CN111220594A - 一种利用超高分辨质谱筛选链霉菌农药活性菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种利用超高分辨基质辅助激光解吸电离‑傅立叶变换离子回旋共振质谱对链霉菌农药活性菌株进行筛选的方法,涉及蛋白指纹图谱检测及质谱领域。本发明基于基质辅助激光解吸电离‑傅立叶变换离子回旋共振质谱技术,首先利用基质辅助激光解吸电离‑傅立叶变换离子回旋共振质谱对具有农药活性差异的链霉菌菌株进行蛋白指纹图谱检测,通过利用筛选得到的特征蛋白质峰对盲样菌株有无农药活性进行判别,经盲样测试验证,预测正确率达到90%。
Description
技术领域
本发明涉及利用质谱技术检测蛋白质指纹图谱领域,具体地,涉及基于超高分辨基质辅助激光解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱方法对链霉菌农药活性菌株进行筛选的方法。
背景技术
近年来,我国农作物病害发生较为严重,除了广受关注的真菌性病害外,细菌性病害成为另一个重要原因。特别是随着气候、种植结构的变化,导致细菌性病害频繁发生。放线菌作为抗生素类活性物质的最好来源,其次生代谢活性产物已被广泛应用于防治农作物细菌性病虫害中,尤其是链霉菌作为最高等的放线菌,已经成为农药活性物质筛选的重要来源。
微生物的传统活性菌株筛选方法有活性物质萃取法和共培养法。其中活性物质萃取法需要将微生物活性物质进行提纯分离,与验证微生物共培养进行筛选,该方法操作复杂耗时,不利于快速筛选,而共培养法虽然省去活性物质萃取的步骤,只需将验证菌株与待测菌株共培养,但该方法灵敏度较低,同样耗时也较长。
随着质谱技术的发展,基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)已经成为一种快速、操作简便、可以在较高质量范围对蛋白/多肽进行表征的技术手段。利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测微生物的蛋白指纹图谱进而对其进行分型鉴定的技术已被广泛应用于临床、环境、食品安全等领域。基质辅助激光解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱(MALDI-FTICR MS)作为一种具有超高分辨率、高的准确度、高的动态范围的质谱已经被利用到铜绿假单胞菌的分型中。但关于利用MALDI-FTICR MS对链霉菌进行可能农药活性菌株筛选的研究目前还没有报道。
发明内容
本发明针对现有方法操作繁琐,耗时长等局限性,建立了一种利用超高分辨质谱对链霉菌农药活性菌株进行筛选的方法。
本发明的目的在于建立一种基于MALDI-FTICR MS检测链霉菌蛋白指纹图谱方法的农药活性菌株筛选方法。该方法通过盲样菌株的蛋白指纹图谱与特征蛋白质峰进行对比,对盲样菌株的农药活性进行预测。
为实现以上目的,本发明采用的技术方案如下:
一种链霉菌农药活性菌株筛选的方法,选取12株具有农药活性和6株不具
有农药活性的链霉菌蛋白指纹图谱质谱数据用于特征差异蛋白的筛选,最终
得到的判别有无农药活性的蛋白质峰为m/z 4424±1.5、4575±1.5、6888±
1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5,其中m/z 6888±1.5、
8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5是无农药活性,m/z 4424±1.5、
4575±1.5是有农药活性的特征蛋白质峰。
盲样菌株蛋白指纹数据获取的具体步骤如下,
1)样品制备:将在固体培养基、26-30℃条件下培养2-4天的链霉菌菌落接种于ISP-2液体培养基中,28-30℃摇床培养2-3天得到菌液,采用乙醇/甲酸法对其进行处理,制备蛋白样品;
2)对建模样本进行MALDI-FTICR MS分析:
质谱仪为SolariX XR-15T MALDI-FTICR MS(布鲁克),氮激光频率为500Hz,质量采集范围1013.1-15000Da,飞行时间2.5ms,每张谱图累计采集32次,DC bias RX0、DC BiasTX180、Bias RT180、DC Bias TX0电压分别为1.308V、1.405V、1.693V、1.595V。数据采集前用三碘化铯作为外标校正仪器。
将处理得到的蛋白样品分别点于质谱自带抛光不锈钢样品靶板上,利用MALDI-FTICR MS对蛋白指纹图谱进行检测;
其中,步骤(2)点靶方式为先点样品,干燥后再点基质。基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸的饱和溶液,溶剂为乙腈:5%三氟乙酸([v/v]:1:1);
步骤(1)的乙醇/甲酸法具体为:
