WO2000055356A1 - Dosage fluorimetrique enzymatique de camp et de l'adenylate cyclase - Google Patents

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Atsushi Sugiyama
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to cAMP (cyclic adenosine 3,5′-monophosphate) produced from endogenous adipate by endogenous adenylate cyclase, ATP (adenosine triphosphate), AMP (adenosine triphosphate). Mono-phosphate)), ADP (adenosine mono-diphosphate) and mixtures thereof.
  • cAMP cyclic adenosine 3,5′-monophosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • AMP adenosine triphosphate
  • Mono-phosphate Mono-phosphate
  • ADP adenosine mono-diphosphate
  • the present invention provides a method for measuring diyl cyclase activity without using a radioactive reagent.
  • An effective amount of avirase, adenosine deaminase and an alkyrin phosphatase is mixed to enzymatically remove the acid, (2) enzymatic conversion of cAMP to AMP, and (3) radioactive material.
  • a without using It relates to a method characterized by measuring the amount of MP.
  • Adenylate cyclase (adenylyl cyclase, adenyl cyclase, EC 4.6.1.1) is used in the presence of Mg 2+ or Mn 2+
  • Adenylate cyclase is localized at the cell membrane and plays an important role as a signal transduction cascade of various basic hormones and neurotransmitters. For example, by measuring adenylate cyclase activity, it is possible to understand the physiological changes that occur during human heart transplantation and congestive heart disease [MRBristow et al., New Engl. J. Med. , 307, 205 (1982); KG Lurie et al.,
  • This adenylate cyclase activity is determined by the catalytic action of adenylate cyclase. It can be determined by measuring the change in the amount of cAMP synthesized from TP.
  • cAMP cyclic adenosine 3 ', 5, monophosphate
  • c AMP is synthesized from ATP in vivo by adeleate cyclase located in the membrane, and degraded to 5'-AMP by phosphodiesterase. It is widely present in bacteria and the animal kingdom, but in very small amounts (constant concentration 0.1-1 nM morno wet weight).
  • a method for quantifying cAMP a method using a cAMP binding protein or a radioimmunoassay is convenient.
  • cAMP content is sensitive to cell nutrition, growth, differentiation and adaptation.
  • Measuring cAMP in tissues and body fluids of a wide variety of mammals and non-mammalian organisms measures cell viability, endocrine hormone function, adenylate cyclase activity, and phosphodiesterase activity Can be a useful way to Furthermore, C A
  • the G protein (guanine nucleotide binding protein) family, which plays important roles in signal transduction, ribosomal protein synthesis, nascent protein translocation, and other key cellular functions.
  • the activity of a number of signal transducing proteins can be evaluated [Bourne et al., Nature, 348, 125 (1990)].
  • measurement of cAMP may be based on other endogenous and exogenous compounds that may alter the levels of cyclic nucleotides in particular cells, tissues, organs or body fluids (eg, It can be used for evaluation of nitrous oxide).
  • hormones including epinephrine, norepinephrine, adrenoco / reticotropin (ACTH), vasopressin, gnore gon, thyroxine, and thyroid and melanocyte stimulating hormones, the major regulatory hormone noproteins in organisms, Use cAMP as the second messenger.
  • the activity of all these hormones and modulators can be measured in tissues, serum, body fluids and all cell cultures (cells and media) by applying the measuring method of the present invention. Measurements of these hormones can be performed for a wide variety of disease states that can result in a particular condition from hormonal imbalance.
  • a hormone or regulatory protein When a hormone or regulatory protein interacts with a particular receptor, it is generated as a second messenger (cAMP) force cascade.
  • cAMP second messenger
  • the production of cAMP can optionally be specifically suppressed by hormones that use a decrease in cAMP as part of a particular hormonal signal transduction pathway.
  • the consequences of this regulatory protein or hormone-receptor interaction include (1) changes in cell permeability due to changes in ion channels, (2) changes in enzyme-catalyzed reaction rates sensitive to cAMP concentration, 3) Changes in the rate of protein synthesis, including the synthesis and degradation of other enzymes, are possible.
  • cAmp measurements can be used to measure these results directly and indirectly after the hormone or regulatory protein interacts with the receptor.
  • cAMP is used as a pharmaceutical level marker, such as aminophylline or theophylline, which stimulates the adrenergic nervous system by preventing the degradation of cAMP in the sample. can do.
  • Measurement of cAMP in cell culture can be used to evaluate specific hormones, regulatory proteins and pharmaceuticals, where cAMP is indicative of biobinding during signal transduction.
  • cAMP measurements can also be used to assess cell viability and stability by testing cells in the absence or presence of certain hormones or regulatory proteins. For example, the viability of hepatocytes can be evaluated by measuring cAMP in moon-dried cells (hepatocytes) with glucagon. This includes, for example, organ and / or cell transplantation, such as heart, liver, lung, kidney, Useful for organ transplantation, skin and brain cell transplantation.
  • Measuring cellular responsiveness from biopsy samples after activation with a variety of hormones, regulatory proteins, and drugs that increase or decrease intracellular cAMP levels provides a detailed assessment of cellular function Can be used as a method.
  • a special clinical case is measuring cAMP in cardiac biopsies to assess myocardial response.
  • Cardiomyocyte heart cells do not respond to increased cAMP content following ⁇ -adrenergic stimulation.
  • Diagnosis of the severity of heart disease and the efficacy of some drugs, such as] 3-adrenergic blockers and angiotensin converting enzyme inhibitors is based on the response of biopsy samples obtained from normal and cardiomyopathic hearts. This can be done by comparing genders.
  • Measurement of basal or stimulated adenylate cyclase activity or cAMP in circulating blood cells can be used to guide treatment of patients.
  • cAMP release into cells or into the arterial or venous circulation may affect organ and / or tissue response to a variety of different physiological and non-physiological stresses such as ischemia, hypoxia or pharmaceutical or hormonal stimulation. Can be used as a response indicator.
  • CAMP values in tissues or body fluids can be measured in almost any mammalian cell or body fluid, including blood cells and platelets, using this method.
  • cAMP values in response to specific stimulants can be measured as indicators for fl angiogenesis and Z or invasiveness.
  • measurement of cAMP can be used to determine the efficacy of specific therapies that may alter cAMP synthesis or degradation.
  • cAMP plays an important role in intracellular signal transduction as a second messenger, and at the same time, has various physiological functions. Measuring the amount of cAMP synthesized from ATP by catalysis, determining adenylate cyclase activity, and elucidating the behavior of cAMP is not only in basic medical research but also in clinical medicine. This can be said to be very significant.
  • the measurement of adenylate cyclase activity is performed by quantifying cAMP produced using ATP as a substrate.
  • c Quantification of AMP was performed by (1) using labeled ATP as a substrate. And (2) a method using unlabeled ATP as a substrate.
  • AT P e.g. [a- 32 P] ATP
  • a radioactive isotope e.g. [a- 32 P] ATP
  • AT P e.g. [a- 32 P] ATP
  • Radiolabeled cAMP [ 32 P] cAMP) is separated from ATP and its radioactivity is measured [Y. Salomon et al., Anal. Biochem., 58, 541
  • [a- 32 P] ATP and [ 32 P] c AMP are separated by continuous affinity chromatography using an ion exchange resin and an aluminum oxide column.
  • the method using (2) unlabeled ATP as a substrate is as follows: (1) cAMP produced from unlabeled ATP is compared with cAMP labeled with a radioactive substance to compete with antiserum. An antigen-antibody reaction is performed, and the radioactivity of the bound antibody is measured to determine cAMP. A so-called radioimmunoassay, and 2 cAMP-dependent protein kinase and cAM
  • the method (2) using an unlabeled ATP substrate cannot correct the degradation of cAMP by cyclic nucleotide phosphodiesterase, and thus is not suitable for a sample having strong phosphodiesterase activity.
  • cAMP concentration of cAMP in most mammalian tissues is so low that it is not easy to measure without radioactive materials.
  • acyclic adenine nucleotides in samples such as AMP, ADP, and ATP coexist at concentrations of hundreds to hundreds of thousands of times or more than cAMP, and have similar chemical structures. Therefore, it acts as an interfering substance, making quantification of cAMP more difficult.
  • ATP can be present at a concentration 100 million times higher than cAMP, and accurate measurement of cAMP is virtually impossible unless such endogenous ATP is completely removed.
  • c AMP is converted to AMP by the action of phosphodiesterase
  • glycogen phosphorylase an enzyme that converts glycogen to glucose-1-phosphate
  • AMP inorganic phosphate
  • daricogen phosphorylase activity is determined from the amount of glycogen converted to glucose-1-phosphate, and the AMP amount can be measured using this activity as an index.
  • Lurie et al. K. Lurie et al.
  • the present inventor has previously attempted to measure the activity of adenylate / leic acid cyclase and develop a method for quantifying the amount of cAMP from a completely new viewpoint.
  • cAMP in the sample is enzymatically converted to AMP.
  • AMP is further converted to ATP, and then converted to glucose-6-phosphate via fructose-6-phosphate, then converted to NADPH, and the NADPH concentration is measured by fluorometry.
  • the cAMP level and the corresponding adenylate cyclase activity were successfully measured without using harmful radioactive substances and using only the enzymatic reaction and chemical reaction (WO 94, 1 71 98).
  • Step 1 Kleeung reaction (removal of endogenous acyclic nucleotides and endogenous glucose-6-phosphate in the sample) Avirase
  • Step 3 Conversion reaction 2 (Conversion of AMP to ATP) Myokinase
  • the above-mentioned prior art method is a very excellent means of quantifying cAMP in principle and is also theoretically accurate, but the cleaning reaction takes a long time, and the enzyme by heating after the cycle reaction is used. There was room for improvement in that, for example, the reaction mixture became turbid when deactivated.
  • the present invention has been completed as a result of diligent research aimed at developing a simpler and faster means for measuring cAMP levels and adenylate cyclase activity, and also using no radioactive substance.
  • the present invention is an improvement of the method for measuring adenylate cyclase activity and the method for determining cAMP (WO 94 Z 171 98), which employ the enzyme reaction and the fluorometric method previously disclosed by the present inventors. is there.
  • (1) in the cleaning reaction the use of 5′-nucleotidase was discontinued, whereby the reaction time was dramatically reduced from 1 hour to 5 to 10 minutes
  • (2) in the cycle reaction The method of inactivating the enzyme after the reaction was replaced with heating, and Mg2 + in the sample was chelated and removed using a chelating agent such as EDTA, and the enzyme was inactivated to prevent clouding of the sample. .
  • (3) the conversion reaction which was conventionally two steps, is reduced to one step, so that simpler operations are possible.
  • the present invention relates to guanine regulatory protein and cAMP-specific. It can also be used to measure the activity of a specific phosphodiesterase. The reaction used for measuring cAMP of the present invention is described below.
  • Step 1 Cleaning reaction (removal of endogenous acyclic adenine nucleotides and glucose_6-phosphate in the sample)
  • Step 2 Conversion option reaction 1 (ATP conversion reaction)
  • 6-phosphodalconic acid dehydrogenase Mg s 6-phosphodalconic acid + NADP + ribulose-5-phosphate + NADPH + H ++ CO,
  • Step 3 Detection Reaction 3 (Detection of ATP) (Luciferase Reaction)
  • Step 1 One cleaning reaction (removal of endogenous acyclic adenine nucleotides and glucose-6-phosphate in the sample)
  • the present invention uses a mixture of avirase, adenosine deaminase and alkaline phosphatase to remove c
  • the method further comprises a step of enzymatically converting glucose-6-phosphate in the sample into glucose using alkaline phosphatase (cleaning reaction).
  • the cleaning reaction of the present invention removes endogenous ATP, ADP and AMP in any sample that is at a much higher concentration than cAMP and may otherwise substantially enhance the blank if not removed be able to. Since dalcos-6-phosphate is generated later in the detection reaction, it is preferable to enzymatically remove glucose-6-phosphate from the sample in advance, since this improves the accuracy of the measurement method. These cleaning reactions are important for improving detection sensitivity.
  • the reaction time was significantly shortened and simplified. That is, it was found that the reaction time, which required about 1 hour, could be remarkably reduced to only about 5 to 10 minutes.
  • fructose-6-phosphate produced by the cycle reaction and the detection reaction is preferably hydrolyzed with alkaline phosphatase and removed.
  • glucose oxidase, glycogen phosphorylase II and alkaline phosphatase are used to remove endogenous glycogen in the sample that is converted to glucose-6-phosphate (optional reaction). This eliminates endogenous glycogen, which is an interfering substance when adding a known amount of glycogen in step 3
  • One detection reaction 1 fluorescence measurement of NAD PH.
  • phosphodiesterase is allowed to act on the sample after the cleaning reaction to convert cAMP into AMP (conversion reaction).
  • Step 3 Detection reaction 1 (Fluorescence measurement of NAD PH)
  • glycogen and inorganic phosphate are added, and AMP is quantified using the degree to which AMP activates glycogen phosphorylase to generate glucose-1-phosphate from glycogen as an index. That is, glucose-1-phosphate is converted to glucose-6-phosphate by phosphoglucomutase, and glucose-6-phosphate is ultimately enzymatically converted to 6-phosphodalconolactone, NADPH and H +. Is converted. Finally, the NADPH concentration was determined, for example, by the method of Trus et al. [M. Trus et al.,
  • Step 3 Detection Option Reaction 1 (Degradation of 6-phosphodalconolactone) 6-phosphodalconolactone can also be converted to 6-phosphodalconic acid by heating in vitro in an aqueous solvent, 6-phosphodalconic acid It can be converted to NAD PH and ribulose-5-phosphate in vitro in the presence of P +. Thereby, the concentration of NADPH can be increased.
  • the NA DPH concentration is measured using a fluorimetric method in the same manner as described above, for example, according to the method of Trus et al. [M. Trus et al., Diabetes, Vol. 29, page 1, 1980].
  • ⁇ Stimulated adenylate cyclase activity in the same sample from the heron heart was measured by both the modified Salomon radioactivity method and the fluorometric method without the use of lyric phosphatase. [Weign et al., Anal. Biochem., 208, 217 (1993)]. Comparing the results obtained from the radioactivity assay and the fluorimetry, the absolute specific activities are different, but the stimulation factor for adenylate cyclase is similar. The difference in specific activity is probably due to a minor factor in the adenylate cyclase reaction mixture.
  • radioactivity measurement uses unlabeled cAMP to prevent degradation of [ 32 P] cAMP by phosphodiesterase in the sample, while fluorometry suppresses degradation of newly synthesized cAMP by phosphodiesterase in the sample.
  • Theophylline has been used to do this.
  • absolute specific activity is identical for both radioactivity and fluorimetry, as determined by measuring adenylate cyclase using the ATP-ADP cycle reaction described in Step 3—Detection cycle reaction 2. Became clear.
  • the method of the present invention can be more easily carried out by encapsulating enzymes and buffers used in each reaction step in a vial or the like and preparing a kit in advance.
  • an effective amount of acyclic adenine nucleotides consisting of endogenous ATP, ADP and AMP and endogenous glucose-6-phosphate in a biological sample is removed.
  • a vial kit for the clearing reaction containing avirase, allyl phosphatase and adenosine deaminase is removed.
