CN108918643B - 在样本支持物上由生物细胞样本制备蛋白质的方法 - Google Patents

在样本支持物上由生物细胞样本制备蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在样本支持物上由未纯化生物细胞样本制备蛋白质的方法，以用于质谱分析细胞特性。该所述方法包括以下步骤：在样本支持物的样本点上提供所述生物细胞；使用溶剂和酸中的至少一种破坏样本点上的所述细胞，由此细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点；用缓冲溶液洗涤样本点上的细胞蛋白质；以及制备经洗涤的细胞蛋白质以用于随后的解吸电离。所释放的细胞蛋白质附着到样本支持物上，因此可以用缓冲溶液仔细洗涤该细胞蛋白质以除去可能来自早期处理步骤，如来自营养液的盐和其它可溶性杂质，而没有大量的蛋白质因洗脱而无法分析。

Description

在样本支持物上由生物细胞样本制备蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及在质谱样本支持物上由生物细胞制备蛋白质以用于质谱分析细胞特性，例如分类学分类(同一性)、抗生素耐药性，对药物或其它活性物质的响应等。该细胞可以是原核或真核微生物，或来源于组织的真核细胞；特别地可以在样本支持物上在培养基中培养这些细胞，以便能够从它们在某些影响(例如存在特定物质)下的生长中得出关于特定细胞特性的结论。
本发明提出，通过加入用于随后电离(通过基质辅助激光解吸(MALDI)进行)的基质溶液不会破坏质谱样本支持物上的细胞，但是使用(有机)酸和/或溶剂在单独的处理步骤中破坏细胞。出乎意料的是，从细胞中释放的重质蛋白质随后附着到样本支持物上，因此可以直接用缓冲溶液将重质蛋白质洗涤以去除盐和其它可溶性杂质，而没有大量的蛋白质因洗脱而无法分析。
背景技术
专利申请PCT/DE2016/100561(K.Becker and E.Idelevich:“Aufbereitunglebendiger,mikrobieller Proben und Mikroorganismen für anschlieβendemassenspektrometrische Messung und Auswertung”(“制备活的微生物样本或微生物以随后进行质谱测量和评估”))详细描述了如何在(例如)添加和不添加抗生素的营养液中孵育质谱样本支持物上的微生物，以便通过观察进一步的生长来确定是否存在耐药性。该文献及其全部内容通过引用并入本文。
该文献中描述的方法代表了一种用于非常快速且简单的基于MS的生物细胞特性分析的新方法；该特性例如关于细胞对抗生素或药物的响应或关于生物细胞的进一步表征。本公开尤其涉及样本处理和样本制备的方法以及数据评价算法。
所引用的文献的优选方面涉及制备活的微生物样本以进行随后的质谱测量的方法，其包括以下步骤：(a)提供平坦的样本支持物，其含有多个样本施加位置(所谓的“点”)；(b)将培养基液滴中的至少一种活的微生物样本沉积在至少一个样本点上；(c)将样本支持物置于具有确定气氛的孵育室中一段预定的时间，以使微生物生长和繁殖；(d)在预定的一段时间后从培养基液滴中除去残余液体以暴露样本点上的微生物沉积物；(e)制备用于解吸电离的样本点；(f)将样本支持物转移到质谱仪的解吸离子源中，从所制备的样本点中产生离子并采集至少一个相应的质谱；以及(g)将采集的质谱与一组参考数据进行比较，以测定微生物样本的至少一种特性。
例如，可以使用该方法来确定存在不同类型的抗生素时微生物细胞的生长：进一步的生长揭示了微生物细胞对所使用的抗生素是否具有耐药性或敏感性。
该方法有时会遇到困难。当微生物在液体表面游动(如用沙门氏菌和其他鞭毛虫的情况)时，用该方法将微生物从残余液体中分离，例如用移液管或吸墨纸吸出，可能不会成功，因为那时也有很高的吸出微生物的风险。干燥营养液以将细胞结合到样本支持物表面并随后制备它们留下了营养液中的盐和其他成分，这些盐和其他成分对通过基质辅助激光解吸附进行的电离具有不利影响，并且显著降低许多蛋白质的灵敏度。通常情况下，干燥的微生物样本不能被洗涤，因为许多物种的微生物在营养液干燥后不能牢固地附着到样本支持物的表面。
