JP2005513479A - 質量分析用のプローブ - Google Patents
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Abstract
Description
a)検体又はおとりをプローブ上へアミンによりカップリングするので、一部又はすべての生物活性を損失する;
b)検体と表面との特異性が低く、そのため、いくつかの検体が表面に非特異的に結合する(例えば、イオン交換の表面);
c)検体の表面への親和性が低く、そのため、どの洗浄手段においても表面から検体が浸出する(例えば、イオン交換表面及びニトリロ酢酸の表面);
d)アフィニティー・キャプチャーの表面が非特異的なタンパク質への抵抗性を欠き、そのため、タンパク質マイクロアレイの分析を妨害する非特異的なタンパク質の結合が高レベルで生じる;
e)限られた数のアフィニティー・キャプチャー・タンパク質しか利用できない、
というものである。
a)本発明のプローブを用意する工程と;
b)前記プローブを、1種又はそれ以上のタンパク質と接触させる工程と;
c)前記プローブの表面上におけるタンパク質のレーザー脱離/イオン化質量分析を行う工程を含む。
d)前記タンパク質分子の質量を測定する工程と;
e)さらに、プローブ又はプローブ表面上で前記タンパク質の反復したサンプルの消化を行う工程と;
f)工程e)より生じたペプチドのレーザー脱離/イオン化質量分析を行って、前記タンパク質を同定する工程をさらに含む。
c)前記プローブ表面上のタンパク質を、1種又はそれ以上の試験分子と接触させる工程と;
d)前記プローブ表面から結合していない試験分子を除去する工程と;
e)前記タンパク質、及び前記タンパク質との相互作用を介して前記プローブ表面上に特異的に保持されている任意の分子のレーザー脱離/イオン化質量分析を行って、前記タンパク質及び/又は試験分子の同一性を決定する工程をさらに含む。
c)前記プローブ表面上のタンパク質を、1種又はそれ以上の試験基質と接触させる工程と;
d)前記タンパク質及び試験基質のレーザー脱離/イオン化質量分析を行って、前記タンパク質による前記試験基質の触媒反応の生成物の存在及び/又は同一性を決定する工程という他の及び/又は追加の工程を含む。
左側は(上から下に向かって):
i) α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸と;
ii) シナピン酸と;
iii)ゲンチシン酸である。
すべて、99%アセトン、1%グリセロール(容積/容積)の溶液中で製造した。
右側は(上から下に向かって)、上記と同じマトリックスであり、すなわち
iv)α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸と;
v) シナピン酸と;
vi)ゲンチシン酸である。
これらは、先行技術のように水溶性の溶媒で製造した。
1.1 金で被覆したスライドグラス及びMALDIプローブの清浄。
金で被覆した顕微鏡スライドグラスを含むプローブ又はMALDIプローブを、アセトン、アセトニトリル、2回蒸留した水の順に洗浄することで使用前に完全に清浄にし、窒素下で乾燥した。
1.2.1 PEG−PLL誘導体の合成
PEG−PLL−ビオチン:
平均サイズが17-30kDaである100mgのポリ−L−リジン(Sigma,Dorest,UK)を、109mgのmPEG-SPA(Shearwater Corporation,Huntsville,Alabama)及び1.1mgのビオチンPEG-CO-NHSと、100mMの炭酸緩衝液pH9中で30分間反応させた。1mMのTris-HCl pH7.5中で一晩透析することによって反応を終了した。この反応から生じた生成物を、1%PEG−PLL−ビオチン(1%PEG誘導体がビオチン頭部基を含んでいる)と呼び、その他に、リガンドの割合が小さいものをいくつか合成した(1%、2%、10%及び20%)。
10mgのブレオマイシンB6(Calbiochem)を、1mlのアセトンに溶解し、7.5mgのEDCとNHSをそれぞれ添加した。反応のpHを、HClでpH3に調整した。別の反応では、99mgのポリ−L−リジンを、11mgのDVS-PEG-CO-NHS及び100mgのmPEG-CO-NHSと、100mMの炭酸緩衝液 pH9中で反応させた。20分後、両反応を混合し、必要なときにはpHをpH9に調整した。多量の1mMのTris-HCl pH7.5緩衝液に対して一晩透析することによってPEG−PLL−ブレオマイシンの合成を完了した。この合成の生成物を、10%PEG−PLL−ブレオマイシンと呼び、これは、約10%のPEG側鎖がブレオマイシンと置換されていることを示している。
前記PLL−PEG−ビオチンは、0.5mg/mlのニュートラビジン(neutravidin)を、湿度の高い部屋内で、室温で1時間、添加することによって、ビオチンに結合したニュートラビジン(neutravidin)分子を有する。次に、プローブを洗浄緩衝液で濯ぎ、窒素下で乾燥する前に、十分な脱塩緩衝液で2回洗浄した。前記表面は、適切なアフィニティー・タグ、例えばビオチン又はフレオマイシン/ゼオシン耐性結合タンパク質を持つ高分子の高い特異性を有するアフィニティー・キャプチャーとしていつでも使用することができる。