  • an amount of cAMP in a biological sample effective to enzymatically convert it to AMP is effective to enzymatically convert it to AMP
  • Vial kit for conversion reaction containing phosphodiesterase and (3) (a) glycogen, inorganic phosphate and dalycogen phosphorylase for converting glycogen to glucose-1-phosphate, and (b) glucose-1-phosphate.
  • Phosphoglucomatase for converting glucose-6-phosphate to, and (c) glucose-6-phosphate to 6-phosphodalconolactone Kit for measuring the amount of cAMP in biological samples or adenylate cyclase activity, including vial kits for detection reactions containing glucose-6-phosphate dehydrogenase II and NAD P + for conversion to NADPH It is.
  • endogenous acyclic adenine nucleotides other than cAMP in a biological sample and an amount of arabinase effective for enzymatically removing endogenous glucose-6-phosphate
  • a vial kit for the Cleunging reaction containing adenosine deaminase and alkaline phosphatase (2) an effective amount of phosphodiesterase, ATP, myokinase, phospholipase for enzymatic conversion of ATP from cAMP in biological samples
  • a vial kit for the conversion reaction containing enolvirbic acid and pyruvate kinase and (3) (a) fructosin- and hexokinase for converting ATP to fructo-6-phosphate, and (b) fructokinase.
  • a kit for measuring the amount of cAMP or adenylate cyclase activity in a biological sample including a detection reaction vial kit containing DP + , may be mentioned.
  • the method of the present invention can measure the amount of cAMP in a trace amount of sample less than 0.1 mg, and can measure less than lfmol cAMP / sample.
  • a known amount of ATP is added to a biological sample, the ATP is converted to cAMP by the action of adenylate cyclase in the sample, and then a cleaning reaction is performed. After removing all adenine nucleotides such as endogenous ATP, the amount of cAMP converted can be determined to calculate the activity of adenylate / relate cyclase.
  • FIG. 1 is a graph showing the measured fluorescence intensity versus incubation time for an ATP standard sample.
  • FIG. 2 c is a graph showing the measured absorbance against the concentration of the AMP standard sample.
  • FIG. 3 is a bar graph showing the results of comparative measurement of cAMP values using the method of the present invention, immunocolorimetry and radioimmunoassay.
  • FIG. 4 is a bar graph showing the results of comparative measurement of adenylate cyclase activity using the method of the present invention, the radioimmunoassay method and the Salomon method.
  • the biological sample to be quantified according to the method of the present invention is preferably from a mammal, including tissues, blood cells, bones, and biological fluids such as urine, blood, cerebrospinal fluid, etc. Is included. These samples are either fresh or stored frozen (Lowry et al., Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, New York (1972)).
  • the present invention includes the following steps.
  • Step 1-Cleaning reaction endogenous acyclic nucleotides in the sample
  • glucose-6-phosphate c AMP, glucose-6-phosphate and at least one acyclic adenine nucleotide, ie those selected from the group consisting of ATP, ADP, AMP or mixtures thereof
  • the biological sample is mixed with an aqueous buffer containing a mixture of avirase, adenosine deaminase and lipolytic phosphatase to form acyclic adenine nucleotides (ATP, ADP and Z or AMP). And enzymatically convert and remove dalcose-6-phosphate.
  • faster means that the cleaning reaction, which has conventionally required about one hour, is reduced to about 12 to 1 minute, that is, 1 to 12 to at least 1Z6.
  • the above reaction mixture is mixed with glucose oxidase, glycogen phosphorylase and alkaline phosphatase to mix glycogenase in all samples. Disassembly and removal. At this time, cAMP is kept as it is in the reaction mixture. This eliminates endogenous glycogen, which is an interfering substance when adding a known amount of glycogen in step 3—Detection reaction 1 (fluorescence measurement of NAD PH).
  • the above reaction mixture is mixed with phosphodiesterase to convert cAMP in the sample into AMP.
  • Step 3 Detection reaction 1 (Fluorescence measurement of NAD PH)
  • AMP is contacted with dalycogen phosphorylase in the presence of glycogen and inorganic phosphate to form glucose-1-phosphate in the above reaction mixture, and reacted with phosphodalcomtase in the above reaction mixture. It produces glucose-6-phosphate. Then, it is enzymatically converted into 6-phosphodalconolactone, NADPH and H +, and the NADPH concentration in the reaction mixture is measured by fluorimetry. The NADPH concentration correlates with adenylate cyclase activity, cAMP amount, or AMP concentration in the sample.
  • This method of measuring cAMP is based on the principle that AMP generated by cleavage of the 3 ', 5'-phosphodiester bond of cAMP stimulates dalicogen phosphorylase activity. That is, the amounts of cAMP and adenylate cyclase activities correspond to the absorbance of NADPH finally obtained by AMP generated from cAMP activating glycogen phosphorylase.
  • the correlation between the final concentration of NAD PH and the AMP concentration can be determined by, for example, a calibration curve (see Fig. 2).
  • heating is used to inactivate the enzyme used in the cleaning reaction.
  • step 1_cleaning reaction phosphodiesterase, glycogen phosphorylase, glucose-1,6-diphosphate, inorganic phosphoric acid, glycogen, NADP + , glucose-6-phosphate dehydrogenase, A solution consisting of phosphoglucomutase and Mg 2 + is added to the reaction mixture, and the above-described conversion reaction and detection reaction steps are continuously performed in vitro.
  • Step 3 Detection Optional Reaction 1 (Decomposition of 6-phosphodalconolactone)
  • Step 3 Detection reaction 1 to sequentially convert 6-phosphodalconolactone to 6-phosphodalconic acid, in the presence of mg 2 + is reacted with NA DP + and 6-Hosuhodarukon dehydrogenase, into so that indicated above, ribulose - 5-phosphate, NADPH, H + and C_ ⁇ 2 as above step 3 detecting reactions
  • concentration of NAD PH produced can also be increased.
  • Step 3 The effective concentration of NADPH produced in detection reaction 1 can be increased by several orders of magnitude by using it in a cyclic reaction system. That is, NADPH is converted to NAD ⁇ ⁇ + and glutamic acid in the presence of ⁇ -ketoglutarate. NAD P + sequentially converts the added glucose-6-phosphate to 6-phosphodalconolactone and NADPH.
  • 6-Hosuhodarukono lactone is hydrolyzed (H 2 0, heated), 6 Hosuhodarukon acid dehydrogenase one peptidase and Mg 2 + ribulose in the presence of - 5 - converted into phosphoric acid and N NADPH child [Lowry et al., A Flexible System of Enzymatic Analysis,
  • AMP produced from cAMP can be converted to ADP by mixing with myokinase in the presence of traces of ATP.
  • the resulting ADP is then converted to ATP and pyruvate by treatment with 2-phosphenol pyruvate and pyruvate kinase.
  • 2-phosphenol pyruvate and pyruvate kinase By this reaction, one molecule of ATP is generated from one molecule of AMP (ATP conversion reaction).
  • Step 2 conversion reaction and Step 2—conversion option reaction 1 from cAMP to AMP via AMP and ADP can be performed in one step.
  • Step 3 Detection reaction 2 (Fluorescence measurement of NADPH)
  • ATP is first treated with hexokinase in the presence of fructose and converted to fructose-6-phosphate and ADP.
  • the formed fructose-6-phosphate is converted to glucose-6-phosphate by the action of phosphodarcoisomerase, and finally enzymatically converted to 6-phosphodalconolactone, NADPH and H +.
  • NADPH concentration was determined by the method of Trus et al. [M. us et al.,
  • 6-phosphodalconolactone is hydrolyzed to further convert it to 6-phosphogluconic acid, which is converted to NADP in the presence of NAD P +.
  • Step 3 Detection Cycle Reaction 2 (ATP—Amplification by ADP cycle reaction) And then ATP is subjected to ATP-ADP cycle reaction. That is, ATP is first treated with hexokinase in the presence of fructose and converted to fructose-6-phosphate and ADP. This ADP is then converted to ATP and pyruvate by the action of phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase. The ATP produced here is again converted to fructothose-6-phosphate and ADP. By repeating this reaction, fructose-6-phosphate is eventually accumulated. Add a chelating agent to inactivate the enzyme at the end of the cycle reaction. As a chelating agent, a polyaminocarboxylic acid such as EDTA, an oxycarboxylic acid such as citric acid, and the like are used. Preferably, it is EDTA.
  • a polyaminocarboxylic acid such as EDTA, an
  • fructose-6-phosphate obtained from excess fructose and phosphoenolpyruvate is converted to glucose-6-phosphate by phosphoglucose isomerase.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase and NADP + it is converted to 6_phosphogluconolatatone and NADPH.
  • the NADPH concentration is measured according to the method of Trus et al. [MTrus et al., Diabetes, Vol. 29, p. 1 (1980)].
  • the ATP generated in the ATP-forming reaction of the step 2_conversion option reaction 1 can be detected by absorbance measurement using a luciferase reaction, that is, a chemical fluorescence analysis method using firefly luciferin. Good [Wulff et al., Methods of Enzymatic Analysis, edited by HU Bergmeyer, VCH (1985)]. From the ATP measurements, the AMP and c AMP concentrations and the corresponding Lurate cyclase activity can be calculated.
  • reaction yield (defined as the ratio of the number of photons emitted to the number of converted ATP molecules) is almost 100%. Emission intensity is directly proportional to ATP concentration and is measured at 582 nm.
  • the measurement method of the present invention can be applied to substances other than AMP as long as the concept of the reaction system is the same.
  • substances other than AMP for example, by adapting an enzyme corresponding to GMP, guanylate cyclase activity, cyclic guanosine-3 ', 5'-phosphate (cGMP) and guanosine-3', 5'-phosphate (GMP) can also be used.
  • GMP guanylate cyclase activity
  • cGMP cyclic guanosine-3 ', 5'-phosphate
  • GMP guanosine-3', 5'-phosphate
  • the reaction formula used is shown below.
  • a cleaning mixture composed of alkaline phosphatase, nucleoside phosphorylase and guanase is used.
  • Allelic phosphatase can also be used to dephosphorylate compounds that may increase blank values during the measurement of cGMP, such as glucose-6-phosphate-acyclic nucleotides (cleaning reactions).
  • GTP in the sample is converted to GMP + 2 Pi and then to guanosine and Pi.
  • Guanosine is converted to guanine and ribose-1-phosphate, and guanine is converted to xanthine and ammonia.
  • the ammonia (or NH 4 +) in the final cleaning reaction essentially terminates the series of cleaning reactions, thereby ensuring that the interfering nucleotides are removed.
  • the enzyme used in the cleaning reaction is inactivated before the next step (ii) conversion reaction, for example by heating.
  • GMP guanosine-5'-diphosphate
  • GDP produces a certain amount of pyruvate in the presence of excess phosphoenolpyruvate, succinyl-CoA and inorganic phosphoric acid (P (cycle reaction).
  • This pyruvate is quantified indirectly by adding known amounts of NADH which are converted to lactic acid and NAD + in the presence of the acid.
  • the fluorescence of the indicator sample decreases in direct proportion to the amount of pyruvate produced in the sample being assayed for cGMP, GMP or guar cyclase.
  • measurement sensitivity can be improved by decomposing excess NADH with an acid and then converting the converted NAD + to 2-hydroxynicotinaldehyde with higher fluorescence intensity using an alkali. [K. Scya et al., Anal. Biochem., 272, 243 (1999)].
  • the amount of GMP can also be determined by measuring the amount of ATP degraded by guanine monophosphate kinase in step (ii) one conversion reaction. ATP can be measured by a known method as described above.
  • the measurement of adenylate cyclase activity or guanylate cyclase activity using the enzymatic method of the present invention is highly sensitive, is remarkably inexpensive, and results can be obtained in a short time. it can. In addition, it does not use radioactive materials, so it is safe for operators and good for the environment.
  • the measurement method of the present invention is easily adapted to measure the amount of endogenous or exogenous phosphodiesterase in a biological sample. That is, a preselected single amount of cAMP is added to a sample containing an unknown concentration of phosphodiesterase. At this time, a specific inhibitor for phosphodiesterase may be added as necessary. A standard curve is obtained by adding a single preselected excess of cAMP to various preselected known amounts of phosphodiesterase. The reaction is stopped after a reaction time (5-60 minutes) in which some of the added cAMP is converted to AMP by phosphodiesterase. c AMP standard curves can be run at the same time to prove that the reaction is proceeding properly.
  • Chestnut A non-cyclic adeyun nucleotide is decomposed by initiating the aging reaction. Residual cAMP is inversely proportional to native + added phosphodiesterase. Next, cAMP is converted to AMP in the usual way and measured.
  • the sample tissue was dissolved in SET buffer (0.5 M sucrose, 0.03 M Tris, 2 mM EDTA), and 2 volumes of PDE mixture (50 mM Tris, 50 / M cAMP) Incubate at 37 ° C for 20 minutes. The reaction mixture is heated at 80 ° C for 30 minutes. Add 4 volumes of the cleaning reaction mixture to the tissue and incubate at 37 ° C for 1 hour. The reaction mixture is heated at 80 ° C for 30 minutes. Next, a 10-fold amount of the conversion reaction mixture is added to the tissue, and incubated at room temperature for 1 hour. Then, the fluorescence intensity of NADPH is measured by a detection reaction.
  • SET buffer 0.5 M sucrose, 0.03 M Tris, 2 mM EDTA
  • PDE mixture 50 mM Tris, 50 / M cAMP
  • the enzymes, buffers, and the like to be used are provided as preparations prepared in a kit in advance.
  • vials for each reaction step such as a cleaning reaction mixture vial, a conversion reaction mixture vial, a cycle reaction mixture vial, and a detection reaction mixture vial, to make a kit.
  • the enzyme or the like used in the present invention is provided by being filled in a vial or ampoule of a suitable glass or plastic container, for example, in the form of a liquid agent, a lyophilized agent or a solid agent.
  • the enzymes may be previously dissolved in a buffer solution, electrolyte solution, distilled water, or the like. Alternatively, the enzyme and the lysate may be stored separately in a multi-chamber container and mixed immediately before use. In addition, additives such as a preservative, a stabilizer, a coloring agent, an excipient, and a pH adjuster can be appropriately added.
  • the measurement method of the present invention may be performed using a suitable automatic analyzer in addition to using the amplification reaction described in the present specification.
  • the present invention provides a non-radioactive enzymatic fluorimetric method for adenylate cyclase activity and cAMP and cAMP-specific phosphodiesterase activity and the biological activity of G regulatory proteins.
  • the present invention also provides non-radiometric measurements of guanylate cyclase activity and cGMP.
  • the method of the present invention is a method of measuring adenylate cyclase activity and the like which are currently used.
  • the present invention relates to a conventional method disclosed by Y. Salomon et al. [Anal. Biochem., Vol. 58, p. 541 (1974); Adv. Cyclic Nucleotide Res., Vol. )] Unlike radioactive materials.
  • the measurement method of the present invention has higher sensitivity and is easier to operate than the conventional method.
  • the cleaning reactions of the present invention have much higher concentrations than cAMP and endogenous ATP, AD in all samples that could otherwise substantially enhance the blank if not removed.
