KR102374464B1 - Maldi-tof를 통한 미생물의 특징 분석 방법 - Google Patents

Maldi-tof를 통한 미생물의 특징 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MALDI로서 공지된 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 질량 분석법 기술을 사용하는 질량 분석법에 의해 적어도 하나의 항미생물제의 존재하에 적어도 하나의 미생물 집단의 적어도 하나의 특징분석을 수행하기 위해 분석판의 특징분석 영역을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 다음 단계들을 연속적으로 포함한다: -　MALDI 기술에 의한 특징분석을 위해, 항미생물제를 수반하는 적어도 하나의 분석 영역을 포함하는 분석판을 제공하는 것으로 이루어진 단계; -　적어도 하나의 미생물 집단을, 상기 항미생물제와 접촉된 상기 분석 영역 상으로 침적시키는 단계; -　존재하는 항미생물제 및 미생물이 상호작용하도록 하는 조건하에 그리고 이를 위해 충분한 시간 동안 분석판을 보존하는 것으로 이루어진 항온처리 단계; 및 -　MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 분석 영역 상으로 침적시키는 단계. 본 발명은 이와 연관된 특징분석 및 기능성화 방법, 분석판 및 용도에 관한 것이다.

Description

MALDI-TOF를 통한 미생물의 특징 분석 방법{CHARACTERIZATION OF MICROORGANISMS VIA MALDI-TOF}
본 발명은 미생물학 분야에 관한 것이다. 보다 정확하게는, 본 발명은 질량 분석법, 및 특히 MALDI-TOF로서 공지된 매트릭스-보조 탈착-이온화 앤드 비행 시간(matrix-assisted desorption-ionization and time of flight)에 의한 질량 분석법(MS)을 사용한 적어도 하나의 미생물 집단을 특징 분석하는 방법에 관한 것이다.
수년 동안, 상기 MALDI-TOF 기술은 종 수준으로 미생물의 신속한 동정(identification)을 수행하기 위해 사용되어 왔다. 상기 유형의 특징분석에 적합한 다양한 유형의 기구들이 본 출원인에 의해 그리고 또한 특히 제조원(Bruker Daltonics 및 Andromas)에 의해 시판되고 있다.
미생물은 미생물의 과(family), 속(genus) 및 통상적으로 종(species)을 동정하기 위해 미생물에서 가장 풍부한 단백질의 MALDI-TOF 스펙트럼을 참조 데이타와 비교함에 의해 동정된다. 통상적으로, 사용되는 프로토콜은 미생물 집단의 적어도 일부를 MALDI 판(plate) 상에 침적시키는 단계, MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 부가하는 단계, 질량 스펙트럼을 취득하는 단계, 데이타베이스에 저장된 표준 데이타와 비교함에 의해 종을 동정하는 단계를 포함한다.
보다 최근에, MALDI 기술은 또한 항생제에 대한 미생물의 내성을 검출하기 위해 그리고 특히 베타-락타마제 유형 효소 및 특히 카바페네마제(carbapenemase) 유형의 분비로 인한, 베타-락탐 유형 항생제의 가수분해에 관여하는 표현형(phenotype)을 동정하기 위해 사용되어 왔다. 이와 관련하여 US 2012/0196309 및 WO 2012/023845 출원이 언급될 수 있다. MALDI-TOF에 의한 내성의 특징분석은 베타-락타마제를 생성할 수 있는 미생물을 함유할 수도 있는 베타-락탐 항생제의 샘플에 의하여 항온처리한 후 베타-락탐 항생제의 가수분해된 형태의 검출 및/또는 이의 고유 형태 상실의 검출 단계를 포함한다.
침적될 샘플의 제조가 상기 특허 출원에서 상세히 기재되어 있지 않지만, 일반적으로 미생물을 미리 항생제와 혼합하고 이어서 상기 혼합물을 MALDI 판 상에 침적시키거나 미생물(들)의 용해물이 사용되는 것으로 고려된다(문헌참조: WO 2012/023845, 특히, 청구항 15).
문헌 WO 2013/113699는 베타-락타마제에 대한 물질의 억제 효과를 평가하기 위해 질량 분석법을 사용함을 고려하고 상기 평가는 세균의 존재하에 수행될 수 있다.
다음의 공보(Hrabak, Walkova et al. 2011, Hooff, van Kampen et al. 2012, Hrabak, Studentova et al. 2012, Sparbier, Schubert et al. 2012)는 샘플을 제조하기 위해 수행될 프로토콜을 보다 상세하게 기재하고 있고 상기 프로토콜은 하기의 단계를 포함한다:
-　미생물의 집단을 포함하는 접종물(inoculum)을 제조하는 단계;
-　상기 접종물을 원심분리하는 단계;
-　세균 펠렛을 가수분해 시약의 존재 또는 부재하에 항생제 용액으로 재현탁시키는 단계;
-　30분 내지 3시간의 기간 동안 항온처리하는 단계;
-　원심분리하는 단계; 및
-　1 마이크로리터의 상등액을 MALDI 판 상으로 이동시키고 1 마이크로리터의 매트릭스를 부가하고 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 분석하는 단계.
따라서, MALDI-TOF 기술에 의해 내성을 검출하기 전 샘플을 제조하는 것은 길고 성가시다. 실제로, MALDI-TOF 기술에 의해 내성을 검출하기 위해 사용되는 과정은 고농축 단계 및/또는 하나 이상의 원심분리 단계에 의하여 접종물을 제조하는 것이 필요하다. 이들 단계는 재료, 소모품 및 특정 기구를 필요로 하고 따라서 소비자는 소모품 및 시간 및 운영자 전문지식을 가져야 한다. 추가로, 상기 유형의 사전 제조는, 다수의 샘플의 특징분석을 수행하는 것이 하루에 예상될 수 없다는 것을 고려하면, 내성 검출을 위해 MALDI-TOF 기술을 통상적으로 사용하는 것을 어렵게 한다. 사실, MALDI-TOF 기술에 의한 내성 현상의 동정을 수행하기 위한 기구의 유용성과 의무적인 제조 단계 후 수득되는 샘플의 유용성 간에는 흔히 부조화가 있다. 또 다른 문제점은 세균을 10μL 내지 50μL 정도의 용적의 항생제로 항온처리한다는 사실인데, 이는 효소-항생제 상호작용을 감소시키는 잠재적 고위험을 유발하게 된다. 그 결과, 효소적 활성의 효능에서 감소될 수 있는데, 이는 특히 소량의 효소를 생성하거나 분비하는 것으로 공지된 미생물의 경우에 검출의 민감성 및 이에 따른 기술의 응용성(robustness)에 영향을 주게 될 것이다.
항미생물제에 대한 내성의 검출은 또한 출원 WO 2011/045544 및 US 2012/0196309에 기재되어 있고, 여기서는 질량 분석법-질량 분석법(MS-MS) 및 다중 반응 모니터링(MRM)과 같은 다른 질량 분석법 기술을 사용하여 수행될 수 있는 것이다. 이러한 상황하에, 질량 분석법에 이어서 이온화에 의한 분석은 미생물에 대해서 수행되는 것이 아니라 다양한 정제 조작 후 수득된 단백질에 대해 수행된다.
본 발명의 맥락과 관련하여, 본원 발명자는 MALDI 기술에 의해 미생물을 특징분석하기 위해 특징분석 영역을 제조하는 신규 방법을 수행하는 것을 제안하고, 상기 방법은 항생제에 대한 내성을 동정하기 위해 사용될 수 있고 단순하게 수행될 수 있다. 추가로, 상기 신규 방법은 특징분석 영역(characterization zone), 항생제에 대한 내성을 동정하는 것에 상응하는 적어도 하나의 영역, 및 미생물을 동정하는 것에 상응할 수 있는 또 다른 하나의 영역에 존재하는 샘플의 다양한 특징분석을 행하는 것이 적합하다.
따라서, 본 발명은 MALDI-TOF 기술을 사용하여 적어도 하나의 미생물을 함유하는 샘플을 특징분석하는 방법을 제공하며, 이는 존재하는 미생물 집단이 적어도 하나의 항미생물제에 내성인지 아닌지를 수시간 내지 1시간 또는 심지어 그 미만의 비교적 단기간 내에 구별하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 항미생물제의 존재하에 적어도 하나의 미생물집단의 적어도 하나의 특징분석을 수행하기 위해 분석판(analysis plate)의 특징분석 영역을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 특징분석은, 분석 영역 상에 침적된 적어도 하나의 미생물 집단이 MALDI로서 공지된 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry)기술에 따라 상기 분석 영역을 레이저 빔으로 포격시킴에 의해 적어도 하나의 이온화 단계를 진행하는 동안에 질량 분석법에 의한 분석을 포함하고;
상기 분석 영역을 제조하는 방법은 하기의 단계를 연속으로 포함함을 특징으로 한다:
-　MALDI 기술에 의한 특징분석을 위해, 항미생물제를 수반하는 적어도 하나의 분석 영역을 포함하는 분석판을 제공하는 것으로 이루어진 단계;
-　적어도 하나의 미생물 집단을, 상기 항미생물제와 접촉된 상기 분석 영역 상으로 침적시키는 단계;
-　존재하는 항미생물제 및 미생물이 상호작용하도록 하는 조건하에 그리고 이를 위해 충분한 시간 동안 분석판을 보존하는 것으로 이루어진 항온처리 단계; 및
-　MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 분석 영역 상으로 침적시키는 단계.
바람직하게, 본 발명에 따른 제조 방법과 관련하여, 특징분석될 단일 미생물 집단이 침적된다. 이어서, 상기 특징분석 영역은 단일 미생물을 특징분석하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, 침적된 미생물(들) 집단은 항미생물제와의 사전 접촉 단계 없이 제조되고, 즉 침적된 미생물(들) 집단은 침적되기 전 특징분석 영역 상에 존재하는 항미생물제와 혼합되지 않는다.
본 발명에 따른 방법은 농축 단계, 집적 단계 및/또는 정제 단계 후 수득된 미생물(들) 집단 및/또는 적합한 배지, 특히 겔 배지 상에서의 성장 후 수득된 집단 또는 집단 분획에 상응하는 집단에 대해 유리하게 수행된다.
예를 들어, 본 발명과 관련하여, 상기 항미생물제는 베타-락타마제의 생성 및 특히 카바페네마제의 생성으로 인한 내성을 식별 가능하게 하는 방식으로 선택된다.
상기 항미생물제는 통상적으로, 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신, 카바페넴, 및 모노박탐으로부터 바람직하게 선택되고, 특히, 암피실린, 아목시실린, 티카실린, 피페라실린, 세팔로틴, 세푸록심, 세폭시틴, 세픽심, 세포탁심, 세프타지딤, 세프트리악손, 세프포독심, 세페핌, 아즈트레오남, 에르타페넴, 이미페넴, 메로페넴 및 파로페넴으로부터 선택되는 항생제이다.
본 발명에 따른 제조 방법은 MALDI 기술에 의한 특징분석을 위해, 기능화된 영역으로 호칭되는 항미생물제를 수반하는 적어도 하나의 분석 영역을 포함하는 분석판을 수득하기 위해 기능화 단계(functionalization step)를 포함할 수 있고, 상기 기능화 단계는 바람직하게 항미생물제의 수용액을 침적시키는 단계에 이어서 건조시키는 단계에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 미생물 집단을 특징분석하는 방법에 관한 것으로서, 상기 특징분석은 적어도 하나의 항미생물제에 내성인 미생물 집단의 존재 또는 다른 사항을 결정하는 단계를 적어도 포함하고;
상기 방법은 이것이 연속으로 하기의 단계들을 포함함을 특징으로 한다:
-　본 발명의 제조 방법에 따라 분석판의 적어도 하나의 특징분석 영역을 제조하는 단계;
-　항미생물제에 내성인 미생물 집단이 상기 특징분석 영역 상에 존재하는지의 여부를 결론지을 수 있도록 하기 위해, MALDI-TOF로서 공지된 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry)을 사용하여 상기 특징분석 영역 상에 침적된 미생물 집단을 적어도 1회 분석하는 단계.
특히, 항미생물제에 내성인 미생물 집단이 특징분석 영역 상에 존재하는지의 여부를 결론짓기 위한 MALDI-TOF 기술에 의한 질량 분석법 분석은 항미생물제의 존재 및/또는 항미생물제의 분해 생성물의 존재를 입증하는데 있다.
유리하게, 본 발명에 따른 특징분석하는 방법은 적어도 2개의 특징분석을 포함한다. 특히, 상기 특징분석은 상기 특징분석 영역 상에 침적된 미생물 집단의 과, 속 또는 바람직하게 종을 동정하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 특징분석하는 방법은 다음을 포함한다:
ㆍ　특징분석 영역을 이온화시키는 제1 단계에 상응하는 MALDI 유형 질량 분석법에 의해 제1 분석을 수행하고 상기 분석을 위한 제1 보정을 사용하여 특징분석 영역 상에 침적된 미생물 집단의 과, 속 또는 바람직하게 종을 동정하는 단계; 및
ㆍ　동일한 특징분석 영역을 이온화시키는 제2 단계에 상응하는 MALDI-TOF 기술을 사용하는 질량 분석법에 의한 제2 분석을 수행하고 상기 분석을 위한 제2 보정을 사용하여 항미생물제에 내성인 미생물 집단의 특징분석 영역 상에 가능한 존재를 결정하는 단계.
