ES2265913T3 - Ensayo fluorometrico enzimatico de ampc y adenilato ciclasa. - Google Patents
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Abstract
Un método para eliminar los nucleótidos de adenina no cíclicos, componiéndose de ATP, ADP y AMP endógenos, y la glucosa-6-fosfato endógena en una muestra biológica, el cual comprende el tratar dicha muestra con cantidades eficaces de apirasa, fosfatasa alcalina y adenosina desaminasa, con exclusión de la 5¿-nucleotidasa, para eliminar dichos nucleótidos de adenina no cíclicos y la glucosa-6-fosfato.
Description
Ensayo fluorométrico enzimático de AMPc y
adenilato ciclasa.
La presente invención proporciona un método para
determinar el contenido de AMPc o la actividad de adenilato ciclasa
en una muestra biológica conteniendo nucleótidos de adenina no
cíclicos seleccionados del grupo que se compone de AMPc producido a
partir de ATP mediante adenilato ciclasa endógena
(adenosina-3',5'-monofosfato
cíclico), ATP (adenosina trifosfato), ADP (adenosina difosfato) y
una mezcla de los mismos, sin el empleo de agentes radiactivos. Más
concretamente, la invención tiene que ver con un método que
comprende: (1) combinar una muestra biológica con cantidades
eficaces de apirasa, adenosina desaminasa y fosfatasa alcalina, con
exclusión de la 5'-nucleotidasa, para eliminar
enzimáticamente los nucleótidos de adenina no cíclicos, que no sean
el AMPc, y la glucosa-6-fosfato en
la muestra; (2) transformar enzimáticamente el AMPc en AMP; (3)
determinar la cantidad de AMP sin el empleo de agentes
radiactivos.
La adenilato ciclasa (adenilil ciclasa,
adenilato ciclasa, EC4.6.1.1) es una enzima que cataliza la
conversión:
ATP \rightarrow
AMPc
en presencia de Mg^{2+} o
Mn^{2+}.
La adenilato ciclasa existe localmente en las
membranas celulares, y juega un papel crítico como cascada de
transducción de señales de algunas hormonas y neurotransmisores
fundamentales.
Por ejemplo, la medición de la actividad de
adenilato ciclasa se ha empleado para estudiar la fisiología
alterada exhibida por corazones humanos trasplantados, y en el
fallo cardiaco congestivo. Ver M. R. Bristow y col., New Engl. J.
Med., 307, 205 (1982); K. G. Lurie y col., J. Thorac.
Cardiovasc. Surg., 86, 195 (1983).
La actividad de adenilato ciclasa puede ser
determinada supervisando los cambios del contenido del AMPc
sintetizado a partir de ATP mediante la acción catalítica de la
adenilato ciclasa.
Sin embargo, una más clara explicación del papel
biológico de la adenilato ciclasa ha estado limitada por la
dificultad de controlar exactamente los cambios en el nivel tisular
de AMPc.
EL AMPc
(adenosina-3',5'-monofosfato
cíclico) fue descubierto como un factor que intermedia la acción
elevadora del azúcar en sangre de la adrenalina y el glucagón en
las células del hígado. [E. W. Sutherland y col., J. Am. Chem.
Soc., 79, 3.608 (1957)]. Y también se descubrió que el AMPc
intermedia las acciones de hormonas tales como la
adrenocorticotropina (ACTH), la hormona luteinizante (LH), la
hormona estimulante del tiroides (TSH), y la hormona paratiroidea
(PTH), o sustancias fisiológicamente activas tales como la
prostaglandina. De este modo, cuando han sido secretadas las
hormonas peptídicas o aminas activas y han alcanzado a las células
diana, el AMPc transfiere información para que ellas procedan con
las reacciones enzimáticas, esto es, juega un papel de mensajero
secundario.
El AMPc es sintetizado a partir de ATP mediante
la adenilato ciclasa situada en las membranas en el cuerpo
viviente, y descompuesto por la fosfodiesterasa en
5'-AMP. El AMPc está presente generalmente en
bacterias o animales, pero la concentración de AMPc es
extremadamente baja (una concentración estacionaria es
0'1-1 nmol/g en peso húmedo). Como un ensayo de
AMPc, se emplea oportunamente un ensayo que utiliza proteína de
unión a AMPc o un radioinmunoensayo. El contenido de AMPc depende de
la eutrofia, la proliferación, la diferenciación, la adaptación de
las células y de los cambios en la sensibilidad.
La medición del AMPc en una amplia variedad de
tejido y fluidos mamíferos y no mamíferos proporciona una forma
útil para valorar la viabilidad celular, la función del eje
endocrino-hormonal, la actividad de adenilato
ciclasa y la actividad de fosfodiesterasa. Además, la medición del
AMPc puede ser utilizada para evaluar la actividad de algunas
proteínas de transducción de señales, incluyendo, pero no se limitan
a, la familia de proteínas G (proteína de unión al nucleótido
guanina) que juegan un papel principal en la transducción de
señales, la síntesis de proteínas ribosomales, la transposición de
proteínas nacientes y otras funciones celulares importantes. Bourne
y col., Nature, 348, 125 (1990).
Además, se puede utilizar la medición del AMPc
para evaluar otros compuestos endógenos y exógenos (por ejemplo,
óxido nitroso) que pueden alterar el nivel de nucleótidos cíclicos
en una célula, tejido, órgano o fluido corporal concretos.
Muchas hormonas utilizan el AMPc como segundo
mensajero, incluyendo, pero no se limitan a, epinefrina,
norepinefrina, adrenocorticotropina (ACTH), vasopresina, glucagón,
tiroxina, y hormonas estimulantes del tiroides y estimulantes de
los melanocitos, las cuales son algunas de las principales
hormonas/proteínas reguladoras en el organismo viviente. La
actividad de todas estas hormonas y reguladores puede ser medida en
los tejidos, suero, fluidos corporales, y en todos los cultivos
celulares (células y medio), utilizando el método para AMPc de la
presente invención. La medición de estas hormonas se lleva a cabo
en una amplia variedad de estados de enfermedad donde el
desequilibrio hormonal puede conducir a una patología
específica.
Una vez que una hormona o proteína reguladora
interactúa con un receptor específico, el segundo mensajero, en
este caso el AMPc, es producido mediante una cascada de sucesos
bioquímicos. La producción de AMPc puede ser también inhibida
específicamente, en algunos casos, mediante hormonas que utilizan
una disminución de AMPc como parte de la ruta de transducción de
señales hormonales específicas. El resultado de esta interacción
proteína reguladora u hormona y receptor puede ser, pero no se
limita a, (1) una alteración en la permeabilidad celular secundaria
a, por ejemplo, cambios en los canales iónicos, (2) una alteración
en la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas,
sensibles a la concentración de AMPc, y (3) una alteración en la
velocidad de la síntesis de proteínas, incluyendo la síntesis y
degradación de otras enzimas. Se puede utilizar el contenido de
AMPc para controlar directa e indirectamente las consecuencias
después de interactuar una hormona o proteína reguladora con un
receptor.
Específicamente, se puede medir el AMPc en la
orina o sangre para su uso como marcador para niveles de fármacos,
como la aminofilina o la teofilina que estimulan el sistema nervioso
adrenérgico evitando la descomposición del AMPc endógeno. La
medición del AMPc en cultivos celulares puede ser utilizada para
valorar hormonas, proteínas reguladoras y fármacos específicos
donde el AMPc represente una conexión vital en el proceso de
transducción de señales.
El AMPc también se puede utilizar para valorar
la viabilidad y estabilidad celular, estudiando las células en
ausencia o presencia de una hormona o proteína reguladora
específica. Por ejemplo, la medición del AMPc en células del hígado
(hepatocitos) mediante glucagón puede ser utilizada para valorar la
viabilidad de los hepatocitos. Esto puede ser útil, por ejemplo, en
el trasplante de órganos y/o células, por ejemplo, el trasplante de
corazón, hígado, pulmón, riñón, páncreas, piel y células
cerebrales.
La medición de la reactividad de células de
muestras de biopsia, después de la activación mediante una amplia
diversidad de hormonas, proteínas reguladoras y fármacos que
aumenten o disminuyan los niveles celulares de AMPc, puede ser
utilizada como una manera de valorar específicamente la función
celular.
Un ejemplo clínico específico es el uso de la
medición de AMPc en biopsias cardiacas para valorar la reactividad
del miocardio. Las células cardiacas cardiomiopáticas no responden
con la misma subida en el contenido de AMPc, después de la
estimulación \beta-adrenérgica, como las células
cardiacas normales. El diagnóstico de la gravedad de la enfermedad
cardiaca y la eficacia de algunos fármacos, tales como los
bloqueantes \beta-adrenérgicos y los inhibidores
enzimáticos transformadores de la angiotensina, pueden ser hecho
comparando la reactividad de las muestras de biopsia de corazones
normales con la de corazones cardiomiopáticos. La medición de los
niveles basales y/o estimulados de actividad de adenilato ciclasa o
AMPc en células sanguíneas puede ser utilizada para guiar la
terapia en tales pacientes. Además, la liberación de AMPc
intracelularmente o dentro de la circulación arterial o venosa se
puede utilizar como un indicador de la respuesta de un órgano y/o
tejido a diversas tensiones fisiológicas y no fisiológicas tales
como la isquemia, la hipoxia, o la estimulación por fármacos u
hormonal. Con este enfoque, en un fluido celular o corporal, casi
siempre mamífero, que incluya células sanguíneas y plaquetas, se
pueden medir los niveles de AMPc. En algunos tejidos, los niveles de
AMPc pueden ser medidos como respuesta hacia estimuladores
específicos, como un índice de oncogenicidad y/o invasividad, en el
caso de muestras de células potencialmente tumorales. En otros
casos, se puede utilizar la medición de AMPc para determinar la
eficacia de terapias específicas que puedan alterar la síntesis o
degradación de AMPc.
Como se describió antes, el AMPc juega un
importante papel como segundo mensajero en la transferencia de
información en células, además de diversas funciones fisiológicas.
Es importante en los campos de la medicina básica y clínica medir
el AMPc sintetizado a partir de ATP, mediante la acción catalítica
de la adenilato ciclasa, para determinar la actividad de adenilato
ciclasa o aclarar el comportamiento del AMPc.
La medición de la actividad de adenilato ciclasa
se lleva a cabo mediante la determinación cuantitativa del AMPc
producido a partir de ATP como sustrato. Los métodos para la
medición de AMPc están agrupados en dos métodos que utilizan como
sustrato (1) ATP marcado y (2) ATP no marcado.
