JP2017523420A - Maldi−tofを介した微生物の特性解析 - Google Patents
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Abstract
Description
・微生物のコロニーを含む接種菌液を調製する工程と、
・該接種菌液を遠心分離する工程と、
・溶解試薬を用いて又は用いずに、細菌ペレットを抗生物質の溶液にて再懸濁させる工程と、
・30分〜3時間の期間インキュベートする工程と、
・遠心分離する工程と、
・1マイクロリットルの上清をMALDIプレートへと移し、1マイクロリットルのマトリックスを加え、MALDI−TOF質量分析法による分析を行う工程とを含む。
上記分析ゾーンを作製する方法は、
MALDI法による特性解析のための分析プレートを提供する工程であって、上記プレートは、抗菌剤を保持する少なくとも1つの分析ゾーンを含む、工程と、
上記少なくとも1種の微生物の集団を、上記抗菌剤と接する上記分析ゾーン上に堆積させる工程と、
上記抗菌剤と存在する上記微生物とが相互作用できる充分な時間及び条件下で上記分析プレートを保管するインキュベーション工程と、
MALDI法に適したマトリックスを上記分析ゾーン上に堆積させる工程とを順次含むことを特徴とする作製方法に関する。
本発明の作製方法に従って分析プレートの少なくとも1つの特性解析ゾーンを作製する工程と、
上記抗菌剤に耐性がある微生物の集団が上記特性解析ゾーン上に存在するかどうかを結論付けることができるように、MALDI−TOFとして知られるマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法を使用して上記特性解析ゾーン上に堆積された微生物集団を少なくとも1回分析する工程とを順次含むことを特徴とする特性解析方法に関する。
特性解析ゾーンをイオン化する第1の工程に対応するMALDI型質量分析法による第1の分析、及び、該分析のために第1の校正を行うことによって、上記特性解析ゾーン上に堆積された微生物集団の科、属又は好ましくは種を同定することと、
同一の特性解析ゾーンをイオン化する第2の工程に対応するMALDI−TOF法を用いた質量分析法による第2の分析、及び、該分析のために第2の校正を行うことによって、上記抗菌剤に耐性がある微生物の集団が上記特性解析ゾーン上に存在するかどうかを判定することとを含む。
微生物集団、抗菌剤及びMALDI法に適したマトリックスを含む特性解析ゾーンをイオン化する第1の工程に対応するMALDI法を用いた質量分析法による第1の分析を行うことによって、微生物集団の科、属又は好ましくは種を同定することと、
少なくとも1種の微生物の集団、抗菌剤及びMALDI法に適したマトリックスを含む特性解析ゾーンをイオン化する第2の工程に対応するMALDI法を用いた質量分析法による第2の分析を行うことによって、少なくとも1種の抗菌剤に耐性がある微生物の集団の存在を判定することとを少なくとも含み、
上記第1の分析及び上記第2の分析はそれぞれ、上記少なくとも1種の微生物の集団及び上記抗菌剤を含む同一の特性解析ゾーンをイオン化する別個の第1の工程及び別個の第2の工程によって行われ、
上記第1の分析は第1の校正を使用し、上記第2の分析は上記第1の校正とは異なる第2の校正を使用することを特徴とする特性解析方法を提供する。
上記分析ゾーンに抗菌剤を保持させるように上記分析ゾーンを機能化する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
MALDI分析プレートは、少なくとも1つ、一般的には複数の分析ゾーンを有する。分析ゾーンは、通常は形状が円形のスポットの形態である。後のイオン化を促進するために、少なくとも分析ゾーンのレベルで、プレートの表面は導電性である。一例として、このタイプの分析プレートは、ポリプロピレン等のポリマーによって形成されており、上記ポリマーは、ステンレス鋼の層でコーティングされている。ポリマーは、カーボンブラック等の導電性材料を含有していてもよい。一例として、該プレートは、「Fleximass(商標)DSディスポーザブルMALDIターゲット」を参考として、島津製作所によって販売されるプレートであってもよい。
「抗菌剤」という用語は、微生物の生存率を減少させる、及び/又は、その増殖若しくは繁殖を減少させることの可能な化合物を意味する。このタイプの抗菌剤は、細菌に対して適用される場合、抗生物質であってもよい。しかしながら、本発明は、細菌、酵母、カビ又は寄生生物といった任意の種類の微生物及び結果として対応する抗菌剤にも適用される。
