ES2314258T3 - Matriz y dosificacion enzimaticas. - Google Patents
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Abstract
Método de determinación de la actividad de una enzima, o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de la enzima, usando espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio que comprende: (i) proporcionar una sonda que porta una enzima inmovilizada; (ii) introducir opcionalmente el compuesto de prueba; (iii) introducir uno o más reactivos en la enzima inmovilizada durante un tiempo, y en una forma suficiente para que tenga lugar una reacción; (iv) secar opcionalmente la sonda; (v) someter la sonda a espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio; (vi) determinar la actividad de la enzima, o el efecto que el compuesto de prueba tuvo sobre la actividad de la enzima, detectando la presencia y/o ausencia de uno o más productos y/o el uno o más reactivos; caracterizado porque se proporciona una capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la superficie de la sonda, y en el que el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas mediante desorción-ionización por láser, preferiblemente un espectrómetro de masas MALDI.
Description
Matriz y dosificación enzimáticas.
Esta solicitud reivindica prioridad respecto al
documento GB0311946.8, presentado el 23 de mayo de 2003, el
documento GB0224872.2, presentado el 25 de octubre de 2002 y el
documento PCT/EP02/14859, presentado el 20 de diciembre.
La presente invención se refiere a un ensayo
enzimático y más particularmente a un ensayo de cinasa para su uso
con un espectrómetro de masas mediante desorción/ionización por
láser, tal como un espectrómetro de masas MALDI.
Las aplicaciones proteómicas para espectrometría
de masas han tenido un fuerte crecimiento en los últimos años. Los
métodos analíticos usados en proteómica se basan principalmente en
electroforesis en gel 2D para la separación de proteínas, y o bien
espectrometría de masas o bien degradación de Edman para la
identificación de proteínas. Las limitaciones de la electroforesis
en gel 2D incluyen una resolución, sensibilidad y reproducibilidad
relativamente escasas. Como resultado, los métodos proteómicos que
evitan la electroforesis en gel 2D tales como purificación por
etiqueta de afinidad codificada por isótopo (ICAT)^{1}, de
proteína por afinidad en tándem (TAP)^{2} y el uso de
micromatrices^{3} de proteína están ganando popularidad.
Además, estos nuevos métodos han ampliado el
alcance de la proteómica desde la recogida y catalogación de datos
de expresión diferencial hasta una fase en la que pueden asignarse
relaciones entre moléculas y esto se ha denominado proteómica
funcional. Recientemente se han usado micromatrices de proteína para
analizar 119 cinasas^{4} de levaduras y una fracción principal
del proteoma^{5} de levaduras.
Se han analizado micromatrices de proteína
mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL), marcadores
fluorescentes o radiactivos o mediante sistemas de detección a base
de anticuerpos, pero hasta la fecha no mediante espectrometría de
masas.
La dependencia actual del uso de ligandos
marcados, tales como anticuerpos o sondas marcadas, para analizar
micromatrices de proteína limita las aplicaciones para micromatrices
de proteína. Por tanto, un sistema de detección libre de marcador
sensible sería una gran ventaja y ampliaría el intervalo de
aplicación a áreas en las que o bien no están disponibles
compuestos marcados, o bien son demasiado caros o en las que el
marcaje alteraría fundamentalmente las propiedades del ligando. Un
método libre de marcador de este tipo sería particularmente útil en
las fases tempranas del descubrimiento del fármaco, en las que se
examinan grandes números de compuestos frente a proteínas.
Una sonda de espectrometría de masas de este
tipo, con la que se ha fabricado una micromatriz enzimática,
permite la interrogación de reacciones enzimáticas y el efecto que
tienen compuestos sobre las mismas de una manera libre de marcador
mediante desorción e ionización de reactivos y productos. La sonda y
los métodos son particularmente útiles en el proceso de
descubrimiento de fármacos, por ejemplo en evaluación de series de
resultados positivos (hit series evaluation), optimización de
compuestos de interés biomédico (lead optimization),
toxicogenómica predictiva y perfilado del metabolito.
Sin embargo, las sondas y el método podrían
usarse como herramienta de diagnóstico tanto para diagnosticar
estados patológicos como monitorizar la evolución de la
enfermedad.
Nelson (nov-dic. de 1997) Mass
Spectrometry Reviews, vol. 16(6) páginas
353-376 describe el uso de sondas biorreactivas en
la caracterización de proteínas.
Zhu et al (nov. de 2000), Nature
Genetics, vol. 26, páginas 283-289 describe el
análisis de proteína cinasas de levaduras usando chips de
proteína.
El documento WO 00/04382 da a conocer matrices
de proteína para el examen paralelo, in vitro, de la
actividad biomolecular.
Según la invención se proporciona un método de
determinación de la actividad de una enzima, o el efecto que un
compuesto de prueba tiene sobre la actividad de la enzima, usando
espectrometría de masas mediante
desorción-ionización por láser asistida por matriz
o espectrometría de masas mediante
desorción-ionización sobre silicio que
comprende:
- i)
- proporcionar una sonda que porta una enzima inmovilizada;
- ii)
- introducir opcionalmente el compuesto de prueba;
- iii)
- introducir uno o más reactivos en la enzima inmovilizada durante un tiempo, y en forma suficiente para que tenga lugar una reacción;
- iv)
- secar opcionalmente la sonda;
- v)
- someter la sonda a espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio; y
- vi)
- determinar la actividad de una enzima, o el efecto que el compuesto de prueba tuvo sobre la actividad de la enzima, detectando la presencia y/o ausencia de uno o más productos y/o el uno o más reactivos, caracterizado porque se proporciona una capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la superficie de la sonda, y en el que el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas mediante desorción-ionización por láser.