  • glucose-6-phosphate and glycogen in the sample which also act as interfering substances, can be removed. These cleaning reactions are important for improving detection sensitivity.
  • Mg 2 + is trapped by a chelating agent, so that excess enzyme can be inactivated without heating, and the sample does not become cloudy.
  • the sensitivity of the measurement method of the present invention can also be increased by reducing the reaction volume.
  • This sensitivity can be determined by the method of Meinrich et al. Or E. Helmrich et al. [E. Helrarich et al., Biochemistry, Vol. 52, p. 647 (1964)] to determine the amount of glycogen and inorganic phosphate in the reaction mixture. Can be further enhanced by changing the concentration Can also be.
  • cAMP can be measured in a wide concentration range (1 fmol to 1 mmol).
  • the present invention is further described by the following examples.
  • the enzymes, substrates and cofactors used in these examples were obtained from Boehringer Mannheim. However, Avila and 5'-nucleotidase were obtained from Sigma. [a- 32 P] ATP, 3 Hc AMP, and aquasol scintillation kak tenore New England Nuclearf soil power were purchased. Neutral Chromatographic Alumina WN-3 was manufactured by Bio-Rad.
  • 3 ⁇ L of ATP standard (0, 10, 100, 1000 and 10000 pmol / tube) was added to a 10 ⁇ 57 Pyrex (trade name) analytical tube.
  • 25 ⁇ L of the cleaning reaction mixture (100 mM Tris-HCl, H8.0; 2 mM MgCl 2 ; 2 U / mL apyrase; 10 U / mL adenosine deaminase; 40 U / mL alkaline phosphatase) was added to each analysis tube. This mixture was incubated at 37 ° C (0, 5, 10, 15, and 20 minutes).
  • Step 2 Conversion reaction (AMP conversion reaction) and Conversion option reaction (ATP conversion reaction)
  • Step 3 Detection cycle reaction 2
  • the results are shown in Figure 1. As a result, it was found that the interfering substance ATP almost disappeared by incubation for at most 10 minutes.
  • the purpose of the present invention was to compare the Kleeung reaction of the present invention with the Kleeung reaction using 5'-nucleotidase.
  • 3 ⁇ L ATP standard (0, 10, 100, 1000 and 10000 pmol / tube) was added to a 10 ⁇ 57 Pyrex analytical tube.
  • Ventricular myocytes were harvested from the hearts of 1-day-old rats grown in primary culture. About 5 million cardiomyocytes survived per heart. After seeding at a density of about 1 million cells per 100 mm, dish cells were grown in minimal essential medium with Hanks' balanced salt solution containing 5% serum serum cells (Simpson et al., Cir. Res., Vol. 51, p. 787 (1982)]. On day 4, the medium was changed. Cultures contained more than 90% cardiomyocytes and cell numbers remained constant over time [Simpson et al., Cir. Res., Vol. 51, p. 787 (1982); Rocha-Singh et al. al., J. Clin. Invest., Vol. 88, p. 204 (1991); Rocha-Singh et al., J. Clin. Invest., Vol. 88, p. 706 (1991)].
  • a total of 4 mL was prepared by adding water to 32 L of Avila L, 100 ⁇ L of 400 U / mL adenosine deaminase and 40 ⁇ L of 4000 U / mL alkaline phosphatase to make a total volume of 4 mL. 2).
  • the conversion reaction mixture was prepared by adding water to 24 ⁇ L / ml phosphodiesterase, 24 uL of myokinase at 720 U / mL and 160 / iL of pyruvate quinase at 2000 U / mL to make a total volume of 4 mL (Table 3).
  • cAMP was determined by a series of enzymatic fluorometric assays consisting of a cleaning reaction, a conversion reaction, a cycle reaction, and a detection reaction.
  • Step 2 Conversion reaction (AMP conversion reaction)
  • the detection reaction mixture prepared in E 100 mM Tris-HCl, ⁇ 80; 3.2 mM EDTA; 0.6 mM NADP +; lU / mL phosphoglucoisomerase fructose; 0.5 U / mL of gnorecose-6-phosphate dehydrogenase) 125 / ZL was added. After reacting for 20 minutes at room temperature, the final concentration of NADPH was measured using a fluorimeter (Optical Technology Devises, New York). The fluorometer was set so that a reading of 10 fluorescence units was equivalent to lnmol NADPH in 900 / L of buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0).
  • Each analysis step was confirmed by simultaneously analyzing an internal control using a known concentration of the appropriate substrate (e.g., using additional ATP to check the cleaning reaction and evaluating the conversion reaction).
  • the AMP standard line was used to perform the analysis, and the ATP standard line was used to evaluate the cycle response.
  • the standard c AMP linear line shown in FIG. 2 was obtained from the c AMP standard (0, 3.6, 7.2, 14.4, 21.6 and 28.8 pmol / 20 // L) by absorbance measurement at 340 nm.
  • the cAMP content in the control group and the isoproterenol-stimulated group to which no additional drug was added was determined from the plate of The eluent of 0 was measured using the obtained standard c AMP linear line (FIG. 2) to obtain the actual value of a cAMP 68 Opmol / 100RAM plate.
  • FIG. 3 shows the results of cAMP measurement using the method of the present invention, an immunocolorimetric kit (Amersham International) and a radioimmunoassay kit (Amersham International).
  • the measurement result of cAMP content was in good agreement with the result obtained by a radioactivity measurement method using a known method, and the difference was 5% or less of the usual value.
  • adenylate cyclase activity was determined from the results of quantification of cAMP by the method of the present invention, radioimmunoassay, and Salomon method.
  • Fig. 4 shows the results.
  • Adenylate cyclase activity was expressed as cAMP production (pmol) per mg of protein per minute.
  • Step 1 One cleaning option reaction 2
  • a glycogen solution containing 206 // M glycogen and dispense it into 12 Pyrex analysis tubes (Iwaki Glass: 10X57) (0, 20, 40 and 80 ⁇ L each of 3 tubes) and distilled water were added to make a total volume of 80 // L.
  • 500 // L Cleaning Reaction mixture (LOOmM Tris - HC 1 (p H8.0); 2mM of M g C 1 2; a 0. ImM AMP;; K 2 HP0 4 in 5 mM 20 U / mL of alkaline phosphatase; 10 / g / mL glycogen phosphorylase) was added to each tube. This mixture was incubated at 37 ° C for 60 minutes.
  • Each analyzer tube cleaning reaction converting the reaction mixture (LOOmM Tris _HC 1 (p H8.0); of 0. ImM AMP;; K 2 HP0 4 in 5 mM; 2 mM of Mg C 1 2 ImM of Dithiothreitol; 4 / M glucose-1, 6-diphosphate; 0.01% serum albumin; 0.2 mM NADP; 20 / g / mL glycogen phosphorylase; 4 g / mL phosphodal commutase; Then, 500 g / L of glucose / 6-phosphate dehydrogenase (zg / mL) was added. Incubated at 37 ° C for 30 minutes. The fluorescence wavelength of 460 nm at the excitation wavelength of 340 nm was measured for each analytical tube. As a result, it was confirmed that all of the dalycogen in the glycogen solution had disappeared by the cleaning reaction.
  • a tube containing EDTA a detection reaction mixture (Tris-HCl of ⁇ , ⁇ 80; 0.6 mM of NAD P +; 1 U / mL of Phosphodal coisomerase; 125 ⁇ L of 0.5 U / mL glucose-6-phosphate dehydrogenase) was added thereto, and the mixture was heated at 90 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme. The degree of cloudiness of the sample solution was visually observed.
  • the detection reaction mixture-added solution obtained in Example 2 (EDTA-inactivated enzyme at room temperature) was used as a control.
  • the present invention provides a method for measuring the amount of cAMP or adenylate cyclase activity in a biological sample without using a radioactive reagent.