取2-3ml菌液样品,15000g,离心5min,去上清,利用1ml超纯水,洗涤菌体沉淀2次,离心干燥10±5min,加入300μl超纯水,涡旋1min,再加入900μl分析级乙醇,涡旋1min充分混合,15000g离心5min,去上清,离心干燥20±5min。向菌体沉淀中加入50~150微升70%色谱级甲酸,涡旋1min,再加入等体积色谱级乙腈,涡旋1min充分混合后,15000g离心5min,上清液体即为待测的蛋白样品;
对超高分辨基质辅助激光解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱获得到的数据采用布鲁克质谱工作站处理软件(Data Analysis)进行峰处理得到峰表,具体参数:采用单同位素峰标注算法(Sophisticated Numerical Annotation Procedure,SNAP),质量因素阈值(Quality factor threshold)为0.7,信噪比(S/N)大于3;
利用特征蛋白质峰m/z 4424±1.5、4575±1.5、6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5与权利要求3得到的矩阵对比,对盲样菌株农药活性进行预测。
附图说明
图1利用MALDI-FTICR MS得到的链霉菌菌株蛋白指纹图谱(A)有农药活性菌株539(B)无农药活性菌株D24。
图2通过已知农药活性特性菌株的蛋白指纹图谱结果筛选特征蛋白的步骤。
具体实施方式
实施例
1.链霉菌菌株选取和培养
1.1链霉菌菌株选取
18株已经过传统抑菌活性测试[张姗姗,赵心清,陈亮宇,等.星海链霉菌抑菌活物质的分离纯化[J].微生物学通报,2011,38(10):1540-1545],具有对抗野油菜黄单胞菌、白叶枯病菌或者欧文氏菌活性有差异的链霉菌作为建模样品。其中12株链霉菌具有抗野油菜黄单胞菌(XC)、水稻黄单胞菌(XO)或者是胡萝卜软腐欧文氏菌(EC)(编号为697、507、579、586、700、699、555、723)的菌株对3种病菌都有抗性,编号为771、506、706的菌株对XC、EC具有抗性,编号为519的菌株对XO、EC具有抗性,另外编号分别为502、508、539、553、698、710、D46、D24、524、707的10株链霉菌菌株被用于盲样测试。
1.2链霉菌菌株的培养
将在高氏2号固体培养基,26-30℃条件下培养2-4天的链霉菌菌落接种于ISP-2液体培养基中,28-30℃摇床培养2-3天得到菌液。
2.分析方法
2.1链霉菌菌株蛋白提取
样品预处理采用乙醇-甲酸法,具体步骤为:取2-3ml菌液样品,15000g离心5min,去上清,利用1ml超纯水,洗涤菌体沉淀2次,再加入300μl超纯水,涡旋1min,再加入900μl分析级乙醇,涡旋1min充分混合,15000g离心5min,去上清,离心干燥10min。向菌体沉淀中加入50~150微升70%色谱级甲酸,涡旋1min,再加入等体积色谱级乙腈,涡旋1min充分混合,15000g离心5min,上清液体即为待测的蛋白样品。
2.2MALDI-FTICR MS分析
取1μl蛋白样品点于样品样品靶上,干燥后,覆盖1μl基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸,溶剂乙腈:5%三氟乙酸([v/v]:1:1),干燥后采集数据,每个样品采集3张谱图。
MALDI-FTICR MS为美国布鲁克公司的solariX XR-15T,采集的范围为1000-15000Da,参数设定为氮激光频率为500Hz,质量采集范围2000-15000Da,飞行时间2.5ms,每张谱图累计采集32次,DC bias RX0、DC Bias TX180、Bias RT180、DC Bias TX0电压分别为1.308V、1.405V、1.693V、1.595V。数据采集前用CSI3作为外标校正仪器。
2.3菌株农药活性特征差异蛋白筛选
对超高分辨基质辅助激光解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱获得到的数据采用布鲁克质谱工作站处理软件(Data Analysis)进行峰处理,具体参数:采用单同位素峰标注算法(Sophisticated Numerical Annotation Procedure,SNAP),质量因素阈值(Quality factor threshold)为0.7,信噪比(S/N)大于3;首先从12株具有农药活性菌株的蛋白指纹图谱中随机选取8张,从6株不具有农药活性菌株的蛋白指纹图谱中随机选取3张进行组合,利用基于R语言的XCMS程序包(group.nearest算法,absMz=1.5Da)对得到的峰表进行峰对齐处理得到一个矩阵,通过筛选得到有无农药活性特征蛋白,重复随机组合4次,同样进行峰对齐处理得到一个矩阵并进行特征蛋白的筛选,最后将4组特征蛋白进行对比,选取共同存在的特征蛋白作为最终的特征差异蛋白对盲样菌株进行预测。最终得到的判别有无农药活性的蛋白质峰为m/z 4424±1.5、4575±1.5、6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5,其中m/z 6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5是无农药活性,m/z 4424±1.5、4575±1.5是有农药活性的特征蛋白质峰(具体步骤如图2所示)。