本発明の文脈において、微生物集団は、後に引き続きそれを特性解析するために、抗菌剤で機能化されたMALDIプレートの分析ゾーン上に堆積される。
微生物集団を堆積させた後、抗菌剤及び特性解析対象の微生物の集団の両方を保持する分析ゾーンは、微生物及び抗菌剤を相互作用させ、抗菌剤に耐性がある微生物の集団の存在下にある場合には、その耐性の由来となる反応/現象を生じさせるために、インキュベーション工程に供される。特に、検出される耐性現象が、堆積された微生物によって生成される酵素の存在によるものである場合、インキュベーションは、酵素反応を生じさせるように行われてもよい。
一般的に、MALDI法に用いられるマトリックスは、感光性であり、分子及び存在する微生物の完全性を有しながら、微生物集団の存在下で結晶化する。特にMALDI−TOF MS法に適したこのタイプのマトリックスは周知であり、例えば、3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシけい皮酸、α−シアノ−4−ヒドロキシけい皮酸、フェルラ酸及び2,5−ジヒドロキシ安息香酸から選択される化合物で構成される。多くの他の化合物が当業者に知られている。大気圧下又は圧力下にあっても結晶化しない液体マトリックスも存在する。レーザビームの作用下で特性解析ゾーンに存在する分子をイオン化するために使用される任意の他の化合物を使用できる。
MALDIマトリックス中に入れられて、特性解析ゾーンを形成する微生物集団及び抗菌剤は、ソフトイオン化に供される。
・MALDI分析法に適合したマトリックス中に、研究対象の微生物集団及び少なくとも1種の抗菌剤を含む特性解析ゾーンを提供する工程と、
・場合によっては、微生物集団及び抗菌剤が配置されたマトリックスの結晶化を行う工程と、
・レーザビームを用いて、微生物集団と抗菌剤との混合物及びマトリックスをイオン化する工程と、
・電位差により得られるイオン化された分子を加速させる工程と、
・イオン化され、加速された分子を、減圧下のチューブ内で自由に移動させる工程と、
・チューブの出口において、イオン化された分子の少なくとも一部を、それらが減圧下のチューブを通過するのにかかった時間を測定し、所与の時間に検出器に到達するイオン化された分子の数に対応する信号が得られるように、検出する工程と、
・検出された分子のm/z比に応じて、同一の質量電荷比(m/z)を有するイオン化された分子の数に対応する信号が得られるように、検出された分子の質量電荷比(m/z)を計算する工程とを順次含む。
i)微生物集団と抗菌剤との混合物及びマトリックスをイオン化するためのイオン化ソース(一般的にはUVレーザ)と、
ii)電位差を加えるイオン化された分子の加速器と、
iii)イオン化され、加速された分子がその中で移動する減圧チューブと、
iv)形成された分子イオンを、それらの質量電荷比(m/z)に応じて分離するための質量分析計と、
v)分子イオンによって直接生成される信号を測定するための検出器とを含む。
「耐性」という用語は、微生物が、耐性の非存在下ではその微生物に対して有効であると認められる濃度の抗菌剤に晒されたとき、その生存率の減少又は増殖若しくは繁殖の減少を示さない現象を意味する。
a1)例えば、抗菌剤及び/又はその分解物について基準マススペクトルを提供する工程を含み、このタイプの分解物は、耐性現象の結果であり、特に分解酵素の存在によるものであり、該判定はさらに、
b1)分析ゾーン上に堆積され、マトリックスの存在下に置かれた微生物集団及び抗菌剤(本発明に係る特性解析ゾーンに対応する)にイオン化を施す工程と、
c1)耐性の判定の対象の質量範囲で、このイオン化後に得られるマススペクトルを取得する工程と、
d1)工程c1)で得られたマススペクトルと基準スペクトルとを比較し、それにより耐性が存在するか否かを推定する工程とを含んでいてもよい。
