全敏感]，和下部曲线为DH5α大肠杆菌)。

图18示出了(-)MALDI脂肪分型聚类分析(m/z 200-900间选定的峰)。

图19示出了用于酵母和丝状真菌的蛋白质分型结果(Saramis)。

图20示出了不同的酵母和真菌的(+)MALDI-MS谱(使用MALDI-TOF检测)(上部曲线为酿酒酵母；第二曲线为扩展青霉菌；第三曲线为赭曲霉；和下部曲线为出芽短梗霉)。

图21示出了(+)MALDI脂肪型聚类分析。

图22示出了肺炎克雷伯菌在蛋白质m/z范围的MALDI-MS谱，对应于图16的蛋白质分析。

图23示出了大肠杆菌DH5D在蛋白质m/z范围的MALDI-MS谱，对应于图16中的蛋白质分析。

具体实施方式

下面描述的实施例是说明性的，仅作为示例的方式。

方法

微生物的细胞培养物

培养13种不同的细菌种类和菌株(列于表1)。菌株于37℃在哥伦比亚血液(CB)琼脂或基本培养基(LB琼脂，Sigma)、及标准有氧条件下生长过夜(24小时)。

表1：培养的细菌菌株。菌株6a和6b是溶血葡萄球菌和纹带棒状杆菌(C.Striatum)的混合培养物。菌株7和8是抗生素敏感性的，菌株9和10是耐抗生素的和菌株11、12和13是致病性大肠杆菌菌株。基于测定最小抑制浓度(MIC)值，针对17种不同的化合物测试了抗生素抗性。

同样培养9种酵母菌株。它们属于酿酒酵母和库德里阿兹威(氏)酿酒酵母，和在GYP(葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨)介质中在室温(25℃)下生长三天。

也培养丝状真菌(丝孢纲)。属于短梗霉属、曲霉属、青霉属、木霉属、节担菌属(Waliemia)和毛霉菌属的真菌在室温(25℃)下在麦芽提取物琼脂平板中生长一周。

微生物脂质提取

使用三种脂质的提取技术。

在所有三种技术中，在CB琼脂或LB琼脂(Sigma)中在37℃下过夜培养含有纯细胞培养物(～10⁶个细胞)的一个10μΙ塑料环(Nunc)，然后悬浮于500μΙ的双蒸馏水中，立刻涡旋并在微型离心机中以3000g离心3分钟。然后除去上清液，留下细菌细胞团块，并将其悬浮在40μΙ的双蒸馏水中。在进行脂质提取之前再重复一次该过程。

在酵母和丝状真菌的情况下使用相同的步骤。

方法1：甲醇提取

向悬浮的细胞团中添加200μΙ甲醇(Sigma)。然后微生物细胞悬浮液在室温下超声处理5分钟，随后在冰上放置15分钟。然后将悬浮液涡旋几秒钟，在冰上再放置15分钟，以完成脂质提取。然后将所得悬浮液以12000g离心5分钟以沉淀细胞碎片。然后将上清液储存在-20℃直至进行MS分析。

方法2：丙酮提取

向悬浮的微生物细胞团中添加200μΙ丙酮。然后将细菌悬浮液置于冰上30分钟。然后将所得悬浮液在3000g离心3分钟。然后将上清液储存在-20℃直至进行MS分析。

方法2a：甲醇：丙酮提取

测试各种甲醇/丙酮的混合物用于酵母和真菌的脂质提取，结果显示出各种甲醇/丙酮的混合物均适合于提供良好的质谱质量。最好混合物范围为从70:30(体积)至90:10。

方法3：氯仿/甲醇提取

向悬浮的微生物细胞团中添加300μΙ氯仿：甲醇＝70：30(v/v)，然后将其放置在冰上30分钟。然后将75μΙ的0.7M甲酸添加到细胞悬浮液并在冰上放置另外15分钟。然后将细菌悬浮液涡旋几秒钟并置于冰上另外15分钟，以分离成上层水相上部和下层有机相。之后将细胞悬浮液以12000g离心5分钟，用移液管吸出包含被提取的脂质的下相并将其转移至新的样品瓶。最后脂质提取物被储存在-20℃直至进行MS分析。