En el método que utiliza ATP marcado como
sustrato (1), utilizando como sustrato ATP marcado mediante un
elemento radiactivo, por ejemplo [\alpha-^{32}P]
ATP, se separa y determina el AMPc ([^{32}P] AMPc) generado a
partir de ATP marcado radiactivamente. [Ver Y. Salomon y col.,
Anal. Biochem., 58, 541 (1974; R. A. Jonson y col., In
Method in Enzymology, 195, 3 (1991)]. El método emplea
cromatografía de afinidad secuencial con columnas de resina de
intercambio iónico y de óxido de aluminio para la separación de
[^{32}P] AMPc del [\alpha-^{32}P] ATP.
Aunque este método es sensible, cuenta con
compuestos marcados radiactivamente, peligrosos y caros.
Por otra parte, los métodos que utilizan ATP no
marcado están clasificados en (1) radioinmunoensayo, en donde el
AMPc marcado radiactivamente es sometido a una reacción
antígeno-anticuerpo competitivamente con antisuero
que incluye AMPc generado a partir de ATP no marcado, y después se
verifica la radiactividad del anticuerpo de unión para determinar
el contenido de AMPc; y (2) ensayo de unión de proteína, en donde se
mide la radiactividad del ^{3}H-AMPc unido con
proteína quinasa dependiente de AMPc, utilizando unión la específica
entre la proteína quinasa dependiente de AMPc y el AMPc. Ver A. G.
Gilman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 67, 305
(1970).
El método que utiliza el sustrato de ATP no
marcado no puede compensar la descomposición del AMPc por la
fosfodiesterasa nucleótido cíclica y, por lo tanto, el método no es
apropiado para muestras que incluyan fuerte actividad de
fosfodiesterasa.
Dadas las preocupaciones de seguridad y
ambientales, se debería evitar el uso de materiales radiactivos.
Existe la necesidad de un ensayo no radiactivo, muy sensible, para
medir la actividad de adenilato ciclasa y el AMPc como índice de la
actividad de adenilato ciclasa.
Sin embargo, es muy difícil determinar el AMPc
sin utilizar compuestos radiactivos debido a la concentración
extremadamente baja de AMPc en la mayoría de los tejidos mamíferos.
Además, puesto que los nucleótidos de adenina no cíclicos, tales
como el AMP, ADP y ATP, están presentes en una muestra biológica en
varios cientos o varios cientos de miles de veces la concentración
de AMPc, y también aquellas estructuras químicas son similares a la
del AMPc, actúan como sustancias interferentes en el ensayo de AMPc.
Concretamente, el ATP está presente en cien millones de veces la
concentración de AMPc y, por lo tanto, es sustancialmente imposible
determinar exactamente el AMPc sin la eliminación completa del ATP
endógeno.
Por otra parte, el AMPc se transforma en AMP por
la acción de la fosfodiesterasa. Se ha revelado un ensayo para AMP
sin compuestos radiactivos. Lowry y col. han desarrollado un ensayo
sensible basado en la fluorescencia del nucleótido de piridina
reducido. Ver O. H. Lowry y col., A Flexible System of Enzymatic
Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, Nueva York (1972); F. M.
Matschinsky y col., J. Histochem. Cytochem., 16, 29 (1968).
El ensayo depende de que la absorbencia de la nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato reducido (NADP) a 340 nm sea 0'617 por 0'1
mmol, y se calcula la concentración absoluta de NADP en la
absorbencia de la muestra.
Se revela un ensayo para AMP que depende de los
efectos estimulatorios del AMP en la glucógeno fosforilasa, la
enzima que transforma el glucógeno en
glucosa-1-fosfato, en presencia de
fosfato inorgánico (P_{i}). Ver E. Helmrich y col.,
Biochemistry, 52, 647 (1964); ibídem, 51, 131 (1964);
M. Trus y col., Diabetes, 29, 1 (1980). Conforme al método,
se determina la actividad de glucógeno fosforilasa mediante la
cantidad de glucosa-1-fosfato
generada a partir de glucógeno, y se puede ensayar el AMP utilizando
como índice la actividad de glucógeno fosforilasa. Lurie también ha
desarrollado un ensayo sensible para AMP. Ver K. Lurie y col.,
Am. J. Physiol., 253, H662 (1987).
Un método para aumentar la sensibilidad y
especificidad analítica para el AMPc o adenilato ciclasa ha empleado
la degradación enzimática de los nucleótidos de adenina no
cíclicos, o su eliminación mediante cromatografía. Ver N. D.
Goldberg y col., Anal. Biochem. 28, 523 (1969); B. Mcl.
Breckenridge, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 52, 1.580
(1964).
En el análisis convencional, puesto que el ADP o
ATP endógeno interferente pudiera no ser eliminado completamente,
se ha considerado que sería imposible la medición de AMPc. Por lo
tanto, no existe sustancialmente ningún método para la medición
sumamente sensible del contenido de AMPc y la actividad de adenilato
ciclasa basada en la cantidad de AMPc, sin utilizar sustancias
radiactivas.
A partir de un punto de vista completamente
diferente, el inventor y otros intentaron previamente desarrollar
ensayos para actividad de adenilato ciclasa y AMPc, y, como
consecuencia de un estudio intenso, descubrieron un método para la
medición sumamente sensible del contenido de AMPc y actividad de
adenilato ciclasa basada en la cantidad de AMPc, utilizando
únicamente reacciones enzimáticas y químicas, el cual comprende el
eliminar selectivamente las sustancias interferentes, los
nucleótidos de adenina no cíclicos endógenos tales como el ATP, el
ADP y otros, utilizando enzimas, transformar el AMP en ATP,
transformar el ATP en
glucosa-6-fosfato a través de
fructosa-6-fosfato, transformar el
NADPH, determinar la concentración de NADPH y correlacionarla con
la concentración de AMPc (WO94/17198).
Conforme al método, se puede medir estrictamente
el AMPc a nivel de pmol o fmol, en una cantidad del orden de \mug
en una muestra biológica. Ver A. Sugiyama y col., Anal.
Biochem., 218, 20 (1994); A. Sugiyama y col., J. Clin.
Lab., 8, 437 (1994); A. Sugiyama y col., Anal. Biochem.,
225, 368 (1995); A. Sugiyama y col., Yamanashi Med. J., 10,
11 (1995).
A continuación se describen los esquemas de
reacción del método convencional anterior.
Fase
1
(Eliminación de los nucleótidos no
cíclicos endógenos y la
glucosa-6-fosfato
endógena)
ATP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Apirasa}} \hskip0,3cm ADP + P_{i}
ADP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Apirasa}} \hskip0,3cm AMP + P_{i}
AMP + H_{2}O \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{5'-nucleotidasa}}
\hskip0,3cm Adenosina + P_{i}
Adenosina + H_{2}O
\hskip0,3cm\xrightarrow{\textstyle{Adenosina \ desaminasa}}
\hskip0,3cm Inosina + NH_{4}^{+}
Glucosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}}
\hskip0,3cm Glucosa +
P_{i}
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
2
(Transformación del AMPc en
AMP)
AMPc \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Fosfodiesterasa}} \hskip0,3cm AMP
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
3
(Transformación del AMP en
ATP)
AMP + (ATP (traza) \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Mioquinasa}} \hskip0,3cm 2ADP
ADP + fosfoenolpiruvato
\xrightarrow{\textstyle{Piruvato \ quinasa}} ATP + piruvato
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
4
(Se amplifica la sensibilidad del
ensayo 6.000-10.000
veces)
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
5
(Ensayo inmunofotométrico de
NADPH)
Fructosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfoglucosa \ isomerasa}}
\hskip0,3cm Glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato +
NADP^{+} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucosa-6-fosfato
\ deshidrogenasa}} \hskip0,3cm
6-Fosfogluconolactona + NADPH + H^{+}
El método explicado arriba era muy excelente
como método para el análisis cuantitativo en el principio de
metodología, y teóricamente correcto. Sin embargo, el método
necesita mucho tiempo para la reacción de limpieza, o la mezcla de
reacción se vuelve turbia cuando se ha desactivado una enzima
calentando después de una reacción del ciclo.
La presente invención ha sido realizada, a
consecuencia de un estudio intenso, para el desarrollo de un método
sencillo y rápido para determinar el AMPc y la adenilato ciclasa sin
sustancias radiactivas.
La presente invención ha perfeccionado los
métodos para determinar la actividad de adenilato ciclasa y el
análisis cuantitativo de AMPc, con reacciones enzimáticas e
intensidad de la fluorescencia que el inventor y otros
desarrollaron anteriormente (WO94/17198). Esto es, (1) en las
Reacciones de Limpieza, mediante la supresión de la
5'-nucleotidasa de las enzimas a utilizar, la hora
del periodo de reacción puede ser sumamente acortada hasta 5 a 10
minutos; (2) en las Reacciones de Ciclación, las enzimas utilizadas
son desactivadas eliminando el Mg^{2+} con un agente quelante tal
como EDTA, en lugar de calentar. La mezcla de reacción no se vuelve
turbia, y se mejora la exactitud de la Reacción de Detección en la
etapa siguiente; (3) la Reacción de Transformación es cambiada a la
reacción de una etapa desde las reacciones de transformación de 2
etapas convencionales. La operación puede ser más sencilla; y (4)
se revisaron las concentraciones de los agentes de reacción
utilizados en las Reacciones de Detección, para optimizar el método
presente. Mediante estas mejoras, se podría proporcionar un ensayo
fluorométrico enzimático o un ensayo espectrofotométrico en el que
se determinen, rápidamente y con alta sensibilidad, el AMPc y la
adenilato ciclasa correspondiente al AMPc.
Por cierto, como se describe a continuación, se
puede utilizar el presente método para la medición de las proteínas
reguladoras de guanina y la fosfodiesterasa específica de AMPc.
A continuación se muestran las reacciones
utilizadas en el presente método para determinar el AMPc.