本発明の方法によって同定できる微生物は、抗菌剤への耐性現象を提示し得る産業及び臨床現場の両方において遭遇される病原性又は病原性でないあらゆるタイプの微生物である。それらは、細菌、カビ、酵母又は寄生生物であってもよく、好ましくは細菌、カビ、酵母又は寄生生物である。本発明は、特に、細菌の研究に適用される。このタイプの微生物として挙げられる例としては、グラム陽性、グラム陰性及びミコバクテリアである。グラム陰性菌の属として挙げられる例としては、シュードモナス(Pseudomonas)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、赤痢菌(Shigella)、エンテロバクター(Enterobacter)、クレブシェラ(Klebsiella)、セラチア(Serratia)、プロテウス(Proteus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、シトロバクター(Citrobacter)、アエロモナス(Aeromonas)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)、モルガネラ(Morganella)、腸球菌(Enterococcus)及びプロビデンシア(Providencia)、特に、大腸菌(Escherichia coli)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、シトロバクター(Citrobacter sp.)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumanii)、コマモナス(Comamonas sp.)、アエロモナス(Aeromonas sp.)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、腸球菌(Enterococcus sp.)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・センフテンベルク(Salmonella senftenberg)、霊菌(Serratia marcescens)、サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)等がある。グラム陽性菌の属として挙げられる例としては、腸球菌(Enterococcus)、連鎖球菌(Streptococcus)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、バチルス(Bacillus)、リステリア(Listeria)及びクロストリジウム(Clostridium)がある。
a2)少なくとも1つの微生物、通常は、一連の微生物についての基準マススペクトルを提供する工程と、
b2)分析ゾーン上に堆積され、マトリックスの存在下にある微生物集団及び抗菌剤(本発明に係る特性解析ゾーンに対応する)にイオン化を施す工程と、
c2)微生物の同定の対象の質量範囲で、このイオン化後に得られるマススペクトルを取得する工程と、
d2)工程c2)で得られたマススペクトルと基準スペクトルとを比較し、それにより少なくとも1つの微生物の科、属又は好ましくは種を推定する工程とを含んでいてもよい。
a3)少なくとも1つの微生物、通常は、一連の微生物についての基準マススペクトル1、並びに、抗菌剤及び/又はその分解物についてのマススペクトル2を提供する工程と、
b3)基準分析ゾーン上に既に堆積された、同定に使用される検量体により、使用される質量分析計を校正する工程と、
c3)分析ゾーン上に堆積され、マトリックスの存在下にある微生物集団及び抗菌剤(本発明に係る特性解析ゾーンに対応する)にイオン化を施す工程と、
d3)微生物の同定の対象の質量範囲で、このイオン化後に得られるマススペクトルを取得する工程と、
e3)基準分析ゾーン上に既に堆積された、耐性を検出するために使用される検量体により、使用される質量分析計を2回目に校正する工程と、
f3)分析ゾーン上に堆積され、マトリックスの存在下に置かれた微生物集団及び抗菌剤(本発明に係る特性解析ゾーンに対応する)に再びイオン化を施す工程と、
・g3)耐性の判定の対象の質量範囲で、このイオン化後に得られるマススペクトルを取得する工程と、
・h3)工程d3)で得られたマススペクトルと基準スペクトル1とを比較し、それにより存在する少なくとも1つの微生物の科、属又は好ましくは種を推定する工程と、
・i3)工程g3)で得られたマススペクトルと基準スペクトル2とを比較し、それにより耐性が存在するか否かを推定する工程とを含んでいてもよい。
・1つの同一の特性解析ゾーンから、情報、特に抗菌剤への耐性の現象の特性解析と微生物の同定との両方を迅速に得るため、
・抗菌剤への耐性の現象を特性解析するために、MALDIプレート上にサンプルを堆積させる前の長々として煩雑なサンプルの調製を行うことなく、MALDI−TOF分析法を簡略化するため、
