KR102124151B1 - 탈착 이온화를 위한 질량 분광 샘플 지지대 상의 생물학적 세포의 제조 - Google Patents

탈착 이온화를 위한 질량 분광 샘플 지지대 상의 생물학적 세포의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분류학적 분류, 항생제 내성, 약 또는 다른 활성 물질에 대한 반응 등과 같은 세포 특성의 질량 분광 분석을 위한 생물학적 세포의 준비에 관한 것이다. 세포는 특히 질량 분광 샘플 지지대 상에 직접 배양된 원핵성 또는 진핵성 미생물, 또는 조직 또는 세포 배양물로부터의 진핵 세포일 수 있다. 본 발명은 세포가 매트릭스-보조된 레이저 탈착 (MALDI)에 의한 후속 이온화를 위한 매트릭스 용액을 첨가하여 분쇄되지 않지만, 이들은 산 및/또는 용매를 이용하여 샘플 지지대 자체 상에서 분리된 처리에서 분쇄된다는 것을 제시한다. 놀랍게도, 그 결과 방출된 세포 단백질은 샘플 지지대 상에 접착되고 그 결과 이들은 조심스럽게 완충 용액으로 세척되어, 초기 처리 단계, 예를 들면 배양 용액으로부터의 유래할 수 있는 염 또는 다른 용해성 불순물을 제거될 수 있다.

Description

탈착 이온화를 위한 질량 분광 샘플 지지대 상의 생물학적 세포의 제조 {PREPARATION OF BIOLOGICAL CELLS ON MASS SPECTROMETRIC SAMPLE SUPPORTS FOR DESORBING IONIZATION}
본 발명은 분류학적 분류 (taxonomic classification) (동정), 항생제 내성, 약물 또는 다른 활성 물질에 대한 반응 등과 같은 세포 특성의 질량 분광학적 분석을 위해, 질량 분광학적 샘플 지지대 상에서 생물학적 세포로부터 단백질을 제조하는 것에 관한 것이다. 세포는 원핵 (prokaryotic) 또는 진핵 (eukaryotic) 미생물 또는 조직으로부터 진핵 세포일 수 있다; 특정 영향 하에서의, 예를 들면 특정 물질의 존재 하에서의 이들의 성장으로부터 특정 세포 특성에 대해 도출되는 판단을 가능하게 하기 위해, 이들은 배양 매질 중의 샘플 지지대 플레이트 상에서 특별히 배양될 수 있다.
본 발명은 질량 분광 샘플 지지대 상의 세포가 매트릭스-보조된 레이저 탈착 (matrix-assisted laser desorption; MALDI)에 의한 후속 이온화를 위한 매트릭스 용액을 가함으로써 분쇄되지 않지만, 이들이 (유기) 산 및/또는 용매를 이용한 분리된 처리 단계에서 분쇄된다는 것을 제시한다. 놀랍게도, 그 이후 세포로부터 방출된 무거운 단백질이 샘플 지지대에 접착하고, 따라서 이들은 거기서 완충 용액으로 직접 세척되어 염 및 다른 용해성 불순물이 제거될 수 있으며, 현저한 양의 단백질이 세척되는 것을 통해 분석으로부터 손실되는 것 없이, 세척되어 제거될 수 있다.
특허 출원 PCT/DE2016/100561 (K. Becker 및 E. Idelevich: "Aufbereitung lebendiger, mikrobieller Proben und Mikroorganismen fur anschließende massenspektrometrische Messung und Auswertung" ("Preparation of Living, Microbial Samples and Microorganisms for Subsequent Mass Spectrometric Measurement and Evaluation"))은 추가적인 성장을 관찰함으로써 내성이 존재하는지 아닌지를 결정하기 위해, 질랑 분광 샘플 지지대 플레이트 상의 미생물이 어떻게 배양 용액 (nutrient solutions), 예를 들면 항생제의 첨가 및 미첨가 배양액 중에서 배양될 수 있는지를 자세히 설명한다. 이 문서 및 이의 모든 내용은 본 명세서에서 참조로 포함될 것이다.
이러한 문서 내에서 설명된 방법은 생물학적 세포의 특정 특성의 매우 빠르고 단순한 MS-기반 분석의 신규한 방법을 나타낸다; 예를 들면 상기 특정 특성은 항생제 또는 약물에 대한 세포의 반응에 관하여 또는 생물학적 세포의 추가적인 특성화에 관한 것이다. 개시사항은 특히 샘플 가공 및 샘플 제조 방법에 관한 것이고 또한 데이터 평가 알고리즘에 관한 것이다.
인용된 문서의 바람직한 양태는 다음 단계들을 포함하는, 후속 질량 분광 측정을 위한 살아있는, 미생물 샘플을 준비하는 방법에 관한 것이다: (a) 샘플을 위한 몇몇 도포 부위("스팟(spot)"으로 불림)를 포함하는 평편한 샘플 지지대를 제공함; (b) 적어도 하나의 살아있는, 미생물 샘플을, 적어도 하나의 샘플 스팟 상의 배양 매질 액적 중에서 침적시킴; (c) 미생물이 성장하고 번식하도록, 소정의 시간 동안 한정된 (defined) 분위기를 갖는 배양 챔버 내에 샘플 지지대를 위치시킴; (d) 샘플 스팟 상의 미생물의 침적을 드러내기 위해, 소정의 시간의 기간 후 배양 매질 액적으로부터 잔여 액체를 제거함; (e) 탈착 이온화 (desorbing ionization)를 위한 샘플 스팟을 준비; (f) 샘플 지지대를 질량 분석기의 탈착 이온 공급원으로 이동시키고, 준비된 샘플 스팟으로부터 이온을 생성시키고 적어도 하나의 대응하는 질량 분광을 얻음; 및 (g) 미생물 샘플의 적어도 하나의 특성을 측정하기 위해 레퍼런스 데이터 세트와 얻어진 질량 분광을 비교함.