Etapa
1
(Eliminación de los nucleótidos no
cíclicos endógenos y la
glucosa-6-fosfato
endógena)
ATP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Apirasa}} \hskip0,3cm ADP +
P_{i}
ADP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Apirasa}} \hskip0,3cm AMP +
P_{i}
AMP + H_{2}O \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}}
\hskip0,3cmAdenosina + P_{i}
Adenosina + H_{2}O \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Adenosina \ desaminasa}} \hskip0,3cm
Inosina + NH_{4}^{+}
Glucosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}}
\hskip0,3cm Glucosa + P_{i}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
(Eliminación de
fructosa-6-fosfato)
Fructosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}}
\hskip0,3cm Fructosa + P_{i}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
(Eliminación del glucógeno endógeno
en una muestra
fisiológica)
Glucógeno \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucógeno \ fosforilasa}} \hskip0,3cm
Glucosa-1-fosfato
Glucosa-1-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfoglucomutasa}}
\hskip0,3cm Glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}}
\hskip0,3cm Glucosa + P_{i}
Glucosa + H_{2}O + O_{2} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucosa \ oxidasa}} \hskip0,3cm
Glucono-1,4-lactona +
H_{2}O_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
(Transformación en
AMP)
AMPc \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Fosfodiesterasa}} \hskip0,3cm AMP
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
(Transformación en
ATP)
AMP + ATP (traza) \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Mioquinasa}} \hskip0,3cm 2ADP
ADP + fosfoenolpiruvato \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Piruvato \ quinasa}} \hskip0,3cm ATP +
piruvato
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
(Ensayo fluorofotométrico de
NADPH)
Glucógeno + P_{1} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucógeno \ fosforilasa \ (activada \ por \
AMP)}} \hskip0,3cm
Glucosa-1-fosfato
Glucosa-1-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfoglucomutasa}}
\hskip0,3cm Glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato +
NADP^{+} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucosa-6-fosfato
\ deshidrogenasa}} \hskip0,3cm
6-Fosfogluconolactona + NADPH + H^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
(Degradación de
6-fosfogluconolactona)
6-fosfogluconolactona + H_{2}O
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Calor}} \hskip0,3cm
6-fosfogluconato + H^{+}
6-fosfogluconato + NADP^{+}
\hskip0,05cm
\xrightarrow{\textstyle{6-fosfogluconato \
deshidrogenasa, Mg^{2+}}} \hskip0,05cm
ribulosa-5-fosfato + NADPH + H^{+}
+ CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\alpha-cetoglutarato+ NADPH +
NH_{4}^{+}\hskip0,3cm\xrightarrow{\textstyle{Glutamato \
deshidrogenasa}}\hskip0,3cm glutamato+NADP^{+}
Glucosa-6-fosfato +
NADP^{+} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucosa-6-fosfato
\ deshidrogenasa, Mg^{2+}}}
\xrightarrow{\hskip2,5cm}\hskip0,3cm
6-Fosfogluconolactona + NADPH + H^{+} +
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
6-fosfogluconolactona + H_{2}O
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Calor}} \hskip0,3cm
6-fosfogluconato + H^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
6-fosfogluconato + NADP^{+}
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{6-fosfogluconato
deshidrogenasa, Mg^{2+}}}
\xrightarrow{\hskip2,5cm}\hskip0,3cm
ribulosa-5-fosfato + NADPH + H^{+}
+ CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
(Ensayo fluorofotométrico de
NADPH)
ATP + Fructosa \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Hexoquinasa}} \hskip0,3cm
Fructosa-6-fosfato + ADP
Fructosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfoglucosa \ isomerasa}}
\hskip0,3cm Glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato +
NADP^{+} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Glucosa-6-\ fosfato \
deshidrogenasa}} \hskip0,3cm
6-Fosfogluconolactona + NADPH + H^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
(Amplificación por reacción de
ciclación
ATP-ADP)
(La sensibilidad del ensayo es
amplificada 6.000 - 10.000
veces)
Etapa
3
(Detección de ATP) (Reacción de la
luciferasa)
ATP+luciferina+O_{2} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Luciferasa, Mg^{2+}}} \hskip0,3cm
oxiluciferina + P_{i} + AMP + CO_{2} + luz
Las reacciones ilustradas en los esquemas
anteriores están demostradas a continuación.
Etapa
1
(Eliminación de nucleótidos de
adenina no cíclicos y
glucosa-6-fosfato)
El presente método para la medición comprende
etapas en las que los compuestos endógenos que tengan un grupo
adenina no cíclico, que no sea el AMPc (adenosina, ATP, ADP y AMP),
son eliminados enzimáticamente mediante una mezcla de apirasa,
adenosina desaminasa y fosfatasa alcalina, con exclusión de la
5'-nucleotidasa. Preferentemente, el presente
método consta de una etapa en la que la
glucosa-6-fosfato en una muestra es
enzimáticamente transformada en glucosa, utilizando fosfatasa
alcalina (Reacciones de Limpieza).
Las Reacciones de Limpieza de la presente
invención pueden eliminar todo el ATP, ADP y AMP endógenos que están
presentes en concentraciones mucho más grandes que el AMPc, y
aumentan sustancialmente la señal de fondo. Puesto que se genera
glucosa-6-fosfato durante las
Reacciones de Detección posteriores, es favorable previamente el
eliminar enzimáticamente la
glucosa-6-fosfato de una muestra,
para mejorar la precisión de la medición. Las Reacciones de
Limpieza son importantes para aumentar la sensibilidad.
También, el periodo de las Reacciones de
Limpieza fue sumamente acortado y simplificado al suprimir la
5'-nucleotidasa de las cuatro clases de enzimas,
esto es, apirasa, 5'-nucleotidasa, fosfatasa
alcalina y adenosina desaminasa, que han sido utilizadas en la
etapa de reacción de limpieza convencional. Esto es, se ha
descubierto que se puede acortar aproximadamente la hora del
periodo de reacción de limpieza convencional a únicamente 5 a 10
minutos.
Etapa
1
(Eliminación de la
fructosa-6-fosfato)
Es favorable eliminar previamente de una muestra
la fructosa-6-fosfato, la cual se
genera durante las Reacciones de Ciclación y Reacciones de
Detección, mediante hidrólisis con fosfatasa alcalina.
Etapa
1
(Eliminación del glucógeno endógeno
en una
muestra)
Es más favorable el eliminar de una muestra el
glucógeno endógeno, el cual es transformado en
glucosa-6-fosfato utilizando
glucosa oxidasa, glucógeno fosforilasa y fosfatasa alcalina
(Reacciones opcionales). Según estas Reacciones de Limpieza
Opcionales, se destruye el glucógeno endógeno, que es una sustancia
interferente en las Reacciones de Detección, en donde se añade una
cantidad conocida de glucógeno.
Etapa
2
(Transformación en
AMP)
Posteriormente, después de las Reacciones de
Limpieza, se combina fosfodiesterasa con la mezcla de reacción para
que el AMPc se transforme en AMP (Reacción de Transformación).
Etapa
3
(Ensayo fluorométrico de
NADPH)
Después de las Reacciones de Transformación, se
añaden glucógeno y ácido fosfórico inorgánico a la mezcla de
reacción, y se determina la cantidad de AMP correlacionando el nivel
de glucosa-6-fosfato que se genera
finalmente a partir del glucógeno con glucógeno fosforilasa activada
mediante AMP. La glucosa-1-fosfato
es transformada en glucosa-6-fosfato
con fosfoglucomutasa y, finalmente, la
glucosa-6-fosfato es enzimáticamente
transformada en 6-fosfogluconolactona, NAPDH y
H^{+}. Se mide la concentración de NADPH mediante ensayo
fluorométrico, por ejemplo, según el método de Trus y col. [M. Trus
y col., Diabetes, 29, 1 (1980)].
\newpage
Etapa
3
(Degradación de la
6-fosfogluconolactona)
Y también, la
6-fosfogluconolactona se puede transformar en
6-fosfogluconato por calentamiento en una solución
acuosa in vitro, y después el
6-fosfogluconato puede ser transformado en NADPH y
ribulosa-5-fosfato en presencia de
NADP^{+} in vitro. La concentración de NADPH puede ser
aumentada mediante la Reacción Opcional y medida mediante ensayo
fluorométrico, por ejemplo, según el método de Trus y col. descrito
antes [M. Trus y col., Diabetes, 29, 1 (1980)].
Cuando la actividad de adenilato ciclasa
estimulada fue medida en la misma preparación de corazón de conejo,
con el método por radiactividad Salomon modificado y el presente
método fluorométrico sin fosfatasa alcalina, los resultados fueron
similares. Weign y col., Anal. Biochem., 208, 217 (1993). Los
resultados con el ensayo radiactivo son comparables al método
fluorométrico presente. Aunque las actividades específicas absolutas
son diferentes cuando se comparan los resultados del ensayo
radiactivo y el ensayo fluorométrico, son similares las veces de
estimulación de adenilato ciclasa, como se determinó utilizando
cualquier método. Las diferencias en las actividades específicas
son muy verosímiles debido a los menores factores en las mezclas de
reacción de adenilato ciclasa. Esto es, se utiliza AMPc sin marcar
en el ensayo radiactivo para evitar la degradación del
[^{32}P]AMPc por fosfodiesterasas endógenas, mientras que
en el ensayo fluorométrico se utiliza teofilina para inhibir la
degradación por fosfodiesterasas endógenas del AMPc recién
sintetizado.
Además, la medición de adenilato ciclasa
utilizando Reacciones de Ciclación ATP-ADP, como se
muestra en la Etapa 3 - Reacciones de Ciclación y Detección 2,
reveló que las actividades específicas absolutas eran las mismas
para ambos ensayos radiactivo y fluorométrico.
El método de la presente invención se lleva a
cabo convenientemente mediante un juego preparado previamente, y
tal juego consta de viales conteniendo enzimas, soluciones tampón y
otros, a utilizar en cada etapa de reacción.
Específicamente, un juego para realizar un
método para determinar rápidamente el contenido de AMPc o la
actividad de adenilato ciclasa de la presente invención está
ejemplificado por un juego que contiene (1) un vial para las
reacciones de limpieza, constando de cantidades eficaces de apirasa,
fosfatasa alcalina y adenosina desaminasa, con exclusión de la
5'-nucleotidasa, para eliminar los nucleótidos de
adenina no cíclicos endógenos, comprendiendo ATP, ADP y AMP, y la
glucosa-6-fosfato endógena en una
muestra biológica; (2) un vial para la reacción de transformación,
constando de una cantidad eficaz de fosfodiesterasa para transformar
enzimáticamente el AMPc en AMP en la muestra biológica; y (3) viales
para las reacciones de detección, constando de cantidades eficaces
de (a) glucógeno, ácido fosfórico inorgánico y glucógeno
fosforilasa, para transformar el glucógeno en
glucosa-1-fosfato, (b)
fosfoglucomutasa para transformar la
glucosa-1-fosfato en
glucosa-6-fosfato, y (c)
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
NADP^{+} (\beta-nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato) para transformar la
glucosa-6-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADPH.