  • endogenous acyclic adenine nucleotides such as ATP, ADP, and AMP, which are interfering substances, and glucose-16-phosphate can be selectively and efficiently removed by a Cleunging reaction using an enzyme.
  • cAMP in the sample is enzymatically converted into AMP, it is converted into ATP.
  • ATP acyclic adenine nucleotides
  • NADPH adenylate cyclase activity
  • the amount of cAMP and the corresponding adenylate cyclase activity can be safely measured only by enzymatic reaction and chemical reaction without using harmful radioactive substances.
  • the enzymes used in the cleaning reaction are By limiting the activity to lipophosphatase and adenosine deaminase, and further adjusting the concentration, the operation is simplified and the reaction time is dramatically reduced to 1Z6-1Z12. Succeeded.
  • the amount of cAMP is sensitive to the nutrition, growth, differentiation, and adaptation of the cell, and can fluctuate sensitively.By measuring the amount of cAMP, cell viability, endocrine hormone axis function, adenyl Acid cyclase activity and phosphodiesterase activity can be evaluated, and these evaluation values can be important indicators in basic medicine and clinical medicine.

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Description

明 細 書 c AMPおよびアデニル酸シクラーゼの酵素的蛍光定量ァッセィ
技術分野
本発明は、 AT Pから内因性アデ二ル酸シクラーゼによって生成される c AM P (サイクリックアデノシン 3，， 5'一一リン酸）と、 AT P (アデノシン一三リン 酸）、 AMP (アデノシン一一リン酸)）、 ADP (アデノシン一二リン酸）およびこ れらの混合物からなる群から選択される内因性の非環状アデユンヌクレオチド類 を含む生物学的試料中の c AMP量またはアデ二ル酸シクラーゼ活性を、 放射性 試薬を使用しないで測定する方法を提供するものであり、 要約すれば、 （ 1 )上記 試料中の c AMP以外の内因性非環状アデニンヌクレオチドおよびグルコース- 6-リン酸を酵素的に除去するためにアビラーゼ、 アデノシンデァミナ一ゼおよ びアル力リフォスファターゼの有効量を混合し、 （2) c AMPを AMPに酵素的 に変換し、 （3)放射性物質を用いることなく AMPの量を測定することを特徴と する方法に関する。
背景技術
アデ二ル酸シクラーゼ（アデ二リルシクラーゼ、 アデニルシクラーゼ、 EC 4.6.1.1)は、 Mg 2 +または Mn 2 +の存在下で
ATP → c AMP
を触媒する酵素である。
アデニル酸シクラ一ゼは細胞膜に局在しており、 種々の基本的なホルモンおよ び神経伝達物質のシグナル形質導入カスケ一ドとして重要な役割を果たしている。 例えば、 アデ二ル酸シクラ一ゼ活性を測定することにより、 ヒ トの心臓移植や 鬱血性心疾患時に現れる生理学的変化を理解することができる [M.R.Bristow et al. , New Engl. J. Med. , 第 307巻， 205頁（1982年) ； K. G. Lurie et al. ,
J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , 第 86巻， 195頁（1983年）] 。
このアデニル酸シクラ一ゼ活性は、 アデニル酸シクラーゼの触媒作用により A T Pから合成される c AM P量の変化を測定することによって求めることができ る。
しカゝし、 アデ-ル酸シクラーゼの生物学的役割のより明確な角 月は c AM Pの組 織レベルでの変化をモニタ一することが困難であるため制限されている。
c AM P (サイクリックアデノシン 3 ' , 5，一一リン酸）は 1 9 5 7年、 肝臓に おいてァドレナリンおよびグルカゴンの血糖上昇作用を仲介する因子として見出 され [E. W. Sutherland et al. , J. Am. Chem. Soc. , 第 79卷， 3608頁（1957年）] 、 その後、 副腎皮質ホルモン（A C T H)、 黄体形成ホルモン（L H)、 甲状腺刺激ホ ルモン（T S H)、 副甲状腺刺激ホルモン（ P T H)などの種々のホルモンゃプロス タグランジンなどの生理活性物質も c AM Pを介して作用が発揮されることが明 らかとなつた。 すなわち、 c AM Pは、 ペプチドホルモンや活性ァミンが分泌さ れて目標の細胞に到達した際、 それらが細胞内で酵素反応を進めるための情報伝 達を担い、 いわゆるセカンドメッセンジャ一としての機能を有している。
c AM Pは生体内では膜に局在するアデエル酸シクラーゼによって A T Pから 合成され、 ホスホジエステラーゼによって 5 '—AM Pに分解される。 細菌や動 物界に広く存在するが、 非常に微量である（定常濃度 0 . 1〜1 nモルノ湿重量)。 c AM Pの定量法としては、 c AM P結合タンパク質を用いる方法または放射免 疫法が簡便である。 cAM P含量は細胞の栄養、 増殖、 分化、 適応状態に左右さ れ敏感に変動する。
多種多様な哺乳動物および非哺乳動物の組織や体液中の c AM Pを測定するこ とは、 細胞生存度、 内分泌ホルモン軸機能、 アデ二ル酸シクラ一ゼ活性およびホ スホジエステラーゼ活性を評価するための有用な方法と成り得る。 さらに、 C A
M P測定を利用して、 シグナル形質導入、 リボソームタンパク質合成、 発生期タ ンパク質の転位および他の主要な細胞機能で重要な役割を果たしている Gタンパ ク質（グァニンヌクレオチド結合タンパク質）ファミリーをはじめとする、 多数の シグナル形質導入タンパク質の活性を評価することができる [Bourne et al. , Nature, 第 348卷， 125頁（1990年）] 。
また、 c AM Pの測定は、 特定の細胞、 組織、 器官または体液中の環状ヌクレ ォチドの値を変動させる可能性のある他の内因性及び外来性化合物（例えば、 一 酸化二窒素)の評価に使用することができる。
生物中の主要な調節ホルモンノタンパク質である、 ェピネフリン、 ノルェピネ フリン、 ァドレノコ/レチコ トロピン（A C T H)、 バソプレシン、 グノレ力ゴン、 チ ロキシン並びに甲状腺刺激及びメラノサイ ト刺激ホルモンをはじめとする多数の ホルモンは、 セカンドメッセンジャーとして c AM Pを使用する。 これら全ての ホルモンおよび調節物質の活性は、 本発明の測定方法を適用して組織、 血清、 体 液および全ての細胞培養物（細胞及び培地）中で測定することができる。 これらホ ルモンの測定は、 ホルモン不均衡から特定の病状となる可能性のある多種多様な 疾病状態について実施することができる。
ホルモンまたは調節タンパク質が特定のレセプタ一と相互作用すると、 セカン ドメッセンジャー（c AM P )力 カスケードとして生成される。 c AM Pの生成 は場合によっては、 特定のホルモンシグナル形質導入経路の一部として c AM P の減少を使用するホルモンによつて特異的に抑制することもできる。 この調節タ ンパク質またはホルモンとレセプターの相互作用の結果は、 （1 )例えば、 イオン チヤンネルの変化による細胞透過性の変動、 （ 2 ) c AM P濃度に敏感な酵素触媒 反応速度の変動、 （3 )他の酵素の合成および分解を含むタンパク質合成速度の変 動が考えられる。 c AM Pの測定は、 ホルモンまたは調節タンパク質がレセプタ 一と相互作用した後に、 これらの結果を直接および間接的に測定するために使用 することができる。
具体的には、 c AM Pの測定は、 試料中の c AM Pの分解を防止することによ つてァドレナリン作動性神経系を刺激するアミノフイリンまたはテオフィリンの ような医薬品レベルのマ一カーとして使用することができる。 細胞培養物中の c AM Pの測定を使用して特定のホルモン、 調節タンパク質および医薬品を評価す ることができ、 その際 c AM Pはシグナル形質導入過程での生体結合を示す。 c AM P測定はまた、 特定のホルモンまたは調節タンパク質の不存在下あるい は存在下で細胞を試験することによって、 細胞の生存度および安定性を評価する ために使用することもできる。 例えば、 グルカゴンによる月干臓細胞（肝細胞）中の c AM Pを測定することにより、 肝細胞の生存度を評価することができる。 これ は、 例えば、 器官および/または細胞の移植、 例えば心臓、 肝臓、 肺、 腎臓、 睥 臓、 皮膚および脳の細胞移植に有用である。
細胞内 c AM P値を高めるかまたは低下させる多種多様なホルモン、 調節タン パク質および医薬品で活性化した後の生検試料から得られる細胞の応答性の測定 は、 細胞機能を詳細に評価する方法として使用することができる。
特殊な臨床例としては、 心筋層の応答を評価するために心臓生検で c AM Pを 測定することが挙げられる。 心筋症の心臓細胞は、 β -ァドレナリン作動性刺激 後の c AM P含有量が上昇しても応答しない。 心疾患の重篤度および幾つかの医 薬品、 例えば ]3 -ァドレナリン作動性遮断剤およびアンギオテンシン変換酵素ィ ンヒビターの有効性の診断は、正常な心臓と心筋症心臓から得られる生検試料の 応答性を比較することによって行うことができる。 循環血液細胞中の基底状態ま たは刺激状態でのアデニル酸シクラーゼ活性または c AM Pの測定は患者の治療 の指針に用いることができる。 更に、 細胞内または動脈若しくは静脈循環内への c AM P放出は、 虚血、 低酸素症または医薬品若しくはホルモン刺激のような 種々の異なる生理学的および非生理学的ストレスに対する器官および/または組 織の応答のインディケ一ターとして使用することができる。 組織若しくは体液中 の c AM P値は、 この方法を用いて血球および血小板を含む殆ど全ての哺乳動物 細胞または体液中で測定することができる。 幾つかの組織では、 潜在的腫瘍細胞 試料の場合に、 fl重瘍原性および Zまたは侵入性に対する指標として特異的な刺激 剤に応答する c AM P値を測定することができる。 他の場合には、 c AM P合成 または分解を変える可能性のある特異的な治療法の有効 1生を決定するために c A M Pの測定を使用することができる。
上記のように、 c AM Pはセカンドメッセンジャーとして細胞内情報伝達にお いて、 重要な役割を果たしていると同時に、 様々な生理的機能を有していること から、 アデ二ル酸シクラ一ゼの触媒作用により A T Pから合成される c AM P量 を測定し、 さらにアデ二ル酸シクラーゼ活性を求めたり、 c AM Pの挙動を解明 することは、 基礎医学研究分野のみならず、 臨床医学の分野においても非常に意 義深いことといえる。
アデニル酸シクラ一ゼ活性の測定は、 A T Pを基質として生成した c AM Pを 定量することによって行う。 c AM Pの定量は、 （ 1 )標識された A T Pを基質と する方法と（2)非標識 ATPを基質として用いる方法に区別することができる。
( 1 )の標識された AT Pを基質とする方法では、 放射性同位元素で標識された AT P (例えば [a- 32P] ATP)を基質とし、 アデ二ル酸シクラーゼの作用に より合成された放射性標識 cAM P( [32P] c AMP)を ATPから分離し、 その放射活性を測定する [Y. Salomon et al.， Anal. Biochem. , 第 58巻， 541頁
(1974年） ； R.A. Johnson et al. , In Method in Enzymology, 第 195巻， 3頁（1991 年)] 。 この方法においては、 イオン交換樹脂および酸化アルミニウムカラムを 用いた連続ァフィ二ティクロマトグラフィーを用いて [a- 32P] ATPと [32 P] c AMPを分離している。
し力 し、 上記（1)の定量法は高感度である反面、 高価で危険性の高い放射性標 識化合物を使用しなければならない。
一方、 （2)の非標識 AT Pを基質として用いる方法は、 ①非標識 AT Pから生 成した c AM Pを放射性物質で標識した c AM Pと競合的に対応する抗血清に対 して抗原抗体反応させ、 結合抗体の放射活性を測定して c AMPを定量する、 レヽ わゆるラジオィムノアッセィと、 ② c AMP依存性プロテインキナーゼと c AM
Pの特異的結合を利用し、 c AMP依存性プロテインキナ一ゼと結合した3 H- c AMPの放射能を測定する、 プロテインバインディングアツセィ [A.G.Gilman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 67卷， 305頁（1970年）] に分類することが できる。
この（2)の非標識 ATP基質を用いる方法は、 環状ヌクレオチドホスホジエス テラーゼによる c AMPの分解を補正できないため、 ホスホジエステラーゼ活性 の強い検体には不適当である。
さらに、 安全性及び環境に与える影響を考慮すれば、 このような放射性物質の 使用は極力避けるべきである。 従って、 アデ二ル酸シクラーゼ活性およびその指 標となる c AMPの定量のため高感度の非放射性定量法の開発が望まれていた。
しかしながら、 大部分の哺乳動物の組織中において、 c AMPの濃度は非常に 低いため、 放射性物質を用いないで測定することは容易ではない。 また、 AMP や ADP、 ATPなどの試料中の非環状アデニンヌクレオチド類が、 c AMPの 数百倍から数十万倍以上の濃度で共存しており、 しかも化学構造が類似している ことから、 妨害物質として作用し、 c AMPの定量を一層困難なものとしている。 特に ATPは c AMPの 1億倍の濃度で存在していることもあり、 このような内 因性の AT Pを完全に除去しない限り、 正確な c AMPの測定は実質的に不可能 であった。
一方、 c AMPはホスホジエステラーゼの作用により AMPに変換されるが、
AMPの測定については、 放射性物質を用いない方法が開示されている。 Lowry らは、 還元型ピリジンヌクレオチドの蛍光を用いた高感度定量法 [0.Η· Lowry et al. , A Flexible System of Enzymatic Analysis, Har court Brace Jovanovich, New York(1972年） ； F. M. Matschinsky et al. , J. Histochem. Cytochem. , 第 16卷， 29頁（1968年)] を開示している。 これは、 還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチドリン酸（NADPH)の 340nmにおける吸光度が 0.1瞧 olあたり 0.617を示 すことを利用し、 試料の吸光度値から N A D P Hの絶対濃度を求める方法である。 また、 グリコーゲンをグルコース- 1 -リン酸に変換する酵素であるグリコーゲ ンホスホリラーゼが無機リン酸（P i)の存在下で AMPにより活性ィ匕されること を利用した AMPの測定も提案されている [E. Helmreich et al.， Biochemistry, 第 52巻， 647頁（1964年) ；同上， 第 51卷， 131頁（1964年) ； M. Trus et al. , Diabetes, 第 29卷， 1頁（1980年）] 。 この方法では、 グリコーゲンがグルコース- 1-リン酸に変換される量からダリコーゲンホスホリラ一ゼ活性を求め、 この活 性を指標として、 AMPの量を測定することができる。 さらに、 AMPを高感度 に測定する方法は、 Lurie等によって開発されている [K. Lurie et al. ,