이 방법은 예를 들면 상이한 종류의 항생제 존재 하에 미생물학적 세포의 성장을 측정하기 위해 사용될 수 있고; 추가적인 성장은 미생물학적 세포가 사용된 항생제에 내성이 있는지 또는 민감성인지 (susceptible)를 드러낸다.
상기 방법은 가끔 어려움에 부딪힌다. 언급된 방법으로 잔여 액체로부터 미생물의 분리, 예를 들면 블로팅 페이퍼 (blotting paper)의 시트 또는 피펫으로 빼내는 것은, 살모넬라 및 다른 편모충류의 경우처럼, 미생물이 액체의 표면 상에서 수영할 때 성공하지 않을 수 있으며, 이는 예를 들면 그 결과 미생물 또한 빠질 높은 위험이 있기 때문이다. 세포를 샘플 지지대 표면에 결합시키고 이어서 이들을 준비하기 위해 배양 용액을 건조하는 것은 배양 용액으로부터 염 및 다른 구성물질을 남기며, 이는 매트릭스-보조된 레이저 탈착에 의한 이온화에 불리한 영향을 미치고 많은 단백질에 대한 민감성을 현저하게 감소시킨다. 또한 건조된 미생물 샘플은 세척될 수 없는 경우가 자주 있으며, 이는 많은 종의 미생물이 배양 용액이 건조된 후 샘플 지지대의 표면에 충분히 견고하게 접착하지 않기 때문이다.
매우 일반적으로, 생물학적 세포는 이들의 구성성분, 특히 이들의 단백질을 측정하기 위해 분쇄돼야만 하며, 이는 차후 이온화를 위한 단백질을 방출하기 위힘이다. 문맥에서 "분쇄(disruption)"는 세포 벽의 파괴 및 단백질이 세포 밖으로 이주할 수 있도록 세포 내부의 단백질 복합체의 분해를 의미한다.
2가지 방법이 이러한 분쇄를 위해 추천된다: (1) 특별한 용기 내에서 산의 도움으로 세척된 미생물의 원심분리, 추가적인 원심분리 및 세포로부터의 단백질을 갖는 상층액의 질량 분광 샘플 지지대로의 이송에 의한 "외부(external)" 분쇄, 및 (2) 매트릭스 물질의 용액, 즉 대부분의 미생물을 분쇄되게 하는, 유기 용매 중의 유기산을 가하여 샘플 지지대에 도포된 세포의 분쇄. 매트릭스 용액은 동시에 매트릭스-보조된 레이저 탈착 (MALDI)에 의한 차후 이온화를 위한 샘플을 준비시킨다. 미생물의 동정을 위한 방법에서, 외부 분쇄는 높은 퍼센트의 명백한 (unequivocal) 동정을 제공하지만, 다수의 원심분리 때문에 현저하게 긴 시간이 걸리고 더 많은 업무가 부담된다(more work-intensive).
논문 "Evaluation of a Simple Protein Extraction Method for Species Identification of Clinically Relevant Staphylococci by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry" (N. Matsuda 등, J. Clin. Microbiology, 50, 3862-3866, 2012)에서, 70% 포름산으로 샘플 지지대 플레이트 상의 미생물의 분쇄는 언급된 2가지 방법에 더하여 조사되며, 외부 분쇄와 유사하게 좋은 결과를 갖지만, 현저하게 적은 시간과 업무를 요구한다.
공개 문헌 "Evaluation of a Short, On-Plate Formic Acid Extraction Method for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry-Based Identification of Clinically Relevant Yeast Isolates" (R. L. Gorton 등, J. Clin. Microbiology 52, 1253-1255, 2014)에서 샘플 지지대 플레이트 상의 세포의 분쇄는 효모 (yeast) 세포였던 것을 빼고 똑같이 조사되었고, 동정의 성공이 외부 분쇄에 비해 현저하게 낮다.
이러한 두 문헌 모두에서, 샘플은 샘플 지지대 상의 분쇄 바로 후 건조되고 MALDI에 의한 이온화를 위한 매트릭스 용액으로 준비된다. 염 또는 다른 불순물이 특히 제거되지 않는다; 도포된 생물학적 세포는 MALDI 제조를 위해서 명백히 항상 충분하게 깨끗했다.