通常，必须破坏生物细胞以测量它们的成分，特别是它们的蛋白质，以便释放蛋白质用于随后的电离。在这种情况下，本文的“破坏”意味着破坏细胞壁并破坏细胞内的蛋白质复合物，使得蛋白质可以从细胞中迁移出来。
建议两种破坏方法：(1)通过借助特殊容器中的酸使经洗涤的微生物离心来进行“外部”破坏，进一步离心并将具有来自细胞的蛋白质的上清液转移到质谱样本支持物上，(2)通过添加基质物质的溶液(即，有机溶剂中的有机酸)来破坏施加至样本支持物的细胞，该有机酸使大部分微生物破坏。同时基质溶液制备样本以随后进行基质辅助激光解吸(MALDI)电离。在用于鉴定微生物的方法中，外部破坏提供了更高比例的明确鉴定，但由于需要多次离心，因此外部破坏需要明显更长的时间，并且工作量更大。
在论文“Evaluation of a Simple Protein Extraction Method for SpeciesIdentification of Clinically Relevant Staphylococci by Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry(通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱评价用于临床相关葡萄球菌的物种鉴定的简单的蛋白质提取方法)(N.Matsuda et al.,J.Clin.Microbiology,50,3862-3866,2012)”中，除了所述的两种方法之外，还研究了用70％甲酸对样本支持板上的微生物破坏，其具有与外部破坏类似的良好结果，但需要大量的时间和工作。
在出版物“Evaluation of a Short,On-Plate Formic Acid Extraction Methodfor Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight MassSpectrometry-Based Identification of Clinically Relevant Yeast Isolates(用于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱鉴定临床相关酵母菌株的短的板上甲酸提取方法的评价)(R.L.Gorton et al.,J.Clin.Microbiology 52,1253-1255,2014)”中，同样研究了样本支持物上的细胞破坏，但这些是酵母细胞，鉴定的成功率明显低于外部破坏。
在这两份公开文献中，样本都是在样本支持物上破坏后直接进行干燥，并用MALDI电离用的基质溶液进行制备。特别是盐或其它可溶性杂质未被除去：施加的生物细胞对于MALDI制备显然应当总是足够清洁的。
因此仍然需要一种方法，该方法允许质谱样本支持物上(例如在样本支持物本身上的营养液滴中孵育之后)的被盐和其它可溶性杂质污染的细胞以这样的方式准备，即，解吸电离的灵敏度(例如在MALDI的帮助下)几乎完全保留。
发明内容
本发明现在提出，质谱样本支持物的样本点上的生物细胞不是被添加的基质溶液破坏，而是通过使用无基质(有机)酸和/或溶剂在单独处理步骤破坏。出人意料地是，通过这种破坏释放的细胞蛋白质良好地附着到样本支持物的表面并且可以用洗涤缓冲液(例如纯水)洗涤以除去可能来自早期处理步骤的盐、洗涤剂、缓冲物质和其它可溶性杂质。
根据第一方面，本发明涉及由样本支持物上的未纯化生物细胞样本(例如微生物)制备蛋白质的方法，以用于质谱测定细胞特性，例如微生物分类学的分类或其对抗菌物质的耐药性，该方法包括以下步骤：
-在样本支持物的样本点上提供生物细胞，该样本支持物可以包括不锈钢板、在疏水环境中具有亲水锚定物的板(“AnchorChipTM”)、或被覆陶瓷材料的板，
-借助(有机)酸和/或溶剂破坏样本点上的细胞，使得细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点，