MALDI样品制备

使用不同脂类特异性共基质系统，以获得MALDI脂质谱。

溶解在包含10mM乙酸钠的丙酮:甲醇(MeOH)＝70:30(v/v)中的2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)用于检测中性脂质(如DAGs、TAGs、DGDCs等等)。

溶解在包含10mM柠檬酸氢二铵(DAHC)的乙醇(EtOH)：水(H₂O)＝90:10(v/v)中的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)用于检测阳离子磷脂(例如PC、SM)。

溶解在包含5mM的盐酸胍(GUA)或0.5％吡啶(PYR)作为基质添加剂的异丙醇：乙腈(ACN)＝60：40(v/v)中的9-氨基吖啶(9AA)用于检测阴离子PLs(如PA、PE、PG、PS、PI、CL)。

将少量体积(如0.3-0.5μΙ)且浓度为10g/L的基质点在MALDI靶表面，紧接着是等体积微生物脂质提取物。该已知的“干滴技术”对于脂质分析而言，是灵活的和完全自动化的点样方法[17]。

FlexiMass^TM-DS(岛津，曼彻斯特，英国)48孔一次性聚合的目标玻片被用作样品支持物，因为它们相对于传统的不锈钢靶板(targets)提供了最佳表现而不会在低质量范围(如m/z<1000)产生任何干扰的背景噪音。

结晶后，将样品插入到MALDI质谱仪，立即使用携带多达四个样品板的特定目标适配器(AXIMA-PrecisionTM，岛津，曼彻斯特，英国)进行分析。

在制备用于蛋白质分析的MALDI样品的情况下，基质的溶液由溶解在包含最终浓度为3％TFA的33/33/33乙腈/乙醇/水的1ml的饱和的CHCA溶液组成。

制备：称取约40毫克的CHCA，将其溶解在包含最终浓度为3％TFA的1mL 33/33/33乙腈/乙醇/水中(预先制备的)。涡旋混合。在室温下，得到饱和溶液；离心或允许任何不溶解的固体沉淀。

分析混合物(脂质+蛋白质颗粒，或仅是蛋白质颗粒)：将1μΙ样品直接转移到MALDI靶，然后添加1μl CHCA基质溶液(见上)。

MALDI分析步骤与脂质分析相同，除了质量范围不同(2000-22000最大值)以及在正离子模式下进行。

MALDI-MS的测量

使用装配有氮激光器(λ＝337nm)和用于直接观察靶表面和研究中的基质的集成单色视频-影像系统(25倍放大倍率)的MALDI-反射-TOF(RTOF)质谱仪(AXIMA-CFR+或AXIMA-Performance，岛津，曼彻斯特，英国)获得MALDI脂质谱。

离子加速电压设为20千伏，以及反射器分析器在25千伏下进行操作。使用峰的基线单一同位素质量分辨率的离子延时引出，在正(+)或负(-)离子模式下进行测量。

根据制造商的额定值(最大功率180)，将激光能量调整到激光辐射阈值以上的10-20％(功率90-100)，由此使用被调整到靶表面上的基质斑点的形态的圆形激光光栅(～500-1000μm直径)。

微生物识别

进行层级聚类分析，基于脂质/蛋白质图谱的不同，使用市售统计软件包DataLab3.5(http://www.lohninger.com/datalab)和BioNumerics 7.1(应用数学，比利时)建立可以显示微生物种类之间的关联性的树状图(dendrogramme)。在DataLab的情况下，使用欧几里德距离度量，并且联杆类型(linkage type)是基于沃德方法。

统计分析前，对MALDI-MS数据进行了处理。首先，将每个单独生物的MALDI数据导出到所谓的包含m/z值和相应的信号强度的“质量名单”至Microsoft Excel 2007。其次，对来自所有样本的m/z值执行升序数据排列，以及从中减去来自培养介质(如CB或LB琼脂)的信号、用于脂质提取的信号管以及基质背景信号(记录自空白样品)。这导致了全部样品中发现的m/z值和相应信号强度的一个数据基质。第三，将每个生物体所有峰的信号强度归一化为信号的总和(即显示为％相对强度)，并导入到用于聚类分析的软件程序。