Ann. J. Physiol., 第 253巻， H662頁（1987年）] 。
c AMPやアデニル酸シクラ一ゼの分析感度や特異性を高めるために、 試料中 の非環状アデニンヌクレオチド類を酵素分解および Zまたはクロマトグラフィー により除去する方法も知られている [N.D.Goldberg et al. , Anal. Biochera. , 第 28卷， 523頁（1969年） ； B.McL. Breckenridge, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 52卷，
1580頁（1964年）] 。
しかしながら、 これらの先行技術においては、 妨害物質である内因性の ADP や AT Pを完全には除去できないため c AMPの測定は不可能であると結論され ていた。 それゆえ、 放射性物質を使用することなく、 生物学的試料中の c AMP 量およびそれに基づくアデニル酸シクラーゼ活性を高感度に求める手段は実質的 にはなかったことになる。
本発明者は、 先に、 全く新しい観点からアデ二/レ酸シクラ一ゼ活性の測定およ び c AMP量の定量方法の開発を試み、 鋭意検討した結果、 妨害物質である AT Pや AD P、 AMPなどの試料中の内因性非環状アデ ンヌクレオチド類ゃグル コース- 6-リン酸を酵素を用いて選択的に除去した後、 試料中の c AMPを AM Pに酵素的に変換し、 さらに AMPを ATPに変換し、 そして、 フルク トース- 6-リン酸を経由してグルコース- 6 -リン酸に変換した後、 NAD PHに変換し、 この NAD PH濃度を蛍光光度法で測定し、 c AMP濃度と相関させることによ り、 有害な放射性物質を用いることなく、 酵素反応 '化学反応のみで、 cAMP 量およびそれに対応するアデニル酸シクラーゼ活性を測定することに成功した (WO 94,1 71 98)。
そして、 この方法を用いることで、 /gオーダーの生物学的試料中の c AMP 量を pmolまたは fmolレベルで正確に定量することが可能となった [A. Sugiyama et al. , Anal.Biochem. , 第 218卷， 20頁（1994年） ； A. Sugiyama et al. ,
J. Clin. Lab. , 第 8卷， 437頁（1994年） ； A. Sugiyama et al. , Anal.Biochem., 第 225巻， 368頁（1995年） ； A. Sugiyama et al. , Yamanashi Med. J. , 第 10卷， 11頁 (1995年）参照] 。
上記従来方法の反応式を以下に示す。 工程 1 ：クリーユング反応 (試料中の内因性非環状ヌクレオチド類および内 因性グルコース- 6-リン酸の除去） アビラーゼ
ATP > ADP + P i アビラーゼ
Figure imgf000010_0001
5 '-ヌクレオチダーゼ
AMP + H20 > アデノシン +P, アデノシンデァミナーゼ
アデノシン +H20 イノシン +NH4 + アル力リホスファターゼ
グルコース- 6-リン酸 > グルコース + Pi 工程 2 ：変換反応 1 (c AMPから AMPへの変換） ホスホジエステラ一ゼ
c AMP > AMP
工程 3 ：変換反応 2 (AMPから AT Pへの変換） ミオキナーゼ
AMP + ATP (痕跡量） 2 ADP ピルビン酸キナーゼ
AD P +ホスホェノールピルビン酸 AT P +ピルビン酸 工程 4 ： ATP- ADPサイクル反応による増幅
(測定感度を 6000〜 1万倍に増幅する）
ン酸 + AD P
P +ピルビン酸
Figure imgf000010_0002
工程 5 ：検出反応（NAD PHの蛍光光度測定）
ホスホダルコイソメラーゼ
フルクトース -6-リン酸 > グルコース- 6-リン酸 グルコース- 6 -リン酸デヒドロゲナーゼ グルコース- 6-リン酸 +NADP+ 一" >6-ホスホダルコノラクトン +NADPH + H + 発明の開示
上記の従来技術の方法は、 原理的に非常に優れた c AMPの定量手段であり、 かつ、 理論的にも正確なものであるが、 クリーニング反応に要する時間が長い、 サイクル反応後に加熱による酵素を失活させる際に、 反応混合物の白濁が生じる、 などの点で改良の余地があった。
本発明は、 より簡便で、 迅速な c AMP量やアデニル酸シクラーゼ活性の測定 手段であって、 しかも放射性物質を使用しない測定方法の開発を目指して鋭意研 究した結果完成されたものである。
本発明は、 先に本発明者らが開示した酵素反応および蛍光光度法を採用したァ デニル酸シクラーゼ活性測定法および c AM P定量法 (WO 94 Z 1 71 98 )の 改善を図ったものである。 即ち、 （1)クリーニング反応において、 5'-ヌクレオ チダーゼの使用を取りやめることにより、 反応時間を 1時間から 5分乃至 10分間 と劇的に短縮することに成功し、 （2)サイクル反応において、 反応後の酵素の失 活方法を加熱に代えて、 EDTAなどのキレート剤を用いて試料中の Mg 2 +を キレート処理して除去し、 酵素を失活させることにより、 試料の白濁を防止した。 これにより、 続いて行う検出反応の精度が向上した。 また、 （3)従来 2段階であ つた変換反応を 1段階とすることで、 より簡便な操作を可能とした。 そして、
(4)検出反応において試薬等の濃度を再検討し、 最適化した。 これらの改良を加 えることによって、 生物学的試料中の c AM P量およびそれに対応するアデニル 酸シクラーゼ活性をより迅速、 且つ高感度に測定できる酵素的蛍光定量アツセィ または分光光度ァッセィを提供することが可能となった。
なお、 本発明は後述するように、 グァニン調節タンパク質および c AMP特異 的ホスホジエステラ一ゼの活性を測定するために使用することもできる。 本発明の cAM Pの測定に用いられる反応を以下に記載する。
ステップ 1—クリーニング反応 (試料中の内因性非環状アデニンヌクレオチ ド類およびグルコース _ 6 _リン酸の除去） アビラ一ゼ
AT P ADP + P i アビラ一ゼ
AD P > AMP + P i アル力リホスファターゼ
AMP + H20 アデノシン + P； アデノシンデァミナーゼ
アデノシン +H20 イノシン +NH4 + ァノレ力リホスファターゼ
グルコース- 6-リン酸 > グルコース + P, ステップ 1—クリーユングォプション反応 1
(フルク トース- 6-リン酸の除去） アル力リホスファターゼ
フルク トース -6-リン酸 > フルク トース + P i
ステップ 1—クリーユングオプション反応 2
(試料中の内因性ダリコーゲンの除去） グリコーゲンホスホリラーゼ
グリコーゲン グルコース - リン酸 ホスホグ コムターゼ
グルコース-レリン酸 >グルコース- 6-リン酸 ァノレ力リホスファターゼ
グルコース- 6-リン酸 グルコース + Pi グルコース才キシダーゼ
グノレコース + H20 + 02 >
ダルコノ -1,4-ラクトン +H。02
ステップ 2—変換反応（AMP化反応） ホスホジエステラーゼ
c AMP > AMP
ステップ 2 _変換オプション反応 1 (AT P化反応） ミオキナーゼ
AMP + ATP (痕跡量） > 2 ADP ピルビン酸キナーゼ
AD P +ホスホェノールピルビン酸 > ATP +ピルビン酸
一検出反応 1 (NAD PHの蛍光光度測定） ダリコーゲンホスホリラーゼ
(AMPにより活性化）
グリコーゲン + > グルコース- 1-リン酸 ホスホグノレコムターゼ
グルコース- 1-リン酸 > グルコース- 6-リン酸 グ^^コース- 6 -リン酸デヒ ド口ゲナーゼ グルコース ·6-リン酸 +NAD Ρ+ 一" > 6-ホスホダルコノラクトン +NADPH + H + ステップ 3—検出オプション反応 1 (6-ホスホダルコノラク トンの分解） 加熱
6-ホスホダルコノラク トン +H20 > 6-ホスホダルコン酸 +H +
6-ホスホダルコン酸デヒ ドロゲナーゼ、 Mg2 + 6-ホスホダルコン酸 +NADP+ 一 ~ >リブロース- 5-リン酸 +NAD PH + H + + C02 -検出サイクル反応 1
グルタミン酸デヒ ドロゲナーゼ α-ケトグルタル酸 +NAD ΡΗ + ΝΗ4+
—— >グルタミン酸 +NAD Ρ + グルコース- 6-リン酸デヒ ドロゲナーゼ、 Mg2 + グルコース ·6.リン酸 +NAD P+
—— >6-ホスホダルコノラク トン + NADPH + H + +C02 加熱
6-ホスホダルコノラク トン +H20 > 6-ホスホダルコン酸 +H +
6-ホスホダルコン酸デヒ ドロゲナ一ゼ、 Mgs 6-ホスホダルコン酸 +NADP+ リブロース- 5-リン酸 +NADPH + H + + CO,
-検出反応 2 (NAD P Hの蛍光光度測定） へキソキナーゼ
ATP +フルク トース フルク トース -6-リン酸 + ADP ホスホダルコイソメラーゼ
フルク トース -6-リン酸 > グルコース- 6-リン酸 グルコース- 6-リン酸デヒ ドロゲナーゼ ダルコ一ス.6-リン酸 +NAD P+ 一^ >6-ホスホダルコノラク トン +NADPH + H + ステップ 3—検出サイクル反応 2 ( A T P - A D Pサイクル反応による増幅
(測定感度を6000〜 1万倍に増幅する））
、レ へキソキナーゼ
ATP +フルク ト一ス フルク トース -6-リン酸 + ADP ピルビン酸キナーゼ
ADP +ホスホェノールピルビン酸 >AT P +ピルビン酸
ステップ 3—検出反応 3 (AT Pの検出）（ルシフ ラーゼ反応）
ノレシフェラーセ、 Mg2 +
AT P+ルシフェリン + 02
―"ォキシフェリン +P i+AMP + C02 +光
上記の反応をさらに詳細に説明する。
ステップ 1一クリーニング反応 (試料中の内因性非環状アデニンヌクレオチ ド類およびグルコース— 6—リン酸の除去） 本発明は、 アビラーゼ、 アデノシンデァミナーゼおよびアルカリホスファタ一 ゼの混合物により、 試料中の c AMP以外の内因性非環状アデニン残基を有する 化合物（アデノシン、 ATP、 ADPおよび AMP)を酵素的に除去する工程を含 む。 そして、 好ましくは、 アルカリホスファターゼを用いて試料中のグルコース - 6-リン酸をグルコースへ酵素的に変換する工程を含む（クリーニング反応）。 本発明のクリーニング反応は、 c AMPより遙かに高濃度であり、 除去しなけ れば実質的にブランクを高めるおそれのある全ての試料中の内因性 AT P、 AD Pおよび AM Pを除去することができる。 ダルコ一ス- 6 -リン酸は後に検出反応 で生成するので、 試料中のグルコース- 6-リン酸をあらかじめ酵素的に除去して おくことは、 本測定方法の精度を向上させるので好ましい。 これらのクリーニン グ反応は、 検出感度の向上のために重要である。
しかも本発明では、 従来クリーニング反応に用いられていた 4種類の酵素（ァ ビラーゼ、 5， -ヌクレオチダ一ゼ、 アルカリホスファターゼぉよびァデノシンデ アミナーゼ）のうち、 5'-ヌクレオチダーゼの使用を取りやめることにより、 反 応時間が著しく短縮され、 簡略化した。 すなわち、 約 1時間を要していた反応時 間が僅か 5分乃至 10分間程度に著しく短縮できることを見出した。
ステップ 1—クリーニングオプション反応 1
(フルク トースー 6—リン酸の除去）
また、 同様にサイクル反応および検出反応で生成するフルクトース- 6-リン酸 もアルカリフォスファタ一ゼで加水分解し、 除去しておくのが好ましい。
ステップ 1ークリーニングォプション反応 2
(試料中の内因性グリコーゲンの除去）
さらに好ましくは、 グルコースォキシダーゼ、 グリコーゲンホスホリラーゼぉ よびアルカリホスファターゼを用いて、 グルコース- 6-リン酸に変換される試料 中の内因性グリコーゲンを除去する（オプション反応)。 これにより、 ステップ 3 一検出反応 1 (NAD PHの蛍光光度測定） において既知量のグリコーゲンを添 加する際の妨害物質となる内因性グリコーゲンが消失する。
ステップ 2—変換反応（AM P化）
次に、 クリーニング反応後の試料にホスホジエステラーゼを作用させ、 cAM Pを AM Pに変換する（変換反応）。
ステップ 3—検出反応 1 (NAD PHの蛍光光度測定）
上記変換反応後、 グリコーゲンおよび無機リン酸を添加し、 AMPがグリコー ゲンホスホリラーゼを活性化してグリコ一ゲンからグルコース- 1 -リン酸を生成 する程度を指標として、 AMPを定量する。 即ち、 グルコース- 1-リン酸は、 ホ スホグルコムターゼによりグルコース- 6 -リン酸に変換され、 グルコース _ 6 _ リン酸は最終的に 6-ホスホダルコノラク トン、 NADPH及び H +に酵素的に 変換される。 最後に、 NADPH濃度を例えば Trusらの方法 [M. Trus et al. ,
Diabetes, 第 29巻， 1頁（1980年)] に従い、 蛍光定量法を用いて測定する。
ステップ 3—検出オプション反応 1 (6—ホスホダルコノラク トンの分解） また、 6-ホスホダルコノラク トンは、 水性溶媒中、 in vitroで加熱して 6 -ホ スホダルコン酸に変換することができ、 さらに 6-ホスホダルコン酸は、 NAD P+の存在下で in vitroで NAD PH、 およびリブロース- 5-リン酸に変換する ことができる。 これにより、 NADPHの濃度を高めることができる。 この NA DPH濃度を上記と同様に例えば Trusらの方法 [M.Trus et al. , Diabetes, 第 29卷， 1頁（1980年)] に従い、 蛍光定量法を用いて測定する。
ゥサギ心臓から得られた同一試料に対する、 刺激されたアデ二ル酸シクラーゼ 活性を修正 Salomon放射活性方法およびアル力リホスファターゼを用いない蛍光 定量法の両方で測定したところ、 測定結果は類似していた [Weign et al. , Anal. Biochem. , 第 208巻， 217頁（1993年)] 。 放射活性測定法と蛍光定量法から得られ た結果を比較すると、 絶対的な比活性は異なっているが、 アデ二ル酸シクラーゼ の刺激倍率は類似している。 比活性の差異は恐らくアデ二ル酸シクラーゼ反応混 合物における些細なファクタ一によるものと思われる。 即ち、 放射活性測定では 試料中ホスホジエステラーゼによる [32P] c AMP分解を防ぐために非標識 c AMPが使用され、 一方、 蛍光定量法では、 新たに合成される c AMPの試料 中ホスホジエステラーゼによる分解を抑制するためにテオフィリンが使用されて いる。
さらに、 ステップ 3—検出サイクル反応 2で示した AT P-ADPサイクル反 応を使用したアデニル酸シクラ一ゼの測定によって、 絶対的な比活性は放射活性 および蛍光定量法の両方で同一であることが明らかになつた。
本発明の方法は、 各反応工程毎に使用する酵素や緩衝液等をバイアル等に封入 し、 予めキットとして調製すれば、 より簡便に実施することができる。
具体的には、 （1)生物学的試料中の内因性 AT P、 AD Pおよび AMPからな る非環状アデニンヌクレオチド類および内因性グルコース- 6-リン酸を除去する のに効果的な量のアビラ—ゼ、 アル力リホスファターゼおよびアデノシンデアミ ナーゼを含むクリ一ユング反応用バイアルキット、 （2)生物学的試料中の c AM Pを AM Pに酵素的に変換するのに有効な量のホスホジエステラーゼを含む変換 反応用バイアルキット、 および (3) (a)グリコーゲンをグルコース- 1-リン酸に変 換するためのグリコーゲン、 無機リン酸およびダリコーゲンホスホリラーゼ、 (b)グルコース- 1 -リン酸をグルコース- 6 -リン酸に変換するためのホスホグル コムターゼ、 ならびに（c)グルコース一 6—リン酸を 6-ホスホダルコノラクトン および N A D P Hに変換するためのグルコース- 6 -リン酸デヒド口ゲナーゼぉよ び NAD P +を含む検出反応用バイアルキットを含む、 生物学的試料中の cAM P量またはアデニル酸シクラーゼ活性の測定用キットである。
また、 （1)生物学的試料中の c AMP以外の内因性非環状アデニンヌクレオチ ド類、 および内因性グルコース- 6-リン酸を酵素的に除去するのに有効な量のァ ビラ一ゼ、 アデノシンデァミナーゼおよびアルカリホスファタ一ゼを含むクリー ユング反応用バイアルキット、 （2)生物学的試料中の c AMPから AT Pの酵素 的変換のための有効量のホスホジエステラーゼ、 ATP、 ミオキナーゼ、 ホスホ エノールビルビン酸およびピルビン酸キナーゼを含む変換反応用バイアルキット、 および（3) (a) AT Pをフルク ト一ス -6-リン酸に変換するためのフルク トースぉ よびへキソキナーゼ、 （b)フルク トース- 6-リン酸を 6-ホスホグルコノラクトン および N A D P Hに変換するのためのホスホグルコイソメラーゼぉよびグルコ一 ス- 6-リン酸デヒドロゲナーゼおよび NAD P +を含む検出反応用バイアルキッ トを含む、 生物学的試料中の c AMP量またはアデニル酸シクラーゼ活性の測定 用キットを挙げることができる。