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Preferiblemente, la espectrometría de masas usa
un espectrómetro de masas MALDI. Sin embargo, el experto apreciará
que también pueden usarse otros numerosos métodos de espectrometría
de masas que permiten el evento de ionización, incluyendo
espectrometría de masas mediante
desorción-ionización por láser, espectrometría de
masas mediante desorción-ionización por láser
asistida por matriz (MALDI); y espectrometría de masas mediante
desorción-ionización sobre silicio (DIOS).
Claramente, pueden usarse métodos de espectrometría de masas de
transformada de Fourier (FT/MS) tales como espectrometría de masas
de resonancia de ión ciclotrón por transformada de Fourier
(FT-ICR) para potenciar la precisión de los
diversos métodos de ionización.
Aunque el método puede usarse para estudiar
cualquier reacción enzimática en la que uno o más reactivos se
convierten en uno o más productos y o bien los reactivos y/o bien
los productos pueden distinguirse usando, por ejemplo,
espectrometría de masas MALDI, es particularmente adecuado como
método para investigar cinasas ya que todas las cinasas usan y/o
generan un nucleótido trifosfato (NTP) o un nucleótido difosfato
(NDP), por ejemplo adenín trifosfato (ATP) o adenín difosfato (ADP)
que pueden detectarse de manera fácil y distinguible. El experto
entenderá que también pueden usarse otras especies de nucleótidos
tales como guanina, uridina y citosina, aunque se prefiere la
adenina debido al hecho de que proporciona un ensayo de más
sensibilidad ya que la detección puede lograrse a niveles molares
pico (10^{-12}). La sensibilidad se mejora usando espectrometría
de masas MALDI debido a los efectos potenciadores de la matriz.
En una realización la etapa ii) es esencial, y
se determina el efecto que el compuesto de prueba tiene sobre la
actividad enzimática mediante la comparación con los resultados
obtenidos cuando el compuesto de prueba está ausente. El ensayo
puede ejecutarse sobre una única matriz, ejecutando dos o más
ensayos en paralelo, o mediante comparación con un patrón. El
compuesto de prueba puede añadirse antes, después o lo más
preferiblemente con el uno o más reactivos.
El método puede usarse para proporcionar un
resultado o bien cualitativo bien cuantitativo.
Preferiblemente, el método determinará la
actividad de una o más cinasas o el efecto que un compuesto de
prueba tiene sobre la actividad de una o más cinasas usando
espectrometría de masas MALDI. Por tanto, una matriz de cinasa para
su uso en el método puede comprender una o más cinasas, por ejemplo,
al menos 10, hasta 25, 50, 75, 100, 200, 300 o más de algunas de
las más de 500 cinasas del cineoma. Éstas pueden disponerse sobre
una micromatriz, estando depositada cada cinasa en un área diana
diferenciada.
Para un ensayo de cinasas, el uno o más
reactivos pueden comprender un donador de fosfato, un aceptor de
fosfato y un catión divalente. El donador de fosfato puede ser un
sustrato fosforilado y el aceptor de fosfato puede ser un
nucleótido difosfato (NDP). La simplicidad del método reside en el
hecho de que estos reactivos son comunes para todas las reacciones
de cinasas permitiendo así que se aplique un único conjunto de
condiciones a lo largo de una gama de cinasas. Esto significa que
el ensayo es robusto y que permite que se use para selección de
alto rendimiento.
Por supuesto, es posible usar sustratos
genéricos así como diferenciados y se muestran ejemplos de cinasas
y sus sustratos en las tablas 1 y 2, adjuntas al presente
documento.
En una realización, el donador de fosfato es un
nucleótido trifosfato (NTP) y el aceptor de fosfato es un sustrato
que va a fosforilarse. Preferiblemente el catión divalente
(M^{2+}) es magnesio o manganeso.
En otra realización, el producto es un
nucleótido trifosfato o un nucleótido difosfato, cuya presencia se
detecta. Por supuesto, dado que una reacción de cinasa típica es
reversible, los reactivos pueden ser los productos y viceversa.
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Normalmente, el nucleótido trifosfato o
nucleótido difosfato se detectan como [NTP]^{-} o
[NDP]^{-} y/o como uno o más picos de aducto de los mismos.
El uno o más picos de aducto son normalmente picos de aducto con un
catión monovalente (M^{+}) (por ejemplo Na, K, Li.) dependiendo de
los reactivos/tampones usados. El uno o más picos de aducto pueden
incluir, por ejemplo, [ATP+M]^{-}, [ATP+2M]^{-} y
[ATP+3M]^{-} y/o [ADP+M]^{-},
[ADP+2M]^{-} y
[ADP+3M]^{-}.
[ADP+3M]^{-}.
Un factor importante para poder lograr una buena
detección es la selección de un tampón con bajo contenido en sal.
Preferiblemente, el tampón con bajo contenido en sal es un "tampón
semivolátil" tal como tampón bicarbonato de amonio. Tales
tampones no dejan un residuo en evaporación a medida que se
convierten en gases, que en el caso del bicarbonato de amonio son
amoniaco, dióxido de carbono y agua. Alternativamente, dado que la
mezcla de reacción sólo necesita ser un tampón "con bajo
contenido en sal" en el punto de evaporación/ionización, sería
posible usar un tampón que contiene una concentración superior de
una sal semivolátil y luego, tras finalizar la reacción, eliminar
el tampón semivolátil a vacío (o bien en la cámara de vacío del
espectrómetro de masas o bien en una cámara de vacío externa). Sin
embargo, esto es más complejo y menos deseable.