상기 상황하에, 미생물 집단의 과, 속 또는 바람직하게 종을 동정하고 항미생물제의 가능한 존재를 결정하는 단계는 바람직하게는 동일한 미생물과 관련된 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 미생물 집단을 특징분석하는 방법을 제공하고, 상기 특징분석은 적어도 다음 단계들을 포함하고:
-　미생물(들) 집단, 항미생물제 및 MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 포함하는 특징분석 영역을 이온화시키는 제1 단계에 상응하는 MALDI 기술을 사용하는 질량 분석법에 의한 제1 분석을 수행함에 의해, 미생물 집단의 과, 속 또는 바람직하게 종을 동정하는 단계;
-　적어도 하나의 미생물 집단, 항미생물제 및 MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 포함하는 특징분석 영역을 이온화시키는 제2 단계에 상응하는 MALDI 기술을 사용하는 질량 분석법에 의한 제2 분석을 수행함에 의해, 적어도 하나의 항미생물제에 내성인 미생물 집단의 존재를 결정하는 단계;
상기 방법은 다음을 특징으로 한다:
-　상기 제1 분석 및 제2 분석은 각각 적어도 하나의 미생물 집단 및 항미생물제를 포함하는 동일한 특징분석 영역을 이온화시키는 독특한 제1 단계 및 독특한 제2 단계에 의해 수행되고;
-　상기 제1 분석은 제1 보정을 사용하고, 그리고 제2 분석은 제1 보정과는 상이한 제2 보정을 사용한다.
바람직하게, 침적된 집단은 특징분석될 단일 미생물을 포함한다.
상기 유형의 특징분석하는 방법은 바람직하게는, 본 발명에 따른 분석판의 특징분석 영역을 제조하는 방법을 사용한다.
본 발명과 관련하여, 동일한 특징분석 영역 및 동일한 미생물(들) 집단은 연속적으로 2개의 이온화를 진행하여 2개의 목적하는 특징분석을 수득한다: 항미생물제에 대한 미생물 내성 현상의 특징분석 및 미생물의 동정. 본 발명은 또한 MALDI 기술에 적응된 분석판의 분석 영역을 기능화하는 방법을 제공하고, 상기 분석 영역을 기능화하는 방법은 다음을 포함함을 특징으로 한다:
-　분석 영역을 기능화하여 항미생물제를 수반하는 분석 영역을 제조하기 위한 단계.
상기 기능화 단계는 항미생물제의 수용액을 침적시키는 단계에 이어서 건조시키는 단계에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 MALDI 기술에 따른 질량 분석법에 의한 분석 영역 상에서 특징화될 적어도 하나의 미생물 집단을 수용하도록 의도된 분석판을 제공하고, 상기 판은 분석판의 상기 분석 영역 상에, 특히 고체 침적 형태로, 침적된 항미생물제를 포함하여, 기능화된 것으로 일컬어지는 분석 영역을 형성하는, 단계를 특징으로 한다. 특히, 상기 유형의 분석판에서, 항미생물제를 수반하는 기능화된 분석 영역(들)은 MALDI 기술에 의해 검출가능한 양으로 미생물을 포함하지 않고/않거나 항미생물제를 수반하는 상기 기능화된 분석 영역(들)을 건조시킨다.
용어 "건조된"은 특히 상기 항미생물제가 용액 중에 있지 않고 이의 위에 침적되는 분석 영역에 부착되어 있는 고체 침적 형태로 존재함을 의미한다. 특히, 기능화된 것으로 일컬어지는 분석 영역 상에 항미생물제를 유지하는 것은 정전기 결합, 이온 결합, 공유 결합, 친화성 결합 또는 실제로 접착제에 의해 성취될 수 있다. 특히, 상기 접착제는 수용성인 중합체일 수 있다. 언급될 수 있는 분석 영역 또는 영역들 상에 항미생물제를 고정화하기 위해 사용될 수 있는 접착제의 예는 헵타키스(2,6-디-O-메틸)-β-사이클로덱스트린이다.
특정 양태에서, 특징분석될 적어도 하나의 미생물 집단을 수용하도록 의도된 분석판에서, 상기 기능화된 분석 영역 또는 각각의 기능화된 분석 영역은 단일 항미생물제를 수반한다.
본 발명에 따라 적어도 하나의 미생물 집단을 수용하기 위한 분석판은 밀폐적으로 밀봉된 포장재(packaging)에 포장될 수 있다. 특히, 밀폐적으로 밀봉된 포장재는 빛 및 수분으로부터 판을 보호하기 위해 적합할 수 있다.
상기 기능화된 분석 영역(들)은 항미생물제의 수용액을 침적시키는 단계에 이어서 건조시키는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 유형의 판은 다수의 기능화된 분석 영역을 포함할 수 있고, 이의 각각은 항미생물제를 수반하는, 특히, 제1 항미생물제를 수반하는 적어도 제1 기능화된 분석 영역, 및 제1 항미생물제와는 구분되는 제2 항미생물제를 수반하면서, 상기 제1 분석 영역과 구분되는, 제2 기능화된 분석 영역을 포함할 수 있다.
통상적으로, 상기 유형의 판은 참조 미생물(reference microorganism) 집단을 후속적으로 수용하도록 의도된 적어도 하나의 참조 분석 영역(reference analysis zone)을 포함하고, 여기서 참조 분석 영역의 표면은 항미생물제가 없다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 특징분석하는 방법에서 본 발명에 따른 분석판의 용도를 제공한다.
하기의 기재 사항은 첨부된 도면을 참조로 하여, 본 발명의 보다 양호한 이해를 위한 것이다.
도 1은 MALDI 판의 도식적 평면도이다.
도 2 내지 4는 MALDI-TOF 기술에 의한 실시예에서 수득된 질량 스펙트럼이다. 이들 도면에서, 상기 강도 스케일은 스펙트럼의 가장 강한 피크를 참조로 하는 상대적 스케일이다. 하나의 예로서, 선택된 질량 범위(특히, 200 m/z 내지 1200　m/z)에서, 가장 강한 피크가 100　mV인 경우, 이것은 100 %로서 지칭된다(스펙트럼의 좌측면상에 언급된 바와 같이). 덜 강한 피크는 가장 강한 피크에 상대적으로 지칭된다: 따라서, 75 mV의 강도를 갖는 피크는 스케일의 75 %에 이른다(100 mV의 최대 강도 피크를 함유하는 스펙트럼 상에서). 결과로서, 동일한 스펙트럼에 대해, 균주 간의 피크의 강도 수준은 비교될 수 없다. 반면에, 이들 스펙트럼은 하나의 균주 및 동일한 균주에 대해 사용되어 항미생물제의 본래의 피크와 이의 분해 생성물의 본래의 피크 간의 강도를 비교할 수 있다. 또한 하나의 균주 및 동일한 균주에 대해 본래의 또는 가수분해된 피크와 시험될 미생물의 생물학적/효소적 활성에 의해 유도된 변화에 구애받지 않는 대조군 피크 간의 강도를 비교할 수 있다. 하기의 피크: HCCA 매트릭스의 피크, 펩타이드의 피크 또는 상기 매트릭스에 부가되거나 이미 상기 분석 영역 상으로 건조된 참조 분자의 피크는 대조군 피크로서 고려될 수 있다.
도 5는 접종 루프로 스크레이핑(scraping) 하기 전후에, 접착제(헵타키스)의 존재 및 부재하에, 항생제인 파로페넴이 침적된 분석 영역(스팟)의 외형을 보여준다.
도　6은 [헵타키스]/[파로페넴] 비율의 함수로서 HCCA의 대조군 피크와 비교하여, MALDI-TOF 기술에 의해 수득된, 본래의 파로페넴 및 가수분해된 파로페넴의 피크 강도의 비율에서의 변화를 보여준다.
도 7은 실시예 5의 제2 시리즈의 취득 동안에 수득된 질량 스펙트럼을 제공한다.
도 8은 실시예 5에서 시험된 2개의 균주에 대해 사용된 접종물의 농도의 함수로서 304/308 및 304/330 강도의 비율에서의 변화를 보여준다.
도 9는 액체 형태로 미생물 집단을 침적시키도록 적응될 수 있는 MALDI 판을 통합하는 경우의 구현예를 나타낸다.
MALDI 분석판
MALDI 분석판은 적어도 하나 및 일반적으로 다수의 분석 영역을 갖는다. 상기 분석 영역은 스팟 형태이고 일반적으로 원형 형태이다. 적어도 상기 분석 영역 또는 영역들의 수준에서, 후속적 이온화를 촉진시키기 위해, 상기 판의 표면은 전도성이다. 예를 들어, 상기 유형의 분석판은 폴리프로필렌과 같은 중합체에 의해 형성되고 상기 중합체는 스테인레스강의 층으로 피복된다. 상기 중합체는 카본 블랙과 같은 전도성 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 판은 표준 "Fleximass™ DS 1회용 MALDI 표적"과 함께 시마즈(Shimadzu)에 의해 시판되는 판일 수 있다.
다양한 MALDI 판이 시판되고 있고, 예를 들어, 제조원(bioMerieux)으로부터의 Fleximass DS 판(1회용 또는 재사용가능한) 및 제조원(Bruker Daltonics)으로부터의 Maldi Biotarget 판이 있다. 상기 유형의 판 I은 통상적으로 48개 내지 96개 분석 영역 1 또는 스팟, 및 적어도 하나 또는 심지어 2개 또는 3개의 참조 분석 영역 2를 포함하고, 이의 크기는 도 1의 예에서 보여지는 바와 같이, 상기 분석 영역의 크기와는 상이하다.
본 발명과 관련하여, 용어 "특징분석 영역"은 항미생물제, 미생물(들) 집단 및 MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 갖는 분석 영역을 위해 사용된다.
분석 영역 기능화
용어 "항미생물제"는 미생물의 생존능을 감소시키고/시키거나 이의 성장 또는 생식을 감소시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 상기 유형의 항미생물제는 이들이 세균을 겨냥하는 경우 항생제일 수 있다. 그러나, 본 발명은 세균, 효모, 곰팡이 또는 기생충 유형의 임의의 유형의 미생물에 적용되고 따라서 상응하는 항미생물제에 적용된다.
바람직하게, 상기 항미생물제는, 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신, 카바페넴, 및 모노박탐으로부터 특히, 선택되고, 그리고 암피실린, 아목시실린, 티카실린, 피페라실린, 세팔로틴, 세푸록심, 세폭시틴, 세픽심, 세포탁심, 세프타지딤, 세프트리악손, 세프포독심, 세페핌, 아즈트레오남, 에르타페넴, 이미페넴, 메로페넴 및 파로페넴으로부터 특히 선택되는 베타-락탐과 같은 항체이다.
카바페넴은 특히 엔테로박테리움 과와 같은 그람-음성 세균, 슈도모나스(Pseudomonas) 및 아시네토박터(Acinetobacter)를 퇴치하기 위한 마지막 수단으로서 사용된다. 따라서 상기 유형의 항생제는 존재하는 미생물이 카바페넴에 대해 내성을 가질 수도 있는 엔테로박테리움 또는 또 다른 그람-음성 종인 것으로 의심되는 경우 분석 영역 상에 침적된다.
바람직하게, 이는 항미생물제의 수용액으로부터 침적된다.
표적화된 내성의 기원에서 최적화된 활성 메카니즘 뿐만 아니라 항미생물제의 민감성에 적응된 완충제를 또한 사용하여 항미생물제 용액을 제조할 수 있다. 아연 염(특히, 염화아연 또는 황산염 유형의 염)의 항미생물 용액으로의 부가는 또한 메탈로-베타-락타마제의 최적화된 활성을 위해 고려될 수 있다.
작은 방울(droplet), 예를 들어, 대략 1 내지 2 마이크로리터의 항미생물 용액이 분석 영역의 전체가 커버되도록 하는 방식으로 침적될 수 있다. 이어서, 상기 용액 중에 함유되는 물은 예를 들어, 단순히 주위 공기 및 주위 온도에서 건조시킴에 의해 증발 제거된다. 예를 들어, 상기 분석판은 17 ℃ 내지 40 ℃의 범위에 있는 온도에서 그리고 특히 주위 온도(22 ℃)에서 방치할 수 있다. 또한, 건조를 가속화하기 위해, 예를 들어, 37 ℃에서 온도조절된 챔버로 이전시킬 수 있다.
상기 항미생물제는 매우 단순한 방식으로 수용액 중에 침적되고 상기 침적에 이어서 건조 조작을 수행한다. 따라서, 기능화된 것으로 일컬어 지는 항미생물제를 수반하는 분석 영역을 수득한다. 또한, 항미생물제는 정전기, 이온, 공유 또는 친화성 결합에 의해 또는 접착제에 의해 분석 영역 상에 고정시킬 수 있다. 상기 항미생물제를 단순히 침적시키는 것은 이의 만족할만한 고정을 제공하지 않을 수도 있다. 구체적으로, 상기 항미생물제가 상기 특징분석 영역에 충분히 접착하지 않는 경우, 이것은 미생물(들) 집단을 침적하는 경우, 항미생물제를 소실시킬 수 있고 이는 이어서 침적물을 생성하는 경우 조작자 입장에서 특별한 수완을 요구하거나, 실제로 후속적 용도를 위해 MALDI 판의 저장 동안에 침적물의 탈착에 의해 항미생물제를 소실시킬 수 있다. 추가로, 단순한 침적 대신에, 항미생물제는 분석 영역의 표면 및 항미생물제로 이미 그래프트된 비오틴/스트렙타비딘의 상호작용을 사용하거나, 항미생물제의 성질 및 분석 영역의 표면에 적응된 임의의 다른 유형의 결합에 의해, 또는 실제로 접착제에 의해, 임의로-특이적 링커 또는 아암(항체, 재조합 파아지 단백질)의 사용에 의하거나 또는 이의 사용 없이 정전기, 이온 또는 공유 결합을 통해 분석 영역에 연결될 수 있다. 그러나, 결합 또는 침적 방식은 항미생물제와 미생물의 임의의 상호작용이 손상되지 않도록 하는 방식으로 선택되어야만 하는데, 그 이유는 이것이 내성 현상을 차폐(masking)시킬 수 있기 때문이다. 특히, 항미생물제의 형태로의 변화를 예방하기 위해 그리고 미생물에 의해 생성될 수 있는 효소의 활성 부위로의 적당한 근접을 취득할 수 있도록 보장하기 위해, 공유 결합 또는 친화성 결합에 의한 것 보다는 차라리 접착제를 사용하여 항미생물제를 고정시키는 것이 바람직할 수 있다.