También, otro juego para realizar un método para
determinar rápidamente el contenido de AMPc o la actividad de
adenilato ciclasa de la presente invención puede ser un juego que
consta de (1) un vial para las reacciones de limpieza, constando de
cantidades eficaces de apirasa, adenosina desaminasa y fosfatasa
alcalina, con exclusión de la 5'-nucleotidasa, para
eliminar enzimáticamente los nucleótidos de adenina no cíclicos
endógenos, comprendiendo ATP, ADP y AMP, y la
glucosa-6-fosfato endógena en una
muestra biológica; (2) un vial para la reacción de transformación,
constando de cantidades eficaces de fosfodiesterasa, ATP,
mioquinasa, fosfoenolpiruvato y piruvato quinasa para transformar
enzimáticamente el AMPc en AMP en una muestra biológica; y (3)
viales para las reacciones de detección, constando de cantidades
eficaces de (a) fructosa y hexoquinasa para transformar el ATP en
fructosa-6-fosfato y (b)
fosfoglucosa isomerasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
NADP^{+} para transformar la
fructosa-6-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADPH.
El método de la presente invención es bastante
sensible para medir el AMPc en muestras biológicas pequeñas que
pesen menos de 0'1 mg, y puede ser adaptado para medir 0'1 fmol de
AMPc/muestra. Conforme a la presente invención, a una muestra
biológica se añade una cantidad conocida de ATP, y después el ATP es
transformado en AMPc mediante la acción de la adenilato ciclasa en
la muestra. La actividad de adenilato ciclasa puede ser
proporcionada determinando el AMPc transformado después de eliminar
todos los nucleótidos de adenina, tal como el ATP endógeno, por las
Reacciones de Limpieza.
El ion amonio producido a partir de adenosina en
las Reacciones de Limpieza acciona la secuencia de reacciones de
limpieza, esencialmente hasta la terminación, evitando la
reformación de nucleótidos en la muestra. Estas etapas proporcionan
una mejora inesperada importante sobre los ensayos fluorométricos.
Weign y col., Anal. Biochem., 208, 217 (1993).
La Figura 1 es un gráfico de líneas que muestra
la fluorescencia frente a la concentración de ATP en diversos
periodos de incubación.
La Figura 2 es un trazado gráfico de la
absorbancia frente a la concentración de AMPc de muestras estándar,
como se determinó por una forma de realización de la invención.
La Figura 3 es un histograma que muestra las
cantidades de AMPc detectadas en células no tratadas y estimuladas,
como se determinó mediante el método fluorométrico actual
(continuo), el ensayo inmunocolorimétrico disponible comercialmente
(sombreado), y el ensayo radioinmunométrico (limpio).
La Figura 4 es un histograma que muestra la
actividad de adenilato ciclasa determinada por el método
fluorométrico actual (continuo), ensayo radioinmunométrico
(sombreado), y el método Salomon (limpio).
La materia fisiológica que se ensaya con el
presente método es obtenida, preferentemente, de una fuente
mamífera, que incluye tejido, células sanguíneas, hueso y fluidos
biológicos tales como orina, sangre, fluido espinal y otros, y puede
ser reciente o congelada. Lowry y col., A Flexible System of
Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, Nueva York
(1972).
Así, en una forma de realización preferida, la
presente invención comprende las etapas de:
Etapa
1
(Eliminación de los nucleótidos no
cíclicos endógenos y la
glucosa-6-fosfato)
Una muestra de materia fisiológica constando de
AMPc, glucosa-6-fosfato y, como
mínimo, un nucleótido de adenina no cíclico, esto es, seleccionado
del grupo que se compone de ATP, ADP, AMP y una mezcla de los
mismos, se combina con un tampón acuoso constando de una mezcla de
apirasa, adenosina desaminasa, y fosfatasa alcalina, con exclusión
de la 5'-nucleotidasa, a fin de que dichos
nucleótidos no cíclicos de adenosina (el ATP, ADP y/o AMP) sean
enzimáticamente transformados o eliminados.
El término "más rápidamente" significa que
el periodo de Reacción de Limpieza, que ha tardado convencionalmente
alrededor de 1 hora, es acortado a menos de unos 5 a 10 minutos,
esto es, de un duodécimo a un sexto, como mínimo un sexto del
periodo de reacción.
Etapa
1
Y opcionalmente, la mezcla de reacción se
combina con una mezcla de glucosa oxidasa, glucógeno fosforilasa y
fosfatasa alcalina a fin de que se destruya todo el glucógeno en la
muestra, mientras que el AMPc es retenido en la mezcla de reacción.
Estas etapas destruyen todo el glucógeno endógeno, el cual es una
sustancia interferente en la Etapa 3 - Reacción de Detección
(Fluorometría de NADPH) en la que se añade una cantidad conocida de
glucógeno.
Etapa
2
(Reacción de transformación en
AMP)
La mezcla de reacción se combina con
fosfodiesterasa, a fin de que dicho AMPc sea transformado en
AMP.
Etapa
3
(Ensayo fluorométrico de
NADPH)
Además, dicho AMP es puesto en contacto con
glucógeno fosforilasa, en presencia de glucógeno y fosfatasa
inorgánica, para que se produzca
glucosa-1-fosfato en la mezcla de
reacción. Después, la
glucosa-1-fosfato es transformada
enzimáticamente en 6-fosfogluconolactona, NADPH y
H^{+} en dicha mezcla de reacción, y se mide fluorométricamente
la concentración de NADPH. Se correlaciona la concentración de NADPH
con la concentración de actividad de adenilato ciclasa, el
contenido de AMPc o la concentración de AMP.
El método para determinar el AMPc se basa en el
principio de que el AMP producido por escisión del enlace
3',5'-fosfodiéster del AMPc estimula la actividad de
glucógeno fosforilasa. Esto es, la cantidad de AMPc y la actividad
de adenilato ciclasa se corresponde con la absorbancia del NADPH
obtenido finalmente a partir de la actividad de glucógeno
fosforilasa, la cual es activada por el AMP producido a partir del
AMPc.
La correlación de la concentración final de
NADPH con la concentración de AMP puede ser obtenida, por ejemplo,
mediante una curva de calibración. Ver la Figura 2.
Preferentemente, a continuación de las
Reacciones de Limpieza, las enzimas utilizadas en la Reacción de
Limpieza pueden ser desactivadas por calentamiento.
Más preferentemente, después de la Etapa 1 -
Reacciones de Limpieza, a la mezcla de reacción se añade una
solución de fosfodiesterasa, glucógeno fosforilasa,
glucosa-1,6-difosfato, fosfato
inorgánico, glucógeno, NADP^{+},
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
fosfoglucomutasa y Mg^{2+}, y se realizan secuencialmente las
Etapas 2 de las Reacciones de Transformación y la Etapa 3 de las
Reacciones de Detección 1, in situ.
Etapa
3
(Degradación de la
fosfogluconolactona)
La concentración de NADPH, que es generada en la
Etapa 3, puede ser incrementada transformando secuencialmente la
6-fosfogluconolactona en
6-fosfogluconato, calentando la mezcla de reacción
de la Etapa 3 - Reacciones de Detección 1, y después haciendo
reaccionar el 6-fosfogluconato con NADP^{+} y
6-fosfogluconato deshidrogenasa añadidos, en
presencia de Mg^{2+}, para producir
ribulosa-5-fosfato, NADPH, H^{+},
y CO_{2}.
Etapa
3
La concentración efectiva de NADPH, que es
generada en la Etapa 3 - Reacciones de Detección 1, puede ser
aumentada por sus órdenes de magnitud empleándola en un sistema de
reacciones de ciclación. Uno de tales sistemas de reacción
transforma el NADPH añadido a \alpha-cetoglutarato
en NADP^{+} y glutamato. A su vez, el NADP^{+} transforma la
glucosa-6-fosfato añadida en
6-fosfogluconolactona y NADPH. Como se describió
antes, la 6-fosfogluconolactona puede ser
hidrolizada (H_{2}O, calor) y transformada en
ribulosa-5-fosfato y NADPH, en
presencia de 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Lowry
y col., A Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt
Brace Jovanovich, Nueva York (1972).
Etapa
2
(Reacción de transformación en
ATP)
Alternativamente, el AMP que se produce a partir
del AMPc en la Etapa 2 - Reacciones de Transformación puede ser
transformado en ADP combinándolo con una cantidad traza de ATP en
presencia de mioquinasa. El ADP que se produce es transformado
después en ATP y piruvato, combinando el ADP con
2-fosfo (enol) piruvato quinasa. En esta etapa, una
molécula de AMP produce una molécula de ATP (Reacción de
transformación en ATP).
La Etapa 2 - Reacciones de Transformación y la
Etapa 2 - Reacciones de Transformación 1, en las que el AMPc es
transformado en AMP, y el AMP es transformado en ATP a través de
ADP, pueden ser realizadas secuencialmente en una etapa.
Etapa
3
(Ensayo fluorométrico de
NADPH)
Además, el ATP es transformado en
fructosa-6-fosfato y ADP mediante
combinación con hexoquinasa en presencia de fructosa. La
fructosa-6-fosfato es transformada
en glucosa-6-fosfato en presencia de
fosfoglucoisomerasa, la cual es transformada enzimáticamente en
6-fosfogluconolactona, NADPH y H^{+}. La
concentración de NADPH se mide por el método de Trus y col., como se
describió antes. M. Trus y col., Diabetes, 29, 1 (1980).
Etapa
3
Alternativamente, como se describió
anteriormente, la 6-fosfogluconolactona puede ser
hidrolizada y transformada posteriormente en
6-fosfogluconato, el cual es transformado en NADPH,
H^{+}, CO_{2} y
ribulosa-5-fosfato.
\newpage
Etapa
3
(Amplificación de la reacción de
ciclación
ATP-ADP)
Además, el ATP es sometido a una reacción de
ciclación ATP-ADP. Esto es, el ATP es transformado
en fructosa-6-fosfato y ADP
combinándolo con hexoquinasa en presencia de fructosa. Después, el
ADP es transformado en ATP y piruvato combinando fosfoenolpiruvato
en presencia de piruvato quinasa. El ATP así producido es nuevamente
transformado en fructosa-6-fosfato
y ADP. Mediante la repetición de estas reacciones, se puede acumular
fructosa-6-fosfato finalmente.
Al final de las Reacciones de Ciclación se añade
un agente quelante para desactivar las enzimas. Los agentes
quelantes pueden ser ejemplificados por ácidos poliaminocarboxílicos
tales como el EDTA, ácidos oxicarboxílicos tales como el ácido
cítrico; preferentemente, el EDTA.
La
fructosa-6-fosfato resultante,
producida a partir del exceso de fructosa y
fosfo(enol)piruvato utilizados en las Reacciones de
Ciclación, es transformada en
glucosa-6-fosfato utilizando
fosfoglucosa isomerasa, y la
glucosa-6-fosfato es transformada en
6-fosfogluconolactona y NADPH exponiendo a la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
NADP^{+}. Después, la concentración de NADPH se puede determinar
mediante el método de Trus y col. M. Trus y col., Diabetes,
29, 1 (1980). Ver la Etapa 3 - Reacciones de Detección 2, como se
describió antes.