그러므로 질량 분광 샘플 지지대 상의 염 및 다른 용해성 불순물로 오염된 세포를 허용하는 방법, 예를 들면 샘플 지지대 자체 상의 배양 액적 내 배양 후, 탈착 이온화(예를 들면 MALDI로 보조됨)의 민감도가 거의 완전히 보유되는 방식으로 제조되는 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 이제 질량 분광 샘플 지지대의 샘플 스팟 상의 생물학적 세포가 매트릭스 용액의 첨가에 의하지 않고, 매트릭스-없는 (유기) 산 및/또는 용매를 이용한 분리된 처리 단계에서 분쇄되는 것을 제시한다. 이러한 분쇄에 의해 방출된 세포 단백질은 놀랍게도 샘플 지지대의 표면에 잘 접착하고 세척 완충액, 예컨대 정제수로 세척되어 염, 세제(detergent), 완충 물질 및 앞선 처리 단계로부터 기인할 수 있는 다른 용해성 불순물을 제거할 수 있다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, 세포 특성, 예를 들면 미생물의 분류학적 분류 또는 이들의 항균성 물질에 대한 내성의 질량 분광학적 측정을 위한 샘플 지지대 상의 비정제된 생물학적 세포(예를 들면 미생물)의 샘플로부터 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다:
- 상기 생물학적 세포를 샘플 지지대의 샘플 스팟 상에 제공하는 단계로서, 상기 샘플 지지대는 스테인리스 강 플레이트 (stainless steel plate), 소수성 환경 내 친수성 앵커(anchor)를 갖는 플레이트 ("AnchorChipTM"), 또는 코팅된 세라믹 물질로 만들어진 플레이트를 포함할 수 있는 것인, 단계,
- 상기 샘플 스팟 상에서 (유기) 산 및/또는 용매의 도움으로 상기 세포를 분쇄하여, 세포 단백질은 복합체 (complexes)로부터 분리되고, 분쇄된 세포로부터 이동하고, 상기 샘플 스팟에 접착적으로 (adhesively) 결합되도록 하는 것인, 단계,
- 상기 샘플 스팟 상 세포 단백질을 (고정) 완충 용액으로 세척하는 단계, 예를 들면 수 마이크로리터의 수용성 용액 (특히 순수한 탈이온화 수)를 샘플 스팟에 도포하여, 이를 거기서 소정의 시간의 기간 동안 두고, 이어서 이를 제거하는 단계에 의함, 및
- 상기 세척된 세포 단백질을 후속 탈착 이온화를 위해 준비하는 단계, 예를 들면 매트릭스-보조된 레이터 탈착에 의한 후속 이온화를 위해 샘플 스팟 상에 매트릭스 용액을 가하고 결정화하는 단계에 의함.
다양한 구현예에서, 생물학적 세포의 제공은 질량 분광 샘플 지지대의 샘플 스팟 상의 배양 액체 중 미생물의 배양을 포함할 수 있다. 대안적으로, 미생물은 또한 외부 배양 용기 중에서 배양되고, (비정제된) 배양된 미생물의 샘플 지지대의 샘플 스팟으로 차후에 이송될 수 있다.
생물학적 세포가 미생물을 포함한다면, 이들은 항균성 물질이 첨가된 배양 액체 및 항균성 물질이 첨가되지 않은 배양 액체 내에서 샘플 지지대의 상이한 샘플 스팟 상에서 배양될 수 있고, 항균성 물질에 대한 이들의 내성은 이러한 물질의 존재 하에서의 추가적인 성장에 의해 측정될 수 있다.
상이한 구현예에서, 항균성 물질의 존재 하의 성장은 소정의 투여량 (a dosed quantity)으로 첨가된 레퍼런스 물질과 이를 비교함으로써 측정될 수 있으며, 특히, 전체 내용이 본 개시에서 참조로 포함되는, EP 2 806 275 B1 및 WO 2014/187517 A1를 참고한다.
세포 특성, 특히 미생물의 세포 특성은 바람직하게는, m/z 3,000 초과, 특히 약 m/z 3,000 및 m/z 15,000 사이의 질량 범위의 질량 분광 단백질 신호를 기초로 하여 측정된다.
본 발명의 원리에 따른 항생제/항진균제(antimycotics)에 대한 내성을 측정하기 위한 방법의 바람직한 변형은 예를 들면 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
(1) 항생제/항진균제가 있는 배양 매질 및 항생제/항진균제가 없는 배양 매질 중의 세포를 샘플 지지대의 상이한 샘플 스팟에 도포하는 단계,
(2) 종 및 항생제에 따른 시간 동안 챔버 내에서 배양하는 단계로서, 상기 챔버는 일정한 조건(특히 습도 및 온도)을 제공하는 것인, 단계,
(3) 샘플 스팟 상의 샘플을 더 높은 온도에서 건조시키는 단계,
(4) 세포를 분쇄시키고 단백질이 확산되도록 하기 위하여, 1 마이크로리터의 물 중 70% 포름산을 가하는 단계,
(5) 샘플 스팟 상의 분쇄된 세포를 더 높은 온도에서 건조시키는 단계,
(6) 3 마이크로리터의 H2O를 샘플 스팟에 가하여, 짧은 시간 (~ 3분) 동안 반응하게 두고 이를 빼내는 (피펫 또는 샘플 스팟으로부터 액체를 제거하기 위한 특별한 장치로) 단계,
(7) 샘플 스팟 상 남아있는 수분을 건조되도록 하는 단계.
(8) 샘플 스팟 상으로 매트릭스 용액 (내부표준(internal standard)로 적절한 곳에서)을 피펫팅하고(pipetting) 건조되도록 하는 단계,
(9) 질량 분광기, 예를 들면 MALDI 비행시간 질량 분광기(time-of-flight mass spectrometer)로 단백질 프로파일을 측정하는 단계.
단계 (3)에서, 온도는 예를 들면 30 ℃ 내지 60℃ 사이일 수 있고, 또는 심지어 더 높은 드문 경우일 수 있다. 단계 (4)에서, 다른 변성 휘발성 용매(denaturing volatile solvent)가 사용될 수 있다, 예를 들면 물 중 50% 아세톤 또는 물 중 50% 아세토나이트릴, 2.5% 트리플루오로아세트산 및 47.5% 물.