实施例

实施例1-提取溶剂的比较

图1示出了6种不同的有机溶剂对带电荷的磷脂(PLs)和中性脂质(NLs)的提取效率。提取效率是基于在MALDI-MS谱中相应的脂质种类的信号强度来计算的。

可以看出Folch、MTBE和MeOH溶剂优先允许检测到PLs，而丙酮则有利于NLs的检测。使用DIPE/BuOH时观察到两种脂类具有几乎相等的效率，而己烷的结果最差。

基于这些初步结果，进一步评价Folch、MeOH和丙酮在脂质提取步骤中的应用和在针对来自不同的细菌、酵母和真菌种类的磷脂的MALDI-MS分析。

将这三种溶剂施用于革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)。从图2可以看出，甲醇得到带有最佳信噪比(S/N)的脂质MALDI-MS谱。

实施例2-基质物质的比较

图3示出了包含不同脂质标准品的混合物的相同样本的三种不同的质谱。根据上述的方法，使用不同的基质物质得到质谱。由此可以看出，在负离子模式下，9AA-GUA允许检测到大量峰。这些对应于阴离子磷脂。

也可以看出，ATT和THAP在正离子模式均能返回清晰的谱图。在ATT-DC谱峰对应于阳离子磷脂，以及THAP-Na峰对应于中性脂质。由此可以看出，在正离子模式下，检测到更少的峰。

本申请发明人评估了三种不同的基质物质对于电离生物膜中存在的不同的主PL类的选择度。结果示于图4。

数据显示，在正离子模式下，来自等摩尔PL-混合物的阳离子磷脂(PC和SM)比阴离子磷脂(如PA、PE、PS)更容易被电离和检测到，阴离子磷脂要么没有被检测到要么仅表现出微弱的信号(图2A)。ATT在正电离模式下，在所有磷脂PL范围内的测试中表现出最好的电离。

与此相反，在负离子模式下阴离子磷脂(如PA、PE、PG、PS、PI、CL)容易被检测到，但是PC和SM无法被检测到(图2B)。9AA允许对所有阴离子磷脂几乎相等的检测，而THAP和ATT显示出倾向PG和PS而非其它PL类的电离。

因此，ATT和9AA分别显示出在(+)和(-)离子模式下用于微生物脂质谱的优选基质物质。这些是优选的基质组分。

实施例3-培养介质和电离模式的影响

图5示出了在甲醇脂质提取溶剂存在下，来自血液琼脂的质谱。当在(+)的MALDI模式下而非(-)MALDL模式下测量时，可以在脂质谱质量范围(m/z 700-1500)内看到几个背景峰。

这是因为血液琼脂中含有一些血浆脂质(例如，源自血细胞和脂蛋白)，其为主要的阳离子PL-类(主要为LPC、PC和SM)，和它们因此优先在(+)离子模式下被检测到。

这个问题可以在(+)MALDI模式通过使用基本培养基(没有外源脂质)代替血液琼脂来规避。所得脂质质谱基本上是相同的，但含有较少的培养基污染物。然而，使用基本培养基通常导致不太有利的培养条件，并导致更长的温育时间以获得足够数量的细胞用于分析。该(-)模式允许在培养中使用血液琼脂，同时最小化来自琼脂的信号。

实施例4-脂肪酸检测的

负电离模式允许检测到构成脂质的脂肪酸残基分解产生的羧酸根阴离子。这有助于微生物识别，因为不同的菌株包括不同的FAs。

图6A示出了根据所要求保护的方法用于大肠杆菌菌株得到的脂质MALDl-MS谱。插图示出了7个峰，其被认为是在大肠杆菌的脂质提取物中记录的PL的7种主要FA-残基。