-用(静态)缓冲溶液洗涤样本点上的细胞蛋白质，例如通过将几微升水溶液(特别是纯去离子水)施加到样本点上，在该处保留预定的一段时间，然后将其去除，以及
-制备经洗涤的细胞蛋白以用于随后的解吸电离，例如在样本点加入基质溶液并进行结晶，以用于随后的基质辅助激光解吸电离。
在多个实施方案中，提供生物细胞可以包括在质谱样本支持物的样本点上培养营养液中的微生物。或者，微生物也可以在外部培养容器中培养，随后将(未纯化的)培养的微生物转移到样本支持物的样本点上。
如果生物细胞含有微生物，则可以在营养液中添加或不添加抗菌物质的情况下，在样本支持物的不同样本点上培养这些微生物，然后可以通过在该物质存在下的进一步生长来确定其对抗菌物质的耐药性。
在不同的实施方案中，抗菌物质存在下的生长可以通过将其与按剂量添加的参考物质进行比较来确定，特别参见EP 2 806 275 B1和WO 2014/187517 A1，其全部内容将通过引用并入本公开中。
细胞特性，特别是微生物的细胞特性优选基于质量范围高于m/z 3,000，特别是在约m/z 3000和约m/z 15,000之间的质谱蛋白质信号来确定。
根据本发明的原理确定对抗生素/抗真菌剂的耐药性的方法的优选变型可以包括以下步骤，例如：
(1)将含有和不含抗生素/抗真菌剂的培养基中的细胞施加至样本支持物的不同样本点，
(2)根据物种和抗生素在容器中孵育一段时间，所述容器提供恒定条件(特别是湿度和温度)，
(3)在较高温度下干燥样本点上的样本，
(4)添加1微升在水中的70％甲酸以破坏细胞并使蛋白质扩散出来，
(5)在较高温度下干燥样本点上的破坏的细胞，
(6)向样本点加入3微升H2O，让其反应一小段时间(约3分钟)并将其抽出(用移液管或用特殊装置从样本点中去除液体)，
(7)使样本点上的剩余水分干燥，
(8)将基质溶液(适当时使用内标)移液到样本点上并使其干燥，
(9)用质谱仪(例如MALDI飞行时间质谱仪)测量蛋白质谱。
在步骤(3)中，例如，温度可以在30℃和60℃之间，或者在极少数情况下甚至更高。在步骤(4)中，也可以使用其它变性挥发性溶剂，例如50％丙酮的水溶液或50％乙腈、2.5％三氟乙酸和47.5％水的水溶液。
尽管本文提出的方法(其中在样本支持物本身上进行洗涤程序)比没有洗涤的方法多花费了几分钟的时间，但其具有显著的优点。出乎意料的是，在洗涤步骤期间，从细胞中释放的重质蛋白质保持相对牢固地结合到样本支持物的表面，因此大部分是不溶的；只有例如来自培养基的盐和其它可溶成分进入溶液并与洗涤缓冲液一起除去。出乎意料的是，这既适用于由抛光不锈钢制成的样本支持板，也适用于熟悉的锚定靶(“AnchorChipTM”)以及最近投放市场的由陶瓷材料制成的“生物靶”。相反，如果如专利申请PCT/DE2016/100561中所描述的那样作为优选方法，遵循从样本点取出培养物上清液而不是使其干燥的程序，则会有丢失在样本支持物表面很少或没有附着的微生物物质的危险。这里可以给出一些沙门氏菌的实例；它们是鞭毛虫，因此在液体表面上游动并因此可以容易地被抽出。
比较测量表明：与未洗涤样本的光谱质量相比，借助于样本支持物上的洗涤获得的光谱的质量好得多，因为通过洗涤步骤大大减少了干扰电离(特别是用MALDI方法)的盐的量。
根据另一方面，本发明特别涉及由生物细胞样本(例如微生物)制备蛋白质的方法，以用于质谱测定细胞特性，例如分类学的分类或微生物对抗菌物质的耐药性，该方法包括以下步骤：
-在质谱样本支持物的样本点上直接培养营养液中的生物细胞，该质谱样本支持物可以包括不锈钢板、在疏水环境中具有亲水锚定物的板(“AnchorChipTM”)或由被覆陶瓷材料制成的板，
-借助(有机)酸和/或溶剂破坏样本点上培养的细胞，使得细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点，
-用(静态)缓冲溶液洗涤样本点上的细胞蛋白质，例如通过将几微升水溶液(特别是纯去离子水)施加到样本点上，在该处保持预定的一段时间，然后将其去除，以及
-在样本点上制备经洗涤的细胞蛋白质以用于随后的解吸电离，例如在样本点上加入基质溶液并且将其结晶，以用于随后的基质辅助激光解吸电离。