세척 과정이 샘플 지지대 자체 상에서 일어나는 것인, 본 명세서에서 제시된 방법은 세척 없는 방법보다 몇 분 더 길게 걸림에도 불구하고, 현저한 이점을 갖는다. 놀랍게도, 세포로부터 방출된 무거운 단백질은 세척 단계 동안 상대적으로 견고하게 샘플 지지대의 표면에 결합되어 남아있고, 그러므로 매우 불용성이다; 오직 염 및 다른 용해성 구성성분은, 예를 들면 배양 매질로부터의 염 및 다른 용해성 구성성분은, 용액으로 들어가고 세척 완충액과 함께 제거된다. 놀랍게도, 이는 폴리싱된 스테인리스 강으로 만들어진 샘플 지지대 플레이트 상에서 및 친숙한 앵커 (anchor) 타겟 ("AnchorChipTM") 상에서 및 세라믹 물질로 만들어진, 최근에 시판되기 시작한 "바이오타겟(biotarget)"상 모두에서 작용한다. 반대로, 특허 출원 PCT/DE2016/100561에서 바람직한 방법으로 설명된 것과 같이, 샘플 지지대로부터의 배양 상층액을 건조하는 대신에 이를 빼는 과정에 따르는 경우, 샘플 지지대 표면에 매우 적게 접착하거나 접착하지 않는 미생물 종을 손실할 위험이 존재할 것이다. 일부 살모넬라 종이 이것의 예시로 주어질 수 있다; 이들은 편모충류이고 그 결과 액체의 표면 상에서 헤엄치며(swim) 그러므로 쉽게 빠질 수 있다.
비교 측정은 샘플 지지대 상의 세척의 도움으로 얻은 분광이 비세척된 샘플의 분광보다 상당히 좋은 품질임을 보여주며, 이는 이온화 (특히 MALDI 방법으로)에 방해되는 염의 양이 세척 단계로 인해 현저하게 감소되기 때문이다.
추가적인 양태에 따라, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는, 특히, 세포 특성, 예를 들면 분류학적 분류 또는 항균성 물질에 대한 미생물의 내성의 질량 분광학적 측정을 위해 생물학적 세포 (예를 들면 미생물)의 샘플로부터 단백질을 준비하는 방법에 관한 것이다:
- 배양용 용액 중 생물학적 세포를 질량 분광 샘플 지지대의 샘플 스팟 상에서 직접 배양하는 단계로서, 상기 샘플 지지대는 스테인리스 강 플레이트 (stainless steel plate), 소수성 환경 내 친수성 앵커를 갖는 플레이트 ("AnchorChipTM"), 또는 코팅된 세라믹 물질로 만들어진 플레이트를 포함할 수 있는 것인, 단계,
- 상기 샘플 스팟 상에 배양된 세포를 (유기) 산 및/또는 용매의 도움으로 분쇄하여, 세포 단백질은 복합체로부터 분리되고, 분쇄된 세포로부터 이동하고, 상기 샘플 스팟에 접착적으로 결합되도록 하는 것인, 단계,
- 상기 샘플 스팟 상 세포 단백질을 (고정) 완충 용액으로 세척하는 단계, 예를 들면 수 마이크로리터의 수용성 용액 (특히 순수한 탈이온화 수)를 샘플 스팟에 도포하여, 이를 거기서 소정의 시간의 기간 동안 두고, 이어서 이를 제거하는 단계에 의함, 및
- 후속 탈착 이온화를 위해 샘플 지지대 상에 세척된 세포 단백질을 준비하는 단계, 예를 들면 매트릭스-보조된 레이터 탈착에 의한 후속 이온화를 위해 샘플 스팟 상에 매트릭스 용액을 가하고 결정화하는 단계에 의함.
순수한 또는 살짝 산성화된, 탈이온수는 특히 본 개시에서 설명된 방법에서 세척 완충액으로 적합함이 증명되었다.
도 1은 미생물의 내성을 측정하기 위해 사용된 방법의 단계들을 나타낸다.
도 2는 도 1 내에서 개요로 주어진 절차가 수행된 후 얻어진 질량 분광을 나타낸다. 이러한 질량 분광은 항생제 부재 하에 및 존재 하에 배양된 후 각각 항생제-민감성인 박테리아 균주 (대장균(E. coli.)) 및 항생제-내성 박테리아 균주 (폐렴간균(Klebsiella pneumoniae))의 것이다. 분광 B는 레퍼런스 물질의 신호만을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 원리에 따라 세척 단계가 사용된 오염된 미생물 분류학적 동정을 위한 단순한 방법을 도시한다.
도 4는 도 1에 따라 접착적으로 결합된 세포 단백질의 세척을 이용한 본 발명의 절차에 따라 처리되고 세척된 순수한 배양 액체의 분광을 보여준다. 배양 액체가 펩타이드를 포함함에도 불구하고, 질량 분광은 깨끗하고 4,000 원자 질량 단위 (달턴) 초과에서, 이는 소정의 투여양에서 첨가된 레퍼런스 물질의 단일 하전된 (1+), 이중 하전된 (2+), 및 삼중 하전된 (+3) 이온의 신호만을 포함한다.
샘플 지지대 플레이트에 도포된 미생물 또는 조직 세포와 같은 생물 물질의 세포는 주로 매트릭스-보조된 레이저 탈착 (MALDI)에 의한 후속 이온화를 위한 매트릭스 물질 및 유기 용매를 포함하는 용액을 가함으로써 분쇄된다. 매트릭스 물질은, 유기 용매와 함께 세포 벽을 파괴하고 세포 내부의 단백질 복합체, 예를 들면 리보좀을 분해하고 세포로부터 단백질이 이주하도록 하는, 유기 산이 필수적이다. 리보좀의 단백질은 특히 미생물의 분류학적 동정에 적합하다. 매트릭스 물질은 샘플이 건조될 때 결정화되고 단백질이 결정 내에 파묻힌다(embedded). 이들은 이어서 레이저 충격 (bombardment)에 의해 질량 분광기에서 증발되고 양성자화에 의해 이온화될 수 있다. 그러나 배양 액체 또는 일부 분쇄 액체가 세포에 여전히 접착한다면, 양성자화 과정은 염, 다른 완충 물질, 세제, 및 이러한 액체의 다른 용해성 불순물에 의해 심각하게 손상된다. 세포 자체는 또한 분쇄에 의해 방출된 염을 포함할 수 있고, 이는 아마도 이온화 과정을 방해한다.