基于羧酸盐离子分配到在MS1模式下记录的脂质谱的特定的峰，在(-)模式下，使用串联质谱计算可检测的所有完整的PL的FA-组合物。

图6B示出通过对来自图6A的质谱中三个最丰富(abundant)的信号(M/Z 688.5，702.5，716.5)进行低能量碰撞诱导解离(CID)分析。

可以清楚地看到，每种MS2谱仅包含一个在MS1模式下测定的选定数量的[RCOO]-离子。基于该信息，可以识别代表三个峰的脂质种类组合物如下所示：

-PE(16:0/16:1(9Z)),PE(17:1(9Z)/15:0)的m/z值为688.5；

-PE(16:0/17:1(9Z)),PE(17:0/16:1(9Z))的m/z值为702.5；和

-PE(6:0/18:1(9Z)),PE(17:0/17:1(9Z))的m/z值为716.5。

这些发现与先前公布的通过(-)LC-ESI-MS/MS获得的大肠杆菌的脂质组成的数据相匹配[18]。然而，MALDl-MS分析更简单，并可以更快地执行。

然而，应该指出的是，FA-残基的确切结构(例如包括链支化、环化或双键的位置)不能使用低能量的CID(例如cy17:0和17:1之间的区别)阐明。为了得到该信息，使用允许高能量的MALDI-CID-MS/MS的仪器是必要的[19]。

实施例5-谱的可再现性

通过对属于酿酒酵母和库德里阿兹威(氏)酿酒酵母的9种不同的酵母菌株根据所要求保护的方法获得MALDI质谱图。

酿酒酵母的脂质组成是众所周知的[20]。因此，可以将通过不同质谱得到的峰容易地分配到特定的脂质。

MALDI脂质谱中单个种类的可再现性测量为相对信号强度变化(RSIV)，所述RSIV是在(+)和(-)MALDI模式下，使用THAP、ATT和9AA基质从同一生物制备的4个独立样品中记录到的Nls和PLs的单个峰的变化系数(CV)测定的。参见图12A到12C。

-与酿酒酵母的主要二酰甘油(DAG)和三酰甘油(TAG)分子种类相关的14个峰代表的NL-谱的RSIV显示平均CV值为10.4±5.2。

-与主要溶血磷脂酰胆碱(LPC)和磷脂酰胆碱(PC)的分子种类相关的25个峰代表的阳离子PL-谱的RSIV显示平均CV值为13.2±7.9。

-与主要磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇相关的24个峰代表的阴离子PL-谱的RSIV显示平均CV值为15.8±10.8。

这些数据是在常规分析系统误差的范围内。因此，该谱是高度可再现的，并且所要求保护的方法满足可靠地用于微生物诊断的要求。

实施例6-4种不同的微生物种类的分化

对4种微生物进行甲醇脂质提取。这些是：

1.金黄色葡萄球菌-革兰氏阳性菌

2.大肠杆菌-革兰氏阴性菌

3.酵母菌-酵母

4.青霉菌-丝状真菌

单独将每个脂质提取物添加到ATT基质中，并在正离子模式下得到MALDI-MS谱。结果示于图7A。

单据将每个脂质提取物添加到9AA基质中，并且在负离子模式下得到MALDI-MS谱。结果示于图7B。

对MALDI质谱的目视检查清楚地表明，微生物可以被区分。记录在m/z400-1000之间(最多1500，在负离子模式下)的包括60-80种选定的脂类相关的峰基于(+)和(-)MALDI脂质谱数据的聚类分析，显示了不同微生物物种之间良好的区分。参见图8A和8B。

基于聚类分析的不同微生物分类，其(+)和(-)MALDI模式下的脂质谱是基本相同的。这一观察表明只使用一种电离模式的对于可靠地区分微生物是足够的。

实施例7-在菌株水平的细菌区分

大肠杆菌代表一种与属于“肠杆菌”科的其他种(如肠杆菌属，志贺氏菌，沙门氏菌，克雷伯氏菌属等)关系紧密的革兰氏阴性菌的不同组，，其通常居住在温血生物体(例如，不同的哺乳动物物种包括人类)的肠道。

