WO2023074687A1 - ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法 - Google Patents

ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法 Download PDF

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guanine
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pyrophosphate
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成 植田
信一 酒瀬川
竜也 平田
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旭化成ファーマ株式会社
学校法人加計学園
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods

Definitions

  • the present invention relates to methods for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate using hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, measuring compositions and reagent kits for measuring these, and methods for amplifying them.
  • Pyrophosphate is a diphosphate molecule and is a substrate or product in a wide variety of enzymatic reactions. It is also a reaction product of the DNA synthase reaction and is toxic to living organisms, so it is decomposed into inorganic phosphorus by pyrophosphorolytic enzymes.
  • a method for measuring pyrophosphate includes a bioluminescence method using luciferase.
  • pyrophosphate is converted to ATP using pyruvate phosphate dikinase (see Patent Document 1) or converted to ATP using ATP sulfurylase (see Patent Document 2), followed by luminescence by luciferase. .
  • Patent Document 3 a method using hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase and xanthine dehydrogenase/oxidase (see Patent Document 3), a method using pyruvate orthophosphate dikinase, nicotinamide nucleotide adenyltransferase and dehydrogenase (see Patent Document 4) ) are known.
  • Patent Documents 1 and 2 are high-sensitivity detection by luminescence
  • Patent Documents 3 and 4 are spectroscopic detection.
  • Patent Document 4 utilizes an amplification reaction by an enzymatic cycling method for the purpose of increasing the sensitivity of measurement.
  • Pyrophosphate is also a by-product in PCR, which is a nucleic acid amplification reaction.
  • PCR nucleic acid amplification reaction.
  • electrophoresis is performed, and ethidium bromide is used for detection by ultraviolet irradiation.
  • a labeled probe obtained by binding an intercalator or a fluorescent substance to amplified DNA is used to detect the generated fluorescence in real time.
  • a fluorescent dye that intercalates with amplified double-stranded DNA for example, SYBR TM Green I (manufactured by Takara Bio Inc.), detects the intensity of fluorescence that binds to the double-stranded DNA. The presence or absence of amplification of the target nucleic acid and its amount can be measured.
  • luminescence using an intercalator has a problem of carcinogenicity, and must be handled with great care.
  • there are problems such as the need for a fluorescence detection device.
  • Non-Patent Document 1 an example of detection of food poisoning bacteria in which pyrophosphate was detected by spectroscopic analysis using the method described in Patent Document 3 has been reported.
  • the amount of pyrophosphate produced in the positive case was 200 to 400 ⁇ M (see Non-Patent Document 1).
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • a method of precipitating the generated pyrophosphate as magnesium pyrophosphate and detecting it as turbidity has also been reported (Non-Patent Document 2). reference).
  • Various methods other than the PCR and LAMP methods have been developed as nucleic acid amplification methods, but pyrophosphate is accumulated in all of them.
  • Phosphoribosyl pyrophosphate is a kind of sugar phosphate, is produced from ribose-5-phosphate by ribose phosphate pyrophosphokinase, and participates in de novo purine synthesis pathway and salvage pathway reactions. ing. In the salvage pathway, it serves as a donor of phosphoribosyl groups as a substrate for phosphoribosyltransferase.
  • Lesch-Nyhan syndrome which is known as a genetic disease
  • PRPP in blood cells is known to be elevated (see Non-Patent Document 3).
  • orotidyl acid produced by orotate phosphoribosyltransferase is combined with orotidyl acid decarboxylase, and the decrease in orotate is measured by the decrease in absorbance at 295 nm (see Non-Patent Document 4).
  • There is a method for measuring radioactivity see Non-Patent Document 5.
  • IMAP inosinic acid
  • HGPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • IMP dehydrogenase was reported, and researched by NovoCIB.
  • Non-Patent Document 3 a method of detecting derivatized phosphoribosylamine by combining an ion-exchange resin and GC-MS using an amidophosphoribosyltransferase mutant enzyme
  • Non-Patent Document 7 a method of detecting derivatized phosphoribosylamine by combining an ion-exchange resin and GC-MS using an amidophosphoribosyltransferase mutant enzyme
  • Non-Patent Document 8 It has been reported that it is responsible for the Interconversion between the corresponding nucleotides IMP and GMP (see Non-Patent Document 8). It is said that human HGPRT does not act on xanthine, but some enzymes derived from microorganisms such as Escherichia coli are known to act on not only hypoxanthine and guanine but also xanthine. There is also a report that an enzyme that uses xanthine as a substrate does not act on xanthine due to a single amino acid substitution (see Non-Patent Document 9). In addition, a chimeric enzyme of human-derived and Plasmodium falciparum-derived HGPRT has also been produced (see Non-Patent Document 10).
  • the enzymatic cycling method disclosed in the aforementioned Patent Document 4 was initially developed as a highly sensitive measurement method that amplifies a trace amount of coenzyme such as NAD as another signal.
  • various enzymatic cycling methods capable of real-time detection have been developed that target substrates themselves rather than coenzymes, and have been put to practical use as reagents that can be applied to automated clinical biochemical analyzers.
  • a method for measuring total bile acid using only one type of enzyme that utilizes the reversible reactivity of dehydrogenase has been developed (see Patent Document 5), and is a reagent that enables real-time detection and can be applied to general-purpose automated analyzers for clinical testing. has been put into practical use.
  • the signal increases over time according to the amount of enzyme added, so there is the advantage that sensitivity can be adjusted by controlling the amount of enzyme.
  • Japanese Patent No. 4782528 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-135098 Japanese Patent No. 4162187 Japanese Patent No. 5570731 Japanese Patent Publication No. 6-73479 Japanese Patent No. 6450394 Japanese Patent No. 6487711
  • Patent Documents 1 and 2 require a luminescence detection device, and the method of Patent Document 4 has problems such as complicated operations.
  • PRPP radioactive polymer spectrometry
  • an object of the present invention is to detect pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate, which has high sensitivity, can be detected by a general-purpose device such as a spectrophotometer or a biochemical automatic analyzer for clinical examination, and is easy to operate. It is to provide measurement methods, measurement compositions and reagent kits for these measurements, and methods for amplifying these.
  • the present inventors aimed to develop a highly sensitive and simple method that can be detected with a spectrophotometer or a biochemical automatic analyzer for clinical testing. Then, focusing on the reversible reactivity of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, obtaining the enzyme by genetic recombination technology, adding xanthine dehydrogenase to detect hypoxanthine produced in the presence of IMP and guanine, When an enzymatic cycling reaction was attempted, it was surprisingly found that the cycling reaction proceeded and pyrophosphate or PRPP could be measured with high sensitivity and simplicity.
  • the present invention provides the following methods for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate, measuring compositions and reagent kits for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate, and pyrophosphate or phosphor A method for amplifying ribosyl pyrophosphate is provided.
  • a method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate comprising the following steps (1) to (3).
  • (1) In the presence of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase that catalyzes the forward reaction of generating pyrophosphate (PPi) from phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) and the reverse reaction, the substrate A for the forward reaction and the substrate A for the reverse reaction
  • the substrate A is guanine ( Gua)
  • said compound A' is guanine 5'-monophosphate (GMP)
  • said substrate B is inosine 5'-monophosphate (IMP) or xanthosine 5'-monophosphate (XMP)
  • said compound B' is Hypoxanthine or Xanthine
  • the enzymatic cycling reaction in step (1) is represented by the following formula (II)
  • step (2) the amount of change in the signal corresponding to the amount of change in any one or more of guanine, GMP, IMP and hypoxanthine, or the amount of change in any one or more of guanine, GMP, XMP and xanthine
  • step (2) is a step of detecting a change in signal corresponding to an increase in GMP and/or hypoxanthine, or GMP and/or xanthine.
  • the step (2) corresponds to the increased amount of hypoxanthine or xanthine using a detection enzyme that does not have substrate specificity for guanine but has substrate specificity for hypoxanthine or xanthine.
  • the measurement method according to [2] above which is a step of detecting the amount of change in the signal.
  • the detection enzyme is xanthine dehydrogenase.
  • step (1) the substrate A is hypoxanthine
  • the compound A' is IMP
  • the substrate B is GMP or XMP
  • the compound B' is guanine or xanthine
  • the enzymatic cycling reaction in step (1) is represented by the following formula (III)
  • step (2) the amount of change in the signal corresponding to the amount of change in any one or more of hypoxanthine, IMP, GMP and guanine, or the amount of change in any one or more of hypoxanthine, IMP, XMP and xanthine
  • the measurement method according to the above [1] which is a step of detecting the amount of change in the signal corresponding to.
  • step (2) is a step of detecting a change in signal corresponding to an increase in IMP and/or guanine or IMP and/or xanthine.