本発明の方法は、 0. lmg未満の極微量の試料中の c AMP量を測定すること でき、 そして lfmol未満の c AMP/試料を測定することができる。 また、 本発 明においては、 生物学的試料に既知量の AT Pを添カ卩し、 この AT Pを試料中の アデニル酸シクラーゼの作用で c AMPに変換させ、 次にクリーニング反応によ り内因性の AT Pなどのアデニンヌクレオチド類を全て除去した後、 変換した c AMP量を求めることによってアデ二/レ酸シクラーゼ活生を算出することもでき る。
クリーニング反応において、 アデノシンから生成したアンモ-ゥムイオンは一 連のクリ一ユング反応を本質的に完了させ、 試料中のヌクレオチド類が再形成す るのを妨げる。 これらの操作により、 これまでの蛍光定量アツセィからは予期で きない顕著な改善効果が得られる。 [Weign et aL, Anal. Biochem. , 第 208卷， 217頁（1993年）] 。 図面の簡単な説明 図 1 AT Pの標準試料におけるィンキュベーシヨン時間.に対する蛍光光度測 定値を示すグラフである。
図 2 c AMPの標準試料の濃度に対する吸光光度測定値を示すグラフである。 図 3 本発明の方法、 免疫比色法および放射免疫測定法を用いて c AMP値を 比較測定した結果を示す棒グラフである。
図 4 本発明の方法、 放射免疫測定法および Salomon法を用いてアデ-ル酸シ クラーゼ活性を比較測定した結果を示す棒ダラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法に従って定量される生物学的試料は、 好ましくは哺乳動物由来の ものであり、 これには組織、 血球、 骨が含まれ、 さらに尿、 血液、 髄液などの生 物学的流体が含まれる。 これらの試料は、 新鮮なものであるか、 または冷凍保存 されてレヽて ょレヽ [Lowry et a丄. , Λ Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, New York (1972年)] 。
好ましい実施態様では本発明は次のような段階を含んでいる。
ステップ 1ークリーニング反応 (試料中の内因性非環状ヌクレオチド類
およびグルコース一 6—リン酸の除去） c AMP, グルコース- 6-リン酸および少なくとも 1種の非環状アデニンヌク レオチド類、 即ち ATP、 ADP、 AMPまたはこれらの混合物からなる群から 選択されるものを含んでいる生物学的試料を、 アビラーゼ、 アデノシンデァミナ ーゼおよびアル力リホスファターゼの混合物を含む水性緩衝液と混合して、 非環 状アデニンヌクレオチド類（AT P、 AD Pおよび Zまたは AMP)およびダルコ ース- 6-リン酸を酵素的に変換して除去する。
「より迅速に」 とは、 従来約一時間を要していたクリーニング反応が約 5〜10 分以内に、 すなわち、 1ノ 1 2〜1Z6、 少なくとも 1Z6の反応時間に短縮さ れることをいう。
ステップ 1—クリ一二ングォプション反応 2
そして任意に、 上記反応混合物をグルコースォキシダーゼ、 グリコーゲンホス ホリラーゼおよびアルカリホスファターゼと混合して全ての試料中のグリコーゲ ンを分解、 除去する。 このとき cAM Pは反応混合物中にそのまま保持される。 これにより、 ステップ 3—検出反応 1 (NAD PHの蛍光光度測定） において既 知量のグリコーゲンを添加する際の妨害物質となる内因性グリコーゲンが消失す る。
ステップ 2—変換反応（AMP化反応）
上記反応混合物をホスホジエステラーゼと混合して試料中の cAMPを AMP に変換する。
ステップ 3—検出反応 1 (NAD PHの蛍光光度測定）
さらに、 AMPをグリコ一ゲンおよび無機リン酸の存在下でダリコーゲンホスホ リラーゼと接触させてグルコース- 1-リン酸を上記反応混合物中で生成させ、 上 記反応混合物中でホスホダルコムタ―ゼと反応させ、 グルコース- 6-リン酸を生 成させる。 ついで、 6-ホスホダルコノラク トン、 NADPH及び H +に酵素的 に変換し、 上記反応混合物中の NAD PH濃度を蛍光定量法で測定する。 そして、 この NAD PHの濃度が上記試料中のアデニル酸シクラーゼ活性、 c AMP量ま たは AMP濃度と相関する。
この c AMPの測定法は、 c AMPの 3', 5 '-ホスホジエステル結合の開裂に よって生成する AMPが、 ダリコーゲンホスホリラーゼ活性を刺激するという原 理に基づいている。 すなわち、 c AMPおよびアデ二ル酸シクラ一ゼ活性の量は c AMPから生成した AMPがグリコーゲンホスホリラ一ゼを活性化し最終的に 得られた NAD PHの吸光度に対応する。
NAD PHの最終濃度と AMP濃度の相関関係は、 例えば検量線によって求め ることができる（図 2参照)。
好ましくは、 上記ステップ 1—クリーニング反応後に、 加熱してクリーニング 反応で使用した酵素を不活性化する。
また好ましくは、 上記ステップ 1 _クリーニング反応に続いて、 ホスホジエス テラ一ゼ、 グリコーゲンホスホリラーゼ、 グルコース- 1 , 6-二リン酸、 無機リ ン酸、 グリコーゲン、 NADP +、 グルコース- 6-リン酸デヒドロゲナーゼ、 ホ スホグルコムターゼぉよび M g 2 +からなる液を反応混合物に添加し、 上記変換 反応および検出反応の工程を in vitroで連続的に実施する。 ステップ 3—検出オプション反応 1 (6—ホスホダルコノラク トンの分解） 任意に、 ステップ 3—検出反応 1の反応混合物を加熱して 6-ホスホダルコノ ラク トンを順次 6-ホスホダルコン酸に変換し、 その後、 Mg2 +の存在下で NA DP+および 6-ホスホダルコン酸デヒドロゲナーゼと反応させ、 上記で示され るように、 リブロース- 5-リン酸、 NADPH、 H +および C〇2として上記ス テップ 3検出反応で生成する NAD P Hの濃度を高めることもできる。
ステップ 3—検出サイクル反応 1
ステップ 3—検出反応 1で生成する NADPHの有効濃度は、 これをサイクル 反応系で使用することによって数オーダー増加させることができる。 即ち、 α- ケトグルタル酸の存在下で NADPHは NAD Ρ+およびグルタミン酸に変換さ れる。 NAD P+は順次、 添カ卩されたグルコース- 6-リン酸を 6-ホスホダルコ ノラク トンおよび NADPHに変換する。 上記したように、 6-ホスホダルコノ ラク トンは加水分解され（H20、 加熱）、 6-ホスホダルコン酸デヒドロゲナ一 ゼおよび Mg2 +の存在下でリブロース- 5 -リン酸および N ADPHに変換するこ と力、できる [Lowry et al. , A Flexible System of Enzymatic Analysis,
Harcourt Brace Jovanovich, ニューョ一ク (1972年)] 。
ステップ 2—変換オプション反応 1 (ATP化）
あるいは、 c AMPから生成する AMPは、 痕跡量の AT Pの存在下でミオキ ナーゼと混合することにより ADPに変換することができる。 次に生成した AD Pは 2-ホスホェノールピルビン酸およびピルビン酸キナ一ゼで処理することに より、 AT Pとピルビン酸に変換される。 この反応により、 1分子の AMPから 1分子の A T Pが生成する（ A T P化反応)。
上記の c AMPから AMP、 ADPを経由して ATPへ至る、 ステップ 2—変 換反応およびステップ 2—変換ォプション反応 1は、 1段階で行うことができる。 ステップ 3—検出反応 2 (NADPHの蛍光光度測定）
さらに AT Pは、 まずフルク トースの存在下でへキソキナ一ゼで処理されフル ク ト一ス- 6-リン酸および ADPに変換される。 生成したフルク トース- 6-リン 酸はホスホダルコィソメラーゼの作用によりグルコース- 6-リン酸に変換され、 最終的に 6-ホスホダルコノラク トン、 NADPH及び H +に酵素的に変換され る。 そして、 同様に、 NADPH濃度を Trusらの方法 [M. us et al. ,
Diabetes, 第 29卷， 1頁（1980年)] に従い測定する。
ステップ 3—検出オプション反応 1
さらに同様に、 6-ホスホダルコノラクトンを加水分解して 6-ホスホグルコン 酸に更に変換し、 この 6-ホスホダルコン酸を NAD P +の存在下で、 NADP
H、 H +、 C02およびリブロース- 5-リン酸に変換してもよい。
ステップ 3—検出サイクル反応 2 (AT P—ADPサイクル反応による増幅） そしてさらに AT Pは、 ATP- ADPサイクル反応に供される。 即ち、 AT Pは、 まずフルク トースの存在下でへキソキナーゼで処理されフルクトース- 6- リン酸および ADPに変換される。 次にこの ADPは、 ホスホェノールピルビン 酸およびピルビン酸キナーゼの作用により AT Pおよびピルビン酸となる。 ここ で生成した AT Pは再びフルク ト一ス -6-リン酸および ADPに変換される。 こ の反応が繰り返されることにより、 最終的にフルクトース- 6-リン酸カ蓄積する。 サイクル反応終了時の酵素の不活性化のために、 キレート剤を添加する。 キレ —ト剤は EDT Aのようなポリアミノカルボン酸、 クェン酸のようなォキシカル ボン酸などが用いられる。 好ましくは、 EDTAである。
サイクル反応では、 過剰のフルク トースおよびホスホェノールピルビン酸から 得られるフルク ト一ス- 6-リン酸は、 ホスホグルコースイソメラ一ゼによりグル コース- 6-リン酸に変換される。 このグルコース- 6-リン酸をグルコース- 6 -リ ン酸デヒドロゲナ一ゼぉよび N A D P +で処理することによって 6_ホスホグル コノラタトンおよび NADPHに変換される。 そして、 NADPH濃度を Trusら の方法 [MTrus et al. , Diabetes, 第 29巻， 1頁（1980年）] に従い、 測定する 検出反応 2参照)。
—検出反応 3
さらに、 本発明においては、 上記ステップ 2 _変換オプション反応 1の AT P 化反応で生成した ATPをルシフェラーゼ反応、 すなわちホタルルシフエリンを 使用する化学的蛍光分析法を用いて吸光度測定によって検出してもよい [Wulff et al. , Methods of Enzymatic Analysis, H. U. Bergmeyer編集， VCH(1985年）] 。 ATPの測定値から、 AMPおよび c AMP濃度ならびにそれに対応するアデ二 ル酸シクラーゼ活性を算出することができる。
この反応の進行は非常に緩慢であるが、 反応収率 (発光した光子数と変換され た AT P分子数の比率として定義される）はほぼ 100%である。 発光強度は AT P 濃度と正比例し、 582nmで測定される。
本発明の測定法は、 反応系の概念が同一であれば、 AMP以外の物質に適用す ることができる。 例えば、 GMPに対応する酵素を適応することにより、 グァニ ル酸シクラーゼ活性やサイクリックグアノシン- 3 ', 5 ' -—リン酸（ c GM P )お よびグアノシン- 3', 5' -—リン酸（GMP)の定量に用いることもできる。 用い られる反応式を下記に示す。
ステップ（ i)—クリーニング反応
アル力リホスファターゼ
GT P > GMP+ 2 P j アル力リホスファターゼ
GMP + H20 グアノシン + P i ヌクレオシドホスホリラーゼ
グアノシン + P i > グァニン +リボース- 1 -リン酸
グアナーゼ
グァニン > キサンチン +アンモニア ステップ (ii)一変換反応 ホスホジエステラーゼ
c GMP > GMP グァニンモノホスフェートキナーゼ
GMP + AT P > GDP + ADP ステップ (iii)—サイクル反応 ピルビン酸キナーゼ
GDP +ホスホェノールピルビン酸 >ピルビン酸 + G T P コハク酸チォキナーゼ
GTP +コハク酸一 CoA >GDP +コハク酸
ステップ (iv)—検出反応 乳酸デヒ ドロゲナーゼ
ピルビン酸 +NADH + H+ 乳酸 +NAD—
上記の反応をさらに具体的に説明する。
ステップ（ i )一クリーニング反応
即ち、 上記式に示したように、 アルカリホスファターゼ、 ヌクレオシドホスホ リラーゼおよびグアナ一ゼからなるクリ一二ング混合物が使用される。 アル力リ ホスファターゼは、 c GM Pの測定中にブランク値を高める可能性のある化合物、 例えばグルコース- 6-リン酸ゃ非環状ヌクレオチドを脱リン酸化にも用いられ得 る（クリーニング反応)。
クリーニング反応では、 試料中 GTPは GMP + 2 Piに変換された後、 グァ ノシンと Piに変換される。 グアノシンはグァニンとリボース- 1-リン酸に変換 され、 そしてグァニンは、 キサンチンとアンモニアに変換される。 c AMPの測 定におけるクリーニング反応と同様に、 最終クリーニング反応におけるアンモニ ゥム（または NH4+)は、 一連のクリーニング反応を本質的に終了させ、 その結 果、 干渉ヌクレオチドを確実に除去する。
好ましくは、 クリーニング反応で使用される酵素は次のステップ (i i)一変換反 応の前に、 例えば加熱によって不活化される。
ステップ (ii)一変換反応
次に、 ホスホジエステラーゼを用いて試料中に存在する c GMPを GMPに変 換する。 GMPをグァニンモノホスフェートキナーゼの存在下で ATPと混合す るとグアノシン- 5'-二リン酸（GDP)と ADPが得られる。
ステップ (iii)—サイクル反応
GDPは、 過剰のホスホェノールピルビン酸、 スクシ二ル- CoAおよび無機リ ン酸（P の存在下で一定量のピルビン酸を生じる（サイクル反応)。
ステップ (iv)—検出反応
このピルビン酸は、 酸の存在下で乳酸および N A D +に変換される既知量の N ADHを添加して間接的に定量される。 かく して、 インジケーター試料の蛍光は、 c GMP、 GMP又はグァ -ル酸シクラーゼについてアツセィされる試料中で生 成するピルペートの量に正比例して減少する。 また、 過剰の NADHを酸で分解 した後、 変換された NAD +をアルカリを用いて、 より蛍光強度の高い 2—ヒ ド ロキシニコチンアルデヒドに変換することによつて測定感度を向上させることが できる [K. Scya et al. , Anal. Biochem.， 第 272巻、 243頁（1999年）]。
本発明では、 ステップ (ii)一変換反応において、 グァニンモノホスフェートキ ナーゼによって分解する AT P量を測定して、 GMP量を求めることもできる。 ATPは上記で示したような、 公知の方法で測定することができる。
本発明の酵素的手法を用レ、たアデ二ル酸シクラーゼ活性またはグァニル酸シク ラ一ゼ活性の測定は、 高感度であり、 費用も顕著に安く、 また短時間で結果を得 ることができる。 さらに放射性物質を使用しないので、 オペレーターにとって安 全であり、 そして環境に対しても良好である。
最後に、 本発明の測定方法は、 生物学的試料中内因性または外来性のホスホジ エステラーゼの量を測定するように適合させることも容易である。 即ち、 cAM Pの予め選択された単一量を未知濃度のホスホジエステラ一ゼを含有する試料に 添加する。 この時、 ホスホジエステラーゼに対する特異的なインヒビターを必要 に応じて添加してもよい。 c AMPの予め選択された単一の過剰量を種々の予め 選択された既知量のホスホジエステラーゼに添加することによつて標準曲線が得 られる。 添加された c AMPの幾らかがホスホジエステラーゼによって AMPに 転換される反応時間（5〜60分)後に、 反応を停止させる。 c AMP標準曲線を同 時に実施して反応が適切に進行していることを証明することができる。 クリ一二 ング反応を開始して、 非環状アデユンヌクレオチドをすベて分解する。 残存 cA MPは天然 +添加ホスホジエステラーゼに反比例する。 次に、 c AMPを通常の 方法で AMPに変換し、 測定する。
具体的には、 試料組織を SET緩衝液 (0. 5Mのシユークロース、 0.03M のトリス、 2mMの EDTA) に溶解し、 2倍量の PDE混合物 （ 50 mMのト リス、 50 /Mの cAMP) を添力 tlし、 37 °Cで 20分間インキュベーションす る。 この反応混合物を 80 °Cで 30分間加熱する。 組織に対して 4倍量のクリ一 ニング反応混合物を添加し、 37°Cで 1時間インキュベーションする。 この反応 混合物を 80°Cで 30分間加熱する。 次に組織に対して 10倍量の変換反応混合 物を添加し、 室温で 1時間インキュベーションした後、 検出反応により、 NAD P Hの蛍光強度を測定する。