2.1 タグを付けたタンパク質の製造
心臓、肝臓又は胸部の組織から精製したmRNAを、既知の技術を用いてcDNAに翻訳した。前記cDNAの3’末端を、DNAの一本鎖を消化する3’−5’一本鎖エキソヌクレアーゼに接触させた。時間、温度及び塩濃度などのパラメータを操作することによって反応を制御した。次に、残存するDNAの一本鎖領域を、グリーン・ビーンズ・ヌクレア−ゼなどの一本鎖ヌクレア−ゼによって除去して平滑末端を残した。次に、生じた切断二本鎖DNAを、cDNA合成の際に導入したcDNAの5’末端部位を有するレア−カット制限酵素(rare-cutting restriction enzyme)で消化した。次に、生じたcDNA断片を、溶解度のマーカーをコードするDNAタグにライゲーションした。この事例では、このライゲーションは、前記cDNA断片を、タグの3’をcDNA断片に提供するベクターにライゲーションすることで成し遂げられた。転写は、クローニングしたcDNAの上流から開始し、前記cDNAと下流のタグを通って進行する。インフレームに、及び終止コドンを欠いてライゲーションされた場合、生じた翻訳生成物は、融合タンパク質の溶解度を知らせるタグと融合した前記クローニングしたcDNA由来のポリペプチド配列から構成される。この技術は、単一のcDNAとコレクションの両方に使用することができる。
一実験において、ヒト肝臓cDNAがこの方法論の対象となり、生じたライブラリーをE.coliで発現した。可溶型融合タンパク質を発現する約5,000のクローンを、クローン的に単離し、個別に発酵させた。前記細胞を溶解し、生じた可溶性のビオチン化タンパク質を、ストレプトアビジンで被覆した表面上で、単一工程で捕捉し、精製した。数千のメンバーから構成されるタンパク質マイクロアレイを製造し、これは、回収の時の発現した肝臓の補体を示すものである。
3.1 エネルギー吸収分子の結晶の製造
タンパク質マイクロアレイを薄く覆うエネルギー吸収分子の溶液を、以下に示すようにして製造した。i)からiii)までとvii)は、本発明の一態様による調整物であるが、iv)からvi)までは、先行技術の方法により製造した比較調整物である。
上記3.1に記載した通りに製造したエネルギー吸収分子の3例を、タンパク質マイクロアレイ上に配列し、倍率100倍での様子を図1aに示した。アセトンに溶解したマトリックスi)、ii)及びiii)は、現在、本技術分野で用いられている水溶性のマトリックスであるiv)、v)及びvi)の製剤と比較して、非常に均一な結晶の形成を示した。
4.1 十分に純粋なタグを付けた生物高分子の表面捕捉
種々のタグを付けたタンパク質のアフィニティー・キャプチャーについて、タンパク質捕捉部分として、例えばPEG−PLL−ビオチン又はPEG−PLL−ブレオマイシンB6を用いて説明する。
MALDIターゲット上のPLL−PEG−ビオチン・ニュートラビジン(Neutravidin)の表面を、この場合は、E.coli由来のビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質(Biotin carboxyl carrier protein、BCCP)の配列タグと共にヒト組換えタンパク質を発現するE.coli溶解液から得られた500ナノリットルのビオチン化タンパク質混合物で薄く覆った。前記タンパク質を表面上で2時間捕捉し、洗浄緩衝液で2回洗浄し、続いて脱塩緩衝液で2回洗浄し、300ナノリットルのエネルギー吸収マトリックス、すなわち飽和α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸のアセトン溶液で薄く覆った。低いレーザー・パワーで遅延抽出技術(delayed extraction technique)を用いてリニアモードで得られたマススペクトルを、図5に図示する。この方法の利点は、サンプルを、タンパク質の複雑な混合物として利用することができ、洗浄後に、所定の分子しか残さないことである。第二に、検体を、マトリックスの添加によってアフィニティー・キャプチャーの表面から放出される前に、空間的に定められた位置に捕捉する。