  • step (2) using a detection enzyme that has no substrate specificity for GMP and XMP but has substrate specificity for IMP, the amount of signal change corresponding to the increase in IMP.
  • the measurement method according to [6] above which is a step of detecting the [9]
  • the measuring method according to [8] above, wherein the detection enzyme is IMP dehydrogenase.
  • step (2) hypoxanthine does not have substrate specificity, but guanine does not have substrate specificity.
  • the measuring method according to [6] above which is the step of detecting.
  • the substrate A is xanthine
  • the compound A' is XMP
  • the substrate B is GMP or IMP
  • the compound B' is guanine or hypoxanthine
  • the enzymatic cycling reaction in step (1) is represented by the following formula (IV)
  • step (2) the amount of change in the signal corresponding to the amount of change in any one or more of xanthine, XMP, GMP and guanine, or the amount of change in any one or more of xanthine, XMP, IMP and hypoxanthine
  • the measurement method according to [1] above which is a step of detecting the amount of change in the corresponding signal.
  • step (2) is a step of detecting a change in signal corresponding to an increase in XMP and/or guanine or XMP and/or hypoxanthine.
  • a detection enzyme that has no substrate specificity for xanthine but has substrate specificity for guanine is used to detect the amount of change in the signal corresponding to the increased amount of guanine.
  • the measuring method according to [11] above, which is the step of [14] A measurement composition for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate, comprising at least the following (1) to (3).
  • hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (2) guanine (3) IMP or XMP [15]
  • (4) xanthine dehydrogenase having no substrate specificity for guanine and hypoxanthine and/or xanthine substrate specificity (5) NAD or thioNAD [16]
  • hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (2) guanine (3) IMP or XMP [17]
  • a method for amplifying pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate comprising the step (1) of any one of [1] to [13] above.
  • a method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate that has high sensitivity can be detected by general-purpose devices such as spectrophotometers and biochemical automatic analyzers for clinical tests, and is easy to operate , measurement compositions and reagent kits for measuring these, and methods for amplifying them.
  • FIG. 4 is a diagram showing measurement results of Example 1.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 2;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 3;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 4;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 5;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 6;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 7;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 8;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 9;
  • FIG. 10 is a diagram showing measurement results of Example 10;
  • FIG. 12 is a diagram showing the calculation results of pyrophosphate concentration in Example 11;
  • this embodiment a form for carrying out the present invention (hereinafter referred to as "this embodiment") will be described in detail.
  • the present invention is not limited to the following embodiments, and can be implemented in various modifications within the scope of the gist thereof, and includes those embodiments.
  • the EC numbers (Enzyme Commission numbers) in this specification are numbers confirmed as of July 18, 2021.
  • the method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate includes the following steps (1) to (3).
  • (1) In the presence of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase that catalyzes the forward reaction of generating pyrophosphate (PPi) from phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) and the reverse reaction, the substrate A for the forward reaction and the substrate A for the reverse reaction A step of contacting a substrate B with a sample and performing an enzymatic cycling reaction of the following formula (I) (2) any one of the substrate A, the compound A' produced by the action of the substrate A, the substrate B, and the compound B' produced by the action of the substrate B, which is a compound different from the substrate A.
  • formula (I) any one of the substrate A, the compound A' produced by the action of the substrate A, the substrate B, and the compound B' produced by the action of the substrate B, which is a compound different from the substrate A.
  • the compound B′ produced by the action of the substrate B must be a different compound from the substrate A, as described above.
  • Examples of the above measurement methods include the following measurement methods.
  • the substrate A is guanine (Gua)
  • the compound A' is guanine 5'-monophosphate (GMP)
  • the substrate B is Inosine 5'-monophosphate (IMP) or xanthosine 5'-monophosphate (XMP)
  • said compound B' is Hypoxanthine or Xanthine
  • the enzymatic cycling reaction in step (1) is represented by the following formula (II)
  • step (2) the amount of change in the signal corresponding to the amount of change in any one or more of guanine, GMP, IMP and hypoxanthine, or the amount of change in any one or more of guanine, GMP, XMP and xanthine
  • a measurement method that is a step of detecting the amount of change in the corresponding signal.
  • the substrate A is hypoxanthine
  • the compound A' is IMP
  • the substrate B is GMP or XMP
  • the compound B' is guanine or xanthine
  • the enzymatic cycling reaction in step (1) is represented by the following formula (III)
  • step (2) the amount of change in the signal corresponding to the amount of change in any one or more of hypoxanthine, IMP, GMP and guanine, or the amount of change in any one or more of hypoxanthine, IMP, XMP and xanthine
  • a measurement method that is a step of detecting the amount of change in a signal corresponding to .
  • the substrate A is xanthine
  • the compound A' is XMP
  • the substrate B is GMP or IMP
  • the compound B' is is guanine or hypoxanthine
  • the enzymatic cycling reaction in step (1) is represented by the following formula (IV)
  • step (2) the amount of change in the signal corresponding to the amount of change in any one or more of xanthine, XMP, GMP and guanine, or the amount of change in any one or more of xanthine, XMP, IMP and hypoxanthine
  • a measurement method that is a step of detecting the amount of change in the corresponding signal.
  • the object to be measured in this embodiment is pyrophosphate and/or phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP). Pyrophosphate and PRPP can be measured separately or simultaneously. If pyrophosphate and PRPP are mixed in the sample and you want to quantify only one of them, convert the non-measurable substance to another substance using a known method prior to the enzymatic cycling reaction. etc. should be processed.
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • HGPRT in this embodiment
  • HGPRT that can be used in the present embodiment is preferably two or more compounds selected from 6-oxopurine and nicotinamide.
  • Enzymes that can use two or more compounds as substrates (corresponding to substrate A and compound B' in the present embodiment) and that exhibit reversible reactivity with respect to each reaction using them as substrates. is not limited and can be used.
  • an enzyme called xanthine phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.22) also corresponds to the above enzyme.
  • HGPRT (EC 2.4.2.8), for example, E. coli, Methanococcus genus (e.g., Methanococcus vannielii, Methanococcus voltae, Methanococcus maripaludis), Pyrococcus genus (e.g., Pyrococcus horikoshii), Thermus genus (e.g., Thermus scotodus ctus, Thermus parvatiensis, Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Thermus oshimai, Thermus brockianus), Since there are many enzymes whose amino acid sequences have been reported from the genus Acetivibrio (eg, Acetivibrio ethanolginens, Hungateiclostridium thermocellum), they can be easily obtained by synthesizing genes corresponding to those amino acid sequences. In addition, many human-derived enzymes have been produced by gene recombination technology using Escherichia coli as a host.
  • animal cells or microorganisms should be cultured and the enzymes should be isolated and purified according to standard methods. For example, after culturing a microorganism, it is possible to obtain a product with increased purity to a practical level by combining known purification methods such as column chromatography. It can also be obtained by culturing transformed cells such as Escherichia coli into which the gene has been inserted. Alternatively, the gene encoding the enzyme protein can be isolated by a conventional method and expressed in a suitable host using gene recombination technology. Furthermore, the HGPRT in this embodiment may be genetically modified for the purpose of improving enzymatic properties.
  • Substrate A and compound B' in this embodiment are preferably 6-oxopurine.
  • the term "6-oxopurine” refers to a purine having an oxo group at the 6-position of the purine skeleton, preferably hypoxanthine, guanine, or xanthine. It also includes its derivatives and analogues synthesized in
  • Substrate B and compound A' in this embodiment are preferably purine mononucleotides.
  • Purine mononucleotide is a binding substance between 6-oxopurine and ribose-5-phosphate, preferably IMP, GMP, and XMP. It also includes derivatives and analogues that are synthetically synthesized.
  • the combination of 6-oxopurine and a purine mononucleotide different from 6-oxopurine is appropriately selected from the following, and these are compared with the measurement object (sample).
  • a large excess should be allowed to exist.
  • IMP or XMP may be selected as a pair of purine nucleotides
  • hypoxanthine is present in an excess amount
  • GMP or XMP may be selected as a pair of purine nucleotides.
  • GMP or IMP may be selected as the paired purine nucleotide when xanthine is present in excess.
  • a preferred combination is guanine and IMP.
  • sample in this embodiment is not particularly limited, it is preferably liquid.
  • liquid samples include, but are not limited to, biological samples such as serum, urine, and erythrocyte lysate, and nucleic acid amplification solutions after nucleic acid amplification reactions such as PCR.
  • biological samples such as serum, urine, and erythrocyte lysate
  • nucleic acid amplification solutions after nucleic acid amplification reactions such as PCR.
  • the sample can be dissolved in a soluble solvent and the resulting solution can be used as the sample.