据证实，纯的或轻微酸化的去离子水尤其适合作为本公开描述的方法中的洗涤缓冲液。
附图简要说明
图1示出了用于确定微生物耐药性的程序的步骤。
图2示出了已经进行如图1所示的程序之后获得的质谱。这些质谱分别是在不存在抗生素和存在抗生素下培养之后，对抗生素敏感的细菌菌株(大肠杆菌)和对抗生素耐药的细菌菌株(肺炎克雷伯氏菌)的质谱。光谱B只示出了参考物质的信号。
图3描绘了使用根据本发明原理的洗涤步骤的污染的微生物的分类学鉴定的简单方法。
图4示出了纯营养液的质谱，该纯营养液根据本发明的程序使用根据图1的洗涤以粘附方式结合的细胞蛋白质的方式进行处理和洗涤。尽管营养液含有肽，但质谱是干净的，并且在高于4000原子质量单位(道尔顿)中，该质谱只包含按剂量加入的参考物质的单电荷(1+)、双电荷(2+)和三电荷离子(3+)的信号。
具体实施方式
通常通过添加包含用于随后的基质辅助激光解吸(MALDI)电离的基质物质和有机溶剂的溶液来破坏已施加至在样本支持板的生物材料的细胞(例如微生物或组织细胞)。基质物质基本上是有机酸，其与有机溶剂一起破坏细胞壁，破坏细胞内的蛋白质复合物，例如核糖体，并允许蛋白质迁移出细胞。核糖体蛋白质特别适用于微生物的分类学鉴定。当样本干燥时，基质材料结晶出来，并且蛋白质被包埋在晶体中。然后可以在质谱仪中通过激光轰击将蛋白质蒸发并通过质子化电离。但如果营养液或部分破坏液体仍附着在细胞上，则质子化过程严重受到盐、其它缓冲物质、洗涤剂和这些液体的其它可溶性杂质的影响。细胞本身也可能含有由于破坏释放的盐，这可能干扰电离过程。
由于样本支持板上的样本中的盐和其它杂质对随后的基质辅助激光解吸(MALDI)电离尤其有害，所以本发明提出了质谱样本支持物上存在的细胞不应该通过简单地添加基质溶液来破坏，而是应首先使用不含基质物质的(有机)酸和/或溶剂在单独的处理步骤中破坏细胞。尽管蛋白质实际上对金属表面仅显示出低的附着性，但有趣的是，由这种破坏释放的蛋白质很好地附着在通常样本支持物的表面上，并且可以用缓冲溶液(例如水溶液)仔细洗涤以特别去除盐。出乎意料的是，这既适用于由抛光不锈钢制成的样本支持板，也适用于在疏水环境中含有亲水样本“点”的熟悉的市售锚板(“AnchorChipTM”)，以及最近进入市场的由被覆陶瓷材料制成的“生物靶”。由此可见来自细胞的蛋白质被破坏流体变性到这样的程度，即，蛋白质具有足够的反应性附着点，并通过附着点附着到表面。
以粘附方式结合至表面的破坏的肽的洗涤是已知的，但是通常在以非常特定的方式制备的表面上进行洗涤。在论文“Paraffin-wax-coated plates as matrix-assistedlaser desorption/ionization sample support for high-throughput identificationof proteins by peptide mass fingerprinting(用石蜡包被的板作为基质辅助激光解吸/电离样本支持物以用于通过肽质量指纹图谱进行蛋白质高通量鉴定)”(N.S.Tannu etal.,Analytical Biochemistry 327(2004)222-232)中，将通过ZipTipC18移液管尖端中的蛋白质的胰蛋白酶消化获得的肽的洗涤与在不同类型的样本支持表面上的洗涤进行了比较。尽管具有石蜡涂层的板应该具有更好的结果，但据报道锚板上的洗涤是切实可行的。应当注意的是，N.S.Tannu等人在论文中感兴趣的分析物是胰蛋白酶消化的，因此是基本上在质量范围低于m/z3,000道尔顿的非常严重变性的肽，而本发明以来自被破坏的生物细胞的约3,000至20,000道尔顿质量范围的未消化的细胞蛋白质作为感兴趣的目标分析物，其附着行为不能与消化产物的附着行为相比。目前普遍的观点认为，未变性的完整蛋白质对异物表面仅表现出轻微的附着；因此，来自细胞的重质蛋白质实际上相对牢固地附着在样本支持板上的认识是完全预料不到的。