Una característica adicional y significativa de
la invención reside en el hecho de que en un ensayo de cinasa los
productos/reactivos detectados son pequeños; normalmente inferiores
a 1000 daltons y en consecuencia el análisis de espectrometría de
masas puede realizarse sin tener que recubrir la sonda con moléculas
absorbentes de energía (matriz). Esto simplifica y acelera el
procedimiento así como ahorra costes. Sin embargo, la adición de la
matriz aumenta la sensibilidad.
Cuando se aplican moléculas absorbentes de
energía, éstas deben aplicarse a la sonda en correspondencia con la
enzima inmovilizada.
El uno o más reactivos, y si está presente el
compuesto de prueba, se introducen preferiblemente en la enzima
inmovilizada en forma compartimentalizada, tal como en forma de una
gota. Preferiblemente, la gota tiene un volumen inferior a 1
microlitro.
Adicionalmente, se prefiere que el ensayo se
realice en un entorno húmedo.
Por supuesto, así como a cinasas, el método de
la invención puede aplicarse a otras enzimas. Por tanto, es posible
estudiar reacciones enzimáticas de proteínas inmovilizadas sobre
matrices de proteína mediante espectrometría de masas donde los
reactivos y/o productos son ionizables y en las que la reacción
enzimática conduce a un cambio de masa en el reactivo y/o producto.
Este puede ser el caso de oxidorreductasas, transferasas,
hidrolasas, liasas y ligasas.
Se enumeran subclases típicas de enzimas de
estos grupos de enzimas en la tabla 3 a continuación:
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Alternativamente, el método puede usarse para
monitorizar reacciones enzimáticas que implican cosustratos
(también reactivos en el contexto de esta solicitud) incluyendo NAD,
NADP, NADH, NADPH, ATP, GTP, UTP, CTP, UDP-glucosa,
UDP-glucosamina UDP-galactosa,
piridoxalfosfato,
UDP-N-acetil-D-glucosamina,
GDP-D-manosa,
dTDP-6-desoxi-L-manosa,
GDP-6-desoxi-D-talosa,
UDP-N-acetilmuramato,
S)-3-hidroxiacil-CoA,
S-adenosil-L-metionina,
acetil-CoA,
L-selenoseril-tARN^{sec},
(S)-3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA,
5,10-metilentetrahidrofolato, ascorbato,
2-oxoglutarato, glutatión, piruvato y
tetrahidropteridina.
Esto es particularmente útil cuando los
sustratos o productos no son ionizables o cuando la reacción no
provoca un cambio de masa, tal como se observa para isomerasas (por
ejemplo, fenilalanina racemasa que hidroliza ATP).
Más específicamente, la enzima se extrae de uno
o más del grupo o de los grupos de aquellas familias de enzimas que
son dianas de fármacos comunes, tales como proteína cinasas
(incluyendo serina/treonina cinasas y tirosina cinasas), proteasas
(incluyendo serina proteasas, cisteína proteasas, aspartil proteasas
y metaloproteinasas), carboxilasas, esterasas, fosfodiesterasas,
proteína fosfatasas (incluyendo tirosina fosfatasas), receptores
acoplados a proteína G, chaperonas dependientes de ATP,
ciclooxigenasas, citrocromo P450, sialidasas y
deshidrogenasa/reductasas de cadena corta.
Puede proporcionarse una sonda para su uso con
un espectrómetro de masas, que comprende un soporte que tiene una
superficie diana electroconductora sobre el mismo caracterizado
porque la superficie diana comprende una matriz que tiene una
pluralidad de enzimas inmovilizadas sobre la misma.
Las enzimas pueden seleccionarse de los grupos
de enzimas enumerados anteriormente. Se prefieren particularmente
aquellas familias de enzimas que son dianas de fármacos comunes,
particularmente aunque no exclusivamente cinasas.
Preferiblemente, la matriz es una
micromatriz.
Las enzimas se unen preferiblemente a la sonda
como proteínas de fusión, normalmente mediante una etiqueta, tal
como, por ejemplo, biotina o una proteína de sh ble.
Se describen aspectos relacionados con la
invención por completo en varias solicitudes de patente anteriores
de los solicitantes incluyendo el documento WO 01/57198 y por tanto
no se tratan con profundidad en el presente documento, pero como
otros están todavía sin publicar, tales como el documento GB
0224872.2, se facilitan a continuación detalles relacionados y de
apoyo:
Por tanto, las sondas a las que se hace
referencia en el presente documento incluyen micromatrices, así como
matrices en las que las manchas de proteína serán visibles a simple
vista, y están adaptadas de modo que pueden interrogarse por medio
de espectrometría de masas mediante desorción/ionización por láser,
particularmente, aunque no exclusivamente, desorción/ionización por
láser asistida por matriz (MALDI).
Los aspectos adicionales incluyen métodos que
conducen a la producción de una sonda de este tipo que puede
interrogarse por medio de espectrometría de masas mediante
desorción/ionización por láser, particularmente
desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) y métodos
de análisis tales como una micromatriz de proteína o sonda.
Por tanto, el desarrollo de una micromatriz de
proteína compatible con EM MALDI, término que incluye micromatrices
enzimáticas, fue complejo dado que los métodos existentes de
formación de micromatrices de proteína no se transfieren fácilmente
a una diana de MALDI. Hay varias razones por las que éste era el
caso, incluyendo la naturaleza especializada de las superficies de
la sonda y el potencial de que las sales presentes en tampones de
reacción interfieran con el método de detección.