  • Step (1) in this embodiment a known method may be referred to perform the enzymatic cycling reaction of step (1). Specifically, excess amounts, for example, 0.025 to 10 mmol/L, preferably 0.05 to 5 mmol/L, of the first purine and the second purine mononucleotide are added to the reaction solution, and the mixture is pH-buffered. Add 20-200 mmol/L of agent. The pH of the reaction solution may be appropriately selected so that the reaction proceeds efficiently. Add 0.5 mmol/L or more and 10 mmol/L or less. Then, the sample and HGPRT are added thereto to initiate the reaction. Although the reaction temperature is not particularly limited, it may be carried out at 25 to 42°C, for example. It is preferably 30 to 37 degrees.
  • the necessary amount of HGPRT to be added to the reaction solution to initiate the enzymatic cycling reaction in step (1) may be determined, for example, by referring to a known method, calculating the cycling rate, and considering the reaction time. For example, 0.2 to 1000 U/mL, preferably 0.8 to 250 U/mL, but not limited thereto.
  • the step of detecting the amount of change in the signal in the step (2) includes reducing the amount of selected purines and/or purine nucleotides, or purine mononucleotides and/or purines produced therefrom.
  • the step (2) is preferably a step of detecting GMP and/or hypoxanthine, or a change in signal corresponding to an increase in GMP and/or xanthine.
  • the step (2) is preferably a step of detecting a change in signal corresponding to an increase in IMP and/or guanine or IMP and/or xanthine.
  • the step (2) is preferably a step of detecting a change in signal corresponding to an increase in XMP and/or guanine or XMP and/or hypoxanthine.
  • HPLC methods As the step of detecting the amount of signal change, known HPLC methods, enzymatic methods, etc. can be used, but are not limited to these.
  • a chelating agent or the like may be added to the reaction solution to terminate the enzymatic reaction, and then a reverse phase column or the like may be appropriately selected for quantification.
  • Information on HPLC methods is readily available from resin manufacturers.
  • an enzyme for detection that has substrate specificity for the generated purine but no substrate specificity for different pre-existing purines, or a detection enzyme that has substrate specificity for the generated purine mononucleotide but does not have substrate specificity for pre-existing different purine mononucleotides using a detection enzyme, the amount of change in the signal corresponding to the increased amount of these generated purines and/or purine mononucleotides can be detected.
  • a preferred method includes a method of detecting the amount of change in signal using a detection enzyme that has substrate specificity for the purine to be produced but does not have substrate specificity for different purines that already exist.
  • a detection enzyme that does not have substrate specificity for guanine but has substrate specificity for hypoxanthine or xanthine is used to correspond to the increased amount of hypoxanthine or xanthine. It is preferable to detect the amount of change in signal.
  • GMP and XMP do not have substrate specificity, but IMP uses a detection enzyme that has substrate specificity. is preferably detected.
  • a detection enzyme that has no substrate specificity for xanthine but has substrate specificity for guanine is used to detect the amount of change in the signal corresponding to the increased amount of guanine. preferably.
  • xanthine dehydrogenase EC 1.2.1.37
  • thioNAD or NAD a method of detecting a change in signal corresponding to an increase in hypoxanthine and/or xanthine
  • IMP dehydrogenase EC 1.1.1.205
  • a method of detecting the amount of change in signal corresponding to the increase in IMP, or guanine deaminase EC 3.5 .4.3
  • xanthine dehydrogenase IMP dehydrogenase
  • guanine deaminase are commercially available and readily available. They can be easily obtained by culturing and purifying them according to conventional methods with reference to the literature on these, and when the gene sequences of the enzymes that produce them are known, the genes can be obtained from cDNA or synthetic DNA and assembled. It can also be produced as a recombinant.
  • Step (3) in this embodiment a known method may be used to calculate the amount of pyrophosphate or PRPP based on the amount of change in the signal detected in the step (2). .
  • the reaction time is defined (for example, 5 minutes to 8 minutes after the start of the reaction), and a reference substance (calibrator) with a known concentration is used as a control.
  • a reference substance calibrbrator
  • a sodium pyrophosphate or potassium pyrophosphate solution can be used when calculating the amount of pyrophosphate, and a solution of pentasodium salt of PRPP can be used when calculating the amount of PRPP.
  • a measuring composition for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate contains at least the following (1) to (3).
  • composition for measurement according to the present embodiment preferably further contains (4) to (5) below.
  • Mg salt etc. may be contained.
  • another measuring composition for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to this embodiment B contains at least the following (1B) to (3B).
  • composition for measurement according to Embodiment B preferably further contains (4B) to (5B) below. Furthermore, Mg salt etc. may be contained. (4B) IMP dehydrogenase with no substrate specificity for hypoxanthine and substrate specificity for IMP (5B) NAD or thioNAD
  • a measurement composition for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to another embodiment C contains at least the following (1C) to (3C).
  • composition for measurement according to Embodiment C preferably further contains (4C) to (5C) below. Furthermore, Mg salt etc. may be contained.
  • the amount of each component in the composition for measurement can be appropriately determined, for example, within the following range.
  • These measurement compositions according to the present embodiment can be used in the method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to the present embodiment.
  • a reagent kit for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate comprises at least the following (1) to (3).
  • the reagent kit according to the present embodiment further comprises (4) to (5) below.
  • Mg salt or the like may be provided.
  • a reagent kit for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to another embodiment B comprises at least the following (1B) to (3B).
  • the reagent kit according to Embodiment B further comprises the following (4B) to (5B). Furthermore, Mg salt or the like may be provided.
  • a reagent kit for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to another embodiment C comprises at least the following (1C) to (3C).
  • the reagent kit according to Embodiment C further comprises the following (4C) to (5C).
  • Mg salt or the like may be provided.
  • the amount of each component in the reagent kit may be an amount that allows the method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to the present embodiment to be performed, and at least one measurement, preferably two or more measurements can be performed. Have as much as you can.
  • reagent kits may be divided into individual components, may be divided into a plurality of reagents (compositions), or may be combined into one. .
  • each of the above components may be appropriately divided into two or three or more reagents.
  • guanine, NAD and Mg salts can be assigned to the first reagent and IMP, xanthine dehydrogenase and HGPRT to the second reagent. Any of these components can also be included redundantly in each separate reagent.
  • reagent kits according to the present embodiment can be used for the method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to the above-described present embodiment.
  • the method for amplifying pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to the present embodiment comprises step (1) of the method for measuring pyrophosphate or phosphoribosyl pyrophosphate according to the present embodiment.
  • the details of step (1) are as described above.
  • Example 1 pyrophosphate measurement using E. coli-derived HGPRT (Reaction solution) 40 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.5) 1mmol/L NAD 2mmol/L IMP 0.1 mmol/L Guanine 0.3 mmol/L MnCl2 1.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 0.1 u/mL HGPRT (E. coli-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • FIG. 1 shows the measurement results plotted with the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution concentration on the X axis and the amount of change in absorbance on the Y axis.
  • Example 2 Measurement of pyrophosphate using E. coli-derived HGPRT: change of metal salt
  • Reaction solution 40 mmol/L BES-NaOH (pH 8.0) 1mmol/L NAD 2mmol/L IMP 0.1 mmol/L guanine 1 mmol/L MgCl2 or 0.5 mmol/L NiCl2 1.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 0.1 u/mL HGPRT (E. coli-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • Example 3 (pyrophosphate measurement using Thermus-derived HGPRT: XMP/Gua) (Reaction solution) 40 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.25) 1mmol/L NAD 1 mmol/L xanthosine monophosphate (XMP) 0.1 mmol/L Guanine 0.3 mmol/L MnCl2 1.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 2u/mL HGPRT (Thermus genus-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • XMP and guanine were used for nucleotides and purine bases, and a recombinant enzyme derived from the genus Thermus was used for HGPRT.
  • 0.02 mL of an aqueous solution of 0, 0.5, 1.0, 1,5, 2.0, 2.5 mmol/L of sodium pyrophosphate decahydrate (import source: Kanto Kagaku) per 1 mL of the above reaction solution In addition, the reaction was allowed to proceed at 37 degrees. After the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution was added, the amount of change in absorbance at 340 nm for 2 minutes from 3 minutes to 5 minutes was measured.
  • FIG. 3 shows the measurement results plotted with the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution concentration on the X axis and the amount of change in absorbance on the Y axis.
  • Example 4 Measurement of pyrophosphate using HGPRT derived from the genus Acetivibrio (Reaction solution) 40 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.25) 1mmol/L NAD 2mmol/L IMP 0.1 mmol/L Guanine 1 mmol/L MgCl2 1.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 0.6u/mL HGPRT (Acetivibrio-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • FIG. 4 shows the measurement results plotted with the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution concentration on the X axis and the amount of change in absorbance on the Y axis.