접착제, 즉 상기 판에 접착함으로써 판으로의 항미생물제의 고정을 개선시키는 제제가 사용되는 경우, 수용액 중 접착제와 항미생물제의 혼합물이 침적된다. 특히, 상기 접착제는 수용성인 중합체일 수 있다. 항미생물제를 분석 영역 또는 영역들에 고정시키기 위해 사용될 수 있는 접착제로 언급될 수 있는 예는 헵타키스(2,6-디-O-메틸)-β-사이클로덱스트린이다. 상기 접착제는 분석 영역 상에 고정화될 항미생물제의 함수(function)에 따라 선택되어야만 한다. 특히, 이것은, 이의 존재가 존재하는 항미생물제 및/또는 이의 분해 생성물의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 후속적 MALDI 검출을 왜곡시키지 않도록 하는 방식으로, 이의 질량의 함수로서 선택되어야만 한다. 당업자는 사용되는 접착제의 양을 조정해야만 하고 상기 양은 미생물 집단이 침적된 경우 항미생물제가 미생물 집단에 근접할 수 있도록 보장하기 위해서는 너무 높지 않아야 한다. 일례로서, 헵타키스(2,6-디-O-메틸)-β-사이클로덱스트린의 경우, 항미생물제로 나눈 헵타키스(2,6-디-O-메틸)-β-사이클로덱스트린의 중량비를 1/20 내지 1/2, 바람직하게 1/10 내지 1/5로 선택할 수 있다.
당업자는 미지의 항미생물제의 함수로서 분석 영역 상에 침적된 항미생물제의 양을 결정하여야만 한다. 사실, 분자의 이온화 정도에 의존하여, MALDI-TOF 내 항미생물제에 상응하는 피크(들)을 검출할 수 있도록 하기 위해, 배경 잡음(background noise) 초과의 강도를 갖는 충분한 양이 침적되어야 한다. 반면에, 항미생물제의 너무 큰 양은 특징분석 되어야만 하는 내성 기원에서 현상의 검출을 차폐시킬 위험을 부과하여, 본래의 항미생물제에 상응하는 피크의 강도 감소가 관찰될 수 없게 할 수 있다. 과량의 항미생물제는 특히, 낮은 활성을 갖는 베타-락타마제의 검출을 위태롭게 할 수 있다. 일례로서, 0.04 g/m2 내지 4　g/m2의 항미생물제가 침적되어야만 한다. 이를 위해, 물 중에, 특히 초순수 물 중에 항미생물제의 용액은 0.1 mg/mL 내지 10　mg/mL의 농도로 침적되어야만 한다. 예를 들어, 암피실린에 대해, 1.7 mg/mL 내지 10　mg/mL의 암피실린을 포함하는 수용액이 침적될 수 있고, 파로페넴에 대해서는 0.1 mg/mL 내지 1　mg/mL의 파로페넴을 포함하는 수용액이 침적될 수 있다.
특징분석 영역은 바람직하게 단일 항미생물제를 수반하야만 하지만, 하나의 그리고 동일한 분석 영역에 대한 다수의 항미생물제의 사용이 배제되지 않는다. 다수의 항미생물제를 수반하는 특징분석 영역은 동시에 다수의 효소의 존재에 대해서, 따라서 상이한 내성 현상에 대해 시험하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 항미생물제를 수반하는 특징분석 영역이 사용되는 경우, 상기 제제는 표적 효소의 작용하에 이들의 본래 형태 및/또는 이들의 분해 생성물의 질량은 이들이 MALDI-TOF에 의해 별도로 검출될 수 있도록 중첩되지 않는 방식으로 선택되어야 한다. 일례로서, 제1 항미생물제에 추가로 동일한 과(family) 또는 상이한 과(family) 기원의 또 다른 항미생물제를 침적시킬 수 있다. 일례로서, 특정 카바페넴은 특정 카바페네마제를 밝히기 위해 보다 적응된다. 따라서, 하나의 그리고 동일한 특징분석 영역에 대해 다수 유형의 카바페넴 또는 다른 베타-락탐을 갖는 것을 고려할 수 있다. 반면에, 2개의 항미생물제가 하나의 그리고 동일한 영역에 대해 침적되는 경우, 이들은 이들의 활성 스펙트럼이 서로를 방해하지 않고 이들이 MALDI-TOF에 의해 구별되게 검출될 수 있도록 하는 방식으로 선택되어야만 한다.
항미생물제에 추가로 또 다른 화합물을 또한 침적시킬 수 있다. 베타-락탐과 함께, 또한 특히 출원 WO 2012/023845에서 사용된 바와 같이 ESBL 현상을 특징분석 하기 위해 (확대된 스펙트럼 베타-락타마제) 베타-락타마제 억제제를 침적시킬 수 있다. 특히, 클라불란산, 설박탐 또는 라조박탐과 같은 베타-락타마제 억제제와 베타-락탐의 배합물이 침적될 수 있다. MALDI 판이 다수의 분석 영역을 포함하는 경우, 적어도 2개의 영역들 또는 심지어 그 이상의 영역들은 상이한 항미생물제를 수반하는 것이 유리하다. 이어서, 단일 판에 의하여, 여러 미생물(들) 집단을 특징분석할 수 있다. 영역들 각각은 상이한 항미생물제를 수반할 수 있다. 그러나, 통상적으로, 상기 특징분석은 2중으로 수행되어, 단일 항미생물제가 적어도 2개의 분석 영역들 또는 심지어 그 이상의 위에 존재하게 된다.
상기 유형의 기능화된 MALDI 판은 연구될 미생물(들) 집단을 침적한 다음, 항온 처리 단계 후 MALDI 매트릭스를 행하여만 하는 소비자에게 직접 공급될 수 있다. 이들은 개별 팩들 또는 여러 판을 포함하는 팩들로 시판될 수 있다.
미생물(들) 집단의 제조 및 침적
본 발명과 관련하여, 미생물(들) 집단은 후속적으로 이를 특징분석하기 위해 항미생물제로 기능화된 MALDI 판의 분석 영역 상에 침적된다.
미생물(들) 집단은 다양한 공급원으로부터 기원할 수 있다. 언급될 수 있는 미생물(들)의 공급원의 예는 생물학적 기원, 특히, 동물 또는 인간 기원의 샘플이다. 상기 유형의 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 뇌척수 또는 유기 분비물 유형 또는 조직 샘플 또는 단리된 세포의 생물학적 유체 샘플에 상응할 수 있다. 상기 샘플은 고려 중에 있는 분석 영역 상으로 침적되기 전에 그대로 침적될 수 있거나 바람직하게는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 집적 또는 배양 농축 및/또는 추출 또는 정제 단계를 포함하는 유형의 제조를 진행할 수 있다. 그러나, 상기 유형의 제조는 분석 영역 상에 침적되기 전에 미생물의 붕해 및 이들의 내용물의 소실을 유발하는 용해 단계에 상응하는 유형이 아니어야 한다. 미생물(들) 집단은 접종 형태로 침적될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 분석 영역 상에 침적된 미생물(들) 집단은 바람직하게 생존 미생물(들)의 집단이지만 생존능에 영향을 미칠 수 있는 세제를 사용한 생물학적 샘플로부터 미생물(들) 집단의 추출은 배제되지 않는다. 그러나, 상기 상황에서, MALDI를 사용한 미생물(들) 집단의 즉각적인 시험을 수행하기 위해, 이미 존재하는 활성 효소의 군체(stock)를 사용하여 임의의 내성 현상을 검출함에 의해 미생물(들) 집단을 특징분석할 수 있다.
미생물(들) 집단의 공급원은 또한 고기, 우유, 요거트와 같은 농식품 및 오염될 수 있는 임의의 다른 소모품, 또는 실제로 화장품 또는 약제품일 수 있다. 여기서, 다시, 상기 유형의 제품에는 침적될 미생물(들) 집단을 수득하기 위해 집적 또는 배양 유형 제조, 농축, 및/또는 추출 또는 정제 단계를 적용할 수 있을 것이다.
통상적으로, 미생물(들) 공급원은 이전에 이를 미생물에서 집적시키기 위해 브로쓰(broth)에 또는 겔 상에서의 배양하에 위치시킬 수 있다. 상기 유형의 겔 또는 브로쓰 배지는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 겔 상에 집적이 특히 선호되는데 그 이유는 분석 영역 상으로 집적 침적될 수 있는 미생물 집단을 수득하기 위해 사용될 수 있기 때문이다.
본 발명과 관련하여, MS/MS 또는 MRM 기술과 함께 추출 또는 정제 단계 후 수득된 하나 이상의 단백질 보다는 세균 집단을 포함하는 세포 배지를 분석 영역 상에 침적시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, 침적된 미생물 집단은 적어도 105 cfu의 미생물을 함유한다. 예를 들어, 105 cfu 내지 109 cfu의 미생물이 침적될 수 있다. 일례로서, 초순수 물 또는 완충제 중에 미생물 현탁액의 바이오매쓰 한 방울(drop)를 직접 침적시킬 수 있다. 미생물 집단 또는 미생물 집단의 분획물이 침적될 수 있다.
상기 침적된 집단은 바람직하게 단일 미생물 종을 포함한다. 그러나, 상이한 미생물을 포함하는 집단을 분석 영역 상으로 침적시키는 것이 배제되지는 않는다. 이 경우에, 어느 미생물이 동정되는 내성을 제공하는지를 알 수 있도록 하기 위해 상이한 내성 메카니즘을 개발하기 위해 미생물이 공지된 것이 바람직할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 침적되어야 하는 특정 샘플의 제조를 수행하는 것은 유용하지 않다. 특히, 미생물(들) 집단은 사전에 항미생물제와 접촉시키지 않고 침적된다. 실제로, 본 발명과 관련하여, 침적될 샘플의 길고 성가신 제조를 수행할 필요가 없고; 침적될 미생물(들) 집단은 원심분리 단계 없이 제조될 수 있다.
침적은 미생물(들) 집단이 균일한 방식으로 분석 영역 상으로 침적되는 방식으로 수행된다. 이러한 목적을 위해, 제조원(bioMerieux)에 의해 시판되는 VITEK® MS 기구와 같은 상업적 MALDI-TOF 기구에 대한 지침 메뉴얼에 나타낸 바와 같은 미생물의 표준 동정을 수행하기 위해 기재된 과정을 사용할 수 있다.
그러나, 미생물(들) 집단에 추가로, 또한 고려 중에 있는 내성 메카니즘에 서 일어나는 효소적 반응을 가속화하는 것으로 공지된 화합물을 첨가할 수 있다. 상기 화합물은 아연일 수 있고, 예를 들어, 특히 메탈로-베타-락타마제의 활성에서 중요한 보조인자인 ZnCl2 또는 황화아연 형태일 수 있다. 상기 화합물은 특징분석 영역의 제조 동안에 항미생물제와 조합하여 분석 영역에 미리 침적될 수 있거나, 또는 임의의 다른 시점에서 침적될 수 있다.
상기 분석 영역 상의 침적물이 실제로 적어도 하나의 미생물 집단을 함유한다는 사실은 처음에 적합한 시험에 의해 결정될 수 있고, 특히 겔상에 단리된 집단라는 사실에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게, 단일 미생물의 단일 집단은 분석 영역 상에 침적된다.
항온처리
미생물(들) 집단을 침적시킨 후, 항미생물제 및 특징분석될 미생물 집단 둘 다를 갖는 상기 분석 영역은, 미생물과 항미생물제가 상호 작용하도록 하고 따라서 항미생물제에 내성인 미생물 집단이 존재하는 경우, 내성 기원에서 반응/현상이 일어날 수 있도록 항온처리 단계에 적용한다. 특히, 검출될 내성 현상이 침적된 미생물에 의해 제조된 효소의 존재 때문인 경우, 항온처리는 효소적 반응이 일어나도록 하는 것과 같은 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 항미생물제에 대한 내성에 관여하는 현상은 MALDI 판 상에 직접적으로 일어나고, 종래 기술에서 일어나는 바와 같이, MALDI 판 상에 항미생물제의 존재하에 미리 미생물(들) 집단을 침적시키기 전에는 전혀 일어나지 않는다. 항미생물제에 대한 내성에 관여하는 현상은 특징분석 영역에 상응하는 최소 용적에서 일어난다. 따라서, 종래 기술과 직면하게 되는 희석 문제는 제한된다.
항온처리 조건 및 기간은 특징분석될 내성 현상의 함수로서 당업자에 의해 변경되어야 한다.
예를 들어, 분석판은 17 ℃ 내지 40 ℃ 범위인 온도, 및 특히 주위 온도(22 ℃)에 방치할 수 있다. 또한 내성 현상의 기원일 수 있는 효소적 반응을 촉진시키기 위해 예를 들어, 37 ℃에서 이것을 온도조절 챔버에 이전시킬 수 있다.
습도 조건은 특히 검출될 내성 현상이 가수분해 반응을 사용하는 경우, 존재하는 미생물이 건조되지 않도록 변경되어야 한다. 상기 판은 적어도 미생물(들) 집단을 함유하는 침적물에 의해 직접 제공되는 수분의 양이 충분하도록 항온처리 동안에 수분 대기에 위치할 수 있다.