図6は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−ビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質(GST-BCCP)のペプチド・フィンガープリント分析を示す。融合タンパク質と細菌のタンパク質を含む細菌の粗製の溶解物を、予めPEG−PLL−ビオチンとニュートラビジン(neutravidin)で被覆したMALDIターゲット上に置いた。GSTのBCCP融合パートナーは、ビオチン化コンセンサス配列を、E.coli.で発現した際にビオチン化されるように含み、融合タンパク質は、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン(neutravidin)の表面に特異的に結合させ、細菌のタンパク質は緩衝液で洗い流す。同定するために、表面に捕捉したタンパク質を、トリプシンで薄く覆うことによって消化し、MALDI MSで分析した。タンパク質フィンガープリント分析によって、Schistosoma mansoni由来のGSTに属する12のペプチド、ニュートラビジン(neutravidin)に属する4のペプチド、及びトリプシンに属する3のペプチドが明らかとなり(表1参照)、残存する一致しないペプチドを用いても細菌のタンパク質は全く同定されなかった。本実験によって、PEG−PLL−ビオチンとニュートラビジン(neutravidin)を用いて、MALDIターゲット上で、単一工程でタンパク質の粗混合物からタンパク質を精製することができることが明らかに示された。まとめると、本実験は、タンパク質マイクロアレイの製造への道を開き、その製造では、アレイ上のタンパク質の内容物が、最初に予め精製する工程を必要とすることなく細菌の発現システムから得られる。
PEG−PLL−ビオチン及びニュートラビジン(Neutravidin)の存在下における小分子の検出の可能性を明らかにするために、薬理学及び毒物学で用いられる3種の小分子をアレイ上に加えた。シクロスポリン、ケトコナゾール及びキニジンの分子をそれらの対応する分子量で同定した。
pH7.4の25mM重炭酸アンモニウム中で、ADP、クレアチンリン酸及びクレアチンリン酸キナーゼを反応させることにより、ATPを酵素的に合成した。[ADP]-を、427.6ダルトンにおいて検出し、[ADP+Na]-を、449.6ダルトンにおいて検出した(図4a参照)。クレアチンリン酸キナーゼ反応の生成物を、507.6、529.6、551.6及び573.8において検出し、それぞれ、[ATP]-並びに3種のATPのナトリウム付加体である[ATP Na]-、[ATP Na2]-及び[ATP Na3]-の予想される分子量と良く適合していた。
ヒトチトクロームP450酵素による薬剤様小分子の酸化は、そのような化合物の代謝において通常最初の段階である。本明細書では、チトクロームP450 3A4によるジベンジルフルオレシンの酸化について、MALDI MSで調査し、結果を図4bに図示した。ジベンジルフルオレシン(dibenzylfluorescine,DBF)の[MH]+を、513.795において検出し、準安定性の酸化生成物は530.069において見られ、これは、1つの酸素の付加を示している。生じた分子は、化学的に不安定であることが知られており、したがって、モノベンジルフルオレシン(monobenzylfluorescein,MBF)とその酸化生成物を、[MH]+は444.912、[MH+O]+は460.890、[MH+2O]は476.855ダルトンにおいて見ることができる。
1.Bruker Daltonic gold target #26993(図3a、3b、3c、4、5)
2.Bruker Daltonic glass target #26754(図6)
3.金で被覆した顕微鏡の30x75mmのスライドグラスを得るために圧延した(milled out)Bruker Daltonic MTP 384 target(図2a、2b)
で得た。
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Claims (73)
- 電気伝導性のターゲット表面を支持体上に有する支持体を含む、レーザー脱離/イオン化質量分析計と共に使用するためのプローブであって、前記ターゲット表面は、1種又はそれ以上の検体捕捉部分を示す複数の別個のターゲット領域を有するマイクロアレイを含むことを特徴とする、プローブ。
- 前記支持体は、スライドグラス又はMALDIターゲットであることを特徴とする、請求項1記載のプローブ。
- 前記複数の別個のターゲット領域は、空間的に定められて配列されていることを特徴とする、請求項1又は2記載のプローブ。
- 各別個のターゲット領域は、1000μm2より小さい面積、より好ましくは500μm2より小さい面積、さらにより好ましくは100μm2より小さい面積を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプローブ。
- 各別個のターゲット領域は、785μm2より小さい面積、より好ましくは392μm2より小さい面積、さらにより好ましくは78μm2より小さい面積を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記別個のターゲット領域は、実質的に円形であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記別個のターゲット領域は、マトリックス内に配列されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記ターゲットの表面上に複数のマトリックスがあることを特徴とする、請求項7記載のプローブ。