  • Example 5 (Pyrophosphate measurement using Activibrio-derived HGPRT) (First reagent) 40 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.5) 2.6mmol/L NAD 0.15 mmol/L Guanine 1.5 mmol/L MgCl2 (Second reagent) 40 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.5) 8mmol/L IMP 6.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 2.35u/mL HGPRT (Acetivibrio-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • FIG. 5 shows the measurement results plotted with the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution concentration on the X axis and the amount of change in absorbance on the Y axis.
  • Example 6 (Pyrophosphate measurement using Acetivibrio-derived HGPRT: measurement using an automatic analyzer) (First reagent) 10 mmol/L MES-NaOH (pH 8.5) 2.6mmol/L NAD 0.15 mmol/L Guanine 1.5 mmol/L MgCl2 (Second reagent) 108 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.5) 8mmol/L IMP 6.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 2.35u/mL HGPRT (Acetivibrio-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • Hitachi 7080 type automatic analyzer using 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20 ⁇ mol / L sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution as a sample, added amount of sample / first reagent / second reagent was set to 3 ⁇ L/120 ⁇ L/40 ⁇ L and measured in 10 min mode. The amount of change in absorbance at 17-20 points was calculated as photometric points, and is shown in FIG.
  • Example 7 (Pyrophosphate measurement using Activibrio-derived HGPRT: counterrotation reaction) (Reaction solution) 40 mmol/L BES-NaOH (pH 8.0) 1mmol/L NAD 2mmol/L Hypoxanthine 1mmol/L MgCl2 0.1 mol/L KCl 1 u/mL IMP dehydrogenase (derived from Bacillus subtilis, Asahi Kasei Pharma Co., Ltd. prototype) 1.05u/mL HGPRT (Acetivibrio-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma Co., Ltd. prototype)
  • the above reaction solution containing hypoxanthine was prepared.
  • GMP is added after preheating the sample and the reaction solution, and in order to specifically detect the generated IMP, IMP dehydrogenase is used to monitor the absorbance change at 340 nm based on the generation of reduced NAD. bottom. That is, 0.025 mL of sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution of 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2 mmol / L was added to 1 mL of the above reaction solution, and Prewarmed. After that, 0.01 mL of 20 mmol/L GMP solution was added to initiate the reaction.
  • FIG. 7 shows the measurement results plotted with the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution concentration on the X axis and the amount of change in absorbance on the Y axis.
  • the cycling rate per unit enzyme was calculated and compared with the results in Example 4. While it was 0.6 times/u during the cycling reaction in the direction of hypoxanthine ⁇ IMP, it was 17 times/u in the direction of IMP ⁇ hypoxanthine. Although the reaction efficiency was low, it was confirmed that the cycling reaction proceeded.
  • Hitachi 7080 type automatic analyzer With Hitachi 7080 type automatic analyzer, 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 ⁇ mol / L phosphoribosyl pyrophosphate pentasodium (PRPP) (manufactured by Cayman) aqueous solution was used as a sample, and sample / The amount of reagent 1/reagent added was set to 3 ⁇ L/120 ⁇ L/40 ⁇ L, and measurement was performed in the 10-minute mode. The amount of change in absorbance at 17-20 points was calculated as photometric points, and is shown in FIG.
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate pentasodium
  • Example 9 (Measurement of pyrophosphate and phosphoribosyl pyrophosphate) (First reagent) 40 mmol/L MES-NaOH (pH 8.5) 2.6mmol/L NAD 0.15 mmol/L Guanine 1.5 mmol/L MgCl2 2u/mL pyrophosphatase (derived from yeast: manufactured by Sigma-Aldlich) ( ⁇ ) (Second reagent) 40 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.5) 8mmol/L IMP 6.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 2.35u/mL HGPRT (Acetivibrio-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype) 40 mmol/L dipotassium hydrogen phosphate (manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • 5-Phospho-D-ribosyl pyrophosphate pentasodium salt (Sigma-Aldrich) and sodium pyrophosphate decahydrate were used to prepare 5, 10, 15, 20 and 25 ⁇ M aqueous solutions, respectively, and 1 Two series of samples were prepared, one being a 1:1 mixture and the other being a 1:1 mixture of pyrophosphate aqueous solution and water of each concentration (PRPP/pyrophosphate mixed solution and pyrophosphate solution). Two types of first reagent were prepared, one to which pyrophosphatase (derived from yeast, Sigma-Aldrich) was added at a concentration of 2 u/mL in the first reagent and the other to which no pyrophosphatase was added.
  • pyrophosphatase derived from yeast, Sigma-Aldrich
  • a second reagent having the above composition was prepared.
  • Dipotassium hydrogen phosphate (40 mM) was added to the second reagent to stop the activity of pyrophosphatase.
  • 0.75 mL of the first reagent containing no pyrophosphatase (PPase) was mixed with 0.02 mL of each of the two types of samples, and the mixture was heated at 37° C. for 5 minutes.
  • 0.25 mL of the second reagent was added to initiate a cycling reaction at 37° C., and the change in absorbance for 1 minute from 3 to 4 minutes after the addition of the second reagent was measured.
  • Example 10 (Pyrophosphate measurement using Activibrio-derived HGPRT) (First reagent) 10 mmol/L MES-NaOH (pH 5.8) 2.6mmol/L NAD 0.095mmol/L Guanine 1.5mmol/L MgCl2 2.6mmol/L IMP (Second reagent) 160 mmol/L Bicine-NaOH (pH 8.5) 0.5mmol/L MgCl2 6.6 u/mL xanthine dehydrogenase (XDHII, manufactured by Asahi Kasei Pharma) 0.05% BSA 5.6u/mL HGPRT (Acetivibrio-derived recombinant, Asahi Kasei Pharma prototype)
  • FIG. 10 shows the measurement results plotted with the sodium pyrophosphate decahydrate aqueous solution concentration on the X axis and the amount of change in absorbance on the Y axis. At this time, it was confirmed that the cycling rate was about 100 cycles/minute and 0.5 ⁇ mol/L of pyrophosphate could be detected.
  • Example 11 Measurement of pyrophosphate contained in PCR reaction product using Activibrio-derived HGPRT
  • a PCR reaction was performed using the multicloning site (228 bp) of 1 ⁇ g of plasmid pBluescript II KS(+), M13-20 and M13reverse as primers, and KOD-plus-neo as DNA polymerase to obtain a PCR reaction product.
  • the number of PCR cycles was 5, 10, 15, 20 and 30 times.
  • the concentrations of pyrophosphate contained in samples with 15, 20, and 30 PCR cycles were 8.9 ⁇ mol/L, 28 ⁇ mol/L, and 205 ⁇ mol, respectively, compared with the pyrophosphate measurement results of known concentrations. /L (Fig. 11).