선택된 조건하에서, 항온처리 시간은 검출될 내성 현상, 특히 효소에 의해 매개되는 내성 현상에 대한 효소적 반응의 MS MALDI-TOF에 의한 후속적 검출을 허용하기에 충분해야만 한다. 항온처리는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게 적어도 20분 동안 및 보다 더 바람직하게 45 내지 90분의 기간 동안 수행된다.
본 발명과 관련하여, 상기 유형의 항온처리 단계를 수행하는 것은, 상기 특징분석이 내성 현상의 검출에 추가로 수행되어야만 하는 경우, 미생물의 후속적 동정에 대한 해로운 효과를 어느 방식으로든 갖지 않는다는 것으로 나타났다.
MALDI 매트릭스 침적
일반적으로, MALDI 기술에 사용된 매트릭스는, 존재하는 분자 및 미생물의 통합성을 보존하면서, 미생물(들) 집단의 존재하에 광감성이고 결정화한다. 특히 MALDI-TOF MS 기술에 적합한 상기 유형의 매트릭스는 널리 공지되어 있고 예를 들어, 하기로부터 선택되는 화합물로 구성된다: 3,5-디메톡시-4-하이드록시신남산, α-시아노-4-하이드록시신남산, 페룰산, 및 2,5-디하이드록시벤조산. 많은 다른 화합물이 당업자에게 공지되어 있다. 또한 대기압하에 또는 가압하에 있는 경우 결정화하지 않는 액체 매트릭스가 있다. 레이저 빔의 효과하에 특징분석 영역에 존재하는 분자를 이온화시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 다른 화합물들이 사용될 수 있다.
매트릭스를 제조하기 위해, 상기 유형의 화합물은 통상적으로 물에, 바람직하게 "초순수" 품질의 물에 또는 물과 유기 용매(들)의 혼합물 중에 가수분해시킨다. 통상적으로 사용되고 있고 언급될 수 있는 유기 용매의 예는 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올, 및 에탄올이다. 트리플루오로아세트산(TFA)이 때로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 매트릭스의 하나의 예는 50/50/0.1(v/v)의 아세토니트릴/물/TFA 혼합물 중 시나프산 20mg/mL로 구성된다. 유기 용매는 존재하는 소수성 분자가 용액 중에 용해되도록 하고 물은 친수성 분자를 용해시키기 위해 사용될 수 있다. TFA와 같은 산의 존재는 양성자 포획(H+)에 의해 분자의 이온화를 고무시킨다.
상기 매트릭스를 구성하는 용액은 분석 영역 상으로 직접 침적되고 이어서 이 위에 존재하는 미생물 집단 및 항미생물제를 커버한다.
임의로, 본 발명에 따른 방법은 또한 특징분석 영역을 이온화시키는 단계 전에 존재하는 매트릭스를 결정화하는 단계를 포함할 수 있다. 통상적으로, 상기 매트릭스는 매트릭스가 주위 공기에서 건조되도록 방치함에 의해 결정화된다. 따라서, 매트릭스에 존재하는 용매는 예를 들어, 분석판을 17 ℃ 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 및 특히 주위 온도(22 ℃)에서 수분 동안, 예를 들어, 5분 내지 2시간 동안 방치함에 의해 증발 제거한다. 이러한 용매의 증발은 미생물(들) 집단 및 항미생물제가 분포하는 매트릭스가 결정화하도록 한다.
이온화 및 질량 스펙트럼 수득
MALDI 매트릭스에 위치하고 특징분석 영역을 형성하는 미생물(들) 집단 및 항미생물제에는 연성 이온화가 적용된다.
이온화를 위해 사용되는 레이저 빔은 매트릭스를 승화시키거나 증발시키기 위해 바람직할 수 있는 임의의 파장을 가질 수 있다. 바람직하게, 자외선 파장 또는 심지어 적외선 파장이 사용된다. 예를 들어, 상기 이온화는 337.1 nm에서 자외선(UV) 방사선을 방출하는 질소 레이저를 사용하여 수행될 수 있다.
이온화 동안에, 미생물(들) 집단 및 항미생물제에는 레이저 여기(laser excitation)가 적용된다. 이어서, 상기 매트릭스는 광 에너지를 흡수하고 상기 에너지의 복원은 매트릭스가 승화되도록 하고 미생물(들) 집단 내 및 항미생물제 내에 존재하는 분자들이 탈착되도록 하고 물질이 플라즈마로 호칭되는 상태로 나타나도록 한다. 상기 플라즈마에서, 전하는 매트릭스의 미생물 및 항미생물제의 분자 간에 교환된다. 일례로서, 양성자는 매트릭스로부터 이탈하여 특징분석 영역 내에 존재하는 단백질, 펩타이드 및 유기 화합물로 전달될 수 있다. 상기 단계는 이들의 파괴를 유도하는 것 없이, 존재하는 분자의 연성 이온화를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 미생물(들) 집단 및 항미생물제는 상이한 크기의 이온을 방출시킨다. 이어서, 이들 이온들은 전기장에 의해 가속화되고 플라이트 튜브(flight tube)로서 공지된 감압하에 튜브 내에서 자유롭게 비행한다. 이온화 동안에 그리고 생성된 이온의 가속화 동안에 적용된 압력은 통상적으로 10-6 내지 10-9 밀리바[mbar] 범위에 있다. 이어서, 최소 이온은 보다 큰 이온보다 더 신속하게 "비행(fly)"함으로써 이들이 분리되도록 한다. 검출기는 플라이트 튜브의 말단에 위치한다. 이온의 비행 시간(TOF; times of flight)를 사용하여 이들의 질량을 계산한다. 따라서, 검출기에 부딪치는 분자의 m/z 비율의 함수로서 동일한 전하당 질량(m/z)에 대해 이온화 분자의 수에 상응하는 시그날의 강도를 나타내는 질량 스펙트럼이 수득된다. 질량-대-전하 비율(m/z)은 톰슨[Th]으로 표현한다. 질량 분석법에 도입되면, 특징분석 영역의 스펙트럼은 통상적으로 1분 미만으로 매우 신속하게 수득된다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 MALDI-TOF 질량 분석법은 특히 질량 스펙트럼을 수득하기 위해 하기의 연속적 단계를 포함할 수 있다:
-　MALDI 분광측정을 위해 적응된 매트릭스 내에서 연구될 미생물(들) 집단 및 적어도 하나의 항미생물제를 포함하는 특징분석 영역을 제공하는 단계;
-　임의로, 미생물(들) 집단 및 항미생물제가 배치된 매트릭스의 결정화를 수행하는 단계;
-　미생물(들) 집단 및 항미생물제의 혼합물 및 매트릭스를 레이저 빔을 사용하여 이온화시키는 단계;
-　수득된 이온화 분자를 전위차에 의해 가속화시키는 단계;
-　상기 이온화되고 가속화된 분자가 감압하에 튜브 내에서 자유롭게 이동하도록 하는 단계;
-　이온화 분자들이 감압하에 튜브를 통과하는데 걸리는 시간을 측정하기 위해 그리고 소정의 시간에서 검출기에 도달하는 이온화 분자의 수에 상응하는 시그날을 수득하도록 하는 방식으로, 이온화 분자의 적어도 일부를 튜브로부터 출구에서 검출하는 단계; 및
-　검출된 분자의 비율 m/z의 함수로서 동일한 질량-대-전하(m/z)와 함께 이온화 분자의 수에 상응하는 시그날을 수득하도록 하는 방식으로, 검출된 분자들의 질량-대-전하 비율(m/z)을 계산하는 단계.
일반적으로, 비율 m/z는 감압 튜브에서 이온화 분자의 질량-대-전하 비율(m/z) 및 비행 시간를 연계하는 방정식 형태로 사용되는 질량 분석법기의 초기 보정을 고려함에 의해 계산된다.
보정은 고려된 특징분석에 상응하는 질량의 범위를 커버하는 이온화 분자를 제공하는 분자 또는 미생물(특징분석에 의존하여)을 사용하는데 있다. 이들 이온화 분자의 m/z 비율은 기구가 질량을 적절하게 측정하도록 하기 위한 표준물로서 작용한다.
미생물을 동정하기 위해, 상기 보정은 동정을 위해 사용되는 질량의 범위 (전형적으로 효모, 곰팡이, 세균 또는 기생충에 대한 2000 돌턴(Da) 내지 20000 Da 범위 내)를 커버하는 m/z 비율을 갖는 이온화 분자와 함께 세균 균주를 사용하여 수행될 수 있다. 항미생물제에 상응하는 시그날을 검출하기 위해, 보정은 작은 질량의 펩타이드의 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 예를 들어, 350 Da 내지 1000 Da의 질량 범위를 커버하는 캘리브런트(calibrant) pepMIX 6(LaserBio Labs)가 사용될 수 있다.
임의의 유형의 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 질량 스펙트럼을 생성할 수 있다. 상기 유형의 분광측정기는 다음을 포함한다:
i)　미생물(들) 집단 및 항미생물제의 혼합물 및 매트릭스를 이온화시키기 위한 이온화 공급원(일반적으로, UV 레이저);
ii)　전위차를 적용하는 이온화 분자 가속기;
iii) 상기 이온화되고 가속화된 분자가 이동하는 감압 튜브;
iv)　분자 이온들의 질량-대-전하 비율(m/z)의 함수로서 형성된 분자 이온을 분리하도록 의도된 질량 분석기; 및
v) 분자 이온에 의해 직접 생성된 시그날을 측정하도록 의도된 검출기.
본 발명과 관련하여, MALDI-TOF에 의한 분석은 바람직하게 단순한 MALDI-TOF 분석이지만 MALDI-TOF TOF에 의한 분석도 배제되지 않는다. MALDI-TOF에 의한 분석은 보다 복잡하지만 특히 특정 상황에서 검출의 민감성을 개선시키기 위해 고려될 수 있고, 이것은 상기 유형의 분석에 적합한 기구를 요구한다.
항미생물제에 대한 내성의 검출
용어 "내성"은 미생물이, 내성의 부재하에 상기 미생물에 대해 효과적인 것으로 인지되는 특정 농도의 항미생물제에 노출되는 경우 이의 생존능의 감소 또는 이의 성장 또는 이의 생식의 감소를 나타내지 않는 현상을 의미한다.
내성 메카니즘은, 질량 유발 스펙트럼 상에서, 소정의 질량을 갖는 피크를 검출하거나, 또는 참조 질량 스펙트럼과 비교하여, 특히 상기 특징분석 영역에 존재하는 항미생물제의 질량 스펙트럼과 비교하여, 질량 피크 내 변화를 검출하는 것을 고려하에 특징분석 영역에 대해 수득된 질량 스펙트럼으로부터 동정될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 항미생물제의 존재하에 한 미생물에 대한 직접적인 MALDI-TOF에 의한 질량 분석법을 수행하는 것은, 상기 항미생물제에 대한 내성의 결정과 관련된 목적하는 분자들을 검출하도록 하는 것임을 입증하였다. 따라서, 미생물 집단의 임의의 내성의 결정은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a1) 예를 들어, 항미생물제에 대해 및/또는 이의 분해 생성물에 대해 참조 질량 스펙트럼을 제공하는 단계(여기서, 상기 유형의 분해 생성물은 내성 현상의 결과이고 특히 분해 효소의 존재로 인한 것이다);
b1) 분석 영역 상에 침적되고 매트릭스에 존재하게 되는 (본 발명에 따른 특징분석 영역에 상응하는) 미생물(들) 집단 및 항미생물제에 이온화를 적용하는 단계;
c1) 내성을 결정하기 위해 목적하는 질량 범위에서 상기 이온화 후 수득된 질량 스펙트럼을 취득하는 단계; 및
d1) 단계 c1)에서 수득된 질량 스펙트럼을 표준 스펙트럼과 비교하고 이로부터 내성의 존재 또는 다른 방식을 추론하는 단계.
단계 d1)에서, 예를 들어, 단계 c1)에서 수득된 질량 스펙트럼에 대해, 항미생물제에 대한 특징적 질량을 갖는 피크 또는 피크들이 소실된 경우 및/또는 항미생물제의 하나 이상의 분해 생성물의 특징적 질량(들)을 갖는 하나 이상의 피크(들)이 존재하는 경우, 그렇다면 이는 항미생물제에 내성인 미생물이 존재하는 것으로 추론될 수 있다. 예를 들어, 해석은 항미생물제에 대한 특징적 질량을 갖는 피크와 외부 보정에 대한 특징적 질량을 갖는 피크 간의 강도의 비율로부터 또는 항미생물제에 대한 특징적 질량을 갖는 피크와 항미생물제의 분해 생성물에 대한 특징적 질량을 갖는 피크 간의 강도 비율로부터 수행될 수 있다.
또한, 항미생물제에 대한 특징적 질량을 갖는 피크 또는 피크들 또는 항미생물제의 하나 이상의 분해 생성물에 대한 특징적 질량을 갖는 피크 또는 피크들과, 시험될 생물학적/효소적 활성에 의해 유도된 변화가 이루어지지 않고 존재하는 화합물의 하나 이상의 참조 피크 간의 강도 수준을 비교할 수 있다. 고려될 수 있는 참조 피크의 예는 MALDI 매트릭스의 하나 이상의 피크, 상기 매트릭스에 부가된 또는 분석 영역 상에서 이미 건조된 펩타이드 또는 참조 분자의 하나 이상의 피크, 또는 여러 종에서 항상 존재하고 불변하는, 존재하는 미생물의 분자(예를 들어, 대사물)에 상응하는 하나 이상의 피크이다.