- 前記マトリックスは、少なくとも2行と2列の別個のターゲット領域を含むことを特徴とする、請求項7又は8記載のプローブ。
- 少なくとも10個、より好ましくは少なくとも100個、さらにより好ましくは少なくとも1000個、さらにより好ましくは10000個の別個のターゲット領域を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載のプローブ。
- マトリックス内の隣接した別個のターゲット領域間の間隔が1mmより小さいことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記電気伝導性の表面は、金属又は半導体を含むことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記金属は、金、銀、白金、イリジウム、鉄、ニッケル、コバルト、銅又はそれらの混合物もしくは合金から選択され、前記半導体は、ケイ素、グラファイト又はゲルマニウムから選択されることを特徴とする、請求項12記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、タンパク質捕捉部分であることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記タンパク質捕捉部分は、抗体ではないことを特徴とする、請求項14記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、小分子であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記小分子は、2kDaより小さいこと、好ましくは1kDaより小さいこと、より好ましくは500Daより小さいことを特徴とする、請求項16記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、別個のターゲット領域に均一に配置されていることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、別個のターゲット領域に決められた方向に配置されていることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、その結合パートナーに対する親和性が高いことを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分とその結合パートナーとの間の結合親和性(Kd)は、少なくとも10-7M、より好ましくは少なくとも10-9M、より好ましくは少なくとも10-12M、さらにより好ましくは少なくとも10-15Mであることを特徴とする、請求項20記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、前記電気伝導性のターゲット表面に直接付着していることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、前記電気伝導性のターゲット表面に間接的に付着していることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、1種又はそれ以上のリンカー分子を介して付着していることを特徴とする、請求項23記載のプローブ。
- 前記リンカー分子は、ポリアミノ酸又はアルカンチオールを含むことを特徴とする、請求項24記載のプローブ。
- 前記ポリアミノ酸は、ポリ−L−リジン、ポリ−L−アスパラギン酸、ポリ−L−グルタミン酸又は前記3種のアミノ酸とその他の既知のアミノ酸との混合物であることを特徴とする、請求項25記載のプローブ。
- 少なくとも1種のタンパク質捕捉部分が、ビオチン又はブレオマイシン耐性タンパク質を結合することを特徴とする、請求項14記載のプローブ。
- 前記タンパク質捕捉部分は、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン(Neutravidin)又はブレオマイシンであることを特徴とする、請求項27記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、非特異的なタンパク質の結合に通常なら十分抵抗性がある層に提供されることを特徴とする、請求項1〜28のいずれか1項に記載のプローブ。
- 非特異的なタンパク質の結合に通常なら十分抵抗性がある前記層は、前記層の、一般にタンパク質を忌避する性質を担う重合体又は、自己組織化膜(self assembled monolayers,SAM)を含むことを特徴とする、請求項29記載のプローブ。
- 前記重合体は、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)、デキストラン、ポリウレタン又はポリアクリルアミドを含むことを特徴とする、請求項30記載のプローブ。