Los procedimientos conocidos en la técnica para
MALDI requieren normalmente la cristalización conjunta del analito
acuoso con moléculas ácidas absorbentes de energía, o "matriz",
para promover la ionización de los analitos (Karas y Hillenkamp,
1988). El método de cristalización conjunta del analito y la matriz
para MALDI, tal como se conoce en la técnica, da como resultado
normalmente un proceso de cristalización heterogénea y produce
cristales diferenciados, separados espacialmente que contienen cada
uno diferentes cantidades de matriz y analito. Como consecuencia,
se observa a menudo que cristales individuales contienen
insuficiente analito para el análisis mediante MALDI. A su vez,
esto da como resultado un requisito de que el analizador tome
muestras de múltiples ubicaciones diferenciadas (es decir,
10-100 o más) dentro de un área diana dada con el
fin de obtener una buena señal de analito; esto se denomina algunas
veces "la búsqueda de la mancha óptima (sweet spot)".
Esto ha impedido anteriormente la miniaturización dado que las
manchas de proteína necesitan ser grandes. Eran generalmente del
orden de al menos
0,5 mm^{2}.
0,5 mm^{2}.
Con el fin de generar micromatrices de proteína
compatibles con MALDI EM, se requerían soluciones para las
deficiencias mencionadas anteriormente de la técnica anterior que
permitiesen tanto la miniaturización de las áreas diana como el
análisis funcional de las proteínas dispuestas en matriz.
Tal como se define en el presente documento, una
sonda es un soporte que puede actuar como una diana en análisis
mediante espectrometría de masas mediante desorción/ionización, por
ejemplo desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI).
La sonda porta las enzimas, por ejemplo cinasas y se añaden los
reactivos (y opcionalmente compuestos de prueba). Tras un tiempo
suficiente para que tenga lugar una reacción, y se formen
productos, las sondas se secan y se someten a espectrometría de
masas. Los reactivos y/o los productos interaccionan con la lente
reflectora del montaje iónico-óptico encontrado en espectrómetros de
masas de tiempo de vuelo (TOF) mediante desorción/ionización por
láser de la técnica, de modo que se convierten en iones gaseosos que
permiten el análisis. Por ejemplo, las sondas de la invención se
pueden obtener de dianas para análisis mediante MALDI tal como se
conoce en la técnica, las cuales son tratadas de modo que un resto
de enlace a proteína de alta afinidad, por ejemplo moléculas de
estreptavidina, avidina o neutravidina, esté presente sobre la
superficie de la sonda que se une a enzimas biotiniladas para su
análisis posterior. Por ejemplo, puede usarse vidrio convencional o
dianas de MALDI de oro.
Tal como se define en el presente documento, una
micromatriz es una matriz en la que el tamaño de las áreas diana
diferenciadas, es decir, las áreas individuales examinadas mediante
sonda por un láser, está en el orden de micrómetros o inferior.
Mientras que en el extremo superior de la escala, aproximadamente
1000 micrómetros de diámetro, pueden ser visibles a simple vista,
en el extremo inferior de la escala las áreas diana diferenciadas
no se distinguirán claramente a simple vista.
Las matrices se dispondrán normalmente en
matrices que comprenden varias filas y columnas. El número de áreas
diana diferenciadas dependerá de qué está siendo examinado, aunque
generalmente es deseable tener una alta densidad de estas áreas
diferenciadas sobre la superficie de la sonda ya que esto facilitará
una selección de alto rendimiento. Normalmente, la sonda
comprenderá al menos 10, más preferiblemente al menos 100, más
preferiblemente al menos 1000 y tantas como 10.000 o más áreas diana
producidas sobre la misma. (Normalmente, una superficie de sonda
tendrá un área de aproximadamente 10.000 mm^{2} - una sonda Bruker
tiene un área de 10.292 mm^{2} aunque no es un requisito usar la
totalidad de la sonda y la micromatriz puede aplicarse en una o más
matrices sobre la misma). La densidad real en una matriz dada
dependerá del tamaño del área diana diferenciada (que normalmente
se imprimirá como una mancha) y el espacio entre manchas adyacentes.
Por tanto, las áreas diana diferenciadas estarán presentes
normalmente a una densidad superior a 1 área diana diferenciada por
mm^{2} dentro de cualquier matriz.
La enzima es el resto sobre el que se produce la
reacción.
El término "enzima" tal como se usa en el
presente documento se usa para incluir tanto enzimas completas como
subunidades o dominios de las mismas.
"Proteína de fusión" tal como se usa en el
presente documento se usa para referirse a una enzima, que tiene
una etiqueta, por ejemplo una secuencia consenso de biotinilación o
una proteína de unión de resistencia a fleomicina/zeocina unida a
la misma.
"Moléculas de ligador" son moléculas que
funcionan como sugiere su nombre. Son moléculas que comprenden
grupos funcionales que permiten que se formen puentes entre
moléculas diferentes.
Otro desarrollo significativo que permite la
"miniaturización" de una matriz enzimática formada sobre una
diana de MALDI deriva de la aplicación de la tecnología COVET del
solicitante descrita en el documento WO 01/57198. En resumen,
usando esta tecnología pueden crearse a partir de enzimas expresadas
en bibliotecas de ADNc, que portan una "etiqueta de secuencia"
que puede usarse para capturar las enzimas con una alta afinidad y
en orientación específica sobre la superficie de la micromatriz. En
primer lugar, esto permite que las enzimas, por ejemplo una
biblioteca de cinasa, se inmovilice de manera estable de modo que se
evita la lixiviación de las enzimas de la superficie y en segundo
lugar la inmovilización orientada de la proteína de fusión sobre la
superficie garantiza una actividad biológica
máxima.
máxima.