在论文“Non-specific,on-probe cleanup methods for MALDI-MS samples(用于MALDI-MS样本的非特异性、探针上的清除方法)(Y.Xu et al.,Mass-SpectrometricReviews,2003,22,429-440)”中，样本支持板涂覆有商业聚合物膜、基质材料薄层、自排序单分子层和超薄聚合物层，并研究了样本支持板对洗涤吸附在其上的蛋白质的适用性。对于一些表面，有可能检测到蛋白质形成允许洗涤的氢键。没有研究未涂覆的样本支持板。
此外，论文“Compressed matrix thin film(CMTF)-assisted laser desorptionionization mass spectrometric analysis(压缩基质薄膜(CMTF)辅助激光解吸电离质谱分析)(L.Huang et al.,Analytica Chimica Acta 786(2013)85-94)”描述了蛋白质的洗涤，该蛋白质以粘附方式结合至已经为此目而压缩的基质物质的薄层膜上。有趣的是，尽管质谱只是低质量的，但申请人在薄基质层上进行洗涤的试验表明随后额外施加的基质溶液对于获得有意义的质谱来说绝对是必要的。
在公开WO 2004/072616(PCT/US2004/003890；J.W.Finch和J.C.Gebler；“ASAMPLE PREPARATION PLATE FOR MASS SPECTROMETRY(用于质谱分析的样本制备板)”)中，也提及了固定化蛋白质的洗涤以保存样本，但是该固定化蛋白质在具有孔的特殊制备板(不适合用作质谱法中的样本支持物)上以保持样本，而不是在质谱样本支持物上，如在用于将专门制备的样本插入离子源中以解吸电离的质谱样本支持物上。
根据本发明原理的方法的确定微生物的耐药性的第一特别优选实施方案可以(例如)包括图1所示的步骤：
(1)将细胞与含有和不含有一种或不同浓度的抗生素/抗真菌剂的培养基(营养液)一起施加至样本支持板上的不同样本点，
(2)随后在容器中孵育特定的一段时间，该容器特别提供恒定的湿度和温度条件，其中时间可以取决于物种和抗生素，
(3)在30℃至60℃之间的温度下干燥样本点上的样本，
(4)加入1微升70％甲酸水溶液以破坏细胞并使细胞蛋白质变性，
(5)在较高温度下使样本点干燥，
(6)向样本点中加入3微升H2O，让其作用一小段时间(约3分钟)并用移液管或用特殊装置将其抽出以从样本点中去除液体，
(7)使样本点上的剩余水分干燥，
(8)将基质溶液(适当时使用内标)移液到样本点上并使其干燥，
(9)用质谱仪(例如MALDI飞行时间质谱仪)测量蛋白质谱，
(10)如果尽管存在特定浓度的抗生素，仍会发生生长，则在该浓度下存在对该抗生素的耐药性；在使用不同浓度的抗生素的营养液中的生长可以确定最小抑制浓度。
在该实例中，使用去离子纯水的洗涤程序在于将水溶性组分溶解在静止的水中，并通过除去水而去除这些对电离过程有害的组分。如果需要，可以重复洗涤程序。应该避免在流动的水中有力地洗涤，因为这可能导致一些细胞蛋白质的损失。
图2示出了抗生素敏感性的细菌菌株(大肠杆菌)和抗生素耐药性的细菌菌株(肺炎克雷伯氏菌)的质谱，其中大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌各自在添加抗生素的情况下培养一次，并在不添加抗生素的情况下培养一次，并根据图1的程序制备。从上到下说明各图：
A：在不含抗生素的Mueller-Hinton培养基(培养基)中的敏感菌株大肠杆菌(E.coli.)；
B：在含有抗生素的Mueller-Hinton培养基中的敏感菌株大肠杆菌(只有按剂量添加的参比物质的质量信号在此出现)；
C：在不含抗生素的Mueller-Hinton培养基中的美罗培南耐药菌株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)；以及
D：在含有抗生素的Mueller-Hinton培养基中的美罗培南耐药菌株肺炎克雷伯菌。
从所有检测到生长的光谱中的质量范围大于m/z 3,000的不同蛋白质质量信号中，很显然看出，破坏后样本支持物本身上的洗涤步骤不会显著消耗来自样本支持物中破坏的细菌蛋白质的量。因此该方法非常适合于样本支持物本身上制备生物细胞样本，其用于随后解吸电离和质谱分析，例如以确定作为细胞特性的耐药性。