2.5链霉菌菌株盲样判别测试
选取编号分别为502、508、539、553、698、710、D46、D24、524、707的10株链霉菌菌株用于盲样测试,并按本专利所描述的方法进行处理和数据采集,利用上述特征差异蛋白对其有无农药活性进行预测。
表1列出了模型样本中特征差异蛋白的信息(序列号为1-18)以及10株盲样菌株(序列号为19-28)特征差异蛋白有无的情况,当盲样菌株中同时具有m/z 6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5而不具有m/z 4424±1.5、4575±1.5蛋白质峰时,预测该盲样菌株不具有上述农药活性,当盲样菌株中具有m/z 4424±1.5、4575±1.5,而不具有m/z 6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5蛋白质峰时,表明该盲样菌株具有农药活性特性。通过特征差异蛋白预测,10株链霉菌中508、539、553、698、710具有农药活性而D46、524、D24、707、502不具有上述农药活性,预测正确率达到90%。
表1模型菌株和盲样菌株特征差异蛋白信息
其中√表示含有,×表示不含有。
Claims (3)
1.一种利用超高分辨质谱筛选链霉菌农药活性菌株的方法,其特征在于:
判别有无农药活性的蛋白质峰为m/z 4424±1.5、4575±1.5、6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5,若蛋白指纹图谱中出现m/z 6888±1.5、8249±1.5、8266±1.5、8455±1.5、8852±1.5特征蛋白质峰是无农药活性菌株,若蛋白指纹图谱中出现m/z 4424±1.5、4575±1.5特征蛋白质峰是有农药活性的菌株;盲样菌株蛋白指纹数据获取的具体步骤如下,
1)样品制备:将在26-30℃条件下培养2-4天的链霉菌菌落接种于ISP-2液体培养基中,28-30℃摇床培养2-3天得到菌液,采用乙醇/甲酸法对其进行处理,制备蛋白样品;
2)对建模样本进行MALDI-FTICR MS分析:
质谱仪为SolariX XR-15T MALDI-FTICR MS(布鲁克),氮激光频率为500Hz,质量采集范围1013.1-15000Da,飞行时间2.5ms,每张谱图累计采集32次,DCbias RX0、DC BiasTX180、Bias RT180、DC Bias TX0电压分别为1.308V、1.405V、1.693V、1.595V;数据采集前用三碘化铯作为外标校正仪器;
将处理得到的蛋白样品分别点于质谱自带抛光不锈钢样品靶板上,利用MALDI-FTICRMS对蛋白指纹图谱进行检测;
其中,步骤(2)点靶方式为先点样品,干燥后再点基质。基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸的饱和溶液,溶剂为乙腈:5%三氟乙酸([v/v]:1:1)。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)的乙醇/甲酸法具体为:取2-3ml菌液样品,15000g,离心5min,去上清,利用1ml超纯水,洗涤菌体沉淀2次,离心干燥10±5min,加入300μl超纯水,涡旋1min,再加入900μl分析级乙醇,涡旋1min充分混合,15000g离心5min,去上清,离心干燥20±5min。向菌体沉淀中加入50~150微升70%色谱级甲酸,涡旋1min,再加入等体积色谱级乙腈,涡旋1min充分混合后,15000g离心5min,上清液体即为待测的蛋白样品。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:对超高分辨基质辅助激光解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱获得到的数据采用布鲁克质谱工作站处理软件(Data Analysis)进行峰处理得到峰表,具体参数:采用单同位素峰标注算法(Sophisticated NumericalAnnotation Procedure,SNAP),质量因素阈值(Quality factor threshold)为0.7,信噪比(S/N)大于3。
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