Etapa
3
Conforme a la presente invención, es posible
detectar absorciométricamente el ATP producido, como se muestra en
la Etapa 2 - Reacciones de Transformación Opcionales 1, con un
ensayo de quimioluminiscencia que utilice la reacción de la
luciferasa y luciferasa de luciérnaga. Wulff y col., Methods of
Enzymatic Analysis, Bergmeyer H. U. eds., VCH (1985). A partir
de la determinación de ATP, es posible calcular la concentración de
AMP y la concentración de AMPc y la actividad de adenilato ciclasa
que les corresponde.
Aunque la velocidad de esta reacción es muy
lenta, el rendimiento de la reacción (definido como la relación del
número de fotones emitidos y el número de moléculas de ATP
transformadas) en casi el 100%. La intensidad de la luz emitida es
directamente proporcional a la concentración de ATP, y se mide a 582
nm.
Si el principio de un sistema de reacción es
idéntico, el presente método de la invención actual puede ser
adaptado para la determinación de cualquier sustancia que no sea
AMP, por ejemplo, la actividad de guanilato ciclasa, guanosina
3',5'-monofosfato cíclico (GMPc), y guanosina
3',5'-monofosfato (GMP), aplicando una enzima
apropiada que corresponda al GMP. Abajo se muestran los esquemas de
reacción utilizados.
Etapa
(i)
GTP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}} \hskip0,3cm GMP +
2P_{i}
GMP + H_{2}O \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}} \hskip0,3cm
Guanosina + P_{i}
Guanosina + P_{i} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Nucleósido \ fosforilasa}} \hskip0,3cm
Guanina + Ribosa-1-fosfato
Guanina \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Guanasa}} \hskip0,3cm Xantina +
amoniaco
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(ii)
GMPc \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Fosfodiesterasa}} \hskip0,3cm GMP
GMP + ATP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Guanina \ monofosfato \ quinasa}}
\hskip0,3cm GDP + ADP
\newpage
Etapa
(iii)
Etapa
(iv)
Piruvato + NADH + H^{+} \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Lactato \ deshidrogenasa}} \hskip0,3cm
Lactato + NAD^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(i)
Como se describió antes, en las Reacciones de
Limpieza se utiliza una mezcla limpiadora de fosfatasa alcalina,
nucleósido fosforilasa y guanasa. La fosfatasa alcalina se puede
utilizar para desfosforilar compuestos, tales como
glucosa-6-fosfato y nucleótidos no
cíclicos, que puedan aumentar los valores en blanco durante la
medición de GMPc (Reacciones de Limpieza).
En las Reacciones de Limpieza, el GTP en la
muestra es transformado en GMP más 2P_{i}, seguido por la
transformación en guanosina y P_{i}. La guanosina es transformada
en guanina y ribosa-1-fosfato, y la
guanina es transformada en xantina y amoniaco. Asimismo, en la
Reacción de Limpieza para la determinación de AMPc, la formación de
amoniaco (o NH_{4}^{+}) en las Reacciones de Limpieza finales
acciona la serie de reacciones vinculadas, esencialmente hasta la
terminación, y asegura la eliminación de los nucleótidos
interferentes.
Preferentemente, las enzimas utilizadas en la
Reacción de Limpieza son desactivadas, por ejemplo, mediante
calentamiento, antes de la siguiente Etapa (ii) - Reacción de
Transformación.
Etapa
(ii)
El GMPc presente en la muestra es después
transformado en GMP con fosfodiesterasa. Se combina el GMP con ATP,
en presencia de guanina monofosfato quinasa, para producir
guanosina-5'-difosfato (GDP) y
ADP.
Etapa
(iii)
El GDP se emplea en presencia de exceso de PEP,
succinil-CoA y fosfato inorgánico (P_{i}), para
dar una cantidad de piruvato (Reacciones de Ciclación).
Etapa
(iv)
Este piruvato es cuantificado indirectamente
añadiendo una cantidad conocida de NADH, el cual, en presencia de
ácido, es transformado en lactato y NAD^{+}. De este modo, la
fluorescencia de las muestras de indicador disminuye en proporción
directa a la cantidad de piruvato generado en la muestra a ensayar
para GMPc, GMP o guanilato ciclasa. También, para aumentar la
sensibilidad del ensayo, después de la descomposición del exceso de
NADH con ácido, el NAD^{+} formado puede ser transformado con
álcali en aldehído 2-hidroxinicotínico, que tiene
una intensidad de fluorescencia superior. K. Scya y col., Anal.
Biochem., 272, 243 (1999).
Conforme a la presente invención, una ruta
alternativa para medir el GMP es medir la cantidad de ATP que es
descompuesta mediante guanina monofosfato quinasa en la Etapa (ii) -
Reacción de Transformación. La cantidad de ATP se puede determinar
mediante un método conocido, como se describió anteriormente.
Además de mejorar la sensibilidad del ensayo, la
medición de la actividad de adenilato ciclasa o la actividad de
guanilato ciclasa con los presentes ensayos enzimáticos es
significativamente menos costosa, exige menos tiempo, más segura
además para el operario y mejor para el medio ambiente debido a no
utilizar ninguna sustancia
radiactiva.
radiactiva.
Finalmente, el presente ensayo puede ser
fácilmente adaptado para determinar la cantidad de fosfodiesterasa
endógena o exógena en una muestra biológica. Esto es, se añade una
única cantidad preseleccionada de AMPc a una muestra conteniendo
una concentración desconocida de fosfodiesterasa. Si se necesitase,
se puede añadir cualquier inhibidor específico para las
fosfodiesterasas. Se genera una curva estándar añadiendo una única
cantidad en exceso preseleccionada de AMPc a cantidades conocidas,
preseleccionadas y diferentes de fosfodiesterasa. Después de un
tiempo finito de reacción (5-60 minutos), en el que
algo pero no todo el AMPc añadido se transforma en AMP mediante la
fosfodiesterasa, se para la reacción. Al mismo tiempo, se puede
aplicar una curva estándar de AMPc para verificar que todas las
reacciones están marchando adecuadamente. Se inicia una reacción de
limpieza para degradar todos los nucleótidos de adenina no
cíclicos. El AMPc que quede será inversamente proporcional al nativo
más la fosfodiesterasa añadida. Después, el AMPc es transformado en
AMP mediante un método convencional a
determinar.
determinar.
Específicamente, se disuelve una muestra de
tejido en un tampón SET (sacarosa 0'5M, Tris 0'03M, EDTA 2 mM) y, a
la mezcla resultante, se añade volúmenes dobles de mezcla PDE (Tris
50 mM, AMPc 50 \muM) e incuba a 37ºC durante 20 minutos. La
mezcla de reacción es calentada a 80ºC durante 30 minutos. Se añade
la Mezcla de Reacción de Limpieza, en un volumen cuatro veces más
que la muestra de tejido, a la mezcla de reacción y se incuba a
37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción es calentada a 80ºC
durante 30 minutos. La Mezcla de Reacción de Transformación, en un
volumen diez veces más que la muestra de tejido, es añadida a la
mezcla de reacción e incubada durante 1 hora a temperatura
ambiente. Utilizando las Reacciones de Detección, se mide la
intensidad de la fluorescencia del NADPH resultante.
La presente invención proporciona una
preparación que consta de enzimas o tampones a utilizar en forma de
juego. Las materias de reacción de cada etapa pueden ser
convenientemente preparadas en un juego tal como, por ejemplo, un
juego de Mezcla de Reacción de Limpieza, un juego de Mezcla de
Reacción de Transformación, un juego de Mezcla de Reacción de
Ciclación, o un juego de Mezcla de Reacción de Detección.
Las enzimas utilizadas en la presente invención
son suministradas en forma de, por ejemplo, soluciones acuosas,
formulaciones liofilizadas o sólidas en un recipiente tal como un
vial, una ampolla fabricada en vidrio o plástico apropiados.
Las enzimas pueden estar disueltas en tampones,
electrolitos, agua destilada, o pueden estar puestas
independientemente en recipientes diferentes, y se pueden mezclar
justo antes de su uso.
Se pueden añadir, convenientemente, aditivos
tales como conservantes, estabilizantes, colorantes, excipientes,
reguladores del pH y otros.
Además de la reacción de amplificación de la
presente invención, el ensayo descrito en la presente invención
puede emplear analizadores automáticos apropiados.
La presente invención proporciona un nuevo
ensayo fluorométrico enzimático, no radiactivo, para la actividad
de adenilato ciclasa y AMPc, además de la actividad fosfodiesterasa
específica de AMPc y la actividad biológica de las proteínas G
reguladoras. Y también se proporciona un ensayo fluorométrico
enzimático, no radiactivo, para la actividad de guanilato ciclasa y
GMPc.
El método de la presente invención ofrece varias
ventajas sobre los métodos disponibles actualmente, comparado con
los métodos convencionales para la medición de la actividad de
adenilato ciclasa y otras. A diferencia de los ensayos previamente
revelados por Y. Salomon y col. en Anal. Biochem., 58,
541 (1974), y Adv. Cycling Nucleotide Res., 10, 35
(1979), el presente ensayo no utiliza ninguna materia radiactiva.
Además, este ensayo es más sensible y más sencillo de realizar que
los ensayos previos.
Y también, conforme a la presente invención, el
periodo de reacción en el método puede ser sumamente acortado, y la
operación llega a ser más sencilla comparado a un método que se
desarrolló anteriormente por el inventor y otros. Ver A. Sugiyama y
col., Anal. Biochem., 218, 20 (1994); A. Sugiyama y col.,
J. Clin. Lab., 8, 437 (1994); A. Sugiyama y col., Anal.
Biochem., 225, 368 (1995); A. Sugiyama y col., Yamanashi Med.
J., 10, 11 (1995). Además, se resuelve el problema de turbidez
en la muestra, que no es evitable en los métodos convencionales,
utilizando un agente quelante tal como EDTA. Y el contenido de AMPc
en una muestra biológica, en el orden de \mug, puede ser
correctamente medido a un nivel de pmol o fmol.
La Reacción de Limpieza de la presente invención
puede eliminar todo el ATP, ADP y AMP endógenos que estén presentes
en una concentración mucho mayor que el AMPc, y que de otro modo
aumentaría sustancialmente el blanco. Adicionalmente, las
Reacciones de Limpieza pueden eliminar toda la
glucosa-6-fosfato y glucógeno
endógenos como sustancias interferentes en la muestra. Estas
Reacciones de Limpieza son importantes para mejorar la sensibilidad
del ensayo.
Se ha descubierto que el periodo de reacción de
1 hora por métodos convencionales podría ser significativamente
acortado a unos 5-10 minutos por supresión de la
5'-nucleotidasa de las cuatro enzimas, esto es,
apirasa, 5'-nucleotidasa, fosfatasa alcalina y
adenosina desaminasa, las cuales han sido utilizadas en las
reacciones de limpieza convencionales.