根据上述方法分析表1中列出的13种细菌，包括抗生素抗性、抗生素敏感性和致病性大肠杆菌菌株。

图9显示了四种大肠杆菌在m/z范围为240-400和650-800的MALDI质谱。

MALDI-MS谱之间的差异是非常明显的。特别是，菌株#7和#8(即对抗生素敏感的两个)的图谱与菌株#11和#13(即耐药株)的图谱明显不同。

通过观察MALDI-QIT-TOF-MS/MS的FA图谱(即基于[RCOO]-离子的检测)(图9A)，表明，这些差异主要归因于17:1(cy17：0)和18：1的不同内容，其代表由圆圈指出的在m/z 702和716(图9B)处峰的主要FA残基。

表1中列出的所有物种的聚类分析显示了以下两大主要群体的区分；

(1)革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(#1)，表皮葡萄球菌(#3)，及溶血葡萄球菌和纹带棒状杆菌的混合培养物(#6)；和

(2)革兰氏阴性肠杆菌与大肠杆菌三个子群集及相关物种(例如，铜绿假单胞菌和粪肠球菌)。

见图10。

由此，抗生素敏感株(#7)可以清楚地分别从抗生素抗性株(#9、#10)与致肠病菌株EIEC(#11)、EAEC(#12)和EPEC(#13)中区分。

在聚类分析中，更远处的簇中发现完全敏感性致肾盂肾炎(UPEC)大肠杆菌12M050679菌株(#8)和铜绿假单胞菌和粪肠球菌。

使用其他软件工具(BioNumerics)对同一数据集也进行聚类分析，结果非常相似。这表明，该方法是稳健的。

在所谓的“最小生成树”(MST)的形式显示的结果，表明我们的研究中分析的不同细菌的相对关联性(见图11)。

其他实施例及分析

图13显示了“多合一”微生物识别方法(相同微生物的脂质指纹图谱和蛋白质指纹图谱)，其利用快速单步提取(～5-10分钟，取决于细胞壁结构的刚性)，以及使用甲醇或乙醇和超声波降解。由此，形成亲水性和疏水性分子(即主要是细胞蛋白质和膜脂质)的均匀悬浮液。这使得允许通过使用最合适的MALDI基质系统(即CHCA用于蛋白质；ATT或9AA用于脂质)及在正和/或负离子模式下的MALDI-MS分析同时分析蛋白质和脂质，。最后，将获得的MS数据使用生物信息学软件工具(例如，多变量数据分析)从数据库中进行检索。

相比已知的用于细胞提取的方法(例如Bruker)，其耗时少且灵敏，因为它可以避免充分洗涤、提取、干燥和重悬，其会带来样品流失和修饰的风险(例如人工氧化和降解)。

通过将分析的有效质量范围从2-20kDa扩大到0.2-20kDa，并包含不同类型的分子(如蛋白质和脂质)的信息内容，这种方法相对于仅仅聚焦于蛋白质模式识别(即MALDI蛋白质分型)的现存方法具有显著的改善。

图14和15示出了通过MALDI-MS用于分析细菌脂质的单步提取的提高。使用超声提取方法，可以在比传统方法更短的时间内获得来自革兰氏阴性(图14A)和革兰氏阳性(图14B)的高质量质谱(5分钟超声vs冰上涡旋30分钟)，使得该方法更适合于日常工作(例如，在临床实验室)。此外，可以检测到额外的脂质种类(例如来自金黄色葡萄球菌的赖氨酰-PG)，这增加了分析的信息内容。例如甲醇或乙醇的使用提高了质谱的质量(图15A和15B)，并相比用于脂质提取的传统溶剂(例如氯仿)，其降低了背景信号(例如，“塑料峰”)的贡献(图15C)。