可以类似地测试异常真核细胞，例如癌细胞对药物的耐药性。单细胞真菌(如真核细胞)可以像其它微生物一样被鉴定到至少物种的分类学级别，并且可以测试单细胞真菌对抗生素(在此为抗真菌剂)的耐药性。然而，菌丝体形成菌也可以通过质谱检测。专利说明书US 8,980,577 B2(T.Mayer，2012)提供了用于形成菌丝体真菌的分类学分类的方法，其包括在相当大的搅拌下培养新鲜菌丝以避免附着到表面。每当其附着到表面，会发生代谢重组(这会改变质谱)。通过将这些与参考光谱进行比较，因此可以得出明确的鉴定。从液体培养物中处理这些形成菌丝体的真菌涉及各种耗时的步骤，例如离心。根据本文所述的方法，可直接从液体培养物中将真菌施加到样本支撑板的样本点并制备真菌以用于质谱鉴定。相反，为了测试对抗真菌剂的耐药性，可以在样本支撑板的样本点上，在具有和不具有抗真菌剂的培养基中培养真菌细胞。当确定在抗真菌剂存在下的生长时，代谢重组并不重要。
用于在样本支持物上培养生物细胞的营养液通常由肉提取物和水解酪蛋白组成，即该营养液含有蛋白质和肽。未被除去而仅干燥和洗涤的营养液可因此在细胞质谱中产生蛋白质和肽的干扰质量信号。然而，正如图4中的质谱所示，这并不令人奇怪。在m/z 4,000和18,000道尔顿之间使用的质量信号中，除了参考物质的质量信号(1+)、(2+)和(3+)外，没有干扰质量信号。这意味着来自营养液的肽或者非常小而不会干扰，或者它们保持可溶并且在洗涤步骤中被去除。
尽管这里提出的方法(在样本支持物本身上进行洗涤程序)比没有洗涤的方法多花费了几分钟的时间，但其具有显著的优点。出乎意料的是，在洗涤步骤期间，从细胞中释放的蛋白保持相对牢固地结合到样本支持物的亲水表面，因此大部分是不溶的；只有例如来自培养基的盐和其它可溶成分进入溶液并与洗涤缓冲液一起除去。出乎意料的是，这既适用于由抛光不锈钢制成的样本支持物板，也适用于熟悉的锚定靶(“AnchorChipTM”)以及最近投放市场的由陶瓷材料制成的“生物靶”。相反，如果如专利申请PCT/DE2016/100561中所描述的那样作为优选方法，遵循从样本点取出培养物上清液的程序，则会有丢失对样本支持物表面很少或没有附着的微生物物质的危险。这里可以给出一些沙门氏菌的实例；它们是鞭毛虫，因此在液体表面上游动并因此可以容易地被抽出。
如比较测量表明，来自包括在样本支持物表面上进行洗涤步骤的方法的光谱本身具有比未洗涤样本的光谱质量好得多的质量(更好的信噪比)，因为通过洗涤步骤大大减少了干扰电离(特别是用MALDI方法)的盐的量。
该方法的上述特定实施方案可以以各种各样的方式进行修改。例如，可以在步骤(4)中使用其它变性的用于破坏细胞的挥发性溶剂，例如50％丙酮水溶液或70％甲酸水溶液。可以使用样本支持板，其中例如通过施加不同量的不同类型的抗生素/抗真菌剂或不同量的相同的抗生素/抗真菌(例如以确定最小抑制浓度)来向该样本支持板的样本点预涂覆活性物质。样本点还可以包含预定剂量的不溶性参考物质以用于定量评价。参比物质应当能溶于基质溶液中，但不能溶于洗涤步骤的缓冲溶液中。
图3示出了根据本发明原理的方法的不同实施方案，这些实施方案涉及未在样本支持物板上培养的，但为了质谱鉴定(分类学分类)的目的而仅仅施加至样本支持物的微生物和其他细胞，尽管样本中含有杂质如盐，洗涤剂等。例如，杂质可以附着到琼脂克隆的微生物上。随着从琼脂培养皿上的菌落中自动转移微生物，通常情况下，包括营养液在内的少量琼脂也被转移。某些类型的微生物也可能含有有害的盐。如在上述方法中的情况，这些样本也可以在没有基质材料的单独处理步骤中被破坏。然后也可以在样本支持物本身上进行它们的变性蛋白质的洗涤步骤。
解吸电离尤其可以是基质辅助激光解吸电离，其中用于电离的制备包括基质溶液的添加和结晶。样本支持物可以由不锈钢、在疏水环境下具有亲水锚定物的板(“AnchorChipTM”)或由被覆陶瓷材料制成的板制成。
细胞可以是微生物。要确定的微生物的特性可以是它们对抗生素/抗真菌剂的耐药性或敏感性。可以添加或不添加抗生素/抗真菌剂的营养液中在样本支持板的不同点培养微生物，并且对抗生素/抗真菌剂的耐药性可以通过在该抗生素/抗真菌剂存在下的进一步生长来确定。通过与按剂量添加的参考物质的比较，可以特别确定在抗生素/抗真菌剂存在下的生长。