샘플 지지대 플레이트 상의 샘플 중의 염 및 다른 불순물이 특히 매트릭스-보조된 레이터 탈착 (MALDI)에 의한 후속 이온화에 매우 불리한 효과를 갖기 때문에, 본 발명은 질량 분광 샘플 지지대 상에 존재하는 세포는 단순히 매트릭스 용액을 가함에 의해 분쇄되지 않아야 하지만, 상기 세포가 매트릭스 물질이 없는 (유기) 산 및/또는 용매를 이용한 분리된 처리 단계에서 먼저 분쇄되어야 함을 제시한다.
단백질이 실제로 금속 표면에 대해서 단지 낮은 접착을 보임에도 불구하고, 흥미롭게도 이러한 분쇄에 의해 방출된 단백질은 보통의 샘플 지지대의 표면에 꽤 잘 접착하고 완충 용액 (예를 들면 수용성 용액)으로 조심스럽게 세척되어 특별히 염을 제거할 수 있다. 놀랍게도, 이는 폴리싱된 스테인리스 강으로 만들어진 샘플 지지대 플레이트 상에서 및 소수성 환경 내 친수성 샘플 "스팟"을 포함하는 친숙하고 상업적으로 이용가능한 앵커 플레이트 ("AnchorChipTM") 상에서, 그리고 최근 시판되기 시작한 코팅된 세라믹 물질로 만들어진 "바이오타겟"에서 모두 작용한다. 이는, 분쇄 유체에 의해 세포로부터의 단백질은 이들이 표면에 접합하는 충분한 반응성 접착 부위를 갖는 정도로 변성됨을 보여준다.
표면에 접착적으로 결합되는 분쇄 펩타이드의 세척은 이미 공지되어 있지만, 주로 매우 특정한 방식에서 준비된 표면 상에서 세척된다. 논문 "Paraffin-wax-coated plates as matrix-assisted laser desorption/ionization sample support for high-throughput identification of proteins by peptide mass fingerprinting" (N. S. Tannu 등, Analytical Biochemistry 327 (2004) 222-232)은 ZipTipC18 피펫 팁 중의 단백질의 트립신 소화 (tryptic digestion)에 의해 수득된 펩타이드의 세척을, 상이한 종류의 샘플 지지대 표면 상의 세척과 비교한다. 파라핀 왁스의 코팅을 갖는 플레이트가 심지어 더 좋은 결과를 주는 것으로 추측됨에도 불구하고, 앵커 플레이트 상의 세척은 실시가능한 것으로 보고된다. 여기서 N. S. Tannu 등에 의한 논문에서 관심있는 분석물이 트립신-소화되고, 따라서 m/z 3,000 달턴 미만 범위의 질량에서 필수적으로 펩타이드가 매우 심각하게 변성되는 반면, 본 발명은 관심있는 분석물로 분쇄된 생물학적 세포로부터 대략 3,000 내지 20,000 달턴 범위의 질량에서 비소화된 세포 단백질을 표적으로 하며, 이의 접착 거동은 소화 생성물의 것과 비교될 수 없음을 주목해야 한다. 현재의 우세한 의견은 변성되지 않은 온전한 (intact) 단백질은 이질적인 (foreign) 표면에 단지 살짝 접착됨을 나타낸다는 것이다; 그러므로 세포 분쇄물로부터 무거운 단백질이 샘플 지지대 플레이트에 실제로 비교적 견고하게 접착하는 것에 대한 실현(realization)은 완전히 예상되지 않았다.
논문 "Non-specific, on-probe cleanup methods for MALDI-MS samples" (Y. Xu 등, Mass-Spectrometric Reviews, 2003, 22, 429-440)에서, 샘플 지지대 플레이트는 상업적인 고분자의 필름, 매트릭스 물질의 얇은 층, 자가-정렬 (self-ordering) 단분자(monomolecular) 층 및 초박(ultrathin) 고분자 층으로 코팅되고, 이들에 흡착된 단백질을 세척하기 위한 이들의 적당함이 조사된다. 일부 표면에서, 단백질이 세척을 가능하게 하는 수소 결합을 형성한다는 것을 감지하는 것이 가능했다. 코팅되지 않은 샘플 지지대 플레이트는 조사되지 않았다.
또한, 논문 "Compressed matrix thin film (CMTF)-assisted laser desorption ionization mass spectrometric analysis" (L. Huang 등, Analytica Chimica Acta 786 (2013) 85-94)은 매트릭스 물질의 얇은-층 필름에 접착적으로 결합된 단백질의 세척을 설명하며, 여기서 상기 매트릭스 물질은 이러한 목적을 위해 압축되었다. 흥미롭게도, 질량 분광이 단지 낮은 품질이었음에도 불구하고, 얇은 매트릭스 층 상에서 세척하는 출원인에 의해 행해진 실험은 매트릭스 용액의 후속의 추가적 도포가 의미 있는 질량 분광을 얻기 위해 절대적으로 필수적이었음을 보여줬다.