Después de las Reacciones de Ciclación, puesto
que el Mg^{2+} es atrapado por un agente quelante y el exceso de
enzimas es desactivado sin calentamiento, la muestra no se vuelve
turbia.
La sensibilidad de este ensayo también puede ser
incrementada reduciendo los volúmenes de reacción. También puede
ser aumentada, además, variando las concentraciones de glucógeno y
fosfato inorgánico en la mezcla de reacción, como se informó por
Meinrich y col. y E. Helmrich y col., Biochemistry, 52, 647
(1964). Conforme a la presente invención, es posible la medición de
la actividad de adenilato ciclasa en muestras de biopsia de tejido
mamífero comprendiendo tan poco como 10'0 \mug de proteína
membranal.
A diferencia de los métodos radiactivos, donde
la sensibilidad está limitada por la actividad específica de
[\alpha-^{32}P]AMPc y por el tamaño de
volumen para la separación cromatográfica y otros, no existen
barreras importantes para aumentar adicionalmente la sensibilidad
del método fluorométrico presente. Por ejemplo, se ha medido el
AMPc por encima del extenso intervalo de concentración de 1
fmol-1 mmol.
La invención será descrita además por referencia
a los siguientes ejemplos detallados, en donde las enzimas,
sustratos y cofactores utilizados fueron obtenidos de Boehringer
Mannheim Co., excepto la apirasa y la
5'-nucleotidasa que fueron de Sigma Co., St Louis,
MO. Los [\alpha-^{32}P]ATP,
^{3}H-AMPc, y el cóctel de centelleo fueron
comprados de New England Nuclear. La alúmina cromatográfica neutra
WN-3 fue obtenida de Bio-Rad.
Se añadió un volumen de 3 \mul de estándar de
ATP (0, 10, 100, 1.000 y 10.000 pmol/tubo) dentro de un tubo de
ensayo Pirex® de 10x57. A temperatura ambiente mientras, a cada tubo
de ensayo se añadió 25 \mul de Mezcla de Reacción de Limpieza
(100 mM de Tris-HCl, pH 8'0; 2 mM de Cl_{2}Mg; 2
U/ml de apirasa; 10 U/ml de adenosina desaminasa; 40 U/ml de
fosfatasa alcalina, con exclusión de la
5'-nucleotidasa). La mezcla fue incubada a 37ºC
durante 0, 5, 10, 15 y 20 minutos. Después se llevaron a cabo
secuencialmente la Etapa 2 - Reacciones de Transformación
(Conversión en AMP), las Reacciones de Transformación Opcionales
(Conversión en ATP), la Etapa 3 - Reacciones de Ciclación y
Detección 2, y se midió la intensidad de la fluorescencia a 340 nm
para determinar el periodo de incubación cuando el ATP haya
desaparecido completamente. En la Figura 1 se muestran los
resultados. A partir de los resultados, se encontró que una
sustancia interferente, esto es, el ATP, desaparecía
sustancialmente después de a lo sumo 10 minutos de incubación.
Ejemplo
comparativo
Se realizó este ensayo para comparar las
Reacciones de Limpieza de la presente invención con las de las
reacciones de limpieza conteniendo
5'-nucleotidasa.
Se mezclaron Tris-HCl (pH 8'0),
Cl_{2}Mg, 5'-nucleotidasa, apirasa, adenosina
desaminasa y fosfatasa alcalina, y a la mezcla se añadió agua hasta
25 \mul totales. La mezcla de reacción de limpieza fue preparada
teniendo las concentraciones finales mostradas en la Tabla 1.
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| Cl_{2}Mg | 2 mM |
| 5'-nucleotidasa | 2'5 U/ml |
| Apirasa | 2 U/ml |
| Adenosina desaminasa | 10 U/ml |
| Fosfatasa alcalina | 20 U/ml |
| Agua | hasta un volumen total de 25 \mul |
Las reacciones de limpieza se pueden mostrar en
los esquemas de reacción siguientes.
ATP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Apirasa}} \hskip0,3cm ADP + P_{i}
ADP \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Apirasa}} \hskip0,3cm AMP + P_{i}
AMP + H_{2}O \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{5'-nucleotidasa}}
\hskip0,3cm Adenosina + P_{i}
Adenosina + H_{2}O \hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Adenosina \ desaminasa}} \hskip0,3cm
Inosina + NH_{4}^{+}
Glucosa-6-fosfato
\hskip0,3cm \xrightarrow{\textstyle{Fosfatasa \ alcalina}}
\hskip0,3cm Glucosa + P_{i}
Se llevaron a cabo las reacciones de limpieza
utilizando la mezcla de reacción de limpieza preparada arriba, como
se describe en el Ejemplo 1.
Se añadió un volumen de 3 \mul de estándar de
ATP (0, 10, 100, 1.000 y 10.000 pmol/tubo) dentro de un tubo de
ensayo Pirex® de 10x57. A temperatura ambiente mientras, a cada tubo
de ensayo se añadió 25 \mul de la mezcla de reacción de limpieza
(100 mM de Tris-HCl, pH 8'0; 2 mM de Cl_{2}Mg; 2
U/ml de apirasa; 2'5 U/ml de 5'-nucleotidasa, 0'1
U/ml de adenosina desaminasa; 20 U/ml de fosfatasa alcalina). La
mezcla fue incubada a 37ºC. Después se llevaron a cabo la Etapa 2 -
Reacciones de Transformación, las Reacciones de Ciclación y las
Reacciones de Detección como se describe en el Ejemplo 2 abajo, y se
midió la absorbancia a 340 nm para determinar el periodo de
incubación cuando el ATP haya desaparecido completamente. Como
resultado, se encontró que el ATP había desaparecido completamente
después de aproximadamente una hora de incubación.
(Preparación de miocitos ventriculares)
Se obtuvieron miocitos ventriculares a partir de
corazones de ratas de 1 día de edad, y se cultivaron en cultivos
primarios. Había aproximadamente 5 millones de células miocárdicas
viables por corazón. Después de plaquear a una densidad de
aproximadamente 1 millón de células por 100 mm, las células de las
placas fueron cultivadas en medio esencial mínimo con solución
salina equilibrada de Hanks conteniendo 5% de suero bovino fetal.
Simpson y col., Cir. Res., 51, 787 (1982). En el día 4, se
cambió el medio. Los cultivos contenían >90% de células
miocárdicas, y los números de células fueron constantes con el
tiempo. Simpson y col., Cir. Res., 51, 787 (1982);
Rocha-Singh y col., J. Clin. Invest., 88, 204
(1991); y Rocha-Singh y col., J. Clin.
Invest., 88, 706 (1991).
Se seleccionaron al azar seis placas de miocitos
en dos grupos (n=3 placas/grupo). Se añadió inhibidor de
fosfodiesterasas,
3-isobutil-1-metilxantina
(IBMX), al medio de cada grupo para lograr una concentración final 2
\muM. Después de 5 minutos, se añadió isoproterenol al grupo
estimulado para conseguir una concentración final 1 \muM, mientras
que el grupo de control no recibió fármaco adicional. Después de 5
minutos, las células de las seis placas y las placas de medio de
cultivo sin células fueron elucionadas con un total de 5 ml de
etanol del 100%. Se extrajo un décimo del eluyente (0'5 ml) de cada
placa, y se secó al aire en un tubo de vidrio borosilicato de 12x75
mm y se almacenó a -80ºC. Los otros 4'5 ml fueron secados al aire de
manera similar, y almacenados. A la par del ensayo, el gránulo fue
descongelado y resuspendido en 100 \mul de ácido perclórico 0'5N.
Los extractos fueron agitados a 4ºC durante 2 minutos, y sonicados
durante 1 minuto utilizando un sonicador (Branson Clearing Equipment
Co.; A Smith-Kline Co., EEUU). El extracto fue
neutralizado con 25 \mul de KOH 2N, centrifugado a 2.000 g durante
30 minutos, y se extrajeron 80 \mul de sobrenadante para el
ensayo.
(Ver Etapa 1 - Reacciones de Limpieza)
Se mezclaron 400 \mul de
Tris-HCl (pH 8'0) 1M, 40 \mul de Cl_{2}Mg 0'2
mM, 32 \mul de apirasa de 500 U/ml, 100 \mul de adenosina
desaminasa de 400 U/ml, 4 \mul de fosfatasa alcalina de 4.000
U/ml, con exclusión de la 5'-nucleotidasa, y a la
mezcla se añadió agua hasta un volumen total de 4 ml para preparar
la Mezcla de Reacción de Limpieza (Tabla 2).
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| Cl_{2}Mg | 2 mM |
| Apirasa | 4 U/ml |
| Adenosina desaminasa | 10 U/ml |
| Fosfatasa alcalina | 40 U/ml |
| Agua | hasta un volumen total de 4 \mul |
Después de enfriar en hielo la preparación de
miocitos ventriculares de rata preparada en el Ejemplo 2 (1), a la
preparación se añadió 0'4 \mul de Mezcla de Reacción de la Etapa 1
- Reacción de Limpieza Opcional (Tris-HCl 100 mM, pH
8'0; Cl_{2}Mg 3 mM, 3 U/ml de apirasa, 150 \mug/ml de adenosina
desaminasa; 30 U/ml de fosfatasa alcalina, y 75 \mug/ml de
glucógeno fosforilasa-\alpha) para eliminar todos
los nucleótidos de adenina endógenos, el glucógeno y la
glucosa-6-fosfato. Después de
incubación a 37ºC durante 1 hora, se desactivaron las enzimas por
calentamiento a 80ºC durante 30 minutos.
(Ver Etapa 2 - Reacciones de Transformación y
Etapa 2 - Reacciones de Transformación Opcionales)
Se mezclaron 400 \mul de
Tris-HCl (pH 8'0) 1M, 40 \mul de Cl_{2}Mg 0'2
mM, 10 \mul de albúmina de suero bovino al 4%, 600 \mul de ClK
1M, 80 \mul de ditiotreitol 0'01M, 16 \mul de ATP 0'1 \muM, 24
\mul de fosfoenolpiruvato 0'5M, 24 \mul de fosfodiesterasa de 2
U/ml, 24 \mul de mioquinasa de 720 U/ml, y 160 \mul de piruvato
quinasa de 2.000 U/ml, y a la mezcla
se añadió agua hasta un volumen total de 4 ml para preparar la Mezcla de Reacción de Transformación (Tabla 3).
se añadió agua hasta un volumen total de 4 ml para preparar la Mezcla de Reacción de Transformación (Tabla 3).