・耐性現象の検出の感度に良い影響を与える場合もある微生物と抗菌剤との最適な接触をMALDIプレート上で直接行うため、
・MALDI−TOFによって抗菌剤への耐性の現象の特性解析を行うために、消耗品及び手動操作に関して時間及びコストの減少を得るため、
・MALDIプレート上に堆積される前に、抗菌剤の存在下での先のインキュベーションが不要となることから、分析されるサンプルのより良いトレーサビリティ及びより良い管理を得るために、使用されることができる。
・同定のためには、Spectra Identifier Version:2.1.0ソフトウェアに含まれるVITEK MSエンジン及びデータベースV2.0.0を利用してスペクトルを分析した。
・加水分解のためには、Launchpad V2.8取得ソフトウェアを利用してスペクトルのピークを視覚化した。
・水にアンピシリンを10mg/mLの濃度に溶解した溶液2μLを、MALDIプレートの分析ゾーン上へ液滴の形態で堆積させた。その液滴が完全に乾くまで、プレートを37℃でインキュベートした。
・組換えβ−ラクタマーゼ(緑膿菌由来β−ラクタマーゼ、Sigma−Aldrich バッチL6170−550UN.CAS:9073−60−3)2μL。
・水に組換えβ−ラクタマーゼを1mg/mLの濃度で溶解した溶液2μLを、酵素活性を促進させるために、硫酸亜鉛(0.76ミリモル(mM))の形態の亜鉛を補足した水に希釈して使用し、アンピシリンを保持する乾いた分析ゾーン上に堆積させた。さらに、アンピシリンで同様に処理した別の分析ゾーン上に、亜鉛0.76mMを含有するが、酵素は含有しない2μLの水1滴を堆積させることによって、陰性コントロールを同時に行った。
・酵素反応が起きるようにプレートを周囲温度で1時間インキュベートした。
・組換えβ−ラクタマーゼを用いて又は用いずに、既にアンピシリンを含有する分析ゾーン上に、HCCAマトリックスであるα−シアノ−4−ヒドロキシけい皮酸(VITEK MS CHCAマトリックス、bioMerieux、製品番号:411071)1μLを堆積させた。
・HCCAと、検量体として用いたpepMIX6(LaserBio Labsより購入)との混合物2μLを使用して、VITEK(登録商標)MS装置でMALDI−TOF質量分析を行った。該混合物は、低質量について装置を校正するために、基準分析ゾーン上に堆積させておいた。この混合物は、9のHCCAに対して1のpepMix6(10X)を加えることによって調製された。pepMix6(10X)の溶液は、製造業者の勧告に従って、希釈剤(超純水に溶解したトリフルオロ酢酸の0.01%溶液)にて調製した。200Da〜1200Daの低質量範囲についてピークを取得し、アンピシリンの未変性分子又は加水分解後のその分解副生成物に対応する分子の存在を研究した。
・亜鉛(0.76mM)を補足した10mg/mLの濃度のアンピシリンの水溶液2μLを、MALDIプレートの分析ゾーン上に堆積させた(実施例1と同様)。
・堆積させた溶液の液滴が完全に乾くまで、プレートを37℃でインキュベートした。
・各菌株について、ゲル培地で24時間増殖させた後に得られたコロニーの一部を、アンピシリンを保持する分析ゾーン上に2つ堆積させた。各スポットは、微生物の同定のためのVITEK(登録商標)MS手順に記載される通りに得られた。
・プレートを、湿った雰囲気下周囲温度(20〜25℃)で1時間インキュベートした。このために、プレート用インキュベーションチャンバとして、水を含有する閉鎖された容器を使用した。
・抗生物質及び細菌の両方を保持する分析ゾーンにHCCAマトリックス1μLを加えた。
・プレートを装置のチャンバ内に入れた後、真空下に置いた状態で、次の2つの工程を行うことによって、VITEK(登録商標)MS装置によりMALDI−TOFマススペクトル分析を行った。すなわち、
堆積させた大腸菌株を保持する基準ゾーンより装置を校正した(E−cal)後の、特性解析ゾーンのスペクトルの第1の取得。
pepMIX6を検量体として用いて装置を小さい質量について校正した後の、同一の特性解析ゾーンの第2の取得。この第2の取得は、チャンバの真空を破らずに、また、プレートを装置から取外さずに、第1の取得の直後に行った。
・種を同定するために、データを収集してデータベースに含まれるデータと比較した。
・抗生物質の未変性型又は加水分解型を検出するために、低質量範囲のピークを見た。