내성을 결정하는 경우, 보정은 적은 질량에 상응하는 질량 범위에서, 전형적으로 200 Da 내지 1200 Da 범위에서 및 바람직하게 200 Da 내지 600 Da 범위에서 수행된다. 단계 c1)에서 수득된 질량 스펙트럼은 또한 이 질량 범위 내에 포함된다. 상기 보정을 수행하기 위해, 펩타이드들의 혼합물 (pepMIX6, LaserBio Labs)및 HCCA 매트릭스, α-시아노-4-하이드록시신남산으로 구성된 2 마이크로리터의 보정 용액은 예를 들어, 참조 분석 영역 상으로 침적될 수 있다. 상기 특징분석 영역을 이온화하기 전, 캘리브런트는 이러한 참조 분석 영역 상에서 이온화된다. 이어서, 상기 캘리브런트의 이온화 분자의 m/z 비율은 기구가 질량을 적당히 측정하기 위해 사용될 수 있도록 하기 위한 표준물로서 작용한다.
본 발명에 따른 방법은 특히 베타-락탐 유형의 항생제를 분해하기 위해 공지되고 특히 페니실리나제, 세팔로스포리나제, 세파마이시나제 및 카바페네마제로부터 선택되는 효소를 분비하는 미생물의 능력으로 인한 내성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 항미생물제의 질량의 변화를 유발하는 분해 또는 효소적 변형을 기초로 하는 다른 내성 현상을 검출하는데에 적합하다. 예를 들어, 에스테라제에 의한 마크롤리드의 분해 또는 에폭시다제에 의한 포스포마이신의 분해, 아미노사이드, 클로람페니콜 또는 실제로 스트렙토그라민의 아세틸화, 아미노사이드, 마크롤리드, 리팝피신 및 펩타이드 항생제의 인산화, 테트라사이클린의 하이드록실화, 아미노사이드 및 린코사미드의 아데닐화, 리팜피신의 ADP-리보실화 및 마크롤리드 및 리팜피신의 당화와 같은 내성 메카니즘을 언급할 수 있다.
상기 용어 "분해 생성물"은 존재하는 미생물의 작용으로 인한 항미생물제의 화학적 구조의 변형에 상응하는 임의의 생성물을 포함한다. 상기 언급된 분해 및 효소적 변형 메카니즘에 추가로, 이것은 또한 항미생물제를 불활성화시키거나 이것이 이의 표적에 결합하지 못하도록 하는 MALDI-TOF에서 검출가능한 그룹을 첨가함을 포함할 수 있다.
내성의 검출을 위한 상기 유형의 방법은 시판되는 MALDI-TOF 기구의 도움으로 사전-기능화된 MALDI 판으로 수행될 수 있다. 단지 보정 및 해석 단계는 내성이 검출될 수 있도록 하기 위해 변경될 필요가 있다. 항미생물제에 대한 내성을 검출하고 특히 통상적인 방식으로 소정의 항생제에 대해 내성을 신속히 결정하는 단계는 많은 임상적 경우에 필수적일 수 있고 현재 본 발명과 관련하여 가능하다.
매우 짧은 시간에서 항생제에 내성인 미생물의 존재를 동정하기 위해 사용될 수 있는 본 발명에 따른 특징분석하는 방법은 신속한 진단을 위한 특히 관심 대상이다. 이것은 카바페네마제-생성 장세균(CPE)을 검출하기 위해 특히 필요한 사실이다. 본 발명에 따른 방법은 신속한 방식으로 투여되는 항생제 치료를 적응시키기 위해 병원 환경에서 신속한 시험을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
미생물의 동정
본 발명의 방법에 의해 동정될 수 있는 미생물은 모든 유형의 미생물, 병원성 미생물 또는 대안적으로는 항미생물제에 내성 현상을 제공할 수 있는 산업적 및 임상적 상황 둘 다에 접하게 되는 미생물이다. 이들은 세균, 곰팡이, 효모 또는 기생충일 수 있고 바람직하게 세균, 곰팡이, 효모 또는 기생충이다. 본 발명은 세균 연구에 특별히 적용되는 분야이다. 언급될 수 있는 상기 유형의 미생물의 예는 그람-양성, 그람-음성 및 마이코박테리아(Mycobacteria)이다. 언급될 수 있는 그람-음성 세균의 속의 예는 다음과 같다: 슈도모나스(Pseudomonas), 에스케리치아 (Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 아시네토박터(Acinetobacter), 시트로박터(Citrobacter), 에어로모나스(Aeromonas), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 모르가넬라(Morganella), 엔테로코커스(Enterococcus), 및 프로비덴시아(Providencia), 및 특히, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 시트로박터(Citrobacter) 종, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanii), 코마모나스(Comamonas) 종, 에어로모나스(Aeromonas) 종, 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 살모넬라 센프텐베르그(Salmonella senftenberg), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 등. 언급될 수 있는 그람-양성 세균 속의 예는 다음과 같다: 엔테로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 및 클로스트리디움(Clostridium).
미생물의 주요 단백질에 상응하는 상기 유형의 미생물에 대해 MALDI-TOF에 의해 수득된 참조 스펙트럼이 유용하고 상업적 MALDI-TOF 기구와 함께 묶여진 데이터베이스에 저장되어 상기 미생물의 존재가 비교에 의해 동정되도록 한다.
따라서, 미생물 집단 존재의 동정은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a2) 적어도 하나의 미생물에 대해 그리고 통상적으로 일련의 미생물에 대해 참조 질량 스펙트럼을 제공하는 단계;
b2) 분석 영역 상에 침적되고 매트릭스의 존재하에 있는 (본 발명에 따른 특징분석 영역에 상응하는) 미생물(들) 집단 및 항미생물제에 이온화를 적용하는 단계;
c2) 미생물의 동정을 위해 목적하는 질량 범위에서 상기 이온화 후 수득된 질량 스펙트럼을 취득하는 단계; 및
d2) 단계 c2)에서 수득된 질량 스펙트럼과 참조 스펙트럼을 비교하고 이로부터 적어도 하나의 미생물의 과, 속 또는 바람직하게는 종을 추론하는 단계.
미생물을 동정하는 경우, 보정은 전형적으로 2000 Da 내지 20000　Da 범위, 및 바람직하게 3000 Da 내지 17000　Da 범위의 높은 질량에 상응하는 질량 범위에서 수행된다. 단계 c2)에서 수득된 질량 스펙트럼은 또한 질량 범위에 포함된다.
상기 보정은 판 상에 존재하는 참조 분석 영역에 참조 미생물을 위치시키고 이를 MALDI-TOF에 의해 분석함에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 유형의 참조 미생물은 대장균(E. coli) 세균일 수 있다. 상기 보정을 위해, 제조원(bioMerieux)에 의해 시판되는 VITEK® MS와 같은 시판되는 MALDI-TOF 기구를 위한 지침 매뉴얼에서 미생물의 표준 동정을 수행하기 위해 기재된 과정을 사용할 수 있다.
보정을 위해 2개의 참조 분석을 사용할 수 있다: 미생물을 동정하는 하나 및 내성을 특징분석하는 또 다른 하나. 또한 2개 보정을 수행하기 위해 동일한 참조 영역을 사용할 수 있다. 상기 상황하에서, 상기 참조 영역은 연구될 내성의 항미생물제로 기능성화되어야만 한다.
본 발명과 관련하여, 바람직하지만 비필수적인 방식으로, 하기의 2개의 특징분석: 내성을 검출하고 미생물을 동정하는 것 둘 다가 수행되어야 하는 경우, 내성은 이후 검출되고, 즉, 내성을 검출할 필요가 있는 이온화 및 분석 단계는 미생물을 동정하기 위해 필요한 단계 후 특징분석 영역 상에서 수행된다.
2개의 특징분석이 하나의 그리고 동일한 특징분석 영역에 대해 수행되는 경우, 이것은 MALDI-TOF 분석에 대해 사용된 질량 분석기로부터 분석판을 제거하는 것 없이 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 이중 특징분석은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a3) 적어도 하나의 미생물을 위하여 그리고 통상적으로 일련의 미생물을 위한 참조 질량 스펙트럼 1뿐만 아니라, 항미생물제 및/또는 이의 분해 생성물에 대해 질량 스펙트럼 2를 제공하는 단계;
b3) 동정을 위해 사용되고, 참조 분석 영역 상에 이미 침적된 캘리브런트에 의해 사용되는 질량 분석기를 보정하는 단계;
c3) 분석 영역 상에 침적되고 매트릭스의 존재하에 있는 (본 발명에 따른 특징분석 영역에 상응하는) 미생물(들) 집단 및 항미생물제에 이온화를 적용하는 단계;
d3) 미생물을 동정하기 위해 목적하는 질량 범위에서 상기 이온화 후 수득된 질량 스펙트럼을 취득하는 단계;
e3) 내성을 검출하기 위해 사용되고 참조 분석 영역 상에 이미 침적된 캘리브런트에 의해 2번 사용되는 질량 분석기를 보정하는 단계;
f3) 분석 영역 상에 침적되고 매트릭스에 존재하게 되는 (본 발명에 따른 특징분석 영역에 상응하는) 미생물(들) 집단 및 항미생물제에 다시 이온화를 적용하는 단계;
g3) 내성을 결정하기 위한 목적하는 질량의 범위에서 상기 이온화 후 수득된 질량 스펙트럼을 취득하는 단계;
h3) 단계 d3)에서 수득된 질량 스펙트럼과 참조 스펙트럼 또는 스펙트럼 1을 비교하고 이로부터 존재하는 적어도 하나의 미생물의 과, 속 또는 바람직하게는 종을 추론하는 단계; 및
i3) 단계 g3)에서 수득된 질량 스펙트럼과 참조 스펙트럼 2를 비교하고 이로부터 내성의 존재 또는 다른 방식을 추론하는 단계.
따라서, 단계 c3) 및 f3)은 하나의 그리고 동일한 특징분석 영역 상에서 이에 따라 하나의 그리고 동일한 미생물(들) 집단에 대해 수행되고 이는 제조 및 조작 단계가 감소될 수 있음을 의미한다.
본 발명과 관련하여, 단일 분석 영역 상에 동일한 미생물(들) 집단 및 이의 단일 침적물은 2개의 이온화가 2개의 특징분석(항미생물제에 대한 미생물의 내성 현상의 특징분석 및 미생물의 동정)을 수득하기 위해 연속으로 적용되는 특징분석 영역을 생성하기 위해 사용된다.
실제로, 항미생물제의 존재 및 내성 현상을 검출하기 위해 필요한 사전 항온처리 단계의 수행은 미생물의 동정 가능성을 어떠한 방식으로도 방해하지 않는 것으로 예상치 않게 나타났다.
비교 단계 h3) 및 i3)은 방법의 말기에 또는 문제의 각각의 취득 후에 수행될 수 있다.
바람직하게, 침적된 집단은 단일 미생물 집단에 상응하고 2개의 특징분석-내성의 검출 및 미생물의 동정은 동일한 미생물에 관한 것이다.
결론적으로, 본 발명은 하기를 수행하기 위해 사용될 수 있다:
-　하나의 그리고 동일한 특징분석 영역으로부터 그리고 특히 항미생물제에 대한 내성 현상을 특징분석하고 미생물을 동정하는 것 둘 다로부터 정보를 신속하게 수득하는 것;
-　항미생물제에 대한 내성의 현상을 특징분석하기 위해 MALDI 판 상에 샘플을 침적시키기 전에 샘플의 길고 성가신 제조 없이 MALDI-TOF 분석 방법을 단순화시키는 것;
-　MALDI 판 상에서 직접적으로, 미생물 및 항미생물제의 최적의 접촉을, 때로는 내성 현상의 검출의 민감성에 대해 긍정적 영향을 갖는 이들의 최적의 접촉을 생성하는 것;
-　MALDI-TOF에 의한 항미생물제에 대한 내성 현상의 특징분석을 수행하기 위한 소모품 및 수동 조작과 관련된 시간 및 비용 감소를 달성하는 것; 및
-　항미생물제를 MALDI 판 상에 침적하기 전에 항미생물제의 존재하에 어떠한 사전 항온처리가 필요하지 않음을 고려할 때, 분석될 샘플의 보다 양호한 추적능력 및 보다 우수한 관리를 달성하는 것.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 의도되지만 이들은 어떠한 방식으로 든지 제한하는 것이 아니다. 상기 분석은 제조원(bioMerieux)에 의해 시판되는 VITEK® MS 기구를 사용하여 수행하였다. 상기 분석은 취득 말기에 하기의 실시예 각각에서 수행하였다. 상기 스펙트럼은 모든 특징분석 영역 상에서 취득하였고 이어서 다음을 위해 분석하였다:
-　동정을 위해, 상기 스펙트럼은 VITEK MS 엔진 및 소프트웨어 (Spectra Identifier Version: 2.1.0 소프트웨어)에 함유된 데이타베이스 V2.0.0을 사용하여 분석하였고;
-　가수분해를 위해, 스펙트럼의 피크는 소프트웨어(Launchpad V2.8 취득 소프트웨어)를 사용하여 가시화하였다.
실시예 1
예비 실험은 MALDI 판의 분석 영역 상에 MALDI 기술을 위해 적당한 매트릭스와 혼합된 항생제를 함유하는 용액 한 방울의 침적 후 베타-락탐 유형의 항생제 피크를 MALDI-TOF에 의해 검출할 수 있는지를 보여주기 위해 수행하였다. 본 실험에서, MALDI 판(VITEK® MS 1회용 슬라이드 TO-430)의 분석 영역은 베타-락탐 항생제로 처리하고 항생제가 베타-락타마제에 의해 절단되는 능력을 평가하기 위해 시험하였다. 암피실린은 항생제 베타-락탐에 대한 모델로서 사용하였다. 상기 실험은 하기의 단계에 의해 수행하였다:
-　물 중에 10mg/mL 농도의 2 μL의 암피실린 용액을 MALDI 판의 분석 영역 상으로 방울 형태로 침적하였다. 상기 판을 방울이 완전히 건조될 때까지 37 ℃에서 항온처리하였다.