Aún otro aspecto significativo, cuando se
compara con micromatrices de proteína actuales, es la provisión de
una sonda de este tipo con una superficie electroconductora. Esta
superficie que incluye superficies semiconductoras es esencial
cuando la sonda va a someterse a análisis mediante MALDI EM.
Mientras que el soporte podría estar compuesto completamente por un
material electroconductor (término que se usa en el presente
documento para incluir materiales semiconductores), se prefiere
recubrir un soporte rígido, por ejemplo un vidrio, con un material
electroconductor tal como, por ejemplo, oro, aunque podría usarse
cualquier metal, por ejemplo plata, platino, iridio, wolframio,
cobre, cobalto, níquel y hierro o mezclas de los mismos, o un
semiconductor, por ejemplo óxido de silicio, grafito u óxido de
germanio.
Cuando la micromatriz enzimática o sonda se
produce, por ejemplo, sobre un portaobjetos de vidrio de microscopio
de tamaño convencional, puede montarse en un adaptador, que lo
porta en un espectrómetro de masas. Se describe un adaptador de
este tipo en la solicitud de patente británica en tramitación junto
con la presente del solicitante número 0216387.1.
Una característica significativa adicional de la
presente invención es la forma en la que el solicitante ha superado
los problemas provocados por la enlace no específico de proteína. El
solicitante ha superado este problema particular proporcionando una
capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la
superficie de la sonda. Más particularmente, la superficie de la
micromatriz se modifica mediante la inclusión de una capa de
moléculas que repelen a las proteínas. Estas moléculas repelentes de
proteínas que incluyen, por ejemplo, polietilenglicol, pueden
unirse a la superficie de la sonda mediante un ligador, tal como,
por ejemplo, un poliaminoácido y que se unen fácilmente a, por
ejemplo, una superficie de vidrio u oro y cuyos grupos laterales
amino o carboxilo pueden usarse para unir las moléculas repelentes
de proteínas de modo que se extienden desde la superficie de la
sonda. El experto apreciará que podrían usarse otras moléculas
funcionalizadas. Preferiblemente, los restos de unión a enzima se
incorporan en una posición en la que se extienden desde la
superficie. Los restos de unión a enzima preferidos incluyen, por
ejemplo, biotina, biotina-neutroavidina y
bleomicina, y estos y otros restos pueden incorporarse en la capa o
bien mediante estos grupos funcionales en las moléculas de ligador
y/o bien mediante grupos funcionales en las moléculas repelentes de
proteínas. Normalmente, se incorporan restos de captura por
afinidad en pequeñas proporciones (normalmente inferiores al 20%)
en relación con las moléculas repelentes de proteínas.
De esta forma, el solicitante ha podido
introducir los restos de captura de enzimas no sólo en una
disposición espacial definida, homogénea sino también de una manera
que permite el enlace de alta afinidad de una manera específica. La
superficie resultante se combina selectivamente para la captura de
macromoléculas biológicas sobre la sonda con unión reducida no
específica del tipo observado comúnmente sobre superficies de metal
o vidrio no derivatizadas y da como resultado adicionalmente una
orientación y distribución homogéneas de las macromoléculas
biológicas capturadas.
Las moléculas componentes responsables de la
repulsión de proteínas no específicas incluyen moléculas que son
generalmente de naturaleza hidrófila. Incluyen polímeros, tales
como, por ejemplo, polietilenglicol, dextrano, poliuretano y
poliacrilamida y monocapas autoensambladas (SAM). Preferiblemente,
los polímeros comprenden uno o más grupos secundarios funcionales
mediante los cuales pueden unirse los restos de captura de
proteínas. En el caso de polietilenglicol, el grupo funcional es un
grupo hidroxilo. Las moléculas responsables de la repulsión de
proteínas no específicas pueden unirse directamente a la superficie
como, por ejemplo, en el caso de SAM o pueden unirse mediante un
ligador. Se prefieren particularmente como ligadores poliaminoácidos
tales como, por ejemplo,
poli-L-lisina, poli-ácido
L-aspártico, poli-ácido L-glutámico
o mezclas de los mismos.
Estos tienen cadenas laterales de amino o
carboxilo mediante las cuales pueden unirse las moléculas
responsables de la repulsión de proteínas no específicas y que
pueden usarse adicionalmente para unir los restos de captura de
proteínas. Alternativamente, o además, los restos de captura de
proteínas pueden unirse mediante las moléculas componentes
responsables de la repulsión de proteínas no específicas.
La figura 1 ilustra la unión de tales moléculas
y compara la orientación definida que puede lograrse mediante este
acoplamiento ordenado en comparación con la lograda usando técnicas
de unión a anticuerpos actuales que dan como resultado un
acoplamiento aleatorio.
En una realización preferida, la sonda tiene
como sus restos de captura de enzimas o bien un aglutinante de
biotina, por ejemplo neutravidina, avidina o estreptavidina o un
aglutinante de proteína resistente a blemicina, por ejemplo
bleomicina. Las enzimas se unen a la sonda para crear una
micromatriz de proteína imprimiendo una pluralidad de lisados de
células bacterianas, de levaduras, sf9 o de mamíferos que contienen
proteínas de fusión en las que se expresa una etiqueta de alta
afinidad, por ejemplo proteína resistente a biotina o zeocina (ZRP)
sobre la superficie de captura. Las proteínas se derivan de la
expresión de una biblioteca de ADNc y cada clon individual se marca
en el extremo C-terminal y/o en el extremo
N-terminal con una secuencia consenso, que
permitirá el reconocimiento de alta afinidad de la enzima incluso en
presencia por lo demás de las moléculas repelentes de proteína.