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| Cl_{2}Mg | 2 mM |
| Albúmina de suero bovino | 0'01% |
| ClK | 150 mM |
| Ditiotreitol | 2 mM |
| ATP | 40 nM |
| Fosfoenolpiruvato | 3 mM |
| Fosfodiesterasa | 12 mU/ml |
| Mioquinasa | 4'5 U/ml |
| Piruvato quinasa | 80 U/ml |
| Agua | hasta un volumen total de 4 \mul |
(Ver Etapa 3 - Reacciones de Ciclación y
Detección 2)
Se mezclaron 400 \mul de
Tris-HCl (pH 8'0) 1M, 40 \mul de Cl_{2}Mg 0'2
mM, 10 \mul de albúmina de suero bovino al 4%, 30 \mul de
fructosa 0'1M, 160 \mul de hexoquinasa de 1.500 U/ml, y a la
mezcla se añadió agua hasta un volumen total de 4 ml para preparar
la Mezcla de Reacción de Ciclación (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| Cl_{2}Mg | 2 mM |
| Albúmina de suero bovino | 0'01% |
| Fructosa | 3 mM |
| Hexoquinasa | 60 mM |
| Agua | hasta un volumen total de 4 \mul |
(Ver Etapa 3 - Reacción de Detección 2)
Se mezclaron 2.000 \mul de
Tris-HCl (pH 8'0) 1M, 320 \mul de EDTA 0'2 mM, 120
\mul de NADP^{+} 0'1M, 6 \mul de fosfoglucosa isomerasa de
3.500 U/ml, 6 \mul de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de
1.750 U/ml, y a la mezcla se añadió agua hasta un volumen total de 4
ml para preparar la Mezcla de Reacción de Detección (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| EDTA | 3'2 mM |
| NADP^{+} | 0'01% |
| Fosfoglucosa isomerasa | 1 U/ml |
| Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa | 0'5 U/ml |
| Agua | hasta un volumen total de 4 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a un Ensayo Fluorométrico Enzimático
que comprende una serie de Reacciones de Limpieza, Reacciones de
Transformación, Reacciones de Ciclación y Reacciones de Detección,
se midió el AMPc en la preparación de miocitos ventriculares
preparada en (A) como muestra.
(Etapa 1 - Reacciones de Limpieza)
Se añadió un volumen de 3 \mul de extracto de
miocitos neutralizado (2'4% ó 0'24% de eluyente total de la placa
de 100 mm) o 3 \mul de estándar de ATP (0, 3'6, 7'2, 14'4, 21'6 y
28'8 pmol/20 \mul) dentro de un tubo de ensayo Pirex® de 10x57
(Iwaki Glass Co.) A temperatura ambiente mientras, a cada tubo de
ensayo se añadió 25 \mul de Mezcla de Reacción de Limpieza
preparada en (B) (100 mM de Tris-HCl, pH 8'0; 2 mM
de Cl_{2}Mg; 2 U/ml de apirasa; 10 U/ml de adenosina desaminasa;
40 U/ml de fosfatasa alcalina, con exclusión de la
5'-nucleotidasa). La mezcla fue incubada a 37ºC
durante 10 minutos. Las enzimas fueron después desactivadas mediante
calentamiento durante 30 minutos a 90ºC. De manera similar, se
preparó un control en blanco de tejido interno.
[Etapa 2 - Reacciones de Transformación
(conversión en AMP) y Reacciones de Transformación Opcionales
(conversión en ATP)]
A cada tubo de ensayo de las Reacciones de
Limpieza se añadió un volumen de 25 \mul de la Mezcla de Reacción
de Transformación preparada en (C) (100 mM de
Tris-HCl, pH 8'0; 2 mM de Cl_{2}Mg; 0'01% de
albúmina de suero bovino; 150 mM de ClK; 2 mM de ditiotreitol; 40 nM
de ATP; 3 mM de fosfoenolpiruvato; 12 U/ml de fosfodiesterasa; 4'5
U/ml de mioquinasa; y 80 U/ml de piruvato quinasa). La mezcla fue
incubada a temperatura ambiente durante la noche. Las reacciones
fueron terminadas calentando los tubos de ensayo a 90ºC durante 5
minutos.
(Etapa 3 - Reacciones de Ciclación y Detección
2)
A cada tubo de ensayo de las Reacciones de
Transformación se añadió un volumen de 25 \mul de la Mezcla de
Reacción de Ciclación preparada en (D) (100 mM de
Tris-HCl, pH 8'0; 2 mM de Cl_{2}Mg; 0'01% de
albúmina de suero bovino; 3 mM de fructosa; y 60 U/ml de
hexoquinasa). En vista de las altas concentraciones de enzimas por
reacción, fue importante poner estas reacciones a 0ºC para asegurar
el mismo momento de inicio para todos los tubos de ensayo. La mezcla
fue incubada a 37ºC durante 2 horas (unos
4.000-10.000 ciclos).
(Etapa 3 -Reacciones de Detección 2)
A cada tubo de ensayo de las Reacciones de
Ciclación se añadió un volumen de 125 \mul de la Mezcla de
Reacción de Detección preparada en (E) (100 mM de
Tris-HCl, pH 8'0; 3'2 mM de EDTA, 0'6 mM de
NADP^{+}; 1 U/ml de fosfoglucosa isomerasa; 0'5 U/ml de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa).
Después de 20 minutos a temperatura ambiente, se midió la
concentración final de NADPH utilizando un fluorómetro (Optical
Technology Devices Inc. NY). Se ajustó el fluorómetro de manera que
una lectura de 10 unidades fluorométricas fuese equivalente a 1 nmol
de NADPH en 900 \mul de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH
8'0).
Se verificaron las etapas del ensayo por
separado, comprobando al mismo tiempo los controles internos
utilizando concentraciones conocidas del sustrato apropiado, por
ejemplo, se utilizó ATP adicional para comprobar las Reacciones de
Limpieza, y se utilizó una curva patrón de AMP para valorar las
Reacciones de Transformación, y se utilizó una curva patrón de ATP
para valorar las Reacciones de Ciclación).
La medición de la absorbancia a partir de un
patrón de AMPc (0, 3'6, 7'2, 14'4, 21'6 y 28'8 pmol/20 \mul) a
340 nm, proporcionó la curva patrón de AMPc mostrada en la Figura
2.
Los valores de AMPc del grupo de control no
recibieron fármaco adicional, y se midieron las células de (1) (A)
estimuladas con isopropenol, para un décimo del eluyente de cada
placa de células, utilizando la curva patrón de AMPc (Figura 2) para
dar un valor real de 680 pmol de AMPc/placa de 100 mm.
En la Figura 3 se mostraron los resultados de la
medición del contenido de AMPc utilizando el ensayo fluorométrico
de la presente invención, el ensayo inmunocolorimétrico (Amersham
International Co.) y el radioinmunoensayo (Amersham International
Co.). Los datos generados de las mediciones de AMPc son
suficientemente coincidentes con los datos obtenidos a partir de un
ensayo radiactivo disponible comercialmente, con una variabilidad
generalmente menor del 5%.
Además, se midió la actividad de adenilato
ciclasa a partir de los resultados de la medición cuantitativa de
AMPc utilizando el ensayo de la presente invención, el
radioinmunoensayo y el método Salomon. En la Figura 4 se mostraron
los datos de estos tres métodos. Los valores de actividad de
adenilato ciclasa se calculan por las cantidades de AMPc (pmol) por
minuto generadas a partir de 1 mg de proteína.
Se mezcló cada cantidad apropiada de
Tris-HCl 1M, pH 8'0, Cl_{2}Mg 0'2 mM,
PO_{4}HK_{2} 1M, AMP 0'1 mM, 4.000 U/ml de fosfatasa alcalina,
y 10 mg/ml de glucógeno fosforilasa, y se añade agua a la mezcla
para preparar la Mezcla de Reacción de Limpieza, en las
concentraciones finales mostradas a continuación.
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| Cl_{2}Mg | 2 mM |
| PO_{4}HK_{2} | 5 mM |
| AMP | 0'1 mM |
| Fosfatasa alcalina | 20 U/ml |
| Glucógeno fosforilasa | 10 \mug/ml |
| Agua | - |
Se mezcló cada cantidad apropiada de
Tris-HCl 1M, pH 8'0, Cl_{2}Mg 0'1 mM,
PO_{4}HK_{2} 1M, AMP 0'1 mM, ditiotreitol 0'1M,
glucosa-1,6-difosfato 1 mM, 4% de
albúmina de suero bovino, NADP 0'1 mM, 10 mg/ml de glucógeno
fosforilasa, 10 mg/ml de fosfoglucomutasa, y 5 mg/ml de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y
se añade agua a la mezcla para preparar la Mezcla de Reacción de
Transformación, en las concentraciones finales mostradas a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | Concentración de Reacción final |
| Tris-HCl pH 8'0 | 100 mM |
| Cl_{2}Mg | 2 mM |
| PO_{4}HK_{2} | 5 mM |
| AMP | 0'1 mM |
| Ditiotreitol | 1 mM |
| Glucosa-1,6-difosfato | 4 \muM |
| Albúmina de suero bovino | 0'01% |
| NADP | 0'2 mM |
| Glucógeno fosforilasa | 20 \mug/ml |
| Fosfoglucomutasa | 4 \mug/ml |
| Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa | 2 \mug/ml |
| Agua | - |
(Etapa 1 - Reacciones de Limpieza Opcionales
2)
Se preparó una solución acuosa de glucógeno
constando de 206 \muM de glucógeno, y se distribuyó en 12 tubos de
ensayo Pirex® (Iwaki Glass Co.; 10x57 mm), cada tres tubos en una
cantidad de 0, 20, 40, y 80 \mul, y se añadió agua a cada tubo de
ensayo hasta un volumen total de 80 \mul. A temperatura ambiente,
a cada tubo de ensayo se añadió 500 \mul de Mezcla de Reacción de
Limpieza (Tris-HCl 100M, pH 8'0, Cl_{2}Mg 0'2 mM,
PO_{4}HK_{2} 5 mM, AMP 0'1 mM, 20 U/ml de fosfatasa alcalina, y
10 \mug/ml de glucógeno fosforilasa). La mezcla fue incubada a
37ºC durante 60 minutos.
(Etapa 3 - Reacciones de Detección 1)
A cada tubo de ensayo se añadió un volumen de
500 \mul de la Mezcla de Reacción de Transformación (100 mM de
Tris-HCl, pH 8'0, 2 mM de Cl_{2}Mg, 5 mM de
PO_{4}HK_{2}, 0'1 mM de AMP, 1 mM de ditiotreitol, 4 \muM de
glucosa-1,6-difosfato, 0'01% de
albúmina de suero bovino, 0'2 mM de NADP, 20 \mug/ml de glucógeno
fosforilasa, 4 \mug/ml de fosfoglucomutasa, y 2 \mug/ml de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa).