本発明においては、 使用する酵素や緩衝液等が予めキット化された製剤として 提供される。 この場合、 クリーニング反応混合物バイアル、 変換反応混合物バイ アル、 サイクル反応混合物バイアル、 検出反応混合物バイアルのように、 各反応 工程毎にバイアルを調製してキット化すると便利である。
本発明に使用する酵素等は、 適当なガラス製またはプラスチック製容器のバイ アル、 アンプルに、 例えば液剤、 凍結乾燥剤または固形剤の形状で充填され、 提 供される。
酵素類は予め緩衝液、 電解質液、 蒸留水等で溶解されていてもよい。 あるいは、 複室容器に酵素と溶解液を別々に収容しておき、 使用直前に混合してもよい。 また、 適宜、 保存剤、 安定化剤、 着色剤、 賦形剤、 pH調整剤などの添加物を 加えることもできる。
本発明の測定方法は、 本明細書に記載した増幅反応を使用する他、 適当な自動 分析装置を用いて行つてもよい。
本発明は、 アデ-ル酸シクラ一ゼ活性および c AMP並びに c AMP特異的ホ スホジエステラーゼ活性および G調節タンパク質の生物学的活性に関する非放射 性の酵素的蛍光定量法を提供する。 また、 本発明は、 グァニル酸シクラーゼ活性 および c GMPの非放射的測定を提供する。
本発明の方法は、 現在利用されているアデニル酸シクラーゼ活性等の測定方法 に比べて幾つかの利点を有する。 即ち、 本発明は、 Y. Salomonらによって開示さ れた従来法 [Anal. Biochem. , 第 58卷， 541頁（1974年） ； Adv. Cyclic Nucleotide Res. , 第 10卷， 35頁（1979年) ] と異なり、 放射性物質を一切使用しない。 加えて、 本発明の測定方法は、 従来法に比べ高感度で、 操作がより簡単である。
さらに、 本発明者らが先に開発した酵素反応を用いた測定方法 [A. Sugiyama et al. , Anal. Biochem. , 第 218卷， 20頁（1994年) ； A. Sugiyama et al. ,
J. Cl in. Lab. , 第 8卷， 437頁（1994年） ； A. Sugiyama et al. , Anal. Biochem. , 第 225巻， 368頁（1995年） ； A. Sugiyama et al.， Yamanashi Med. J. , 第 10卷， 11頁 (1995年) ] と比較しても、 反応時間が著しく短縮され、 操作もより簡便なものと なっている。 また、 従来方法では回避できなかった試料の白濁化を E D T Aなど のキレート剤を用いることで解決した。 そして、 この方法を用いることで、 // g オーダ一の生物学的試料中の c AM P量を pmolまたは fmolレベルで正確に定量す ることが可能である。
本発明のクリーニング反応は、 c AM Pより遙かに高濃度であり、 除去しなけ れば実質的にブランクを高めるおそれのある全ての試料中の内因性 A T P、 A D
Pおよび AM Pを除去することができる。 さらに、 同様に妨害物質として作用す る試料中のグルコース- 6 -リン酸およびグリコーゲンも全て除去することができ る。 これらのクリーニング反応は、 検出感度の向上のために重要である。
しかも本発明では、 従来クリーニング反応に用いられていた 4種類の酵素（ァ ピラーゼ、 5 ' -ヌクレオチダ一ゼ、 アルカリホスファターゼおよびアデノシンデ ァミナ一ゼ）のうち、 5 ' -ヌクレオチダーゼの使用を取りやめることにより、 1 時間を要していた反応時間が僅か 5分乃至 10分間程度に著しく短縮できることを 見出した。
また、 サイクル反応後、 キレート剤により M g 2 +をトラップするので、 加熱 することなく過剰の酵素が不活性化することができ、 試料が白濁しない。
本発明の測定方法の感度は、 反応容量を減少させることによって高めることも できる。 この感度は、 Meinrich等または E. Helmrich等 [E. Helrarich et al. , Biochemistry, 第 52巻， 647頁（1964年）] の方法を用いることにより、 反応混合 物中のグリコーゲンおよび無機リン酸の濃度を変えることによって更に高めるこ ともできる。 本発明は、 10 //g程度の微量の哺乳動物組織の膜タンパク質中のァ デュル酸シクラーゼ活性を測定することが可能である。
従来の [ct- 32P] c AMPの比活性およびクロマトグラフィー分離などの容 量サイズによって感度が制限される放射活性測定方法とは異なって、 本発明の蛍 光定量方法においては、 感度を高めることに対して顕著な障害は存在していない。 例えば、 c AM Pは広範な濃度範囲（ 1 fmol〜 1 mmol)で測定可能である。 実施例
本発明は、 以下の実施例により更に詳細に説明される。 これらの実施例におい ては使用した酵素、 基質およびコファクタ一は、 Boehringer Mannheim社から入 手した。 ただし、 アビラ一ゼおよび 5 '-ヌクレオチダーゼは Sigma社から入手し た。 [a- 32P] ATP、 3H-c AMPおよびアクアゾルシンチレーシヨンカク テノレ ίま New England Nuclearf土力、り購入した。 Neutral Chromatographic Alumina WN-3は B i o- Rad社製を用いた。
実施例 1 クリ一ユング反応時間の設定
3 μ Lの ATP標準品（0、 10、 100、 1000および 10000pmol/tube)を 10X57の Pyrex (商品名）製分析管に加えた。 室温にて、 クリーニング反応混合物（lOOmMの トリス- HC1、 H8.0； 2mMの MgCl2； 2 U/mLのァピラーゼ； 10U/mLの アデノシンデァミナ一ゼ； 40U/mLのアルカリホスファターゼ） 25μ Lを各分析 管に加えた。 この混合物を 37°Cでインキュベートした（0、 5、 10、 15および 20 分間)。 以下、 ステップ 2—変換反応（AMP化反応）および変換オプション反応 (AT P化反応）、 ステップ 3—検出サイクル反応 2を行い、 340nmにおける蛍光 度を測定し、 AT Pが完全に消失するインキュベーション時間を求めた。 結果を 図 1に示す。 その結果、 長くても 10分間のインキュベーションで妨害物質の AT Pはほぼ消失することが判つた。
比較実験
本願発明のクリーユング反応と 5'—ヌクレオチダーゼを用いたクリーユング 反応とを比較するために行われた。
5，一ヌクレオチダーゼを含むクリーユング反応混合物の調製 トリス一 HC 1 (pH8.0) 、 Mg C 12、 5 '—ヌクレオチダーゼ、 アビラ —ゼ、 アデノシンデァミナーゼおよびアルカリホスファタ一ゼに水を加えて全量 25 /z Lとし、 表 1に示す最終濃度を有するクリーニング反応混合物を調製した。 表 1 ：クリ一二ング反応混合物
ィ匕合物 最終濃度
トリス— HC 1 (pH8.0) 100 mM
Mg C 12 2mM
5'—ヌクレオチダーゼ 2. 5U/mL
アビラ一ゼ 2U/mL
アデノシンデアミナーゼ 10 U/ L
ァノレ力リホスファターゼ 2 OU/mL
水 このクリーニング反応は以下の式で示すことができる c ァピラーゼ
AT P > ADP+ P j アビラーゼ
AD P > AMP + P ,
5 ヌクレオチダーゼ
ΑΜΡ + Η,Ο > アデノシン + Ρ , アデノシンデァミナーゼ
アデノシン + Η20 イノシン +ΝΗ4 + アル力リホスファターゼ
グルコース- 6-リン酸 グルコース + クリーニング反応時間の設定
上記で調製したクリーニング反応混合物を用い、 実施例 1の方法に準じてクリ -ユング反応を行った。
3 μ Lの ATP標準品 （0、 10、 100、 1000および 10000 pmol/tube) を 10 X 57の Pyrex製分析管に加えた。 室温にて、 上記で調製し たクリーニング反応混合物 （10 OmMのトリス一 HC 1 (pH8.0) ； 2 m Mの Mg C 12 ； 2U/mLのァピラーゼ； 2. 5 U/m Lの 5 ' -ヌクレオチダ —ゼ； 0. 1 UZmLのアデノシンデァミナーゼ； 2 OU/mLのアルカリホス ファタ一ゼ） 25 Lを各分析管に加えた。 この混合物を 37°Cでインキュベー トした。 以下、 実施例 2に記載の変換反応、 サイクル化反応および検出反応を行 レ、、 340 nmにおける吸光度を測定し、 AT Pが完全に消失するインキュベー シヨン時間を求めた。 その結果、 AT Pを完全に消失させるためには、 およそ 1 時間を要した。
実施例 2 酵素的蛍光定量による組織培養物における微量 c AMP測定
( 1 )試料および反応混合物の調製
A. 生物学的試料の調製 (心室筋細胞の調製）
初代培養で増殖させた 1日齢のラットの心臓から心室筋細胞を採取した。 心臓 あたり約 500万個の心筋細胞が生存していた。 100mmあたり約 100万個の細胞密度 で播いた後、 皿細胞を 5%ゥシ血清細胞を含有するハンクスの平衡塩類溶液を有 する最少必須培地中で増殖させた [Simpson et al. , Cir. Res. , 第 51卷， 787頁 (1982年)] 。 4日目に培地を交換した。 培養物は 90%以上の心筋細胞を含有して おり、 細胞数は期間中一定であった [Simpson et al. , Cir. Res. , 第 51卷， 787 頁（1982年）； Rocha- Singh et al. , J. Clin. Invest. , 第 88卷， 204頁（1991年） ； Rocha - Singh et al., J. Clin. Invest. , 第 88巻， 706頁（1991年）] 。
6プレートの筋細胞を 2群（n = 3プレートノ群）に無作為抽出した。 ホスホジ エステラーゼインヒビター、 3-イソブチル _1 -メチルキサンチン（ I BMX)を 各群の培地に 2 //Mの最終濃度となるように添加した。 5分後、 一方の群にイソ プロテレノールを 1 の最終濃度となるように添加し、 刺激群とした。 他方の 群には追加的な薬品を加えなかった。 5分後、 6つの全プレートの細胞および細 胞なしの培養培地プレートを合計 5 mLの 100%エタノールで溶出した。 各皿から 得られる溶出物の 10分の 1 (0.5mL)を採り、 12X75mmのホウケィ酸ガラス管中 で風乾し、 _80°Cで貯蔵した。 残りの 4.5mLも同様に風乾し、 貯蔵した。 測定時 に、 ペレットを解凍し、 0.5 Nの過塩素酸 100 / Lに再度懸濁した。 抽出物を 4°C で 2分間撹拌し、 超音波処理器 (Branson Cleaning Equipment社、 A Smith-Kline 社、 米国）を使用して 1分間超音波処理した。 抽出物を 25/ Lの 2 N KOHで中 和し、 2000gで 30分間遠心した後、 上清液 80 μ Lを分析用に採取した。
Β. タリーニング反応混合物の調製（ステップ 1クリーニング反応参照）
1 Μのトリス— HC 1 (ρ Η8.0)400 L、 0. 2Mの MgC 1 24 μ L、 500 U/m
Lのアビラ一ゼ 32 L、 400U/mLのアデノシンデァミナ一ゼ 100μ Lおよび 4000 U/mLのアルカリホスファターゼ 40μ Lに水を加えて全量 4 mLとし、 クリー二 ング反応混合物を調製した (表 2 )。
表 2 ：クリーニング反応混合物
化合物 最終濃度
トリス- HC 1 (p H8.0) lOOmM
Mg C 1 2 2mM
ァピラーゼ 4U/mL
アデノシンデァミナーゼ 10U/mL
ァノレカリホスファタ一ゼ 40U/mL
水 一
実施例 2 ( 1 ) で調製したラット心室筋細胞調製物を氷冷した後、 0. 4 /z L のステップ 1—クリーユングオプション反応混合物 （1 0 O mMトリス一 HC 1 (p H8. 0) 、 3 mMの Mg C 1 2、 3 U/mLのアビラーゼ、 1 5 0 μ gZ mLのアデノシンデァミナーゼ、 3 OU/mLのアルカリフォスファタ一ゼ、 お よび 7 5 μ gZmLのグリコーゲンホスブオリラーゼー α) を加えて、 すべての 内因性アデニンヌクレオチド、 グリコーゲン、 およびグルコース一 6—リン酸を 除去した。 3 7 °Cで 1時間ィンキュベ一ションした後、 80 で 3 0分間加熱し て、 酵素を不活性化した。
C. 変換反応混合物の調製 (ステップ 2—変換反応およびステップ 2—変換ォプ シヨン反応参照）
1 Mのトリス- HC 1 (p H8.0)400// L、 0.2Mの MgC 1 240/ L、 4%のゥ シ血清ァノレブミン 10 ju L、 1 MのKC 1600 / L、 0.1Mのジチオトレイ トー 7レ 80 μ L, 0.1//1^の八丁？16 / 、 0.5Μのホスホエノ一ノレピルビン酸 24/ L、 2U /mLのホスホジエステラーゼ 24μ L、 720U/mLのミオキナーゼ 24 i Lおよび 2000U/mLのピルビン酸キナ一ゼ 160/i Lに水を加えて全量 4mLとし、 変換反応 混合物を調製した (表 3)。
表 3 ：変換反応混合物
化合物 最終濃度
トリス - HC 1 (pH8.0) lOOmM
Mg C 12 2mM
ゥシ血清アルブミン 0.01%
KC 1 150π
ジチォトレイ トール 2mM
ATP 40nM
ホスホエノールビ/レビン酸 3mM
ホスホジエステラーゼ 12mU/mL
ミォキナーゼ 4.5U/mL
ピルビン酸キナーゼ 80U/mL
水 一
D. サイクル反応混合物の調製（ステップ 3—検出サイクル反応 2)
1 Mのトリス- HC 1 (p Η8·0)400 ·ί L、 0.2Mの MgC 1240/i L、 4%のゥシ 血清アルブミン ΙΟμ L、 0.1Mのフルク トース 30 / Lおよび 1500U/mLのへキソ キナーゼ 160 μ Lに水を加えて全量 4mLとし、 サイクル反応混合物を調製し た (表 4)。
表 4 ：サイクル反応混合物
化合物 最終濃度
トリス— HC 1 (pH8.0) lOOraM
Mg C 1 , 2mM
ゥシ血清アルブミン 0.01 %
フルク トース 3π
へキソキナーゼ 60mM
水 一 E. 検出反応混合物の調製 (ステップ 3—検出反応 2参照） .
1 Mのトリス— HC 1 (p H8.0)2000 μ L、 0.2Mの E DT A320 Z L、 0.1Mの NADP+120 ζ L、 3500U/mLのホスホダルコイソメラーゼ 6 μ Lおよび 1750 U/mLのグルコース- 6-リン酸デヒドロゲーゼ 6 μ Lに水を加えて全量 4mLと し、 検出反応サイクルを調製した (表 5)。
表 5 ：検出反応混合物
化合物 最終濃度
トリス- H C 1 (p H8.0) lOOmM
EDTA 3.2mM
N ADP+ 0.01%
ホスホク レコイソメラーゼフ ク トース lU/mL
グルコース- 6-リン酸デヒ ドロゲ一ゼ 0.5U/mL
水 一
(2)組織培養物における酵素的蛍光定量による微量 c AMP測定
Aで調製した心室筋細胞調製物を試料とし、 クリーニング反応、 変換反応、 サ ィクル反応および検出反応からなる一連の酵素的蛍光定量法により c AMPを求 めた。
1)クリーニング反応（ステップ 1—クリーニング反応）
中和した 3 L容量の筋細胞抽出物（100画プレートから得られる総溶出物の 2.4。/0または 0.24%のいずれ力 または 3 μ Lの c AMP標準品（ 0、 3.6、 7.2、
14.4、 21.6ぉょび28.811101/20/ L)を 10X57の Pyrex製分析管（岩城硝子製）に加 えた。 室温にて、 Bで調製した 25// Lのクリ一二ング反応混合物（lOOmMのトリ ス- HC 1 (p H8.0) ； 2mMの MgC 12 ； 2 U/mLのアビラーゼ； 10U/mLのァ デノシンデアミナーゼ； 40U/mLのアルカリホスファターゼ）を各分析管に加え た。 この混合物を 37°Cで 10分間インキュベートした。 次に、 90°Cで 30分間加熱し て酵素を不活化した。 同様に内部組織ブランクを調製した。
2 )変換反応（ステップ 2—変換反応（AM P化反応）および
一変換ォプション反応（AT P化反応)）
クリ一ユング反応の各分析管に、 Cで調製した変換反応混合物（lOOmMのトリ ス- HC 1 (p H8.0) ； 2mMの MgCl2 ; 0.01%のゥシ血清アルブミン； 150mM の KC 1 ； 2mMのジチオトレイ ト一ノレ ； 40nMの AT P ； 3 mMのホスホエノ一 ルピルビン酸； 12mU/mLのホスホジエステラーゼ； 4.5U/mLのミオキナーゼ； 80U/mLのピルビン酸キナーゼ） 25 Lを添カ卩した。 室温でー晚インキュべーシ ヨンした。 分析管を 90°Cで 5分間加熱して反応を終了させた。
3 )サイクル反応（ステップ 3—検出サイクル反応 2 )