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Abstract

感度が高く、汎用装置で検出ができ、操作が簡便なピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法を提供する。　下記工程（１）～（３）を含むピロリン酸(ＰＰｉ)又はホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）の測定方法。 （１）ＰＲＰＰからＰＰｉを生成する正反応及びその逆反応を触媒するヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下、正反応の基質Ａ及び逆反応の基質Ｂを試料に接触させて、下記式（Ｉ）の酵素サイクリング反応を行なう工程（２）基質Ａ、基質Ａが作用して生じた化合物Ａ'、基質Ｂ及び基質Ｂが作用して生じた基質Ａとは異なる化合物である化合物Ｂ'のいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程 （３）検出されたシグナルの変化量に基づき、ＰＰｉ又はＰＲＰＰの量を算出する工程

Description

ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法
　本発明は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを用いたピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法に関する。
　ピロリン酸（ＰＰｉ）は、２リン酸分子であり、多種多様な酵素反応における基質あるいは産生物である。また、ＤＮＡ合成酵素反応の反応生成物でもあり、生体にとっては毒性を示すため、ピロリン酸分解酵素により無機リンに分解される。
　ピロリン酸の測定法として、ルシフェラーゼを用いた生物発光法が挙げられる。この方法は、ピロリン酸をピルビン酸リン酸ジキナーゼを用いてＡＴＰに変換（特許文献１参照）、又はＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換（特許文献２参照）した後、ルシフェラーゼにより発光させるものである。また、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用する方法（特許文献３参照）、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ニコチンアミドヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ及び脱水素酵素を用いた方法（特許文献４参照）などが知られている。これらのうち、特許文献１、２は発光による高感度検出、特許文献３、４は分光光学的な検出である。その中でも、特許文献４は測定の高感度化を目的として酵素サイクリング法による増幅反応を利用している。
　また、ピロリン酸は、核酸増幅反応であるＰＣＲにおける副生成物である。ＰＣＲ反応において、遺伝子増幅物そのものを検出するには種々の方法がある。例えばＰＣＲ反応後、電気泳動を実施し、エチジウムブロマイドを用い紫外線照射により検出する。また、リアルタイムＰＣＲの場合は、増幅されたＤＮＡにインターカレーターや蛍光物質を結合させた標識プローブを用い、生じた蛍光をリアルタイムに検出する。インターカレーターを利用した検出方法では、増幅した二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素、例えばＳＹＢＲＴＭ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（タカラバイオ社製）が二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光強度を検出することにより、目的とする核酸の増幅の有無及びその量を測定することができる。しかしながら、インターカレーターを用いた発光は発がん性の問題があり、取り扱いには非常に注意を要する。また、蛍光検出装置が必要であるなどの課題を有する。
　上記の測定方法は、ＰＣＲ反応後のピロリン酸測定に応用されている。このうち、特許文献３に記載の方法を用い、分光分析によりピロリン酸を検出した食中毒菌の検出例が報告され、例えばＰＣＲ陰性の場合のピロリン酸（ＰＰｉ）生成量は６０μＭ以下だったのに対し、陽性の場合のピロリン酸生成量は２００～４００μＭであった（非特許文献１参照）。また、核酸増幅反応を定温で実施できるｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法において、生成されるピロリン酸をマグネシウムピロリン酸として沈殿させ、濁度として検出する方法も報告されている（非特許文献２参照）。核酸増幅法としては、ＰＣＲやＬＡＭＰ法以外の種々の方法が開発されているが、いずれもピロリン酸が蓄積される。
　ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）は糖リン酸の一種であり、リボース－５－リン酸からリボースリン酸ピロホスホキナーゼによって作られ、プリン体のｄｅ　ｎｏｖｏ合成経路、サルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）経路の反応に関与している。サルベージ経路では、ホスホリボシルトランスフェラーゼの基質としてホスホリボシル基の供与体となる。遺伝子疾患として知られているレッシュ－ナイハン（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙｈａｎ）症候群では、血球中のＰＲＰＰが上昇することが知られている（非特許文献３参照）。その測定方法としては、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼにより生成したオロチジル酸をオロチジル酸デカルボキシラーゼと組合せ、オロト酸の減少を２９５ｎｍの吸光度減少で測定する方法（非特許文献４参照）、生成した二酸化炭素の放射活性を測定する方法がある(非特許文献５参照)。また、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）（ＥＣ　２．４．２．８）を用い、生成されたイノシン酸（ＩＭAＰ）をＩＭＰデヒドロゲナーゼを用いて測定する定量法が報告され、ＮｏｖｏＣＩＢより研究用試薬として市販されている。更に、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ変異体酵素を用い、イオン交換樹脂とＧＣ－ＭＳを組合わせ、誘導体化したホスホリボシルアミンを検出する方法（非特許文献３参照）や、ＬＣ－ＭＳによる方法（非特許文献６参照）も報告されている。ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（ＨＭＴ）におけるヒト全血での実測値は、４０８±１０５ [ｎＭ]と極めて低濃度であり(非特許文献７参照)、高感度測定法が求められている。
　上記ＨＧＰＲＴは、プリンヌクレオチドのサルベージ合成経路にかかわり、原核生物から真核生物に渡り、多くの生物に見出されている酵素である。多くの起源から見出された酵素について、反応機構を始め、アミノ酸配列や立体構造についての報告がある。また種々の変異酵素も作製されている。該酵素は次の反応を触媒する。
ヒポキサンチン＋ＰＲＰＰ＝ＩＭＰ＋ピロリン酸
グアニン＋ＰＲＰＰ＝ＧＭＰ＋ピロリン酸
　ヒトの場合、該酵素の欠損によるＸ連鎖性劣性遺伝病であるレッシュ－ナイハン症候群ではプリンのリサイクルが阻害されるため、さまざまな代謝されない物質が細胞内に蓄積するようになり、代表的には、尿酸が細胞内に代謝されない物質として蓄積することが知られている。本酵素はヒポキサンチン、グアニン両者を基質として、生体内ではヌクレオチド生成方向に反応が傾いていることが知られている。また、逆反応も進行し、定常状態の速度解析によって、ＩＭＰとピロリン酸を基質とするヒポキサンチン及びＰＲＰＰ生成方向の反応（ＩＭＰ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）が数μＭ程度のグアニンで活性化されることが見出され、対応するヌクレオチドＩＭＰとＧＭＰ間の相互変換(Ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ)を担っているとの報告がある（非特許文献８参照）。ヒトのＨＧＰＲＴはキサンチンには作用しないと言われているが、大腸菌など微生物由来酵素の中には、ヒポキサンチン、グアニンだけではなくキサンチンにも作用するものが知られている。キサンチンを基質とする酵素について、１アミノ酸置換によりキサンチンに作用しなくなったという報告もある(非特許文献９参照)。また、ヒト由来と熱帯熱マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来ＨＧＰＲＴのキメラ酵素も作製されている(非特許文献１０参照)。
　前述の特許文献４で開示されるような酵素サイクリング法は、当初ＮＡＤなど微量の補酵素を他のシグナルとして増幅する高感度測定法として開発された。臨床検査分野において、補酵素ではなく基質そのものを測定対象とする、リアルタイム検出が可能な酵素サイクリング法が種々開発され、臨床生化学自動分析装置へ適応可能な試薬として実用化されている。例えばデヒドロゲナーゼの可逆反応性を利用した１種類の酵素のみを用いた総胆汁酸測定法が開発され（特許文献５参照）、リアルタイム検出が可能で汎用の臨床検査用自動分析装置に適応可能な試薬が実用化されている。
　また、近年、別位の塩基からなる二種類のヌクレオチドの存在下、クレアチンキナーゼやピルビン酸キナーゼなど１種類のキナーゼを用いて酵素サイクリング反応を進行させ、それぞれのキナーゼに対する基質を高感度に定量する方法の開発も報告されている（特許文献６参照）。また、グアニンとイノシンの共存下、プリンヌクレオチドホスホリラーゼを用いた無機リンの高感度測定法も報告されている（特許文献７参照）。
　酵素サイクリング法において基質又は生成物を定量するに際しては、添加する酵素量に応じてシグナルが経時的に増加するため、酵素量を制御することにより感度を調節できるという利点がある。
特許第４７８２５２８号公報 特開２００３－１３５０９８号公報 特許第４１６２１８７号公報 特許第５５７０７３１号公報 特公平６－７３４７９号公報 特許第６４５０３９４号公報 特許第６４８７７１１号公報
Jpn. J. Food Microbiol., 2004, Vol. 21, No.2, p. 138-144 Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, Vol.289, p.150-154 Gout Nucleic Acid Metabolism., 2010, Vol.34, p.57 Agric Biol Chem., 1966, Vol.30, p.99-106 Clin Chim Acta., 1977, Vol.78, p.209-216 Gout Nucleic Acid Metabolism., 2012, Vol.36, p.41 "PRPP", MeTaBoard(Metabolite Database powered by HMT), 2010年12月14日, Human Metabolome Technologies(HMT), ［2021年10月12日検索］，インターネット＜URL：https://humanmetabolome.com/metaboard/prpp/＞ J.Biol.Chem., 1979, Vol.254, No.20, p.10232-10236 Biochemistry, 1998, Vol.37, p.16612-16619 Proteins, 2008, Vol.73, p.1010-1020
　前述のように、ピロリン酸やＰＲＰＰの測定法は、従来から種々知られている。この中で高感度に測定できる方法としては、例えばピロリン酸の場合、特許文献１、特許文献２及び特許文献４に開示された方法が挙げられる。
　しかしながら、特許文献１、２は発光検出装置が必要であり、また特許文献４の方法は操作が煩雑であるなどの課題がある。また、ＰＲＰＰの場合、血清中での濃度は健常人で１μＭ未満と報告されているため、高感度化が望まれる。そのため質量分析法が用いられるようになってきたが、装置自体が高価である。
　このように、従来のピロリン酸及びＰＲＰＰの測定法において、感度の高い方法は特殊な機器が必要であるか、操作が煩雑である欠点があり、一方、操作が簡便な方法は感度が低い欠点がある。
　そこで、本発明の目的は、感度が高く、かつ、分光光度計や臨床検査用の生化学自動分析装置などの汎用装置で検出ができ、かつ、操作が簡便なピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく、分光光度計や臨床検査用の生化学自動分析装置で検出できる高感度で簡便な方法の開発を目指した。そして、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの可逆反応性に着目し、該酵素を遺伝子組換え技術により取得し、ＩＭＰ及びグアニンの共存下、生成されるヒポキサンチンを検出するためにキサンチンデヒドロゲナーゼを加え、酵素サイクリング反応を試みたところ、驚くべきことに、サイクリング反応が進行し、ピロリン酸又はＰＲＰＰを高感度、かつ簡便に測定できることを見出した。また、ＩＭＰ及びグアニンの代わりにＧＭＰとヒポキサンチンを共存させた場合においても、逆方向に酵素サイクリング反応が進行することを確認し、本発明を完成するに至った。前述のようにＨＧＰＲＴを用いたＰＲＰＰの測定法が報告されているが化学量論的な定量にすぎず、本発明のような酵素の可逆反応性は利用されていない。本発明の酵素サイクリング反応について、及び該反応によりピロリン酸やＰＲＰＰが定量できることについてはこれまで知られていない。
　本発明は、上記目的を達成するために、下記のピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物及び試薬キット、並びにピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の増幅方法を提供する。