- 前記重合体は、1種又はそれ以上のリンカー分子を介して前記プローブの表面に結合していることを特徴とする、請求項31記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、前記重合体及び/又は前記リンカー分子を介して前記表面に付着していることを特徴とする、請求項32記載のプローブ。
- 単一の一般的な検体捕捉部分が前記表面上に提供されていることを特徴とする、請求項1〜33のいずれか1項に記載のプローブ。
- 複数の異なる検体捕捉部分が前記表面上に提供されていることを特徴とする、請求項1〜33のいずれか1項に記載のプローブ。
- 捕捉した検体をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜35のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記捕捉した検体は、タンパク質を含むことを特徴とする、請求項36記載のプローブ。
- 前記タンパク質は、融合タンパク質であることを特徴とする、請求項37記載のプローブ。
- 前記融合タンパク質は、ビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)を含むことを特徴とする、請求項38記載のプローブ。
- 前記融合タンパクは、フレオマイシン/ゼオシン耐性タンパク質を含むことを特徴とする、請求項38記載のプローブ。
- 前記捕捉した検体は、該検体に結合した更なる分子を有することを特徴とする、請求項36〜40のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記更なる分子は、小分子、タンパク質又は核酸のいずれか一つであることを特徴とする、請求項41記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、前記表面の十分全体にわたって均一に配置されていることを特徴とする、請求項1〜42のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体捕捉部分は、別個のターゲット領域のみに均一に配置されていることを特徴とする、請求項1〜43のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体は、前記表面上にプリントされていることを特徴とする、請求項36〜44のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記検体は、インクジェット・プリント、圧電プリント又は接触プリントを用いてプリントされていることを特徴とする、請求項45記載のプローブ。
- 前記接触プリントにおいて、スプリット・ピン、ソリッド・ピン(solid pin)又はホローピン(hollow pin)を用いて前記検体を塗布することを特徴とする、請求項46記載のプローブ。
- 別個のターゲット領域の表面は、実質的に平面であることを特徴する、請求項1〜47のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記別個のターゲット領域は、平底のウェルであることを特徴とする、請求項48記載のプローブ。
- 1000μm2当たり、分子が1015個以下という濃度で、より好ましくは、1000μm2当たり、分子が1012個以下という濃度で、より好ましくは、1000μm2当たり、分子が109個以下という濃度で、さらにより好ましくは、1000μm2当たり、分子が106個以下という濃度で検体を結合することができる、請求項1〜49のいずれか1項に記載のプローブ。
- レーザー脱離/イオン化質量分析計と共に使用するためのタンパク質マイクロアレイを製造する方法であって、該方法は、請求項14記載のプローブを用意し、別個のターゲット領域内のタンパク質捕捉部分に位置を合わせてタンパク質を沈着させること含むことを特徴とする、タンパク質マイクロアレイを製造する方法。
- 請求項51記載のタンパク質マイクロアレイを分析する方法であって、前記タンパク質マイクロアレイのレーザー脱離/イオン化質量分析を行うこと含むことを特徴とする、タンパク質マイクロアレイを分析する方法。
- 前記レーザー脱離/イオン化質量分析は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI)であることを特徴とする、請求項52記載の方法。
- エネルギー吸収分子を、表面全体にわたって沈着させるか、又はタンパク質が捕捉されている別個のターゲット領域に位置を合わせて沈着させることを特徴とする、請求項53記載の方法。
- エネルギー吸収分子を、タンパク質が捕捉されている別個のターゲット領域に位置を合わせて沈着させることを特徴とする、請求項54記載の方法。
- 前記エネルギー吸収分子を、前記タンパク質を変性させ、従って、表面上で、タンパク質捕捉部分のすぐそばに変性したタンパク質を残す前記タンパク質捕捉部分から前記タンパク質を解放する方法で沈着させることを特徴とする、請求項54又は55記載の方法。