・ヘプタキスとファロペネムとの混合物を含有する溶液2つと、ヘプタキスを含有しないファロペネムの溶液1つとを、亜鉛(硫酸亜鉛、0.76mM)を補足したNaCl緩衝液(0.45%)を用いて調製した。これらの溶液中のヘプタキス及びファロペネムの最終濃度は次の通りであった。
ヘプタキス0mg/mL及びファロペネム1mg/mL
ヘプタキス0.1mg/mL及びファロペネム1mg/mL(重量比1:10)
ヘプタキス0.2mg/mL及びファロペネム1mg/mL(重量比1:5)
・各溶液2μLを(実施例1に従って)MALDIプレートの分析ゾーン上に堆積させた。
・堆積させた溶液の液滴が完全に乾くまで、プレートを周囲温度でインキュベートした。
・付着性を評価するために、ファロペネム又はヘプタキス/ファロペネムで機能化された各分析ゾーンを、コロニーの堆積を模倣するために接種ループを利用してかき取り、スライドを撮像した。
・ファロペネムピークの検出に対するヘプタキスの濃度の影響を評価するために、ゲル培地で24時間増殖させた後に得られたコロニーの一部を、ファロペネムを単独で保持するか又はファロペネムとヘプタキスとの混合物を保持する分析ゾーン上に4連で堆積させた。
・湿った雰囲気下37℃で2時間プレートをインキュベートした。
・抗生物質又はヘプタキス/抗生物質混合物及び細菌をさらに保持する分析ゾーンにHCCAマトリックス1μLを加えた。
・低マススペクトルを取得するために、VITEK(登録商標)MS装置を用いてMALDI−TOF質量分析による分析を行った。
・308.3m/zにファロペネムの未変性型のピーク(ファロペネム+Na)及び304.3m/zにファロペネムの加水分解型のピーク(加水分解されたファロペネム+H)並びに212.03m/zにHCCAのピークが見られた。
・すべての試験条件について、これらの3つのピークの強度を記録し、308/212比及び304/212比を計算した。本例においては、不変強度のコントロールピークとして、212m/zでのHCCAのピークを使用した。
・亜鉛(硫酸亜鉛、0.76mM)を補足したNaCl緩衝液(0.45%)を用いて調製した1mg/mLの濃度のファロペネムの溶液2μLを、MALDIプレートの分析ゾーン上に堆積させ、周囲温度で乾燥させた。
・3マクファーランド又は6マクファーランドの濃度の接種菌液2μLを機能化された分析ゾーンに4連で塗布した。
・湿った雰囲気下37℃で2時間プレートをインキュベートした。
・抗生物質及び細菌の両方を保持する分析ゾーンにHCCAマトリックス1μLを加えた。
・(実施例2に従って)2回の取得のために、すなわち、ファロペネムピークを観測するために低マススペクトルで1回、及び、同定のために高マススペクトルでもう1回、VITEK(登録商標)MS装置によりMALDI−TOF質量分析を行った。
・308.3m/zに未変性型のピーク(ファロペネム+Na)及び330.3m/zに未変性型のピーク(ファロペネム+2Na)並びに304.3m/zに加水分解型のピーク(加水分解されたファロペネム+H)が見られた。
・すべての試験条件について、これらの3つのピークの強度を記録し、ファロペネムの加水分解を定量するために、304/308比及び304/330比を計算した。
・カセットからカバーを取り外す工程と、
・12個のウェルに50μL〜100μLの量の水又は生理緩衝液を充填する工程とを含み、混濁度コントロールを含む6つのウェルに充填することにより、混濁溶液が形成され、該プロトコルはさらに、
・対向するウェルの混濁度コントロールと同等の濁度が得られるようにコロニー又はコロニーの一部を加えることによって、他の6つのウェルにて接種菌液を調製する工程と、
・抗生物質を保持する分析ゾーン上に各接種菌液を2μL堆積させる工程と、
・湿った雰囲気を発生させるために、ピペットを利用してカセットに水を加える工程と、
・カバーを再配置して、1時間〜2時間(又はそれ以下)37℃でインキュベートする工程と、
・抗生物質及び細菌の両方を保持する分析ゾーンにHCCAマトリックス1μLを加える工程と、
・MALDI−TOF質量分析による分析のためにスライドを回収する工程とで説明されてもよい。
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Claims (26)