［１］下記の工程（１）～（３）を含む、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法。
（１）ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）からピロリン酸(ＰＰｉ)を生成する正反応及びその逆反応を触媒するヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下、前記正反応の基質Ａ及び前記逆反応の基質Ｂを試料に接触させて、下記式（Ｉ）の酵素サイクリング反応を行なう工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
（２）前記基質Ａ、前記基質Ａが作用して生じた化合物Ａ’、前記基質Ｂ及び前記基質Ｂが作用して生じた前記基質Ａとは異なる化合物である化合物Ｂ’のいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程
（３）検出されたシグナルの変化量に基づき、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の量を算出する工程
［２］前記基質Ａがグアニン（Ｇｕａ）であり、前記化合物Ａ’がグアニン５’－モノリン酸（ＧＭＰ）であり、前記基質Ｂがイノシン５’－モノリン酸（ＩＭＰ）又はキサントシン５’－モノリン酸（ＸＭＰ）であり、前記化合物Ｂ’がヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）又はキサンチン（Ｘａｎｔｈｉｎｅ）であり、
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（II）であり、
　前記工程（２）が、グアニン、ＧＭＰ、ＩＭＰ及びヒポキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はグアニン、ＧＭＰ、ＸＭＰ及びキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［１］に記載の測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
［３］前記工程（２）が、ＧＭＰ及び／又はヒポキサンチン、又はＧＭＰ及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［２］に記載の測定方法。
［４］前記工程（２）が、グアニンには基質特異性を有さないが、ヒポキサンチン又はキサンチンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、ヒポキサンチン又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［２］に記載の測定方法。
［５］前記検出用酵素がキサンチンデヒドロゲナーゼである前記［４］に記載の測定方法。
［６］前記基質Ａがヒポキサンチンであり、前記化合物Ａ’がＩＭＰであり、前記基質ＢがＧＭＰ又はＸＭＰであり、前記化合物Ｂ’がグアニン又はキサンチンであり、
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（III）であり、
　前記工程（２）が、ヒポキサンチン、ＩＭＰ、ＧＭＰ及びグアニンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はヒポキサンチン、ＩＭＰ、ＸＭＰ及びキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［１］に記載の測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
［７］前記工程（２）が、ＩＭＰ及び／又はグアニン、又はＩＭＰ及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［６］に記載の測定方法。
［８］前記工程（２）が、ＧＭＰ及びＸＭＰには基質特異性を有さないが、ＩＭＰには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、ＩＭＰの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［６］に記載の測定方法。
［９］前記検出用酵素がＩＭＰデヒドロゲナーゼである前記［８］に記載の測定方法。
［１０］前記工程（２）が、ヒポキサンチンには基質特異性を有さないが、グアニンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、グアニンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［６］に記載の測定方法。
［１１］前記基質Ａがキサンチンであり、前記化合物Ａ’がＸＭＰであり、前記基質ＢがＧＭＰ又はＩＭＰであり、前記化合物Ｂ’がグアニン又はヒポキサンチンであり、
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（IV）であり、
　前記工程（２）が、キサンチン、ＸＭＰ、ＧＭＰ及びグアニンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はキサンチン、ＸＭＰ、ＩＭＰ及びヒポキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［１］に記載の測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
［１２］前記工程（２）が、ＸＭＰ及び／又はグアニン、又はＸＭＰ及び／又はヒポキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［１１］に記載の測定方法。
［１３］前記工程（２）が、キサンチンには基質特異性を有さないが、グアニンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、グアニンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、前記［１１］に記載の測定方法。
［１４］下記の（１）～（３）を少なくとも含有する、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物。
（１）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２）グアニン
（３）ＩＭＰ又はＸＭＰ
［１５］下記の（４）～（５）をさらに含有する前記［１４］に記載の測定用組成物。
（４）グアニンに基質特異性を有さず、ヒポキサンチン及び/又はキサンチンに基質特異性を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ
（５）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
［１６］下記の（１）～（３）を少なくとも備えた、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための試薬キット。
（１）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２）グアニン
（３）ＩＭＰ又はＸＭＰ
［１７］下記の（４）～（５）をさらに備えた前記［１６］に記載の試薬キット。
（４）グアニンに基質特異性を有さず、ヒポキサンチン及び／又はキサンチンに基質特異性を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ
（５）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
［１８］前記［１］～［１３］のいずれか１つに記載の工程（１）からなるピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の増幅方法。
　本発明によれば、感度が高く、かつ、分光光度計や臨床検査用の生化学自動分析装置などの汎用装置で検出ができ、かつ、操作が簡便なピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法を提供することができる。
実施例１の測定結果を示す図である。 実施例２の測定結果を示す図である。 実施例３の測定結果を示す図である。 実施例４の測定結果を示す図である。 実施例５の測定結果を示す図である。 実施例６の測定結果を示す図である。 実施例７の測定結果を示す図である。 実施例８の測定結果を示す図である。 実施例９の測定結果を示す図である。 実施例１０の測定結果を示す図である。 実施例１１におけるピロリン酸濃度の計算結果を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができ、それらの実施形態も包含する。なお、本明細書中のＥＣ番号（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ）は、２０２１年７月１８日現在において確認した番号である。
〔ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法〕
　本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法は、下記の工程（１）～（３）を含む。
（１）ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）からピロリン酸(ＰＰｉ)を生成する正反応及びその逆反応を触媒するヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下、前記正反応の基質Ａ及び前記逆反応の基質Ｂを試料に接触させて、下記式（Ｉ）の酵素サイクリング反応を行なう工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
（２）前記基質Ａ、前記基質Ａが作用して生じた化合物Ａ’、前記基質Ｂ及び前記基質Ｂが作用して生じた前記基質Ａとは異なる化合物である化合物Ｂ’のいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程
（３）検出されたシグナルの変化量に基づき、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の量を算出する工程
　なお、本発明の課題を解決するための酵素サイクリング反応を成立させるには、上記の通り、基質Ｂが作用して生じた化合物Ｂ’が基質Ａとは異なる化合物である必要がある。
　上記測定方法としては、例えば、下記の測定方法が挙げられる。
〔第１の具体例〕
　上記本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法において、前記基質Ａがグアニン（Ｇｕａ）であり、前記化合物Ａ’がグアニン５’－モノリン酸（ＧＭＰ）であり、前記基質Ｂがイノシン５’－モノリン酸（ＩＭＰ）又はキサントシン５’－モノリン酸（ＸＭＰ）であり、前記化合物Ｂ’がヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）又はキサンチン（Ｘａｎｔｈｉｎｅ）であり、
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（II）であり、
　前記工程（２）が、グアニン、ＧＭＰ、ＩＭＰ及びヒポキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はグアニン、ＧＭＰ、ＸＭＰ及びキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
〔第２の具体例〕
　上記本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法において、前記基質Ａがヒポキサンチンであり、前記化合物Ａ’がＩＭＰであり、前記基質ＢがＧＭＰ又はＸＭＰであり、前記化合物Ｂ’がグアニン又はキサンチンであり、
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（III）であり、
　前記工程（２）が、ヒポキサンチン、ＩＭＰ、ＧＭＰ及びグアニンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はヒポキサンチン、ＩＭＰ、ＸＭＰ及びキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
〔第３の具体例〕
　上記本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法において、前記基質Ａがキサンチンであり、前記化合物Ａ’がＸＭＰであり、前記基質ＢがＧＭＰ又はＩＭＰであり、前記化合物Ｂ’がグアニン又はヒポキサンチンであり、
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（IV）であり、
　前記工程（２）が、キサンチン、ＸＭＰ、ＧＭＰ及びグアニンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はキサンチン、ＸＭＰ、ＩＭＰ及びヒポキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
（本実施形態における測定対象）
　本実施形態における測定対象は、ピロリン酸及び／又はホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）である。なお、ピロリン酸、ＰＲＰＰはそれぞれ別々に測定できるし、同時に測定することもできる。試料中にピロリン酸とＰＲＰＰが混在している場合に、１種だけを定量したい時は、酵素サイクリング反応に先立ち、公知の方法を用いて、非測定対象物を別の物質に変換しておくなどの処理をすればよい。
（本実施形態におけるＨＧＰＲＴ）