Sólo la enzima recombinante marcada puede reconocer la superficie
de captura y otras proteínas del lisado pueden eliminarse por lavado
ya que no se unen a la superficie repelente de proteínas y no
tienen una alta afinidad por los restos de unión a proteína
presentes en la capa.
Puede proporcionarse un método de producción de
una micromatriz enzimática para su uso con un espectrómetro de
masas que comprende proporcionar una sonda y depositar la enzima en
correspondencia con los restos de captura de proteínas en el área
diana diferenciada.
Aún un aspecto adicional proporciona un método
de análisis de una sonda en la que se depositan moléculas
absorbentes de energía de una manera que desnaturaliza y por tanto
separa una enzima de un resto de captura de proteínas dejando la
enzima desnaturalizada separada sobre la superficie.
Las moléculas absorbentes de energía forman una
capa homogénea de cristales en una ubicación diferenciada en
correspondencia con los restos de captura de proteína y la enzima
capturada.
La capa homogénea de cristales es
sustancialmente continua de modo que los cristales individuales no
son visibles a un aumento de 100 veces y no hay huecos visibles.
También tiene una profundidad sustancialmente uniforme, de modo que
no hay variación aparente en el tamaño del cristal a un aumento de
100 veces.
Las moléculas absorbentes de energía se
depositan sobre la superficie en un disolvente no acuoso y el
disolvente no acuoso se elimina por evaporación. Preferiblemente,
el disolvente no acuoso es un disolvente orgánico, tal como, por
ejemplo, acetona o butanona.
Preferiblemente, el disolvente no acuoso incluye
un modificador que controla la tasa de evaporación de modo que se
produce la cristalización de las moléculas absorbentes de energía
sobre la sonda. Los modificadores adecuados incluyen glicerol,
polietilenglicol y tioglicerol.
Preferiblemente, las moléculas absorbentes de
energía se depositan en una mezcla de desde el
80-99,9%, preferiblemente el 99% de disolvente
orgánico, por ejemplo acetona hasta el 20-0,1%,
preferiblemente el 1% de modificador, por ejemplo glicerol
(vol/vol). Las moléculas absorbentes de energía típicas incluyen
cristales de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxi-cinámico,
ácido sinapínico, ácido gentísico, nifidina, ácido succínico,
1,8,9-antracenitriol, ácido
3-indolacrílico, ácido
2-(hidroxifenilazo)benzoico, 4-nitroanilina y
combinaciones de los mismos.
Preferiblemente, las moléculas absorbentes de
energía se depositan en correspondencia con la proteína y cada
mancha de proteína se recubre con una mancha de tamaño similar de
las moléculas absorbentes de energía.
Con el fin de lograr una alta densidad de
muestras individuales sobre la micromatriz, las moléculas
absorbentes de energía necesitan disponerse en microcristales sobre
la superficie. La matriz forma una capa homogénea de cristales
planos sin huecos significativos entre ellos y pueden depositarse en
cantidades muy pequeñas sobre la micromatriz.
Al contrario que la técnica anterior en la que
la matriz y el analito se cristalizan conjuntamente en un disolvente
acuoso, el solicitante usa dos etapas distintas en las que se
deposita en primar lugar la proteína en un disolvente acuoso y
luego las moléculas absorbentes de energía se depositan de modo que
cristalizan en el disolvente no acuoso sobre la sonda. Esto tiene
la ventaja de que la proteína se deposita en su forma biológica. Sin
embargo, el uso de un disolvente no acuoso para suministrar las
moléculas absorbentes de energía permite la formación de una capa
homogénea de microcristales.
Esto tiene dos beneficios. En primer lugar, la
formación de una capa homogénea significa que no es necesario
buscar una mancha óptima ya que la capa homogénea garantiza la
proteína en presencia de moléculas absorbentes de energía y en
segundo lugar da como resultado una medición más precisa debido a la
naturaleza uniforme de la capa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los diversos aspectos de la invención se
describirán ahora, a modo de ejemplo sólo, con referencia a las
siguientes figuras y ejemplos en los que:
la figura 1 muestra la unión orientada de las
enzimas a una sonda
la figura 2 muestra la detección de ADP y ATP
usando espectrometría de masas, y
la figura 3 también muestra la síntesis de ATP
mediada por creatina fosfato sobre una superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En referencia a la figura 2, se sintetizó ATP
enzimáticamente a partir de la reacción de ADP, creatina fosfato y
creatina cinasa (también conocida como creatina fosfocinasa) en
bicarbonato de amonio 25 mM a pH 7,4. Se detectó [ADP]^{-}
a 427,6 dalton y [ADP+Na]^{-} a 449,6 dalton. Se detectaron
los productos de la reacción de creatina fosfato cinasa a 507,6,
529,6, 551,6 y 573,8, lo que se ajusta bien con el peso molecular
esperado de [ATP]^{-} y tres aductos de sodio de ATP
[ATP+Na]^{-}, [ATP+2Na]^{-} y
[ATP+3Na]^{-}.
Las reacciones control en las que se omitió o
bien uno de los sustratos de ADP o la creatina fosfato o bien la
enzima creatina fosfato cinasa no mostraron picos de ATP.