개시사항 WO 2004/072616 (PCT/US2004/003890; J. W. Finch 및 J. C. Gebler; "A SAMPLE PREPARATION PLATE FOR MASS SPECTROMETRY")은 또한 고정된 단백질, 다만 샘플을 잘 고정하는 특별한 준비된 플레이트 상에 고정된 단백질의 세척을 언급하며, 이는 질량 분광법에서 샘플 지지대로 이용하기에 부적합하고, 탈착 이온화를 위해 특별히 제조된 샘플을 이온 공급원으로 삽입하기 위해 사용되는 것과 같은 질량 분광 샘플 지지대 상에 고정된 것이 아니다.
먼저, 미생물의 내성을 측정하는 본 발명의 원리에 따른 방법의 특히 바람직한 구현예는 예를 들면 도 1 내에 나타난 단계들을 포함할 수 있다:
(1) 세포가 하나의 또는 다양한 농도로 상이한 항생제/항진균제가 있는 배양 매질 및 상이한 항생제/항진균제가 없는 배양 매질 (배양 용액)과 함께 샘플 지지대의 상이한 샘플 스팟에 도포된다,
(2) 이는 특정한 시간 동안 챔버 내에서의 배양이 뒤따르며, 상기 챔버는 습도 및 온도에서 특히 일정한 조건을 제공하고, 여기서 시간은 종 및 항생제에 의존할 수 있다,
(3) 샘플은 샘플 스팟 상에서 30 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 건조된다,
(4) 1 마이크로리터의 물 중 70% 포름산의 용액이 첨가되어 세포를 분쇄시키고 세포 단백질을 변성시킨다,
(5) 샘플 스팟은 더 높은 온도에서 건조되도록 된다,
(6) 3 마이크로리터의 물이 샘플 스팟에 첨가되고, 짧은 시간 (대략 3분) 동안 작용하게 두고, 피펫 또는 샘플 스팟으로부터 액체를 제거하기 위한 특별한 장치를 이용하여 상기 물이 빠진다,
(7) 샘플 스팟 상 남아있는 수분은 건조되도록 된다,
(8) 매트릭스 용액 (내부표준(internal standard)로 적절한 곳에서)은 샘플 스팟 상으로 피펫팅되고(pipetting) 건조되도록 된다,
(9) 단백질 프로파일이 질량 분광기, 특히 MALDI 비행시간 질량 분광기로 측정된다,
(10) 성장이 발생한다면 특정한 농도의 항생제에도 불구하고, 이러한 항생제에 대한 내성이 이러한 농도에서 존재한다; 상이한 농도의 항생제를 이용한 배양 용액 중의 성장은 최소 억제 농도가 측정되도록 한다.
이러한 실시예에서, 탈이온화된 정제수를 이용한 세척 과정은 수-용해성 구성성분을 물 중에서 안정되도록 (at rest) 용해시키는 단계 및 물을 제거함으로써 이온화 과정에 불리한 이러한 구성성분들을 제거하는 단계로 이루어진다. 상기 세척 과정은 필요하다면 반복될 수 있다. 움직이는 물 중에서의 더 격렬한 세척은 피해야만 하며, 일부 세포 단백질의 경우에서 손실로 이어질 수 있기 때문이다.
도 2는 항생제-민감성인 박테리아 균주 (대장균(E. coli.)) 및 항생제-내성 박테리아 균주 (폐렴간균(Klebsiella pneumoniae))의 질량 분광을 보여주며, 이들은 각각 항생제의 첨가와 함께 한번 및 첨가 없이 한번 배양되었고 도 1의 절차에 따라 제조되었다. 개별적인 그래프는 상단에서 하단으로 나타난다:
A: 항생제 없는 Mueller-Hinton 매질 (배양 매질) 중의 민감성 균주 대장균;
B: 항생제 있는 Mueller-Hinton 매질 중의 민감성 균주 대장균 (소정의 투여량으로 첨가된 레퍼런스 물질의 질량 시그널만이 여기서 두드러짐);
C: 항생제 없는 Mueller-Hinton 매질 중의 메로페넴 (Meropenem)-저항성 균주 폐렴간균; 및
D: 항생제 있는 Mueller-Hinton 매질 중의 메로페넴-저항성 균주 폐렴간균.
성장이 감지된 모든 분광에서 m/z 3,000 초과 범위의 질량인 구분된 단백질 질량 신호로부터, 분쇄 후 샘플 지지대 자체 상의 세척 단계는 샘플 지지대로부터의 박테리아의 분쇄된 단백질의 양을 현저하게 고갈시키지 않는다는 것이 분명하다. 그러므로 상기 방법은 예를 들면 세포 특성으로 내성을 측정하기 위한, 후속 탈착 이온화 및 질량 분광 분석을 위해서 샘플 지지대 자체 상의 생물학적 세포 샘플의 제조에 매우 적합하다.
비정상적인 진핵 세포, 예를 들면 암세포는 유사하게 약물에 대한 저항이 시험될 수 있다. 단세포 균들은, 진핵 세포와 같이, 적어도 종의 분류학적 수준에서, 다른 미생물들과 같이 동정될 수 있고, 항생제에 대한 내성이 시험될 수 있다(여기서 항생제는 항진균제 (antimycotics)). 그러나, 균사체(Mycelium)-형성 균은 또한 질량 분광학적으로 시험될 수 있다. 특허 명세서 US 8,980,577 B2 (T. Mayer, 2012)은 표면 접착을 피하기 위해 상당한 교반과 함께 신선한 균사(hyphae)를 배양하는 단계로 이루어지는, 균사체-형성하는 균의 분류학적 분류에 대한 방법을 제공한다. 이들이 표면에 접합하는 각 시간에서, 대사성 재구조화 (restructuring)이 일어나며, 이는 질량 분광을 변화시킨다. 이를 레퍼런스 분광과 비교함으로써, 그 결과 분명한 동정에 도달하는 것이 가능하다. 액체 배양으로부터 이러한 균사체-형성 균을 가공하는 것은 원심분리와 같은 다양한 시간-소요 단계들을 수반한다. 본 명세서에서 설명된 방법에 따라, 균은 액체 배양으로부터 샘플 지지대 플레이트의 샘플 스팟에 직접 도포되고 질량 분광 동정을 위해 제조될 수 있다. 항진균제에 대한 내성을 시험하기 위해, 균 세포는 반대로, 항진균제가 있는 배양 매질 및 항진균제가 없는 배양 매질 중의 샘플 지지대 플레이트의 샘플 스팟 상에 배양될 수 있다. 대사성 재구조화는 항진균제 존재 하에 성장을 측정시 중요하지 않다.