- 前記エネルギー吸収分子は、均一な層として、別個のターゲット領域に、前記タンパク質捕捉部分と捕捉したタンパク質に位置を合わせて存在することを特徴とする、請求項54又は55記載の方法。
- 前記均一な層は、個々の結晶が倍率100倍で目に見えず、隣接する結晶間に目に見える隙間が全くないほど十分に連続していることを特徴とする、請求項57記載の方法。
- 前記均一な層は、倍率100倍で結晶の大きさに明らかな差異がないほど十分に一様な奥行きを有することを特徴とする、請求項57又は58記載の方法。
- 前記エネルギー吸収分子を、非水溶性溶媒中で表面上に沈着させ、該非水溶性溶媒を蒸発して取り除くことを特徴とする、請求項54〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非水溶性溶媒は、有機溶媒であることを特徴とする、請求項60記載の方法。
- 前記有機溶媒は、アセトン又はブタノンであることを特徴とする、請求項61記載の方法。
- 前記非水溶性溶媒は、前記エネルギー吸収分子を沈着させた後に前記非水溶性溶媒の蒸発が起きるように蒸発速度を制御する調節剤を含むことを特徴とする、請求項54〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 蒸発速度を制御する前記調節剤は、グリセロール、ポリエチレングリコール又はチオグリセロールであることを特徴とする、請求項63記載の方法。
- 前記エネルギー吸収分子を、80−99.9%、好ましくは99%の非水溶性溶媒、好ましくはアセトンと、20−0.1%、好ましくは1%の調節剤、好ましくはグリセロール(容積/容積)の混合物中で沈着させることを特徴とする、請求項54〜64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エネルギー吸収分子は、α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、ゲンチシン酸、ニフィジン(nifidine)、コハク酸、1,8,9−アントラセントリオール、3−インドールアクリル酸、2−(ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸、4−ニトロアニリン及びそれらの組み合わせの結晶を含むことを特徴とする、請求項54〜65のいずれか1項に記載の方法。
- レーザー脱離/イオン化質量分析による分析方法であって、該方法は、
a)請求項14記載のプローブを用意する工程と;
b)前記プローブを、1種又はそれ以上のタンパク質と接触させる工程と;
c)前記プローブの表面上におけるタンパク質のレーザー脱離/イオン化質量分析を行う工程を含むことを特徴とする、分析方法。 - 工程b)とc)の間に、洗浄することによって、前記プローブから非結合分子を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項67記載の方法。
- 前記1種又はそれ以上のタンパク質は、タンパク質の混合物中に含まれていることを特徴とする、請求項68記載の方法。
- 前記プローブの表面上のタンパク質を同定する方法であって、
d)前記タンパク質分子の質量を測定する工程と;
e)更なるプローブ又はプローブ表面上で前記タンパク質の反復したサンプルの消化を行う工程と;
f)工程e)より生じたペプチドのレーザー脱離/イオン化質量分析を行って、前記タンパク質を同定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項67〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記プローブ表面上のタンパク質の機能及び前記タンパク質と相互作用する分子を分析する方法であって、工程c)の代わりに、
c)前記プローブ表面上のタンパク質を、1種又はそれ以上の試験分子と接触させる工程と;
d)前記プローブ表面から結合していない試験分子を除去する工程と;
e)前記タンパク質及び任意の結合した分子のレーザー脱離/イオン化質量分析を行って、前記タンパク質及び/又は試験分子の同一性を決定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項67〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試験分子は、小分子、タンパク質又は核酸であることを特徴とする、請求項71記載の方法。
- タンパク質の機能を分析する方法であって、
c)前記プローブ表面上のタンパク質を、1種又はそれ以上の試験基質と接触させる工程と;
d)前記タンパク質及び試験基質のレーザー脱離/イオン化質量分析を行って、前記タンパク質による前記試験基質の触媒反応の生成物の存在及び/又は同一性を決定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項67〜69のいずれか1項に記載の方法。
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