图16至图18表明“多合一”方式对于细菌识别的优点。图16显示了不同大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的SARAMIS搜索结果。可以看出，基于％ID和数据计数(评分)的使用单步提取方法((A)蓝色、顶部集、提取＝甲醇)的确认水平相比来自培养板的直接细胞分析((B)红，底部集)基本上更高。在肺炎克雷伯菌包含相比大肠杆菌更为刚性的细胞壁的情况下，差异尤其明显。这清楚地表明我们蛋白分型方法的优势。使用另外的基于在负离子模式下检测脂肪酸(即羧酸根阴离子)和完整的磷脂(PLs)的脂质谱的信息内容(图17)，可以得到基于聚类分析的大肠杆菌菌株的清晰分类(图18)。这允许区分两种致病(红色上部框EIECE35990，和第三框EPEC E2347)和非致病性(黑色第二个框12M050679大肠杆菌完全敏感性，和下框DH5阿尔法大肠杆菌)菌株，而基于单独的蛋白分型(SARAMIS)则无法实现该区分(图16)。

这证明了MALDI脂质分型(lipotyping)对于识别关系紧密的的细菌种类提供了附加值。

图19至21表明“全合一”方式对于真菌识别的优点。图19显示了不同酵母和丝状真菌的SARAMIS搜索结果。可以看出，确认水平(列标题为“％”)(甚至在从细胞提取蛋白质后)要么非常差要么在许多情况下没有有用的用于识别的质谱。这表明了蛋白质分型用于识别酵母菌特别是丝状真菌的一般问题，与大多数细菌相比所述丝状真菌包含更刚性的细胞壁结构。相反，在正离子模式下使用脂质谱，随后是单步提取方法(图20)，可以得到酵母(例如酵母属)和不同的丝状真菌(例如曲霉属、青霉属、木霉属等等)的的良好区分(图21)。

图22和23示出了对应于图16的蛋白质分析的样品的蛋白质m/z范围。良好信噪比和峰值分辨率有助于高置信水平(图16的％值)。

关于将给定微生物的脂质组分和蛋白质组分的质谱数据进行合并，本申请发明人已获得酿酒酵母的蛋白质质谱(使用CHCA基质)和相同的微生物的脂质质谱(使用ATT基质)，然后结合/合并它们。具体地，通过合并m/z范围从500至900的脂质数据和m/z范围从2000到15000的蛋白质数据，得到m/z范围从500到15000的合并数据集。基于此合并的质谱数据的聚类分析，可以使得菌株水平的识别。

这些结果证明了结合脂质和蛋白质提取的优点，以及用于识别真菌的分析方法的优点。在这个和其他情况下(例如细菌和真菌孢子、分枝杆菌、脂包膜病毒等)，其中常规蛋白质分型因为缺乏适当的蛋白质提取和/或缺乏信息蛋白图谱而妥协，MALDI脂质分型(lipotyping)显示出其具有作为微生物识别的新的独立的工具的潜力。

参考文献：

以上引用了很多出版物，以便更充分地描述和公开本发明以及与本发明有关的现有技术状态。以下提供了这些参考文献的完整引用。将每个这些参考文献的全部内容全部并入本文。

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Claims

1.一种识别微生物菌株的方法，该方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取磷脂；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质提取步骤包括从微生物中提取蛋白质，所述样品制备步骤包括制备另一个结合有所提取的蛋白质的MALDI样品，所述数据采集步骤包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以获得关于脂质组成的质谱数据和关于蛋白质组成的数据；以及其中在所述脂质提取步骤中，将有机提取组合物添加到微生物中。

3.一种分析微生物的方法，所述方法包括：

ⅰ)脂质提取步骤，包括向微生物中添加提取组合物以提取脂质，其中所述提取组合物包含大于50体积％的醇或大于50体积％的醚；

iii)数据采集步骤，包括对MALDI样品进行基于MALDI的质谱分析。

4.根据权利要求3的方法，其中所述脂质提取步骤包括从微生物中提取蛋白质，所述样品制备步骤包括制备另一个结合有所提取的蛋白质的MALDI样品，所述数据采集步骤包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以获得关于脂质组成的质谱数据和关于蛋白组成的质谱数据。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中提取组合物包括大于70体积％的醇。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述脂质提取步骤中提取磷脂，适当地，其中所述脂质提取步骤中进一步提取中性脂质。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中有机提取组合物包含大于50体积％的醇，以及所述醇体积包含甲醇或由甲醇组成。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述有机提取组合物包含体积比为70:30至90:10的甲醇/丙酮混合物。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在数据采集步骤中，所述样品被负电离。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在样品制备步骤中，所制备的MALDI样品包括9AA基质材料，和可选地，所述样品还包括吡啶。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在数据采集步骤中，所述样品被正电离，以及在样品制备步骤中，所制备的MALDI样品包含ATT基质材料，可选地，所述样品还包括柠檬酸氢二铵。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在数据采集步骤中，在MS1谱中得到m/z范围在约100至约3000上的数据。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在数据采集步骤，所述基于MALDI的质谱采用以下一种或多种技术；