샘플 지지대 상의 생물학적 세포의 배양을 위한 배양 용액은 주로 고기(meat) 추출물 및 가수분해된 카세인(casein)으로 이루어진다, 즉 이는 단백질 및 펩타이드를 포함한다. 따라서, 제거되지는 않지만 단지 건조되고 세척되는 배양 용액은 세포의 질량 분광 내에서 단백질 및 펩타이드의 방해하는 질량 신호를 생성시킬 수 있다. 그러나, 놀랍게도 이는 도 4 내 질량 분광이 보여주는 것과 같은 경우에는 그렇지 않는다. m/z 4,000 내지 18,000 달턴 사이에서 사용된 질량 범위에서 레퍼런스 물질의 질량 신호 (1+), (2+) 및 (3+)으로부터 모두 떨어져 있는, 방해하는 질량 신호는 없었다. 이는 배양 용액으로부터의 펩타이드가 방해하지 않을 정도로 작거나, 또는 용해성으로 남아있고 세척 단계에서 제거되었음을 의미한다.
세척 과정이 샘플 지지대 자체 상에서 일어나는 것인, 본 명세서에서 제시된 방법은 세척 없는 방법보다 몇 분 더 길게 걸림에도 불구하고, 현저한 이점을 갖는다. 놀랍게도, 세포로부터 방출된 단백질은 세척 단계 동안 상대적으로 견고하게 샘플 지지대의 친수성 표면에 결합되어 남아있고, 그러므로 매우 불용성이다; 오직 염 및 다른 용해성 구성성분은, 예를 들면 배양 매질로부터의 염 및 다른 용해성 구성성분은, 용액으로 들어가고 세척 완충액과 함께 제거된다. 놀랍게도, 이는 폴리싱된 스테인리스 강으로 만들어진 샘플 지지대 플레이트 상에서 및 친숙한 앵커 타겟 ("AnchorChipTM") 상에서 및 세라믹 물질로 만들어진, 최근에 시장에서 거래되는 "바이오타겟(biotarget)"상 모두에서 작용한다. 반대로, 특허 출원 PCT/DE2016/100561에서 바람직한 방법으로 설명된 것과 같이, 샘플 지지대로부터의 배양 상층액을 건조하는 대신에 이를 빼는 과정을 따르는 경우, 샘플 지지대 표면에 매우 적게 접착하거나 접착하지 않는 미생물 종을 손실할 위험이 존재할 것이다. 일부 살모넬라 종이 이것의 예시로 주어질 수 있다; 이들은 편모충류이고 그 결과 액체의 표면 상에서 헤엄치며 그러므로 쉽게 빠질 수 있다.
비교 측정에서 나타나는 것과 같이, 샘플 지지대 표면 자체 상에서 세척하는 단계를 포함하는 방법으로부터 얻은 분광은 비세척된 샘플의 분광보다 상당히 좋은 품질(더 좋은 시그널-대-노이즈 비율)을 가지며, 이는 이온화를 방해하는(특히 MALDI 방법에서) 염의 양이 세척 단계에 의해 현저히 감소되기 때문이다.
상기에서 설명된 본 발명의 특정 구현예는 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 다른 변성, 세포의 분쇄를 위한 휘발성 용매가 단계 (4)에서 사용될 수 있다, 예를 들면 물 중의 50% 아세톤 또는 물 중의 70% 포름산. 샘플 스팟이 활성 물질과 함께 미리-코팅된, 샘플 지지대 플레이트를 사용하는 것이 가능하다, 예를 들면 점진적인 양으로 동일한 항생제/항진균제 또는 상이한 종류의 항생제/항진균제를 도포함으로써 (예를 들면 최소 억제 농도를 측정하기 위해서) 가능하다. 샘플 스팟은 또한 정량적인 평가를 위한 미리-투여된 양의 불용성 레퍼런스 물질을 포함할 수 있다. 레퍼런스 물질은 매트릭스 용액 중에 용해될 수 있어야만 하지만, 세척 단계의 완충 용액에는 용해되지 않아야만 한다.
본 발명의 원리에 따른 방법의 상이한 구현예는 도 3 내에 설명되고, 샘플이 염, 세제 등과 같은 불순물을 포함한다고 함에도 불구하고, 샘플 지지대 플레이트 상에 배양되지 않지만, 질량 분광 동정 (분류학적 분류)을 위한 샘플 지지대 상에 단순히 도포된 미생물 및 다른 세포에 관한 것이다. 불순물은 예를 들면 한천 콜로니 (agar colony)의 미생물에 접착할 수 있다. 한천 접시 상의 콜로니로부터 미생물의 자동화된 이동과 함께, 배양 액체를 포함하는 소량의 한천이 함께 이동되는 경우가 종종 있다. 일부 종류의 미생물 또한 이들 내에 해로운 염을 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 또한 상기에서 설명한 방법의 경우와 같이, 매트릭스 물질 없이 분리된 처리 단계에서 분쇄될 수 있다. 이들의 변성된 단백질은 이어서 비슷하게 샘플 지지대 자체 상의 세척 단계에 도입될 수 있다.