- 少なくとも1種の抗菌剤の存在下で少なくとも1種の微生物の集団の少なくとも1つの特性解析を行うために分析プレートの特性解析ゾーンを作製する方法であって、上記特性解析は質量分析法による分析を含み、該分析中に、上記分析ゾーン上に堆積された上記少なくとも1種の微生物の集団は、MALDIとして知られるマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法に従って上記分析ゾーンにレーザビームを照射することによって少なくとも1つのイオン化工程に供され、
上記分析ゾーンを作製する方法は、
MALDI法による特性解析のための分析プレートを提供する工程であって、上記プレートは、抗菌剤を保持する少なくとも1つの分析ゾーンを含む、工程と、
上記少なくとも1種の微生物の集団を、上記抗菌剤と接する上記分析ゾーン上に堆積させる工程と、
上記抗菌剤と存在する上記微生物とが相互作用できる充分な時間及び条件下で上記分析プレートを保管するインキュベーション工程と、
MALDI法に適したマトリックスを上記分析ゾーン上に堆積させる工程とを順次含むことを特徴とする作製方法。 - 特性解析対象の単一の微生物の集団が堆積されることを特徴とする請求項1に記載の作製方法。
- 上記堆積された微生物集団は、抗菌剤と接触する事前の工程無しに調製されることを特徴とする請求項1又は2に記載の作製方法。
- 上記微生物集団は、濃縮、富化及び/又は精製の工程後に得られるもの、及び/又は、好適な培地、特にゲル培地での増殖後に得られるコロニー又はコロニーの画分に相当するものであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の作製方法。
- 上記抗菌剤は、β−ラクタマーゼ、特にカルバペネマーゼの産生による耐性が同定できるように選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の作製方法。
- 上記抗菌剤は、抗生物質であり、好ましくはペニシリン類、セファロスポリン類、セファマイシン類、カルバペネム類及びモノバクタム類から、特にアンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、ピペラシリン、セファロチン、セフロキシム、セフォキシチン、セフィキシム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフポドキシム、セフェピム、アズトレオナム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム及びファロペネムから選択されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の作製方法。
- 抗菌剤を保持する少なくとも1つの分析ゾーンを含むMALDI法による特性解析のための上記分析プレートを得るための機能化工程を含み、上記機能化工程は、好ましくは、上記抗菌剤の水溶液を堆積させてから乾燥させることによって行われることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の作製方法。
- 上記機能化された分析ゾーンは、単一の抗菌剤を保持することを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の作製方法。
- 少なくとも1種の微生物の集団を特性解析する方法であって、該特性解析は、少なくとも1種の抗菌剤に耐性がある微生物の集団が存在するか否かを判定することを少なくとも含み、上記方法は、
請求項1〜8のいずれか一項に記載の作製方法に従って分析プレートの少なくとも1つの特性解析ゾーンを作製する工程と、
上記抗菌剤に耐性がある微生物の集団が上記特性解析ゾーン上に存在するかどうかを結論付けることができるように、MALDI−TOFとして知られるマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法を使用して上記特性解析ゾーン上に堆積された微生物集団を少なくとも1回分析する工程とを順次含むことを特徴とする特性解析方法。 - 上記抗菌剤に耐性がある微生物の集団が上記特性解析ゾーン上に存在するかどうかを結論付けるためにMALDI−TOF法を用いた質量分析法によって行う上記分析は、上記抗菌剤及び/又は上記抗菌剤の分解物の存在を検証することからなることを特徴とする請求項9に記載の特性解析方法。
- 上記特性解析はさらに、上記特性解析ゾーン上に堆積された微生物集団の科、属又は好ましくは種を同定することを含むことを特徴とする請求項9又は10に記載の特性解析方法。