-　2　μL의 재조합 베타-락타마제(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 β-락타마제, Sigma-Aldrich batch L6170-550UN. CAS: 9073-60-3).
-　물 중에 1mg/mL 농도의 2　μL의 재조합 β-락타마제는 효소적 활성을 촉진시키기 위해 황화아연(0.76 밀리몰 (mM)) 형태로 아연이 보충된 물에 희석하여 사용하고 암피실린을 수반하는 건조 분석 영역 상으로 침적시켰다. 음성 대조군은 또한 암피실린을 사용한 동일한 방식으로 처리된 또 다른 분석 영역 상으로 0.76 mM의 아연과 함께 효소 없이 2 μL의 물 방울을 침적시킴에 의해 수행하였다.
-　상기 판은 1시간 동안 주위 온도에서 항온처리하여 효소적 반응이 일어날 수 있도록 하였다.
-　1 μL의 HCCA 매트릭스, 알파-시아노 4-하이드록시신남산(VITEK MS CHCA 매트릭스, bioMerieux Ref: 411071)을 재조합 베타-락타마제의 존재 또는 부재하에 암피실린을 이미 함유하는 분석 영역 상으로 침적시켰다.
-　 MALDI-TOF 질량 분석법 분석은, 기구를 적은 질량에 대해 보정하기 위해, 참조 분석 영역 상에 침적된 캘리브런트로서 사용된 2 μL의 HCCA 및 pepMIX 6(LaserBio Labs로부터 구입함)의 혼합물을 사용하는 VITEK® MS 기구와 함께 수행하였다. 상기 혼합물은 1 용적의 pepMix6(10X)을 9 용적의 HCCA에 첨가함에 의해 제조하였다. pepMix6 (10X) 용액은 제조업자의 추천에 따라 희석제(트리플루오로아세트산, 초순수 물 중 0.01%)에서 제조하였다. 상기 피크는 200 Da 내지 1200 Da의 낮은 범위의 질량에 대해 취득하였고 암피실린의 본래의 분자에 상응하거나 가수분해 후 이의 분해 생성물에 상응하는 분자의 존재를 연구하였다.
모든 샘플은 판 상에서 이중으로 분석하였다.
도 2는 수득된 질량 스펙트럼을 그래프로 그리고 암피실린이 상기 판 상에 안정하지 못하였고 항온처리 후 베타-락타마제에 의해 효과적으로 분해되었음을 보여준다. 실제로, 도 2에서, 주요 피크는 368.09　m/z에서 관찰되었고, 이는 베타-락타마제와 함께 분석 영역에 상응하는 상부 스펙트럼 상에서 암피실린의 가수분해된 형태(368.4 m/z에 상응하는 암피실린의 1 나트륨 형태에 대해 계산된 질량)에 상응하고 372.09　m/z (372.4 m/z에 상응하는 암피실린의 1 나트륨 형태에 대해 계산된 질량)에서 본래 형태의 완전한 상실에 상응한다. 반면에, 음성 대조군(바닥 스펙트럼)에 대해, 주요 피크는 암피실린의 1 나트륨 본래의 형태에 상응하는 372.09 m/z에 있었다. 암피실린의 약간의 자발적 가수분해가 또한 음성 대조군에서 관찰되었다. 이것은 베타-락탐의 효소적 가수분해 반응이 본 발명에 따른 특징분석 영역을 제조하는 방법을 사용하여, MALDI-TOF 기술에 의해 검출될 수 있음을 입증한다.
실시예 2
본 실험은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 집단(colony)을 암피실린을 수반하는 분석 영역 상으로 직접적으로 침적시킨 다음, 이의 용액을 침적시키고 건조시킨 후, 세균의 다양한 균주에 의한 암피실린의 분해를 연구하기 위해 수행하였다.
세균 균주 및 이들의 특징분석은 하기 표 1에 제공한다.
Figure 112017019898412-pct00001
상기 시험은 하기 단계에 의해 수행하였다:
-　아연(0.76 mM)이 보충된 10mg/mL 농도의 2 μL의 암피실린 수용액을 MALDI 판(실시예 1의 것과 동일하게)의 분석 영역 상으로 침적시켰다.
-　상기 판은 침적된 용액의 방울이 완전히 건조될 때까지, 37 ℃에서 항온처리하였다.
-　각각의 세균 균주에 대해, 겔 배지 상에서 24시간 동안 성장 후 수득된 집단 일부를 암피실린을 수반하는 분석 영역 상으로 이중으로 침적시켰다. 각각의 스팟은 미생물의 동정을 위해 VITEK® MS 과정에 기재된 바와 같이 수득하였다.
-　상기 판은 수분 대기에서 1시간 동안 주위 온도(20-25℃)에서 항온처리하였다. 이를 위해, 물을 함유하는 폐쇄된 용기는 판을 위한 항온처리 챔버로서 사용하였다.
-　1　μL의 HCCA 매트릭스를 항생제 및 세균 둘 다를 함유하는 분석 영역에 첨가하였다.
-　MALDI-TOF 스펙트럼 분석은 VITEK® MS 기구를 사용하여 수행하였고, 상기 판은 하기의 2개 단계에 의한 수행에 의하여, 기구의 챔버에 위치시킨 후 진공 상태에 있도록 하였다:
(i) 대장균의 침적된 균주를 수반하는 참조 영역으로부터 기구를 보정한 후(E-cal) 특징분석 영역 스펙트럼의 제1 취득;
(ii) 캘리브런트로서 pepMIX 6과 함께 작은 질량에 대한 기구를 보정한 후 동일한 특징분석 영역의 제2 취득(상기 제2 취득은 챔버의 진공을 차단하는 것 없이 그리고 또한 기구로부터 판을 제거하는 것 없이 제1 취득 직후 수행하였다).
-　상기 데이타를 수집하고 데이타베이스에 포함된 데이타와 비교하여 종을 동정하였다.
-　상기 피크는 적은 질량의 범위에 대해 관찰하여 본래의 또는 가수분해된 형태의 항생제를 검출하였다.
모든 샘플은 판 상에 이중으로 분석하였다.
도 3은 제2 일련의 취득 동안에 수득된 질량 스펙트럼을 그래프로 그리고, 암피실린-내성 균주가 모두, 사용된 실험적 조건하에 암피실린을 가수분해시킬 수 있음을 보여주고, 암피실린에 민감성인 것으로 공지된 균주 대장균 ATCC 25922의 경우에 어떠한 암시필린 분해도 관찰되지 않았다. 실제로, 적은 질량에서 제2 취득 후, 본래 형태의 암피실린에 상응하는 372.15　m/z에서의 주요 피크는 민감성 균주 및 음성 대조군에 대해 관찰되었고, 모든 암피실린-내성 균주에 대해, 주요 피크는 암피실린의 가수분해된 형태 및 본래 형태의 소실에 상응하는 385.15 m/z에 위치하였다.
제1의 취득 및 상응하는 스펙트럼을 수득한 후, 모든 세균 균주는 고수준의 신뢰도로 동정될 수 있었다.
하기 표 2에서 나타낼 수 있는 바와 같이, 세균은 모든 특징분석 영역에 대해 제1 일련의 취득으로부터 MALDI-TOF에 의해 올바르게 동정될 수 있고, 신뢰도 수준은 99.9 % 내지 100 %의 범위에 있고, 실험적 조건이 또한 상이한 종을 구별할 수 있음을 보여주었다.
Figure 112017019898412-pct00002
실시예 3
다른 시험은, 종의 동정 및 카바페네마제의 생산의 검출이 하나의 그리고 동일한 특징분석 영역으로부터 가능함을 입증하기 위해 수행하였다. 이를 위해, 파로페넴은 항생제 카바펜의 모델로서 사용하였고, 실시예 2에 사용된 것과 동일한 프로토콜을 사용하였다. 파로페넴 용액은 0.5 mg/mL의 파로페넴 농도로 제조하였다.
사용된 세균 균주는 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112017019898412-pct00003
도 4는 제2 일련의 취득 동안에 수득된 질량 스펙트럼을 그래프로 그리고 카바페네마제 활성은 제2 일련의 취득에 의해, 이들 조건하에서 MALDI-TOF에 의해 검출될 수 있음을 보여준다. 가수분해된 형태의 파로페넴이 본 실험에서 검출되지 않았지만 세균에 의한 카바페네마제의 생산으로 인해 파로페넴의 2개의 본래의 형태 소실을 입증할 수 있었다.
적은 질량에서 취득 후, 민감성 균주에 대해 주요 피크는 308.13　m/z에서 관찰되었고 최소 피크는 330.13　m/z에서 관찰되었으며, 이들 각각은 2개의 본래 형태의 파로페넴에 상응하였다(308.3 및 330.3　m/z의 계산된 질량에 상응하는). 이들 2개의 피크는 페로페넴이 카바페네마제 IMP-1을 생성하는 에스. 마르세센스 균주로 항온처리되는 경우 소실되었다.
제1 취득 및 스펙트럼을 수득한 후, 균주 둘 다는 고수준의 신뢰도로 올바르게 동정될 수 있다. 실시예 2와 유사한 방식으로, 특징분석 영역 중에 파로페넴의 존재는 표 4에 제공된 제1 일련의 취득으로 수득된 결과에 의해 나타난 바와 같이 MALDI-TOF가 종을 동정하고 마르세센스 유형의 세균으로부터 대장균 유형의 세균을 구분하는 가능성을 동정하는 능력에 영향을 미치지 않았다.
Figure 112017019898412-pct00004
실시예 4
본 시험은 항생제의 MALDI 판의 분석 영역으로의 접착을 증가시키기 위해 수행하였다. 실제로, 판 상에 침적된 항생제 용액을 건조시키는 것은 표면으로 약하게 접착된 필름의 형성을 유도하였다. 헵타키스(2,6-디-O-메틸)-β-사이클로덱스트린(헵타키스, Sigma-Aldrich ref H0513)을 사용하여 파라페넴을 MALDI 판의 표면에 결합시켰다. 이의 접착 성질 이외에, 헵타키스를 사용하는 선택은 몰 당 1331.3 그램(g.mol- 1)의 이의 분자량에 의해 촉진되었고, 이것은 파로페넴 또는 이의 가수분해된 생성물에 대한 질량 피크를 방해하지 않았다. 상기 실험 동안에, 2개의 질량 비율[헵타키스]/[파로페넴]은 건조 파로페넴의 접착 및 파로페넴의 본래의 피크 및 가수분해된 피크의 검출에 대한 헵타키스의 영향을 평가하기 위해 시험하였다.
사용된 세균 균주는 하기 표 5에 나타낸다.
Figure 112017019898412-pct00005
상기 시험은 하기 단계에 의해 수행하였다:
-　헵타키스 및 파로페넴의 혼합물을 함유하는 2개 용액 및 헵타키스 부재의 파로페넴 1개 용액은 아연(황화아연, 0.76 mM)이 보충된 NaCl 완충액(0.45 %) 중에서 제조하였다. 이들 용액 중 헵타키스 및 파로페넴의 최종 농도는 다음과 같았다:
(i) 0　mg/mL의 헵타키스 및 1　mg/mL의 파로페넴;
(ii)　0.1　mg/mL의 헵타키스 및 1　mg/mL의 파로페넴(중량비 1:10);
(iii) 0.2　mg/mL의 헵타키스 및 1　mg/mL의 파로페넴(중량비 1:5);
-　2　μL의 각각의 용액을 MALDI 판의 분석 영역 상에 침적시켰다(실시예 1의 것에 따라);
-　상기 판은 침적된 용적의 방울이 완전히 건조될 때까지 주위 온도에서 항온처리하였고;
-　접착을 평가하기 위해, 파로페넴 또는 헵타키스/파로페넴으로 기능화된 각각의 분석 영역은 집단의 침적을 모방하기 위해 접종 루프를 사용하여 스크레이핑하고 슬라이드 사진을 촬영하였고;
-　파로페넴 피크의 검출에 대한 헵타키스 농도의 효과를 검출하기 위해, 겔 배지 상에 24시간 동안 성장 후 수득된 집단의 일부는 단독의 파로페넴을 갖거나 파로페넴 및 헵타키스의 혼합물을 갖는 분석 영역 상에 4중으로 침적시켰고;
-　상기 판은 수분 대기에서 2시간 동안 37 ℃에서 항온처리하였고;
-　1 μL의 HCCA 매트릭스는 또한 항생제 또는 헵타키스/항생제 혼합물 및 세균을 갖는 분석 영역에 첨가하였고;
-　MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 분석은 적은 질량 스펙트럼을 취득하기 위해 VITEK® MS 기구를 사용하여 수행하였고;
-　308.3　m/z에서 본래의 형태 (파로페넴　+　Na) 및 304.3　m/z에서 가수분해된 형태 (가수분해된 파로페넴 + H)의 피크, 및 212.03　m/z에서 HCCA에 대한 피크를 검토하였고;
-　모든 시험 조건에 대해, 3개의 피크 강도를 기록하고 308/212 및 304/212 비율을 계산하였다. 212 m/z에서 HCCA에 대한 피크는 본 실시예에서 변화하지 않는 강도의 대조군 피크로서 사용하였다.
모든 샘플은 상기 판 상에 4중으로 분석하였다.