　本実施形態に用いることのできるＨＧＰＲＴは、好ましくは６－オキソプリン、ニコチンアミドから選ばれる２つ以上の化合物、例えば前記具体例の場合には６－オキソプリンであるヒポキサンチン、グアニン、キサンチンのいずれか２つ以上の化合物を基質（本実施形態における基質Ａ及び化合物Ｂ’に相当）にすることができる酵素であって、それらを基質とする各反応について可逆反応性を示す酵素であれば特に起源は限定されず用いることができる。ＨＧＰＲＴ以外にもキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ　２．４．２．２２）と呼ばれる酵素も上記酵素に該当する。
　ＨＧＰＲＴ（ＥＣ　２．４．２．８）については、例えば微生物由来酵素としてＥ．ｃｏｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ属（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｐａｒｖａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属（例えば、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ　ｅｔｈａｎｏｌｇｉｇｎｅｎｓ、Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）など由来のアミノ酸配列が報告されている酵素が多数あるため、それらのアミノ酸配列に対応する遺伝子を合成することによって容易に取得することができる。また、ヒト由来酵素についても大腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術により、変異酵素が多数作製されている。
　上記酵素を取得するには、動物細胞や微生物を培養し、常法に従い該酵素を単離精製すればよい。例えば微生物を培養後、カラムクロマトグラフィ法等の公知の精製法を組み合わせて、実用レベルまで純度を高めたものを取得することができる。また、遺伝子を組み込んだ大腸菌等の形質転換細胞を培養して用いて取得することもできる。また、当該酵素タンパク質をコードする遺伝子を常法により単離し、遺伝子組み換え技術を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって取得することもできる。更に、本実施形態におけるＨＧＰＲＴは、酵素特性を向上する目的等で遺伝的に改変されたものであってもよい。
（本実施形態における基質及び化合物）
　本実施形態における基質Ａ及び化合物Ｂ’は、６－オキソプリンであることが好ましい。「６－オキソプリン」とは、プリン骨格の６位にオキソ基を有するプリンを示し、好ましくはヒポキサンチン、グアニン、キサンチンであるが、天然に存在する６－オキソプリンにとどまらず、化学的あるいは酵素的に合成されたその誘導物質、類似物質も含まれる。
　本実施形態における基質Ｂ及び化合物Ａ’は、プリンモノヌクレオチドであることが好ましい。「プリンモノヌクレオチド」とは、前記６－オキソプリンとリボース－５－リン酸との結合物質であり、好ましくはＩＭＰ、ＧＭＰ、ＸＭＰであるが、天然に存在する物質にとどまらず、化学的あるいは酵素的に合成されたその誘導物質、類似物質も含まれる。
　これらにＨＧＰＲＴが作用するかの確認は、背景技術の項で挙げた方法の他に、例えば公知のプリンヌクレオチドやプリン塩基についてのＨＰＬＣ法による検出法がいくつか報告されているので、これら方法を使用して反応生成物を確認することで可能である。
　本実施形態に係る測定方法において、６－オキソプリンと、この６－オキソプリンとは別異のプリンモノヌクレオチドの組合せとしては、以下の中から適宜選択し、これらを測定対象物（試料）に比べて大過剰存在させればよい。具体的には、グアニンを過剰量存在させる場合は、ＩＭＰ又はＸＭＰを対のプリンヌクレオチドとして選択すればよく、またヒポキサンチンを過剰量存在させる場合は、ＧＭＰ又はＸＭＰを対のプリンヌクレオチドとして選択すればよく、更にキサンチンを過剰量存在させる場合は、ＧＭＰ又はＩＭＰを対のプリンヌクレオチドとして選択すればよい。尚、好ましい組み合わせとしては、グアニンとＩＭＰが挙げられる。
（本実施形態における試料）
　本実施形態における試料としては、特に限定されないが液体であることが望ましい。液体試料として、血清、尿、赤血球溶血液などの生体試、ＰＣＲなどの核酸増幅反応後の核酸増幅液など挙げられるがこれに限定されるものではない。試料が液体試料でない場合、該試料を溶解可能な溶媒に溶解して、得られた溶液を上記試料として用いることができる。
（本実施形態における工程（１））
　本実施形態に係る測定方法において、前記工程（１）の酵素サイクリング反応を行なうには、例えば公知の方法を参考にすればよい。具体的には、過剰量、例えば０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌの第一のプリン、及び第二のプリンモノヌクレオチドを反応液中に加え、これにｐＨ緩衝剤２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌを加える。反応液のｐＨは反応が効率的に進行する条件を適宜選べばよいが、通常は６．５～９．０の範囲から選択し、ＨＧＰＲＴの活性化に必要なマグネシウムやマンガンなどの金属塩を０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下添加する。そして、これに前記試料及びＨＧＰＲＴを加えて反応を開始すればよい。反応温度は特に限定されないが、例えば２５～４２度で行えばよい。好ましくは３０～３７度である。
　前記工程（１）の酵素サイクリング反応を開始させるために反応液に加えるＨＧＰＲＴの必要量は、例えば公知の方法を参考に、サイクリング率を計算し、反応時間を考慮して決めればよい。例えば０．２～１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．８～２５０Ｕ／ｍＬであるが、これに限定されない。
（本実施形態における工程（２））
　本実施形態に係る測定方法において、前記工程（２）のシグナルの変化量を検出する工程は、選択したプリン及び／又はプリンヌクレオチドの減少量、又はこれらから生成されたプリンモノヌクレオチド及び／又はプリンの増加量のどちらの変化量を検出してもよいが、好ましくは生成されたプリンモノヌクレオチド及び／又はプリンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程であるが、これに限定されない。
　例えば、上記第１の具体例では、前記工程（２）が、ＧＭＰ及び／又はヒポキサンチン、又はＧＭＰ及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程であることが好ましい。
　また、上記第２の具体例では、前記工程（２）が、ＩＭＰ及び／又はグアニン、又はＩＭＰ及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程であることが好ましい。
　また、上記第３の具体例では、前記工程（２）が、ＸＭＰ及び／又はグアニン、又はＸＭＰ及び／又はヒポキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程であることが好ましい。
　シグナルの変化量を検出する工程としては、公知のＨＰＬＣ法、酵素法等を用いることができるがこれに限定されない。ＨＰＬＣ法を用いる場合は、キレート剤などを反応液に添加して酵素反応を終了させてから、逆相カラム等を適宜選択して定量すればよい。ＨＰＬＣ法についての情報は、樹脂メーカーから簡単に入手できる。また、酵素法としては、生成するプリンには基質特異性を有するが、予め存在する別異のプリンには基質特異性を有さない検出用酵素、又は生成するプリンモノヌクレオチドには基質特異性を有するが、予め存在する別異のプリンモノヌクレオチドには基質特異性を有さない検出用酵素を用いて、これら生成されたプリン及び／又はプリンモノヌクレオチドの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する方法が挙げられる。好ましくは、生成するプリンには基質特異性を有するが、予め存在する別異のプリンには基質特異性を有さない検出用酵素を用いてシグナルの変化量を検出する方法が挙げられる。例えば、上記第１の具体例では、グアニンには基質特異性を有さないが、ヒポキサンチン又はキサンチンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、ヒポキサンチン又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出することが好ましい。また、上記第２の具体例では、ＧＭＰ及びＸＭＰには基質特異性を有さないが、ＩＭＰには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、ＩＭＰの増加量に対応するシグナルの変化量を検出することが好ましい。また、上記第３の具体例では、キサンチンには基質特異性を有さないが、グアニンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、グアニンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出することが好ましい。
　さらに好ましくは、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．１．３７）を用いて、チオＮＡＤ又はＮＡＤの存在下、ヒポキサンチン及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する方法、又はＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．２０５）を用いて、水とチオＮＡＤ又はＮＡＤの存在下、ＩＭＰの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する方法、又はグアニンデアミナーゼ（ＥＣ　３．５．４．３）を用いて、生じたアンモニアを既知の方法、例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．４．１．３）を用いて検出する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。これらキサンチンデヒドロゲナーゼ、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ及びグアニンデアミナーゼは、市販されており容易に入手できる。これらに関する文献を参考に常法に従い培養、精製することにより容易に取得することができるし、これらを生産する酵素の遺伝子配列が公知の場合は、ｃＤＮＡや合成ＤＮＡなどから遺伝子を取得し、組換え体として生産することもできる。
（本実施形態における工程（３））
　本実施形態に係る測定方法の前記工程（３）において、前記工程（２）で検出されたシグナルの変化量に基づき、ピロリン酸又はＰＲＰＰの量を算出するには、公知の方法を用いればよい。具体的にはこれに限定されないが、次のようにすればよい。すなわち、本実施形態の酵素サイクリング反応において、反応時間を規定し（例えば反応開始後５分目から８分目など）、濃度が既知の基準となる物質（キャリブレーター）を対照において、キャリブレーターの変化物に対応するシグナルの変化量を測定することによって試料中の被検物質の量を計算することができる。キャリブレーターとしては例えば、ピロリン酸の量を算出する場合にはピロリン酸ナトリウムやカリウム溶液を、ＰＲＰＰの量を算出する場合はＰＲＰＰ５ナトリウム塩などの溶液を用いることができる。
〔ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物〕
　本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物は、下記の（１）～（３）を少なくとも含有する。
（１）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２）グアニン
（３）ＩＭＰ又はＸＭＰ
　本実施形態に係る測定用組成物は、下記の（４）～（５）をさらに含有することが好ましい。さらにＭｇ塩等を含有していてもよい。
（４）グアニンに基質特異性を有さず、ヒポキサンチン及び／又はキサンチンに基質特異性を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ
（５）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
　また、別の本実施形態Ｂに係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物は、下記の（１Ｂ）～（３Ｂ）を少なくとも含有する。
（１Ｂ）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２Ｂ）ヒポキサンチン
（３Ｂ）ＧＭＰ又はＸＭＰ
　本実施形態Ｂに係る測定用組成物は、下記の（４Ｂ）～（５Ｂ）をさらに含有することが好ましい。さらにＭｇ塩等を含有していてもよい。
（４Ｂ）ヒポキサンチンに基質特異性を有さず、ＩＭＰに基質特異性を有するＩＭＰデヒドロゲナーゼ
（５Ｂ）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
　また、別の本実施形態Ｃに係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物は、下記の（１Ｃ）～（３Ｃ）を少なくとも含有する。
（１Ｃ）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２Ｃ）キサンチン
（３Ｃ）ＧＭＰ又はＩＭＰ
　本実施形態Ｃに係る測定用組成物は、下記の（４Ｃ）～（５Ｃ）をさらに含有することが好ましい。さらにＭｇ塩等を含有していてもよい。
（４Ｃ）キサンチンに基質特異性を有さず、グアニンに基質特異性を有するグアニンデアミナーゼ
（５Ｃ）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
　測定用組成物中の各成分の量は、例えば下記の範囲内で適宜決めることができる。