탈착 이온화는 특히 매트릭스-보조된 레이저 탈착에 의한 이온화일 수 있으며, 그러면 여기서 이온화를 위한 준비는 매트릭스 용액의 첨가 및 결정화를 포함한다. 샘플 지지대 플레이트는 스테인리스 강으로 만들어질 수 있거나, 소수성 환경 내 친수성 앵커를 갖는 플레이트 ("AnchorChipTM"), 또는 코팅된 세라믹 물질로 만들어진 플레이트일 수 있다.
세포는 미생물일 수 있다. 측정되는 미생물의 특성은 항생제/항진균제에 대한 이들의 내성 또는 민감성일 수 있다. 미생물은 항생제/항진균제가 첨가된 배양 액체 및 항생제/항진균제가 첨가되지 않은 배양 액체 내에서 샘플 지지대 플레이트의 상이한 스팟 상에 배양될 수 있고, 항생제/항진균제에 대한 내성이 이러한 항생제/항진균제의 존재 하의 추가적 성장에 의해 측정될 수 있다. 항생제/항진균제의 존재 하의 성장은 특히 소정의 투여량으로 첨가된 레퍼런스 물질과 비교하여 측정될 수 있다.
주로, 생물학적 세포는 화학물질의 존재 하에 샘플 지지대 상에서 배양되면서, 이러한 화학물질에 대한 이들의 반응으로 분석될 수 있다. 상이한 의학적 활성 물질 또는 활성물질의 조합에 대한 암세포의 반응은 본 명세서에서 예시로 언급될 수 있다.

Claims (13)

  1. 세포 특성의 질량 분광학적 측정을 위한 샘플 지지대 상에서 비정제된 생물학적 세포의 샘플로부터 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 생물학적 세포를 샘플 지지대의 샘플 스팟(spot) 상에 제공하는 단계,
    - 용매 및 산 중 적어도 하나를 이용하여 샘플 스팟 상의 세포를 분쇄하여, 이로 인해 세포 단백질은 복합체 (complexes)로부터 분리되고, 분쇄된 세포로부터 이동하고, 상기 샘플 스팟에 접착적으로 (adhesively) 결합되도록 하는 단계,
    - 상기 샘플 스팟 상 세포 단백질을 완충 용액으로 세척하는 단계, 및
    - 상기 샘플 스팟 상 세척된 세포 단백질을, 후속 탈착 이온화(desorbing ionization)를 위한 샘플 준비를 시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세척하는 단계는 정적 완충 용액 (static butter solution)으로 수행되는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세척하는 단계를 위해서, 수 마이크로리터의 수용성 용액이 상기 샘플 스팟 상에 도포되고, 소정의 시간 기간 동안 샘플 스팟 상에 유지되고, 이후 제거되는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 탈착 이온화를 위한 준비는 매트릭스-보조된 레이저 탈착 (matrix-assisted laser desorption)에 의한 후속 이온화를 위한 샘플 스팟 상에 매트릭스 용액의 첨가 및 결정화를 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 질량 분광 샘플 지지대는 스테인리스 강 플레이트 (stainless steel plate), 소수성 환경 내 친수성 앵커(anchor)를 갖는 플레이트 ("AnchorChipTM"), 및 코팅된 세라믹 물질로 만들어진 플레이트 중 하나를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 세포는 미생물을 포함하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 세포의 제공은 배양액 (nutrient liquid) 중의 미생물을 (i) 질량 분광 샘플 지지대의 샘플 스팟 상에서 직접적으로 배양하는 것과 (ii) 외부 배양 용기에서 배양한 후, 이어서 샘플 스팟 상으로 배양된 미생물을 후속적으로 이동시키는 것 중 하나를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 측정되는 미생물의 세포 특성은 항균성 물질에 대한 이들의 내성인 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 항균성 물질이 첨가된 배양액 및 항균성 물질이 첨가되지 않은 배양액에서, 세포 지지대의 상이한 샘플 스팟 상에서 배양되고, 항균성 물질에 대한 이들의 내성은 항균성 물질의 존재 하의 추가 성장에 의해 결정되는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항균성 물질의 존재 하의 성장은 소정의 투여량 (a dosed quantity)으로 첨가된 레퍼런스 물질과의 비교에 의해 결정되는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 세포는, 화학물질(chemicals)의 존재 하에 샘플 지지대 상의 샘플 스팟 상에서 배양되면서, 이러한 화학물질에 대한 이들의 반응으로 질량 분광학적으로 조사되는 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 세포 특성은 m/z 3,000 초과의 질량 범위 내에서 질량 분광 단백질 신호를 기준으로 측정되는 것인, 방법.
  13. 세포 특성의 질량 분광학적 측정을 위해 생물학적 세포의 샘플로부터 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 배양액 중의 생물학적 세포를 질량 분광 샘플 지지대의 샘플 스팟 상에서 직접적으로 배양하는 단계,
    - 용매 및 유기산 중 적어도 하나를 이용하여 샘플 스팟 상에서 배양된 세포를 분쇄하여, 이로 인해 세포 단백질이 복합체로부터 분리되고, 분쇄된 세포로부터 이동하고, 상기 샘플 스팟에 접착적으로 결합되도록 하는 단계,
    - 상기 샘플 스팟 상의 세포 단백질을 완충 용액으로 세척하는 단계, 및
    - 상기 샘플 스팟 상의 세척된 세포 단백질을 후속 탈착 이온화를 위한 샘플 준비를 시키는 단계를 포함하는, 방법.
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