도 5는 접종 루프를 사용한 스크레이핑하기 전후 분석 영역(스팟)의 출현을 보여준다. 상기 사진은 1/10 및 1/5의 [헵타키스]/[파로페넴] 비율에 대한 스팟의 전체 표면 상에 헵타키스/파로페넴 혼합물의 스크레이핑 후 양호한 분산을 보여주고 스크레이핑 후 양호한 안정성을 갖는다. 헵타키스 없이 건조된 항생제는 슬라이드 표면 상에서 매우 안정하지 않았고 상기 필름은 접종 루프로의 스크레이핑 동안에 완전히 또는 부분적으로 탈착하였다.
도 6은 슬라이드 상에 항생제를 건조시키는 경우 사용되는 [헵타키스]/[파로페넴] 비율의 함수로서 HCCA의 대조군 피크와 비교하여, 본래의 파로페넴 및 가수분해된 파로페넴의 피크의 강도 비율에서의 변화를 보여준다. 상기 값은 4개의 스팟 평균을 나타낸다. 1/10 및 1/5의 비율에 대해, 검출은 헵타키스 부재 조건에 상응하였고 헵타키스의 존재하에 재현성의 추가의 이점을 갖는다. 실제로, 헵타키스 부재하에 관찰된 실질적 변화(큰 오차 막대)는 집단 침적 동안에 특정 스팟 상의 항생제의 전체 또는 부분적 소실로 인한 것이었다. KPC 유형의 카바페네마제-생산 균주를 사용한 항온처리 후 가수분해된 피크의 외형에 관하여, 본원 발명자는 동일한 현상을 관찰하였고, 즉 1/10 및 1/5의 [헵타키스]/[파로페넴] 비율로 양호한 검출을 관찰하였다.
상기 실험 결과는 적합한 농도 (파로페넴 1mg/mL에 대해 0.1 mg/mL 또는 0.2　mg/mL)에서 헵타키스의 사용은 항생제가 집단의 침적 동안에서 세균과 최적화된 혼합물 보장하면서 저장을 위한 슬라이드 상에서 안정화될 수 있음을 의미한다. 이들 동일한 농도에서, 헵타키스는 또한 스팟 간 결과의 재현성을 개선시키기 위해 사용될 수 있고 피크의 검출 또는 실제로 파로페넴 가수분해 반응을 방해하지 않는다.
실시예 5
본 시험은 액체 침적물, 즉 세균 접종물로부터의 MALDI 판의 기능화된 분석 영역 상에 가수분해 반응을 수행할 가능성을 평가하기 위해 수행하였다. 실제로, 집단 침적 동안에 접하게 되는 문제점은 조작자의 함수로서 침적된 미생물의 양 및 침적물의 변화성과 관련하여 표준화의 부재이다. 따라서, 통상의 MALDI-TOF 동정 적용을 위한 슬라이드 상의 집단 침적은 기술적 훈련을 요구하고 심지어 이것은 이종성 침적물로 인해 결과의 변화 위험을 완전히 제거하지 못한다. 추가로, 공지된 농도를 갖는 세균 접종물을 MALDI 판의 기능화된 분석 영역에 적용하였다.
세균 균주는 상기 표 5에 제시되어 있다.
상기 시험은 하기 단계에 의해 수행하였다:
-　아연(황화아연, 0.76 mM)이 보충된 NaCl 완충액(0.45 %) 중에 제조된 1 mg/mL농도의 2　μL의 파로페넴 용액을 MALDI 판의 분석 영역 상으로 침적시켰고 주위 온도에서 건조시켰고;
-　3 McFarland 또는 6 McFarland의 농도에서 2　μL의 세균 접종물을 4중으로 기능화된 분석 영역에 적용하였고;
-　상기 판은 수분 대기에서 2시간 동안 37 ℃에서 항온처리하였고;
-　1 μL의 HCCA 매트릭스를 항생제 및 세균 둘 다를 갖는 분석 영역에 첨가하였고;
-　 MALDI-TOF 질량 분석법 분석은 파로페넴 피크를 관찰하기 위해 적은 질량 스펙트럼 중에서 하나, 및 동정(실시예 2에 따른)을 위한 고질량 스펙트럼에서 또 다른 하나인 2개의 취득을 위해 VITEK® MS 기구를 사용하여 수행하였고;
-　304.3　m/z(가수분해된 파로페넴　+　H)에서 가수분해된 형태에 대한 피크 뿐만 아니라 308.3 m/z(파로페넴 +Na) 및 330.3 m/z(파로페넴 + 2Na)에서 본래의 형태에 대한 피크를 검토하였고;
-　모든 시험 조건에 대해, 3개 피크의 강도를 기록하였고 304/308 및 304/330 비율은 파로페넴의 가수분해를 정량하기 위해 계산하였다.
모든 샘플은 판 상에서 4중으로 분석하였다.
도 7은 제2 일련의 취득 동안에 수득된 질량 스펙트럼을 그래프로 그리고 카바페네마제 활성이 6 McFarland의 강도에서 세균 접종물의 침적 후 MALDI-TOF에 의해 검출될 수 있음을 보여준다. 실제로, 세균에 의한 카바페네마제의 생성으로 인해 2개의 본래 형태의 상실 및 파로페넴의 가수분해 형태의 외형을 입증할 수 있었다.
적은 질량에서 취득 후, 민감성 균주와 함께, 주요 피크는 308.03　m/z에서 관찰하였고 소수 피크는 330.02　m/z에서 관찰하였고, 이들은 각각 2개 본래 형태의 파로페넴에 상응한다(308.3 및 330.3　m/z의 계산된 질량에 상응함). 이들 2개의 피크는 파로페넴이 카바페네마제 KPC를 생성하는 케이. 뉴모니아 균주로 항온처리하는 경우 소실되고 304.06　m/z에서 피크의 외형이 관찰되었고 이는 파로페넴의 가수분해 형태에 상응한다(계산된 질량 304.03).
제1 취득 및 스펙트럼을 수득한 후, 2개의 균주는 고수준의 신뢰도로 올바르게 동정될 수 있다. 특징분석 영역 및 접종물을 침적시키는데 있어서 파로페넴의 존재는 MALDI-TOF에 의한 종을 동정하는 능력에 영향을 주지 않았고 표 6에 나타낸 제1 일련의 취득으로 수득된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 케이. 뉴모니아 유형의 세균으로부터 대장균 유형의 세균을 구분하는 능력에 영향을 미치지 않았다.
Figure 112017019898412-pct00006
도　8은 2개 시험 균주에 대해 사용된 접종물의 농도의 함수로서 304/308 및 304/330 강도 비율의 변화를 보여준다. 항생제를 가수분해시키지 않는 야생형 균주에 대해, 2개 비율의 어떠한 상당한 변화가 세균 접종물의 농도와 상관 없이 관찰되었다. 유형 KPC 카바페네마제 생산 균주에 대해, 상당한 증가는 비율 둘 다에서 관찰되었고, 이는 접종물 농도와 비례하였다. 비율에서의 상기 증가는 도 7에 나타낸 바와 같이 본래의 피크의 강도를 감소시키고 가수분해된 피크의 강도를 증가시켰다.
상기 실험 결과는 접종의 침적물이 또한 MALDI 판 상에 가수분해 반응에 적응되고 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 동정에 적응됨을 보여준다. 추가로, 4개의 침적물의 평균 초과로 관찰된 작은 오차 막대는 상기 결과의 매우 양호한 재현성을 시사한다.
도 9는 액체 형태로 미생물 집단을 침적시키는 것에 적응될 수 있는 MALDI 판을 결합하는 경우의 구현예를 나타낸다. 건조된 항생제로 이미 커버된 분석 영역을 갖는 MALDI 판 슬라이드는 이 안에 다수의 웰(보여진 모델 중 12개)이 성형된 겔러리 내부에 위치시켰다. 동일한 축상에서 정렬된 6개의 웰은 탈수 형태로 불투명 대조군(opacity control)을 함유하였고 다른 6개의 웰은 비어있었다. 상기 슬라이드를 포함하는 겔러리는 그 자체를, 커버를 갖는 카세트에 위치시켰다. 저장을 위해, 상기 카세트는 특히 빛 및 수분으로부터 밀폐적으로 밀봉된 방식으로 포장될 수 있다.
상기 생성물을 사용하기 위한 프로토콜은 하기의 단계로 기재될 수 있다:
-　카세트로부터 커버를 제거하는 단계;
-　용적 50 μL 내지 100　μL의 물 또는 생리학적 완충액으로 12개 웰을 충전시키는 단계(여기서, 불투명 대조군을 함유하는 6개 웰의 충전은 탁한 용액이 형성되도록 한다);
-　마주한 웰의 불투명 대조군에 상응하는 탁도를 수득하기 위해 집단 또는 집단 일부를 첨가함에 의해 다른 6개의 웰에 접종물을 제조하는 단계;
-　항생제를 수반하는 분석 영역 상으로 2 μL의 각각의 접종물을 침적시키는 단계;
-　수분 대기를 생성하기 위해 페펫의 도움으로 카세트에 물을 첨가하는 단계;
-　커버를 교체하고 1시간 내지 2시간(또는 그 이하) 동안 37 ℃에서 항온처리하는 단계;
-　1 μL의 HCCA 매트릭스를 항생제 및 세균 둘 다를 함유하는 분석 영역으로 첨가하는 단계; 및
-　MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 분석을 위해 슬라이드를 회수하는 단계.
불투명 대조군을 부가하는 것은 밀도 또는 탁도 측정 장치를 사용하여 접종물의 제조를 피할 수 있고 시간을 절약할 수 있는 것임을 의미한다. 추가로, 밀도측정기와 같은 통상적인 용도에서 측정 장치는 대형 용적(1 mL 내지 3　mL)에 적응되고, 따라서, 대량의 세균이 사용될 필요가 있다.
상기 접종물은 또한 생물학적 샘플로부터 직접 수득된 세균 (예를 들어, 혈액배양으로부터 추출된 세균)의 고체 또는 액체 추출을 사용하여 제조될 수 있다.
도 9에 나타낸 구현예는 6개의 상이한 균주가 시험되도록 하였다. 이러한 모델은 특히 웰 수를 증가시킴에 의해 통상적으로 시험된 균주의 양의 함수로서 적응될 수 있다.
참조문헌:
Hooff, G.P., J.J. van Kampen, R.J.　Meesters, A. van Belkum, W.H.　Goessens and T.M.　Luider (2012). "Characterization of beta-lactamase enzyme activity in bacterial lysates using maldi-mass spectrometry. "J Proteome Res 11(1): 79-84.
Hrabak, J., V.　Studentova, R.　Walkova, H.　Zemlickova, V.　Jakubu, E.　Chudackova, M.　Gniadkowski, Y.　Pfeifer, J.D.　Perry, K.　Wilkinson and T.　Bergerova (2012). "Detection of NDM-1, VIM-1, kpc, oxa-48, and OXA-162 carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry." J Clin Microbiol 50(7): 2441-2443.
Hrabak, J., R.　Walkova, V.　Studentova, E.　Chudackova and T.　Bergerova (2011). "Carbapenemase activity detection by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry." J Clin Microbiol 49(9): 3222-3227.
Sparbier, K., S.　Schubert, U.　Weller, C.　Boogen and M.　Kostrzewa (2012). "Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based functional assay for rapid detection of resistance against beta-lactam antibiotics." J Clin Microbiol 50(3): 927-937.

Claims (26)

  1. 적어도 하나의 항미생물제의 존재하에 적어도 하나의 미생물 집단의 적어도 하나의 특징분석(characterization)을 수행하기 위해 분석판(analysis plate)의 특징분석 영역을 제조하는 방법으로서, 상기 특징분석이, 상기 특징분석 영역 상에 침적된 적어도 하나의 미생물 집단이 MALDI로서 공지된 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 질량 분석법 기술(matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry technique)에 따라 상기 특징분석 영역을 레이저 빔으로 포격시킴에 의해 적어도 하나의 이온화 단계를 진행하는 동안에 질량 분석법에 의해 분석하는 것을 포함하고;
    상기 특징분석 영역을 제조하는 방법이 다음의 단계들을 연속으로 포함함을 특징으로 하고,
    -　상기 MALDI 기술에 의한 특징분석을 위해, 항미생물제를 수반하는 적어도 하나의 기능화된 분석 영역을 포함하는 분석판을 제공하는 것으로 이루어진 단계;
    -　상기 적어도 하나의 미생물 집단을, 상기 항미생물제와 접촉된 상기 기능화된 분석 영역 상으로 침적시키는 단계;
    -　존재하는 상기 항미생물제 및 상기 미생물이 상호작용하도록 하는 조건하에 그리고 이를 위해 충분한 시간 동안 상기 분석판을 보존하는 것으로 이루어진 항온처리 단계; 및
    -　상기 MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 상기 분석 영역 상으로 침적시키는 단계,
    여기서, 상기 기능화된 분석 영역은 상기 항미생물제의 수용액을 침적시키고 이를 건조시켜 제조되거나, 상기 항미생물제가 정전기 결합, 이온 결합, 공유 결합 또는 친화성 결합에 의해 또는 상기 항미생물제의 성질 및 상기 분석 영역의 표면에 맞는 임의의 다른 유형의 결합에 의해 상기 분석 영역 상에 고정되거나, 상기 항미생물제가 접착제에 의해 상기 분석 영역 상에 고정된 것을 특징으로 하는, 특징분석 영역을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 특징분석될 단일 미생물 집단이 침적됨을 특징으로 하는, 제조 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 미생물(들)의 침적된 집단이 항미생물제와의 사전 접촉 단계 없이 제조됨을 특징으로 하는, 제조 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 미생물(들) 집단이 농축 단계, 집적 단계 또는 정제 단계 후 수득되거나, 적합한 배지 상에서의 성장 후 수득된 집단 또는 집단 분획에 상응함을 특징으로 하는, 제조 방법.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항미생물제가 베타-락타마제의 생성으로 인한 내성을 식별 가능하게 하는 방식으로 선택됨을 특징으로 하는, 제조 방법.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항미생물제가 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신, 카바페넴, 및 모노박탐으로부터 선택되는 항생제임을 특징으로 하는, 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 제조 방법이 상기 MALDI 기술에 의한 특징분석을 위해, 항미생물제를 수반하는 적어도 하나의 기능화된 분석 영역을 포함하는 분석판을 수득하기 위해 기능화 단계(functionalization step)를 포함하고, 상기 기능화 단계가 상기 항미생물제의 수용액을 침적시키는 단계에 이어서 건조시키는 단계에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 제조 방법.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 기능화된 분석 영역(들)이 단일 항미생물제를 수반함을 특징으로 하는, 제조 방법.