La mezcla fue incubada a 37ºC durante 30 minutos. La longitud de
onda de la fluorescencia de 460 nm para cada tubo de ensayo fue
medida a una longitud de onda de excitación de 340 nm. Finalmente,
los datos confirmaron que el glucógeno fue eliminado completamente
en la solución de glucógeno, mediante las Reacciones de
Limpieza.
A cada tubo de ensayo se añadió, después de las
Reacciones de Ciclación en el Ejemplo 2, un volumen de 125 \mul de
la Mezcla de Reacción de Detección sin EDTA (100 mM de
Tris-HCl, pH 8'0; 0'6 mM de NADP^{+}; 1 U/ml de
fosfoglucosa isomerasa; 0'5 U/ml de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa).
La mezcla fue incubada a 90ºC durante 30 minutos, y se desactivaron
las enzimas. Se inspección con la vista la turbidez en la solución
del ensayo. Como control se empleó la solución del Ejemplo 2, a la
se que se añadió Mezcla de Detección con EDTA. En el control se
desactivaron las enzimas mediante EDTA a temperatura ambiente.
Finalmente, mientras que el control era
transparente, la mezcla desactivada mediante calentamiento se volvió
turbia.
La presente invención proporciona un método para
determinar el contenido de AMPc o la actividad de adenilato ciclasa
en una muestra biológica, sin el empleo de agentes radiactivos.
Esto es, las reacciones de limpieza conforme a
la presente invención pueden eliminar selectiva y eficazmente los
nucleótidos de adenina no cíclicos endógenos, tales como ATP, ADP y
AMP, y la glucosa-6-fosfato, los
cuales actúan como sustancias interferentes en el ensayo de AMPc.
Después de la transformación en la muestra del AMPc en AMP, el AMP
es enzimáticamente transformado en ATP. Después, el ATP es
transformado, vía
fructosa-6-fosfato, en
glucosa-6-fosfato para obtener
NADPH, y la concentración de NADPH es finalmente determinada
mediante un método fluorométrico. Mediante la correlación con la
concentración final de NADPH, el contenido de AMPc o actividad de
adenilato ciclasa puede ser obtenido con seguridad, únicamente por
reacciones enzimáticas o químicas sin el empleo de agentes
radiactivos.
En concreto, según la presente invención, las
enzimas utilizadas en las reacciones de limpieza están limitadas a
apirasa, fosfatasa alcalina y adenosina fosfatasa, con exclusión de
la 5'-nucleotidasa. También, mediante la
modificación de sus concentraciones, la presente invención tiene
éxito al fabricar los procesos para la determinación, que llegan a
ser mucho más sencillos, y al hacer que sus periodos de reacción
sean sumamente reducidos a menos de unos 5 a 10 minutos, esto es,
desde un duodécimo a un sexto comparados con los métodos
convencionales.
Puesto que el contenido de AMPc depende la
eutrofia, la proliferación, la diferenciación, la adaptación de las
células y los cambios en sensibilidad, la medición del AMPc
proporciona una manera útil para valorar la viabilidad celular, la
función del eje endocrino-hormonal, la actividad de
adenilato ciclasa y la actividad fosfodiesterasa. Por lo tanto, el
valor del contenido de AMPc puede ser un índice excelente en los
campos de la medicina básica y clínica.
Según el método de la presente invención, el
contenido de AMPc y la actividad de adenilato ciclasa
correspondiente al AMPc pueden ser determinados con seguridad y con
alta sensibilidad.
Claims (20)
1. Un método para eliminar los
nucleótidos de adenina no cíclicos, componiéndose de ATP, ADP y AMP
endógenos, y la glucosa-6-fosfato
endógena en una muestra biológica, el cual comprende el tratar dicha
muestra con cantidades eficaces de apirasa, fosfatasa alcalina y
adenosina desaminasa, con exclusión de la
5'-nucleotidasa, para eliminar dichos nucleótidos
de adenina no cíclicos y la
glucosa-6-fosfato.
2. Un método para determinar el
contenido de AMPc o la actividad de adenilato ciclasa en una muestra
biológica, comprendiendo las etapas siguientes:
Reacción de Limpieza: combinar una muestra
biológica con cantidades eficaces de apirasa, fosfatasa alcalina y
adenosina desaminasa, con exclusión de la
5'-nucleotidasa, para eliminar los nucleótidos de
adenina no cíclicos, componiéndose de ATP, ADP y AMP endógenos, y
la glucosa-6-fosfato endógena;
Reacción de Transformación: transformar
enzimáticamente el AMPc en AMP en la muestra biológica; y
Reacción de Detección: determinar la cantidad de
AMP sin el empleo de agentes radiactivos.
3. El método según la Reivindicación 2
en donde además incluye, en dicha Reacción de Limpieza, el combinar
dicha muestra biológica con cantidades eficaces de glucosa oxidasa,
glucógeno fosforilasa y fosfatasa alcalina, a fin de eliminar
enzimáticamente el glucógeno endógeno de dicha muestra
biológica.
4. El método según la Reivindicación 2,
en donde dicha Reacción de Transformación se lleva a cabo
combinando dicha muestra biológica con una cantidad eficaz de
fosfodiesterasa.
5. El método según la Reivindicación 2 ó
4, en donde la enzima utilizada en dicha Reacción de Transformación
de AMPc en AMP es desactivada, mediante un agente quelante, después
de la transformación en AMP.
6. El método según la Reivindicación 5, en donde
dicho agente quelante es EDTA.
7. El método según la Reivindicación 2,
en donde dicha Reacción de Detección comprende la transformación
del glucógeno en glucosa-1-fosfato
al poner en contacto la glucógeno fosforilasa con el glucógeno, en
presencia de ácido fosfórico inorgánico añadido a dicha muestra, y
dicha transformación se activa in vitro por dicho AMP.
8. El método según la Reivindicación 2 ó
7, en donde dicha Reacción de Detección comprende además el combinar
dicha muestra con una cantidad eficaz de fosfoglucomutasa para
transformar la glucosa-1-fosfato en
glucosa-6-fosfato, y combinar
después dicha muestra con cantidades eficaces de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
para transformar la
glucosa-6-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADP^{+}, a fin de
transformar la glucosa-1-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADPH.
9. El método según la Reivindicación 2
en donde, en la Reacción de Transformación, el AMPc es transformado
enzimáticamente en ATP y, en la Reacción de Detección, el ATP es
transformado enzimáticamente en
fructosa-6-fosfato, el cual es
después transformado enzimáticamente en
6-fosfogluconolactona y NADPH, y se determina la
concentración de NADPH son el empleo de agentes radiactivos.
10. El método según la Reivindicación 9
comprendiendo además, en dicha Reacción de Limpieza, el combinar
dicha muestra biológica con cantidades eficaces de glucosas oxidasa,
glucógeno fosforilasa y fosfatasa alcalina, a fin de eliminar
enzimáticamente el glucógeno endógeno de dicha muestra
biológica.
11. El método según alguna de las
Reivindicaciones 9 y 10 en donde, en dicha Reacción de Limpieza, los
nucleótidos de adenina no cíclicos endógenos, que no sean AMPc, son
uno o más de ATP, ADP, AMP y mezcla de los mismos.
12. El método según la Reivindicación 9 en
donde, en dicha Reacción de Transformación, la transformación del
AMPc en ATP se lleva a cabo mediante una combinación de cantidades
efectivas de fosfodiesterasa, mioquinasa y piruvato quinasa.
13. El método según la Reivindicación 9 en
donde, en dicha Reacción de Detección, la transformación del ATP en
fructosa-6-fosfato se lleva a cabo
mediante una combinación de hexoquinasa y piruvato quinasa.
14. El método según la Reivindicación 9 en
donde, en dicha Reacción de Detección, la transformación de la
fructosa-6-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADPH se lleva a cabo
mediante la combinación de fosfoglucosa isomerasa y
glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.
15. El método según alguna de las
Reivindicaciones 9, 13 ó 14 en donde, en dicha Reacción de
Detección, la enzima para la transformación del ATP en
fructosa-6-fosfato es desactivada
mediante un agente quelante después de la transformación de los
nucleótidos de adenina no cíclicos.
16. El método según la Reivindicación 15,
en donde dicho agente quelante es EDTA.
17. El método según alguna de las
Reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha muestra biológica es un
tejido mamífero.
18. El método según alguna de las
Reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha muestra biológica es un
fluido biológico.
19. Un juego para determinar el contenido
de AMPc o la actividad de adenilato ciclasa en una muestra
biológica, el cual consta de:
(1) un vial para la Reacción de Limpieza,
comprendiendo cantidades eficaces de apirasa, fosfatasa alcalina y
adenosina desaminasa, con exclusión de la
5'-nucleotidasa, para eliminar los nucleótidos de
adenina no cíclicos, componiéndose de ATP, ADP y AMP endógenos, y
la glucosa-6-fosfato endógena en una
muestra biológica;
(2) un vial para la Reacción de
Transformación, comprendiendo una cantidad eficaz de fosfodiesterasa
para transformar enzimáticamente el AMPc en AMP en una muestra
biológica; y
(3) un vial para la Reacción de Detección,
comprendiendo glucógeno, fosfato inorgánico y glucógeno fosforilasa
para transformar el glucógeno en
glucosa-1-fosfato; fosfoglucomutasa
para transformar la
glucosa-1-fosfato en
glucosa-6-fosfato; y
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
NADP^{+} para transformar la
glucosa-6-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADPH.
20. Un juego para determinar el contenido
de AMPc o la actividad de adenilato ciclasa en una muestra
biológica, el cual consta de:
(1) un vial para la Reacción de Limpieza,
comprendiendo cantidades eficaces de apirasa, fosfatasa alcalina y
adenosina desaminasa, con exclusión de la
5'-nucleotidasa, para eliminar enzimáticamente los
nucleótidos de adenina no cíclicos endógenos, que no sean el AMPc,
y la glucosa-6-fosfato endógena en
una muestra biológica;
(2) un vial para la Reacción de
Transformación, comprendiendo cantidades eficaces de
fosfodiesterasa, ATP, mioquinasa, ácido fosfoenolpirúvico y
piruvato quinasa para transformar enzimáticamente el AMPc en ATP en
una muestra biológica; y
(3) un vial para la Reacción de Detección,
comprendiendo fructosa y hexoquinasa para transformar el ATP en
fructosa-6-fosfato; fosfoglucosa
isomerasa, glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa y NADP^{+} para transformar la
fructosa-6-fosfato en
6-fosfogluconolactona y NADPH.
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