変換反応の各分析管に、 Dで調製したサイクル反応混合物（lOOmMのトリス -H C 1 (p H8.0) ； 2 の^¾。12 ； 0.01%のゥシ血清アルブミン； 3mMのフル ク トース ； 60U/mLのへキソキナーゼ） 25/xlを添カ卩した。 反応当たりの酵素濃度 が高いことを考慮して、 これらの反応物を 0°Cにセットして全てのアツセィ管の 開始時間を確実に同一にすることが重要であった。 37°Cで 2時間ィンキュベート (およそ 4000〜 10000サイクル）した。
4)検出反応 (ステップ 3—検出反応 2)
サイクル反応の各分析管に、 Eで調製した検出反応混合物（lOOmMのトリス- H C l、 ρΗ8·0； 3.2mMの EDTA； 0.6mMの NADP+； lU/mLのホスホグ ルコイソメラーゼフルク トース ； 0.5U/mLのグノレコース- 6-リン酸デヒ ドロゲ ナーゼ）125 /Z Lを添加した。 室温で 20分間反応後、 フルォロメータ一（Optical Technology Devises社、 ニュ一ヨーク）を使用して N AD P Hの最終濃度を測定 した。 フルォロメ一ターは、 10蛍光単位の読み取りが緩衝液（50mMのトリス- H C l、 pH8.0)900/ L中 lnmolの NADPHと等価になるようにセットした。 なお、 個々の分析過程は、 既知濃度の適当な基質を使用する内部対照を同時に 分析することにより確認した （例えば、 クリーニング反応をチェックするために AT Pを追加して使用し、 変換反応を評価するために AMP標準直線を使用し、 サイクル反応を評価するためには AT P標準直線を使用した）。
5)測定結果
340nmでの吸光測定によって c AMP標準品（0、 3.6、 7.2、 14.4, 21.6および 28.8pmol/20// L)から図 2に示される標準 c AMP直線が得られた。
また、 （1) の Aで調製した試料について、 追加的な薬剤を加えなかった対照 群およびィソプロテレノール刺激群中の c AMP含量を、 各試料のプレートの 1 0の溶離液に関し、 得られた標準 c AMP直線 (図 2)を用いて測定し、 cAM P 68 Opmol/lOOramプレートの実測値を得た。
本発明の方法、 免疫比色キット （アマシャム 'インターナショナル製） および 放射免疫測定キット （アマシャム 'インターナショナル製） を用いて c AMPを 測定した結果を図 3に示す。 c AMP含量の測定結果は、 公知の方法の放射活性 測定法により得られた結果とよく一致しており、 その差は通常の 5 %以下であつ た。
さらに、 c AMPの定量結果からアデニル酸シクラーゼ活性を、 本発明の方法、 放射免疫測定法、 および Salomon法により求めた。 その結果を図 4に示す。 アデ 二ル酸シクラーゼ活性は、 1分間あたりのタンパク質 lmgにおける c AMPの生 成量 （pmol) で示した。
実施例 3
1Mのトリス _HC 1 (p H8.0) 、 0.2Mの Mg C 12、 1Mの K2HP04、 0.1Mの AMP、 4000U/mLのアルカリホスファターゼ、 および 10mg/mLのグリ コーゲンホスホリラーゼの適量を採り、 水を加えて最終濃度が以下になるように、 クリーニング反応混合液を調製した。 表 6 ：クリーニング反応混合物
化合物 最終濃度
トリス— HC 1 (p H8.0) lOOmM
Mg C 12 2mM
K2HP04 5mM
AMP 0. ImM
ァノレカリホスファターゼ 20U/mL
グリコーゲンホスホリラーゼ 10/zg/mL
水 一
1Mのトリス— HC 1 (p H8.0) 、 0.1Mの Mg C 12、 1Mの K2HP04、 0.1Mの AMP、 0.1Mのジチオトレイ トール、 1 mMのグルコース一 1， 6—二 リン酸、 4%のゥシ血清アルブミン、 0.1Mの NADP、 10mg/mLのグリコ一ゲ ンホスホリラーゼ、 lOrag/mLのホスホダルコムターゼ、 および 5 mg/mLのダルコ ース一 6—リン酸デヒドロゲナ一ゼの適量を採り、 水を加えて最終濃度が以下と なるように、 変換反応混合物を調製した。 表 7 ：変換反応混合物
化合物 最終濃度
トリス- HC 1 (p H8.0) lOOmM
Mg C 12 2mM
K9HPO. 5mM
AMP 0. ImM
ジチォトレイ トール ImM
グゾレコース一 1， 6—二リン酸 4μΜ
ゥシ血清アルブミン 0.01%
NADP 0.2mM
グリコーゲンホスホリラーゼ 20/ g/mし
ホスホグルコムタ一ゼ 4/ g/mし
グルコース一 6—リン酸デヒ ドロゲナーゼ 2 g/mL
水 一
1) クリーニング反応 （ステップ 1一クリーニングオプション反応 2) 206 //Mのグリコーゲンを含有するグリコーゲン溶液を調製し、 12本の Pyrex製 分析管 （岩城硝子製： 10X57隨） に分注し （0、 20、 40および 80 μ Lを各 3 本） 、 蒸留水を加えて全量を 80// Lとした。 室温にて、 500// Lのクリーニング 反応混合液 （lOOmMのトリス- HC 1 (p H8.0) ； 2mMの M g C 12； 5mMの K 2HP04 ； 0. ImMの AMP ； 20U/mLのアルカリホスファタ一ゼ； 10/ g/mLの グリコーゲンホスホリラーゼ） を各分析管に加えた。 この混合物を 37°Cで 60分間 ィンキュベートした。
2) 検出反応 （ステップ 3—検出反応 1)
クリーニング反応の各分析管に、 変換反応混合物 （lOOmMのトリス _HC 1 ( p H8.0) ； 2mMの Mg C 1 2； 5mMの K2HP04 ； 0. ImMの AMP ； ImMの ジチオトレイ トール； 4/ Mのグルコース一 1， 6—二リン酸； 0.01%のゥシ血 清アルブミン； 0.2mMの NADP ； 20/ g/mLのグリコーゲンホスホリラーゼ； 4 g/mLのホスホダルコムタ一ゼ； 2 zg/mLのグルコース一 6—リン酸デヒ ドロ ゲナーゼ） 500 / Lを添カ卩した。 37°Cで 30分間インキュベーションした。 各分析 管につき励起波長 340nmにおける 460nmの蛍光波長を測定した。 その結果、 グリコ 一ゲン溶液中のダリコーゲンがすべてクリーニング反応により消失していること を確認した。
実施例 4 キレート剤による白濁防止効果
実施例 2のサイクル反応後の分析管に、 E D T Aを含まなレ、検出反応混合物 (ΙΟΟπ のトリス- HC1、 ρ Η8· 0； 0.6mMの N AD P+； 1 U/mLのホスホダル コィソメラ一ゼ； 0.5U/mLのグルコース- 6-リン酸デヒ ドロゲーゼ）125μ Lを 添カ卩し、 90°Cで 30分間加熱し、 酵素を失活させた。 試料液の白濁の程度を目視観 察した。 また、 実施例 2で得られた検出反応混合物添加溶液（ E D T A -室温で酵 素を失活させたもの）を対照とした。
その結果、 加熱失活の場合は試料溶液が白濁したのに対し、 EDTAを用いた 場合は、 試料溶液は澄明であった。
産業上の利用の可能性
本発明によって、 生物学的試料中の c AMP量またはアデニル酸シクラーゼ活 性を、 放射能試薬を使用しないで測定する方法が提供される。
即ち、 本発明によれば、 妨害物質である ATPや ADP、 AMPなどの内因性 非環状アデニンヌクレオチド類ゃグルコース一 6 -リン酸を酵素を用いたクリー ユング反応により選択的かつ効率的に除去できる。 そして、 試料中の c AMPを AMPに酵素的に変換した後、 AT Pに変換する。 そしてさらに、 AT Pをフル クト一ス一 6—リン酸を経由してグルコース一 6—リン酸に変換後、 NADPH に変換し、 この NADPH濃度を蛍光光度法で測定し、 c AMP濃度と相関させ ることによって、 有害な放射性物質を用いることなく、 酵素反応 '化学反応のみ で安全に c AMP量およびそれに対応するアデニル酸シクラーゼ活性を測定でき る。
特に本発明においては、 クリーニング反応に使用する酵素をアビラーゼ、 アル 力リホスファターゼおよぴァデノシンデァミナーゼに限定し、 さらにその濃度を 調整することにより、 操作を簡便なものとするともに、 反応時間を 1 Z 6〜1 Z 1 2と劇的に短縮させることに成功した。
c AM P量は、 細胞の栄養、 増殖、 分化、 適応状態に左右され敏感に変動する こと力 ら、 c AM P量を測定することによって、 細胞の生存度、 内分泌ホルモン 軸機能、 アデ二ル酸シクラーゼ活性、 ホスホジエステラーゼ活性を評価すること ができ、 これらの評価値は、 基礎医学および臨床医学分野において重要な指標と なり得る。
本発明の方法を用いることによって、 かかる c AM P量およびそれに対応する アデニル酸シクラーゼ活性の安全かつ高感度な測定が可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 生物学的試料中の内因性 ATP、 ADPおよび AMPからなる非環状アデ ニンヌクレオチド類および内因性グルコース- 6-リン酸をより迅速に除去する方 法であって、 生物学的試料を非環状アデニンヌクレオチド類およびグルコース- 6 -リン酸を除去するのに効果的な量のアビラ一ゼ、 アルカリホスファタ一ゼぉ よびアデノシンデァミナーゼを用いて処理することを特徴とする方法。
2. 生物学的試料中の c AM P量またはアデニル酸シクラーゼ活性の測定方法 であって、
クリーニング反応：生物学的試料を内因性 AT P、 ADPおよび AMPからな る非環状アデニンヌクレオチド類およびグルコース- 6-リン酸を除去するのに効 果的な量のァピラーゼ、 アルカリホスファターゼおよびアデノシンデァミナーゼ を用いて処理する工程、
変換反応：生物学的試料中の c AMPを AMPに酵素的に変換する工程、 検出反応：放射性試薬を用いることなく AM P量を測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
3. 上記クリーニング反応において、 上記試料にさらに、 有効量のグルコース ォキシダーゼ、 グリコーゲンホスホリラーゼおよびアル力リホスファタ一ゼを加 えて処理し、 上記試料から内因性グリコーゲンを酵素的に除去することを含む、 請求項 2記載の方法。
4. 上記変換反応が上記試料を有効量のホスホジエステラーゼによる処理によ り行われる、 請求項 2記載の方法。
5. c AMPから AMPへの上記変換反応の酵素が c AMPを変換させた後に キレート剤により不活性化される、 請求項 2記載の方法。
6. キレート剤が EDTAである、 請求項 5記載の方法。
7. 上記検出反応が、 添加された無機リン酸の存在下、 同じく添加されたグリ コーゲンをダリコーゲンホスホリラ一ゼと接触させて、 グルコース- 1-リン酸に 変換されることを含み、 そしてこの変換が試料に含まれる AMPによって in vitroで活性化されるものである、 請求項 2記載の方法。
8. 上記検出反応において、 さらに、 グルコース- 1-リン酸をグルコース- 6- リン酸に変換させるのに有効な量のホスホダルコムターゼで上記試料を処理し、 っレ、でグルコース一 6―リン酸を 6 -ホスホグルコノラクトンに変換するのに有 効な量のグルコース- 6-リン酸デヒドロゲナーゼおよび NAD P+で上記試料を 処理することによって、 グルコース- 1-リン酸を 6-ホスホグルコノラク トンお よび NAD PHに変換する、 請求項 7記載の方法。
9. 上記検出反応において、 さらに、 上記試料を水の存在下で加熱して、 6- ホスホダルコノラク トンを 6-ホスホダルコン酸に変換し、 ついでこの 6-ホスホ グルコン酸をリブロース- 5 -リン酸および N A D P Hに変換するのに有効な量の
NAD P +を添加することを含む、 請求項 8記載の方法。
1 0. 生物学的試料中の c AMP量またはアデ二ル酸シクラ一ゼ活性の測定方 法であって、
クリ一ユング反応：生物学的試料を、 上記試料中の c AMP以外の內因性非環 状アデニンヌクレオチド類、 および内因性グルコース- 6-リン酸を酵素的に除去 するのに有効な量のアビラーゼ、 アデノシンデアミナーゼおよびアルカリホスフ ァタ一ゼで処理する工程、
変換反応：生物学的試料中の c AMPを AT Pに酵素的に変換する工程、 検出反応： AT Pをフルクトース- 6 _リン酸に酵素的に変換し、 フルク ト一ス -6-リン酸を 6-ホスホダルコノラク トンおよび NAD PHに酵素的に変換後、 放射性物質を用いずに NAD PH濃度を測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
1 1. 上記クリーニング反応において、 さらに、 上記試料を有効量のダルコ一 スォキシダーゼ、 グリコーゲンホスホリラーゼおよびアル力リホスファタ一ゼで 処理し、 上記試料から内因性グリコーゲンを酵素的に除去することを含む、 請求 項 10記載の方法。
1 2. 上記検出反応において、 フルクトース- 6-リン酸を 6-ホスホダルコノ ラク トンおよび NAD PHに酵素的に変換後、 さらに、 引き続き反応混合物を加 熱し、 そして上記反応混合物に 6-ホスホダルコン酸デヒドロゲナーゼおよび N AD P +を添加することによって上記 6-ホスホグルコノラク小ンをリブロース - 5-リン酸および NADPHに変換することを含む、 請求項 10または 1 1記載 の方法。
1 3. 上記クリーニング反応の c AMP以外の内因性非環状アデ-ンヌクレオ チド類が、 ATP、 ADP、 AMPの 1種またはそれ以上の混合物である、 請求 項 10記載の方法。
14. 上記変換反応において、 c AMPから AT Pの変換が有効量のホスホジ エステラーゼ、 ミォキナーゼおよびピルビン酸キナーゼの組み合わせで行われる、 請求項 10記載の方法。
1 5. 上記検出反応において、 AT Pからフルクト一ス- 6-リン酸の変換がへ キソキナーゼおよびピルビン酸キナーゼの組み合わせで行われる、 請求項 10記 載の方法。
1 6. 上記検出反応において、 フルク ト一ス- 6-リン酸から 6-ホスホダルコ ノラク トンおよび NAD PHの変換がホスホダルコイソメラ一ゼおよびダルコ一 ス- 6 -リン酸デヒドロゲナ一ゼの組み合わせで行われる、 請求項 10記載の方法。
1 7. 上記検出反応において、 AT Pをフルク トースー 6—リン酸に変換する 酵素が非環状アデニンヌクレオチド類の変換後にキレ一ト剤により不活性化され る、 請求項 10記載の方法。
1 8. キレート剤が EDTAである、 請求項 17記載の方法。
1 9. 上記生物学的試料が、 哺乳動物組織である、 請求項 1、 2または 1 0記 載の方法。
20. 上記生物学的試料が、 生物学的液体である請求項 1、 2または 10記載 の方法。
21. 生物学的試料中の c AMP量またはアデ二ル酸シクラーゼ活性の測定用 キットであって、 （1)生物学的試料中の内因性 AT P、 ADPおよび AMPから なる非環状アデ-ンヌクレオチド類および内因性グルコース- 6-リン酸除去する のに効果的な量のァビラーゼ、 アル力リホスファターゼおよびアデノシンデァミ ナーゼを含むクリーニング反応用バイアルキット、
(2)生物学的試料中の c AM Pを AM Pに酵素的に変換するための有効量のホ スホジエステラーゼを含む変換反応用バイアルキット、 および
(3)グリコ一ゲン力、らグルコース- 1 -リン酸への変換のためのグリコーゲン、 無機リン酸、 グリコーゲンホスホリラーゼ、 グルコース- 1-リン酸からダルコ一 ス- 6-リン酸への変換のためのホスホダルコムターゼ、 およびグルコース一 6— リン酸から 6-ホスホダルコノラクトンおよび NAD PHへの変換のためのグル コース- 6 -リン酸デヒドロゲナーゼおよび NAD P+を含む検出反応用バイアル キット
を含むことを特徴とするキット。
22. 生物学的試料中の c AMP量またはアデ-ル酸シクラーゼ活性の測定用 キットであって、 （1)生物学的試料中の c AMP以外の内因性非環状アデニンヌ クレオチド類、 および内因性グルコース- 6-リン酸を酵素的に除去するのに有効 な量のアビラーゼ、 アデノシンデァミナ—ゼおよびアル力リホスファタ一ゼを含 むクリ一ニング反応用バイアルキット、
(2)生物学的試料中の c AMPから AT Pの酵素的変換のための有効量のホス ホジエステラーゼ、 ATP、 ミオキナーゼ、 ホスホェノールピルビン酸およびピ ルビン酸キナーゼを含む変換反応用バイアルキット、 および
(3) AT Pからフルク トース -6-リン酸の変換のためのフルクトースぉよびへ キソキナーゼ、 フルクトース- 6-リン酸から 6-ホスホダルコノラク トンおよび NAD PHの変換へのためのホスホグ^^コィソメラーゼ、 グノレコース- 6-リン酸 デヒ ドロゲナーゼおよび NAD P +を含む検出反応用バイアルキット
を含むことを特徴とするキット。
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