  9. 적어도 하나의 미생물 집단을 특징분석하는 방법으로서, 상기 특징분석이 적어도 하나의 항미생물제에 내성인 미생물 집단의 존재 또는 다른 사항을 결정하는 단계를 적어도 포함하고;
    상기 방법이 다음 단계들을 연속으로 포함함을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법:
    -　청구항 1에 따른 제조 방법에 따라 분석판의 적어도 하나의 특징분석 영역을 제조하는 단계;
    -　MALDI-TOF로서 공지된 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry)을 사용하여, 상기 특징분석 영역 상에 침적된 미생물 집단을 적어도 1회 분석하고, 상기 항미생물제에 내성인 미생물 집단이 상기 특징분석 영역 상에 존재하는지의 여부를 결론지을 수 있도록 하는 단계.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 항미생물제에 내성인 미생물 집단이 상기 특징분석 영역 상에 존재하는지의 여부를 결론짓기 위한 상기 MALDI-TOF 기술을 사용한 질량 분석법에 의한 분석이, 상기 항미생물제의 존재 또는 상기 항미생물제의 분해 생성물의 존재를 입증하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 특징분석이 상기 특징분석 영역 상에 침적된 미생물 집단의 과(family), 속(genus) 또는 종(species)을 동정하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법:
    ㆍ　특징분석 영역을 이온화시키는 제1 단계에 상응하는 MALDI 유형 질량 분석법에 의해 제1 분석을 수행하고 상기 분석을 위한 제1 보정을 사용하여, 상기 특징분석 영역 상에 침적된 미생물 집단의 상기 과, 속 또는 종을 동정하는 단계; 및
    ㆍ　동일한 특징분석 영역을 이온화시키는 제2 단계에 상응하는 MALDI-TOF 기술을 사용하는 질량 분석법에 의해 제2 분석을 수행하고 상기 분석을 위한 제2 보정을 사용하여, 상기 항미생물제에 내성인 미생물 집단의 상기 특징분석 영역 상에 가능한 존재를 결정하는 단계를 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 미생물 집단의 상기 과, 속 또는 종을 동정하고 상기 항미생물제의 가능한 존재 여부를 결정하는 단계는 동일한 미생물에 대한 것임을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  14. 특징분석 영역 상에 침적된 적어도 하나의 미생물 집단을 특징분석하는 방법으로서, 상기 특징분석이 적어도 다음 단계들을 포함하고;
    ㆍ　미생물(들) 집단, 항미생물제 및 MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 포함하는 특징분석 영역을 이온화시키는 제1 단계에 상응하는 MALDI 기술을 사용하는 질량 분석법에 의한 제1 분석을 수행함에 의해, 상기 미생물 집단의 과, 속 또는 종을 동정하는 단계;
    -　적어도 하나의 미생물 집단, 항미생물제 및 MALDI 기술에 적합한 매트릭스를 포함하는 특징분석 영역을 이온화시키는 제2 단계에 상응하는 MALDI 기술을 사용하는 질량 분석법에 의한 제2 분석을 수행함에 의해, 상기 적어도 하나의 항미생물제에 내성인 상기 미생물 집단의 존재를 결정하는 단계;
    상기 방법은 다음을 특징으로 하며,
    -　상기 제1 분석 및 상기 제2 분석이 상기 적어도 하나의 미생물 집단 및 상기 항미생물제를 포함하는 동일한 특징분석 영역을 이온화시키는 독특한 제1 단계 및 독특한 제2 단계에 의해 각각 수행되고;
    -　상기 제1 분석이 제1 보정을 사용하고, 그리고 상기 제2 분석이 상기 제1 보정과는 상이한 제2 보정을 사용하고,
    여기서 상기 특징분석 영역은 상기 항미생물제의 수용액을 침적시키고 이를 건조시켜 제조되거나, 상기 항미생물제가 정전기 결합, 이온 결합, 공유 결합 또는 친화성 결합에 의해 또는 상기 항미생물제의 성질 및 상기 분석 영역의 표면에 맞는 임의의 다른 유형의 결합에 의해 상기 특징분석 영역 상에 고정되거나, 상기 항미생물제가 접착제에 의해 상기 특징분석 영역 상에 고정된 것을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 침적된 집단이 특징분석될 단일 미생물을 포함함을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 특징분석하는 방법이 청구항 1에 따라 분석판의 특징분석 영역을 제조하는 방법을 사용함을 특징으로 하는, 특징분석하는 방법.
  17. MALDI 기술을 사용하는 질량 분석법에 의해 분석 영역 상에 특징분석될 적어도 하나의 미생물 집단을 수용하도록 의도된 분석판으로서, 상기 분석판이, 상기 분석판의 상기 분석 영역 상에 침적된 항미생물제를 포함하고, 기능화된 것으로 일컬어지는 분석 영역을 형성하는 것을 특징으로 하는, 분석판.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 기능화된 분석 영역이 상기 항미생물제의 수용액을 침적시키고 이어서 건조시킴에 의해 수득됨을 특징으로 하는, 분석판.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 항미생물제가 정전기 결합, 이온 결합, 공유 결합 또는 친화성 결합에 의해 또는 접착제에 의해 상기 분석 영역 상에 고정시킴을 특징으로 하는, 분석판.
  20. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 판이 전도성 물질을 함유할 수 있는 중합체로부터 형성되고, 상기 중합체가 스테인레스강의 층으로 감싸짐을 특징으로 하는, 분석판.
  21. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 판이 다수의 기능화된 분석 영역들을 포함하고, 각각이 항미생물제를 수반함을 특징으로 하는, 분석판.
  22. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 판이 제1 항미생물제를 수반하는 적어도 제1 기능화된 분석 영역, 및 상기 제1 항미생물제와는 구분되는 제2 항미생물제를 수반하면서, 상기 제1 기능화된 분석 영역과 구분되는, 제2 기능화된 분석 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분석판.
  23. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 기능화된 분석 영역이 또는 각각의 기능화된 분석 영역이 단일 항미생물제를 수반함을 특징으로 하는, 분석판.
  24. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 판이 차후에 참조 미생물 집단을 수용하도록 의도된 적어도 하나의 참조 분석 영역을 포함하고, 상기 참조 분석 영역의 표면에는 항미생물제가 없음을 특징으로 하는, 분석판.
  25. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 판이 밀폐적으로 밀봉된 포장재(packaging)에 포장됨을 특징으로 하는, 분석판.
  26. 청구항 9에 따른 특징분석하는 방법에서 사용되는, 청구항 17에 따른 분석판.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5628677B2 (ja) * 2007-10-19 2014-11-19 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ベータ−ラクタマーゼの検出のための方法および組成物
AU2016431213B2 (en) * 2016-11-30 2023-10-05 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Preparing live microbial samples and microorganisms for subsequent mass-specrometric measurement and evaluation
CN107236782A (zh) * 2017-06-05 2017-10-10 中国医学科学院北京协和医院 革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法
WO2019034437A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Conicet - Consejo Nacional De Investigaciones Científicas Y Técnicas DIRECT DETECTION OF MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY RESISTANCE MECHANISMS
KR20190054921A (ko) * 2017-11-14 2019-05-22 주식회사 노스퀘스트 항생제 변형을 유도하는 내성균에 대한 질량분석법 검사 장치 및 방법
CN110144378A (zh) * 2018-02-11 2019-08-20 上海市食品药品检验所 一种基于抗菌药物差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法
JP7317864B2 (ja) * 2018-02-13 2023-07-31 ビオメリュー・インコーポレイテッド 試料分析システム用のロードロックチャンバ組立体ならびに関連した質量分析計システムおよび方法
CN112005108A (zh) * 2018-04-16 2020-11-27 株式会社岛津制作所 质谱分析用试剂盒、微生物识别用试剂盒、试样的制备方法、分析方法和微生物的识别方法
KR102385738B1 (ko) * 2018-09-11 2022-04-13 주식회사 엘지화학 Maldi 질량분석용 수불용성 물질 시편의 제조방법 및 maldi 질량분석법을 이용한 수불용성 물질의 정량분석방법
JP2020139789A (ja) * 2019-02-27 2020-09-03 株式会社島津製作所 微生物分析用試料の調製方法、微生物の分析方法、微生物の識別方法および微生物分析用キット
FR3103900B1 (fr) * 2019-11-29 2024-07-19 Univ Du Mans Méthode d'identification rapide de microorganismes par analyse de matrices excitation-émission
KR20210084040A (ko) 2019-12-27 2021-07-07 주식회사 노스퀘스트 Maldi-tof를 이용한 카바페넴 분해효소-생성 장내세균 검출
WO2021137645A1 (ko) * 2019-12-30 2021-07-08 (재)씨젠의료재단 카바페넴 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 직접 검출 방법
FR3119459A1 (fr) * 2021-02-04 2022-08-05 bioMérieux Plaque pour une analyse par spectrometrie de masse utilisant une technique d’ionisation maldi
WO2024118601A1 (en) * 2022-11-28 2024-06-06 The Regents Of The University Of California Ionizing an aerosol for analysis of particles in the aerosol

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070092924A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Anderson Norman L Process for treatment of protein samples
WO2012023845A1 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods and means for characterizing antibiotic resistance in microorganisms
JP2013529458A (ja) * 2010-06-11 2013-07-22 ブルーカー ダルトニック ゲーエムベーハー β−ラクタマーゼ耐性の質量分析測定

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4077845A (en) * 1977-04-20 1978-03-07 Miles Laboratories, Inc. Disposable inoculation device and process of using same
JPS58179499A (ja) * 1982-04-13 1983-10-20 Wako Pure Chem Ind Ltd 細菌感受性試験ディスク
US5434053A (en) * 1992-10-06 1995-07-18 Gist-Brocades N.V. Detection of antibiotics
IL139593A (en) * 2000-11-09 2010-12-30 Biogem Optical Ltd Method for the detection of viable microorganisms
DE10140499B4 (de) † 2001-08-17 2005-02-03 Bruker Daltonik Gmbh Probenträgerplatten für Massenspektrometrie mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
JP3860130B2 (ja) * 2002-08-21 2006-12-20 東洋鋼鈑株式会社 固体支持体及び該固体支持体上に固定化された複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法
EP1613965A2 (en) * 2003-04-10 2006-01-11 Kent J. Voorhees Apparatus and method for detecting microscopic living organisms using bacteriophage
JP4740554B2 (ja) * 2004-05-12 2011-08-03 オリンパス株式会社 培養顕微鏡装置
JP2007108015A (ja) * 2005-10-13 2007-04-26 Biologica:Kk 分析用の保持体及びその利用
DE102006021493B4 (de) * 2006-05-09 2010-04-01 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Messung mikrobieller Resistenzen
CN101802213B (zh) * 2007-08-01 2013-12-25 日立化成工业株式会社 大体积颗粒样品中的病原体检测
PT2181330E (pt) * 2007-08-31 2014-02-21 Statens Seruminstitut Composições e meios para diagnóstico de infeções microbianas
FR2924225B1 (fr) * 2007-11-27 2016-12-09 Genoptics Biopuces fonctionnalisees pour le couplage spr-ms
WO2010062349A1 (en) * 2008-10-31 2010-06-03 Biomerieux, Inc. Methods for separation and characterization of microorganisms using identifier agents
GB0902033D0 (en) * 2009-02-06 2009-03-11 B V Rapid detection of bacteria using mass spectrometric analysis
FR2951548B1 (fr) 2009-10-15 2011-11-11 Biomerieux Sa Procede de caracterisation d'au moins un microorganisme par spectrometrie de masse
KR101933084B1 (ko) * 2010-11-25 2018-12-28 알레크라 테라퓨틱스 게엠베하 화합물 및 그의 용도
US20120196309A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 Yale University Methods and Kits for Detection of Antibiotic Resistance
DE102011012060A1 (de) * 2011-02-23 2012-08-23 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Bestimmung der inhibitorischen Wirkung von Substanzen gegenüber beta-Lactamasen
FR2973041A1 (fr) * 2011-03-25 2012-09-28 Biomerieux Sa Detection de bacteries presentant une resistance enzymatique aux carbapenemes
NO2714922T3 (ko) * 2011-06-03 2018-02-17
GB201201547D0 (en) 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
JP6153731B2 (ja) * 2013-01-15 2017-06-28 大成建設株式会社 菌測定方法、抗菌性及び／又は菌減少性評価方法、及び保持材
EP3081652B1 (de) 2015-04-13 2017-06-28 Bruker Daltonik GmbH Massenspektrometrischer schnelltest von resistenzen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070092924A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Anderson Norman L Process for treatment of protein samples
JP2013529458A (ja) * 2010-06-11 2013-07-22 ブルーカー ダルトニック ゲーエムベーハー β−ラクタマーゼ耐性の質量分析測定
WO2012023845A1 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods and means for characterizing antibiotic resistance in microorganisms
JP2013535974A (ja) * 2010-08-19 2013-09-19 エラスムス ユニバーシティ メディカル センター ロッテルダム 微生物における抗生物質耐性の特徴付けの方法および手段

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