一般而言，可以在化学品的存在下在样本支持物上培养生物细胞的同时，分析生物细胞对这些化学物质的响应。这里可以举例说明癌细胞对不同医学活性物质或活性物质组合的反应。

Claims (13)

1.一种在样本支持物上由未纯化生物细胞样本制备蛋白质的方法，该蛋白质用于质谱测定细胞特性，所述方法包括以下步骤：
-在所述样本支持物的样本点上提供所述生物细胞，其中所述样本支持物包括亲水表面，或者在疏水环境中具有亲水锚定物的板；
-使用溶剂和酸中的至少一种破坏所述样本支持物的所述样本点上的所述细胞，由此细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本支持物的所述样本点；
-用缓冲溶液洗涤所述样本支持物的所述样本点上的所述细胞蛋白质，其中可溶性杂质与所述缓冲溶液一起被除去；以及
-直接在所述样本支持物的所述样本点上制备经洗涤的细胞蛋白质以用于随后的解吸电离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用静态缓冲溶液来进行洗涤步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，对于洗涤步骤，将几微升的水溶液施加到所述样本点上，在该处保持预定的一段时间，然后将其去除。
4.根据权利要求1所述的方法，其中用于解吸电离的制备步骤包括：在所述样本点上添加基质溶液并且结晶，以随后进行基质辅助激光解吸电离。
5.根据权利要求1所述的方法，其中质谱样本支持物包括不锈钢板以及由被覆陶瓷材料制成的板中的一者。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物细胞包括微生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中提供所述生物细胞包括下列中的一者：(i)直接在质谱样本支持物的样本点上在营养液中培养所述微生物和(ii)在外部培养容器中在营养液中培养所述微生物，随后将培养的微生物转移到所述样本点上。
8.根据权利要求6所述的方法，其中待测定的所述微生物的细胞特性为微生物对抗菌物质的耐药性。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在样本支持物的不同样本点上，在添加或不添加抗菌物质的营养液中培养所述微生物，并且通过在该抗菌物质存在下的进一步生长来确定微生物对所述抗菌物质的耐药性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述抗菌物质存在下的生长是通过将其与按剂量添加的参考物质进行比较来测定的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，当在化学物质存在下在所述样本支持物的样本点上培养所述生物细胞时，通过质谱研究所述生物细胞对化学物质的响应。
12.根据权利要求1所述的方法，其中基于质量范围高于m/z3,000的质谱蛋白质信号测定所述细胞特性。
13.一种由生物细胞的样本制备蛋白质的方法，该蛋白质用于质谱测定细胞特性，该方法包括以下步骤：
-直接在质谱样本支持物的样本点上培养营养液中的所述生物细胞，其中所述质谱样本支持物包括亲水表面，或者在疏水环境中具有亲水锚定物的板；
-使用溶剂和有机酸中至少一种破坏所述质谱样本支持物的所述样本点上经培养的细胞，由此细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述质谱样本支持物的所述样本点；
-用缓冲溶液洗涤所述质谱样本支持物的所述样本点上的所述细胞蛋白质，其中可溶性杂质与所述缓冲溶液一起被除去；以及
-直接在所述质谱样本支持物的所述样本点上制备经洗涤的细胞蛋白以用于随后的解吸电离。
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