a)四极离子阱(QIT)；

b)飞行时间测量(TOF)；

c)反射式飞行时间测量(RTOF)；

d)轨道阱质谱；

e)傅里叶变换质谱仪(FTMS)；

f)串联质谱(MS/MS)；和

g)碰撞诱导解离。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在样品制备步骤中，样品在聚合的或塑料的MALDI样品平板中制备。

15.一种分析微生物的方法，所述方法包括；

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取脂质；

其中，所述脂质提取步骤包括向微生物中添加甲醇溶液或甲醇/丙酮组合物，和/或

所述样品制备步骤包括向所提取的脂质中添加9AA或ATT基质材料，和/或

在所述数据采集步骤中，在MS1谱中扫描的m/z范围为约100至约3000。

16.根据权利要求15的方法，其中所述脂质提取步骤包括从所述微生物中提取蛋白质，所述样品制备步骤包括制备另一个结合有所提取的蛋白质的MALDI样品，可选的包括向所提取的蛋白质中添加CHCA基质材料，以及所述数据采集步骤包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以获得关于脂质组成的质谱数据和关于蛋白质组成的质谱数据。

17.根据权利要求3-16中任一项所述的方法，进一步包括微生物识别步骤，包括将所述质谱数据与已知值进行比较，以表征或识别微生物。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌。

19.一种分析非细菌微生物的方法，该方法包括；

ⅰ)脂质提取步骤，包括从所述微生物中提取脂质；

ⅲ)数据采集步骤，包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析。

20.根据权利要求19的方法，其中所述脂质提取步骤包括从所述微生物中提取蛋白质，所述样品制备步骤包括制备另一个结合有所提取的蛋白质的MALDI样品，可选地，包括向所提取的蛋白质中添加CHCA基质材料，以及所述数据采集步骤包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以获得关于脂质组成和关于蛋白质组成的质谱数据。

21.一种分析微生物的方法，该方法包括；

ⅰ)脂质提取步骤，包括从微生物中提取脂质；

ⅲ)数据采集步骤，包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，其中在所述数据采集步骤中，所述样品被负电离。

22.根据权利要求21的方法，其中所述脂质提取步骤包括从所述微生物中提取蛋白质，所述样品制备步骤包括制备另一个结合有所提取的蛋白质的MALDI样品，可选地，包括向所提取的蛋白中添加CHCA基质材料，以及所述数据采集步骤包括对MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以获得关于脂质组成和关于蛋白质组成的质谱数据。

23.一种分析微生物的方法，该方法包括；

ⅰ)提取步骤，包括从微生物中提取脂质和蛋白质；

ⅲ)数据采集步骤，包括对一个或多个MALDI样品执行基于MALDI的质谱分析，以便获得微生物的脂质组成和微生物的蛋白质组成的质谱数据。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述脂质的质谱数据和所述蛋白的质谱数据被合并，以及所述方法包括iv)微生物识别步骤，其包括分析合并的质谱数据以表征或识别微生物菌株。

25.一种组件试剂盒，部分包括

(ⅰ)MALDI基质材料，和任选的共基质材料

(ii)样品板，

(ⅲ)阳离子和阴离子磷脂标准品的校准混合物，和

(ⅳ)用于完成根据权利要求1-24中任一项所述的方法的指令。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中

所述基质材料选自ATT、THAP和9AA，以及可选的共基质材料选自DAHC、GUA和醋酸钠或醋酸锂，和/或

包括一个或多个的样品板，其中每个都是48孔靶玻片，和/或

包括用于脂质提取和/或基质材料溶解的有机溶剂。