Ejemplo
2
En referencia a la figura 3, el ejemplo
demuestra la biotinilación, captura y desalación de creatina cinasa
de músculo de conejo en una sonda recubierta con
PEG-PLL-biotina neutravidina para su
análisis mediante espectrometría de masas MALDI y la actividad
enzimática de la cinasa inmovilizada usando espectrometría de masas
MALDI.
\vskip1.000000\baselineskip
Creatina cinasa de ATP del músculo de conejo:
ADP de creatina N-fosfotransferasa, creatina
fosfato, Tris HCl
1 mM pH 7,5, MgCl_{2} 1 mM, portaobjetos de vidrio recubierto con oro, PEG-PLL-biotina, neutravidina.
1 mM pH 7,5, MgCl_{2} 1 mM, portaobjetos de vidrio recubierto con oro, PEG-PLL-biotina, neutravidina.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de lavado: Tris-HCl 1 mM
pH 7,5 con Triton X-100 al 0,1%; tampón de
desalación: Tris-HCl 1 mM pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó el polímero de
poli-L-lisina y
PEG-biotina
(PEG-PLL-biotina) según el protocolo
de Ruiz Taylor^{6}. En resumen, se hicieron reaccionar 100 mg de
poli-L-lisina (tamaño promedio
17-30 kDa; Sigma, Dorset, UK) con 109 mg de
mPEG-SPA y 1,1 mg de
biotina-PEG-CO-NHS
(Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama) en 1 ml de tampón
carbonato de sodio 100 mM pH 9 durante un periodo de 30 minutos. Se
terminó la reacción mediante diálisis en Tris-HCl 1
mM pH 7,5 durante la noche. El producto de esta reacción se denominó
PEG-PLL-biotina (el 1% de
derivados de PEG contiene un grupo principal de biotina).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió creatina cinasa (100 mg) en 1 ml de
Tris HCl 1 mM pH 7,5 y se hicieron reaccionar 1 mg de
biotina-PEO-amina de EZ link y 1 mg
de etilendiaminacarbodiimida durante 20 minutos a temperatura
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se limpiaron cuidadosamente sondas de
micromatrices de proteína antes de su uso con etapas de lavado
secuenciales en acetona, acetonitrilo, agua bidestilada y se
secaron bajo nitrógeno. Entonces se pipeteó polímero de captura por
afinidad recién preparado
PEG-PLL-biotina sobre la superficie
de la sonda y entonces se distribuyó uniformemente sobre la
superficie cubriéndola con película Nesco (Azwell Inc., Osaka,
Japón). Tras 30 min., se lavó la sonda en Tris-HCl
1 mM pH 7,5, se secó bajo nitrógeno y entonces se recubrió con 0,5
mg/ml de neutravidina durante una hora a TA en una cámara húmeda.
Entonces se aclaró la sonda con tampón de lavado, se lavó dos veces
con tampón de desalación y se secó bajo nitrógeno. La superficie
está ahora lista para usarse como un dispositivo de captura por
afinidad sumamente específico para macromoléculas biotiniladas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrió una superficie de
PLL-PEG-biotina neutravidina sobre
una diana de MALDI con 50 ng de creatina cinasa biotinilada (Roche,
Mannheim, Alemania). Se capturó la proteína biotinilada durante un
periodo de 2 horas sobre la diana de MALDI en una cámara húmeda
para evitar el secado, se lavó dos veces con tampón de lavado
seguido por dos lavados con tampón de desalación, se secó la
superficie bajo nitrógeno y se recubrió con 300 nl de una
disolución saturada de ácido
ciano-4-hidroxicinámico en
acetona.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lava la matriz con la creatina cinasa
inmovilizada con 100 ml de Tris-HCl 1 mM pH 7,5 y
entonces se recubre con una mezcla de creatina fosfato 1 mM, ADP 1
mM, MgCl_{2} 1 mM y tampón bicarbonato de amonio 25 mM en un
volumen inferior a 1 microlitro. La enzima y los sustratos se
incuban en una cámara húmeda a 37ºC durante un periodo de 30
minutos. Se ejecutaron en paralelo reacciones que omitieron o bien
ADP, creatina fosfato o bien la cinasa como controles
específicos.
La figura 3 muestra la detección de ADP y ATP.
Se sintetizó ATP enzimáticamente a partir de la reacción de ADP,
creatina fosfato y creatina cinasa en bicarbonato de amonio 25 mM a
pH 7,4. Se detectó [ADP]^{-} a 427,6 dalton y
[ADP+Na]^{-} a 449,6 dalton. Se detectaron los productos de
la reacción de creatina cinasa a 507,6, 529,6, 551,6 y 573,8, lo
que se ajusta bien al peso molecular esperado de [ATP]^{-}
y tres aductos de sodio de ATP [ATP+Na]^{-},
[ATP+2Na]^{-} y [ATP+3Na]^{-}.
Las reacciones control en las que se omitieron o
bien uno de los sustratos de ADP o creatina fosfato o bien la
enzima creatina cinasa no mostraron picos de ATP.
1 Gygi, S. P., Rist, B.,
Gerber, S. A., Turecek, F. Gelb, M. H. y
Aebersold, R.. Nat Biotechnol. 1999; 17,
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2 Gavin AC, Bosche M,
Krause R, Grandi P, Marzioch M, Bauer A,
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CM, Remor M, Hofert C, Schelder M,
Brajenovic M, Ruffner H, Merino. A,
Klein K, Hudak M, Dickson D, Rudi T,
Gnau V, Bauch A, Bastuck S, Huhse B,
Leutwein C, Heurtier MA, Copley RR,
Edelmann A, Querfurth E, Rybin V, Drewes
G, Raida M, Bouwmeester T, Bork P,
Seraphin B, Kuster B, Neubauer G,
Superti-Furga G.. Nature 2002;
415 (6868), 141-147.