- 特性解析ゾーンをイオン化する第1の工程に対応するMALDI型質量分析法による第1の分析、及び、該分析のための第1の校正を行うことによって、上記特性解析ゾーン上に堆積された微生物集団の科、属又は好ましくは種を同定することと、
同一の特性解析ゾーンをイオン化する第2の工程に対応するMALDI−TOF法を用いた質量分析法による第2の分析、及び、該分析のための第2の校正を行うことによって、上記抗菌剤に耐性がある微生物の集団が上記特性解析ゾーン上に存在するかどうかを判定することとを特徴とする請求項9〜11のいずれか一項に記載の特性解析方法。 - 上記微生物集団の科、属又は好ましくは種の同定、及び、上記抗菌剤が存在するかどうかの判定は、同一の微生物に関わることを特徴とする請求項11又は12に記載の特性解析方法。
- 少なくとも1種の微生物の集団を特性解析する方法であって、該特性解析は、
微生物集団、抗菌剤及びMALDI法に適したマトリックスを含む特性解析ゾーンをイオン化する第1の工程に対応するMALDI法を用いた質量分析法による第1の分析を行うことによって、微生物集団の科、属又は好ましくは種を同定することと、
少なくとも1種の微生物の集団、抗菌剤及びMALDI法に適したマトリックスを含む特性解析ゾーンをイオン化する第2の工程に対応するMALDI法を用いた質量分析法による第2の分析を行うことによって、少なくとも1種の抗菌剤に耐性がある微生物の集団の存在を判定することとを少なくとも含み、
上記第1の分析及び上記第2の分析はそれぞれ、上記少なくとも1種の微生物の集団及び上記抗菌剤を含む同一の特性解析ゾーンをイオン化する別個の第1の工程及び別個の第2の工程によって行われ、
上記第1の分析は第1の校正を使用し、上記第2の分析は上記第1の校正とは異なる第2の校正を使用することを特徴とする特性解析方法。 - 堆積させた上記集団は、特性解析対象の単一の微生物を含むことを特徴とする請求項14に記載の特性解析方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の分析プレートの特性解析ゾーンを作製する方法を用いることを特徴とする請求項14又は15に記載の特性解析方法。
- MALDI法を用いた質量分析法によって分析ゾーン上で特性解析対象の少なくとも1種の微生物の集団を受けるための分析プレートであって、該分析プレートの上記分析ゾーン上に、特に固形堆積物の形態で、堆積された抗菌剤を含むことにより、機能化されたと言われる分析ゾーンを形成していることを特徴とする分析プレート。
- 上記機能化された分析ゾーンは、上記抗菌剤の水溶液を堆積させてから乾燥させることによって得られることを特徴とする請求項17に記載の分析プレート。
- 上記抗菌剤は、静電結合、イオン結合、共有結合若しくは親和性結合によって、又は好ましくは、水溶性ポリマー等から選択される接着剤によって、上記分析ゾーン上に固定化されることを特徴とする請求項17又は18に記載の分析プレート。
- 上記プレートは、カーボンブラック等の導電性材料を含んでいてもよいポリプロピレン等のポリマーから形成されており、該ポリマーは、ステンレス鋼の層で被覆されていることを特徴とする請求項17〜19のいずれか一項に記載の分析プレート。
- 上記プレートは、各々が抗菌剤を保持する複数の機能化された分析ゾーンを含むことを特徴とする請求項17〜20のいずれか一項に記載の分析プレート。
- 上記プレートは、第1の抗菌剤を保持する第1の機能化された分析ゾーンと、上記第1の抗菌剤とは異なる第2の抗菌剤を保持する上記第1のゾーンとは異なる第2の機能化された分析ゾーンとを少なくとも含むことを特徴とする請求項17〜21のいずれか一項に記載の分析プレート。
- 上記機能化された分析ゾーンは、単一の抗菌剤を保持することを特徴とする請求項17〜22のいずれか一項に記載の分析プレート。
- その後の工程で基準微生物の集団を受けるための少なくとも1つの基準分析ゾーンを含み、該基準分析ゾーンの表面は抗菌剤を含まないことを特徴とする請求項17〜23のいずれか一項に記載の分析プレート。
- 密閉されたパッケージに包装されることを特徴とする請求項17〜24のいずれか一項に記載の分析プレート。
- 請求項9〜16のいずれか一項に記載の特性解析方法における請求項17〜25のいずれか一項に記載の分析プレートの使用。
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