3 MacBeath, G., y Schreiber, S. F.
Science 2000; 289, 1760-1763.
4 Zhu H, Klemic JF, Chang
S, Bertone P, Casamayor A, Klemic KG,
Smith D, Gerstein M, Reed MA, Snyder M.
Nat Genet. 2000; 26(3):
283-9.
5 Zhu H, Bilgin M, Bangham
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N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T,
Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein
M, Snyder M. Science 2001; 293,
2101-2105.
6 Natsume, T., Nakayama, H.,
Isobe, T. Trends Biotechnolo 2001; 10,
28-33.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Esta es una lista de sustratos disponible de
Upstate.
http://www.upstate.com/features/kinaseprofiler.q./KinaseProfiler+%23153%3B#kinase1
Claims (22)
1. Método de determinación de la actividad de
una enzima, o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la
actividad de la enzima, usando espectrometría de masas mediante
desorción-ionización por láser asistida por matriz
o espectrometría de masas mediante
desorción-ionización sobre silicio que
comprende:
- (i)
- proporcionar una sonda que porta una enzima inmovilizada;
- (ii)
- introducir opcionalmente el compuesto de prueba;
- (iii)
- introducir uno o más reactivos en la enzima inmovilizada durante un tiempo, y en una forma suficiente para que tenga lugar una reacción;
- (iv)
- secar opcionalmente la sonda;
- (v)
- someter la sonda a espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio;
- (vi)
- determinar la actividad de la enzima, o el efecto que el compuesto de prueba tuvo sobre la actividad de la enzima, detectando la presencia y/o ausencia de uno o más productos y/o el uno o más reactivos;
caracterizado porque se proporciona una
capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la
superficie de la sonda,
y en el que el espectrómetro de masas es un
espectrómetro de masas mediante desorción-ionización
por láser, preferiblemente un espectrómetro de masas MALDI.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha capa resistente frente al enlace no específico de proteína
comprende moléculas repelentes de proteínas tales como moléculas de
polietilenglicol, moléculas repelentes de proteínas que están
inmovilizadas sobre la superficie de la sonda.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la enzima es una cinasa tal como una
serina cinasa, tirosina cinasa o treonina cinasa, una
oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una
ligasa, una carboxilasa, una esterasa, una fosfodiesterasa, una
proteína fosfatasa tal como una tirosina fosfatasa, un receptor
acoplado a proteína G, una chaperona dependiente de ATP, una
ciclooxigenasa, un citocromo P450, una sialidasa, una
deshidrogenasa de cadena corta, una reductasa de cadena corta o una
isomerasa.
4. Método según cualquier reivindicación
anterior para determinar la actividad de una o más cinasas o el
efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de una o
más cinasas usando espectrometría de masas MALDI.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
el uno o más reactivos comprenden un donador de fosfato, un aceptor
de fosfato y un catión divalente.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
el donador de fosfato es un sustrato fosforilado y el aceptor de
fosfato es un nucleótido difosfato (NDP).
7. Método según la reivindicación 5, en el que
el donador de fosfato es un nucleótido trifosfato (NTP) y el aceptor
de fosfato es un sustrato que va a fosforilarse.
8. Método según la reivindicación 5, en el que
el catión divalente es magnesio o manganeso.
9. Método según la reivindicación 6 o la
reivindicación 7, en el que el nucleótido difosfato o trifosfato es
un adenín di o trifosfato.
10. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que el producto es un nucleótido trifosfato o un
nucleótido difosfato y se detecta su presencia.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el nucleótido trifosfato o nucleótido difosfato se detectan como
[NDP]^{-} o [NTP]^{-} o como uno o más picos de
aducto de los mismos.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el uno o más picos de aducto son picos de aducto con un catión
monovalente (M^{+}).
13. Método según la reivindicación 12, en el que
el uno o más picos de aducto incluyen: [ATP+M]^{-},
[ATP+2M]^{-} y [ATP+3M]^{-} y/o
[ADP+M]^{-}, [ADP+2M]^{-} y
[ADP+3M]^{-}.
14. Método según cualquier reivindicación
anterior, que comprende además, entre la etapa (iv) y la etapa (v),
recubrir la sonda con moléculas absorbentes de energía.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
dichas moléculas absorbentes de energía se depositan sobre la
superficie de la sonda en un disolvente no acuoso, seguido por
evaporación del disolvente.
16. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que dicha sonda lleva más de una enzima.
17. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que en la etapa (iii) dicho uno o más reactivos se
proporcionan en un tampón con bajo contenido en sal.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
dicho tampón con bajo contenido en sal es un tampón semivolátil tal
como tampón bicarbonato de amonio.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-16, en el que en la etapa (iii)
dicho uno o más reactivos se proporcionan en un tampón semivolátil,
y que comprende además la etapa, tras finalizar la reacción, de
eliminar el tampón semivolátil.
20. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que las enzimas se unen a la sonda como proteínas de
fusión, normalmente mediante una etiqueta.
21. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que dicho compuesto de prueba se añade antes,
después o con el uno o más reactivos para determinar su efecto
sobre la actividad enzimática.
22. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que el uno o más reactivos y el compuesto de prueba
opcional se introducen en la enzima inmovilizada como una gota, tal
como una gota que tiene un volumen inferior a 1 microlitro.
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