（１、１Ｂ、１Ｃ）ＨＧＰＲＴ：０．２～１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．８～２５０Ｕ／ｍＬ
（２）グアニン：０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌ
（３）ＩＭＰ又はＸＭＰ：０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌ
（４）キサンチンデヒドロゲナーゼ：０．２～１０００ｕ／ｍＬ、好ましくは０．８～２５０ｕ／ｍＬ
（５、５Ｂ、５Ｃ）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ：０．２～２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ
（２Ｂ）ヒポキサンチン：０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌ
（３Ｂ）ＧＭＰ又はＸＭＰ：０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌ
（４Ｂ）ＩＭＰデヒドロゲナーゼ：０．２～１０００ｕ／ｍＬ、好ましくは０．８～２５０ｕ／ｍＬ
（２Ｃ）キサンチン：０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌ
（３Ｃ）ＧＭＰ又はＩＭＰ：０．０２５～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５～５ｍｍｏｌ／Ｌ
（４Ｃ）グアニンデアミナーゼ：０．２～１０００ｕ／ｍＬ、好ましくは０．８～２５０ｕ／ｍＬ
　これらの本実施形態に係る測定用組成物は、上記の本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法に使用できる。
〔ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための試薬キット〕
　本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための試薬キットは、下記の（１）～（３）を少なくとも備える。
（１）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２）グアニン
（３）ＩＭＰ又はＸＭＰ
　本実施形態に係る試薬キットは、下記の（４）～（５）をさらに備えることが好ましい。さらにＭｇ塩等を備えていてもよい。
（４）グアニンに基質特異性を有さず、ヒポキサンチン及び／又はキサンチンに基質特異性を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ
（５）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
　また、別の本実施形態Ｂに係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための試薬キットは、下記の（１Ｂ）～（３Ｂ）を少なくとも備える。
（１Ｂ）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２Ｂ）ヒポキサンチン
（３Ｂ）ＧＭＰ又はＸＭＰ
　本実施形態Ｂに係る試薬キットは、下記の（４Ｂ）～（５Ｂ）をさらに備えることが好ましい。さらにＭｇ塩等を備えていてもよい。
（４Ｂ）ヒポキサンチンに基質特異性を有さず、ＩＭＰに基質特異性を有するＩＭＰデヒドロゲナーゼ
（５Ｂ）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
　また、別の本実施形態Ｃに係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための試薬キットは、下記の（１Ｃ）～（３Ｃ）を少なくとも備える。
（１Ｃ）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（２Ｃ）キサンチン
（３Ｃ）ＧＭＰ又はＩＭＰ
　本実施形態Ｃに係る試薬キットは、下記の（４Ｃ）～（５Ｃ）をさらに備えることが好ましい。さらにＭｇ塩等を備えていてもよい。
（４Ｃ）キサンチンに基質特異性を有さず、グアニンに基質特異性を有するグアニンデアミナーゼ
（５Ｃ）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
　試薬キット中の各成分の量は、上記の本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法を実施できる量を備えていればよく、少なくとも１回分、好ましくは２回分以上の測定が可能な量を備える。
　これらの本実施形態に係る試薬キットは、個々の成分ごとに分けられていてもよいし、複数の試薬（組成物）に分けられていてもよいが、すべてが一つにまとまっていてもよい。例えば、上記各成分を適宜二つ又は三つ以上に分けた試薬に振り分けてもよい。例えば、グアニン、ＮＡＤ及びＭｇ塩を第１試薬に、ＩＭＰ、キサンチンデヒドロゲナーゼ及びＨＧＰＲＴを第２試薬に振り分けることができる。これらの成分はいずれも、それぞれ分けられた試薬に重複して含むこともできる。
　これらの本実施形態に係る試薬キットは、上記の本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法に使用できる。
〔ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の増幅方法〕
　本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の増幅方法は、上記の本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法の工程（１）からなる。工程（１）の詳細については、前述のとおりである。
　これらの本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の増幅方法は、上記の本実施形態に係るピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法に使用できる。
　以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１（大腸菌由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定）
（反応液）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
０．３ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｎＣｌ２
１.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
０．１ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（大腸菌由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　上記反応液１ｍＬに対し、０、５０、１００、１５０、２００、２５０μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物（輸入元：関東化学）水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７度にて反応をさせた。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を添加後、３分目から４分目までの１分間の３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図１に示す。
実施例２（大腸菌由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定：金属塩の変更）
（反応液）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＢＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２又は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮｉＣｌ２
１.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
０．１ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（大腸菌由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　上記反応液１ｍＬに対し、０、５０、１００、１５０、２００、２５０μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物（輸入元：関東化学）水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７度にて反応をさせた。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を添加後、３分目から５分目までの２分間の３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。金属塩として１ｍＭ塩化マグネシウム又は０．５ｍＭ塩化ニッケルを共存させたそれぞれの場合につき、ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図２に示す。
実施例３（Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定：ＸＭＰ／Ｇｕａ）
（反応液）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．２５）
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
１ｍｍｏｌ／Ｌ　キサントシンモノリン酸（ＸＭＰ）
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
０．３ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｎＣｌ２
１.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
２ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　ヌクレオチドとプリン塩基にＸＭＰとグアニンを、また、ＨＧＰＲＴはＴｈｅｒｍｕｓ属由来組換え体酵素を用いた。上記反応液１ｍＬに対し、０、０．５、１．０、１，５、２．０、２．５ｍｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物（輸入元：関東化学）水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７度にて反応をさせた。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を添加後、３分目から５分目までの２分間の３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図３に示す。
実施例４（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定）
（反応液）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．２５）
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
１.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
０．６ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　上記反応液１ｍＬに対し、０、１０、２０、３０、４０、１００μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７度にて反応をさせた。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を添加後、３分目から４分目までの１分間の３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図４に示す。
実施例５（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定）
（第１試薬）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
２．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
（第２試薬）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
６.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
２．３５ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　上記第１試薬０．７５ｍＬに対し、０、５、１０、２０、３０、４０、５０μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７度にて５分間加温した。そののち、上記第２試薬０．２５ｍＬを加え、３７度にてサイクリング反応を開始し、第２試薬添加後２分目から３分目までの１分間の吸光度変化量を測定した。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図５に示す。
　また、各濃度のピロリン酸ナトリウムから２分子のＮＡＤＨが生じたときの３４０ｎｍにおける理論吸光度をＮＡＤＨの分子吸光係数を６３００（Ｌ・ｃｍ－１・ｍｏｌ－１）として次式にしたがい計算し、併せて図５にプロットした（Ｃは各濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とした）。本発明のシグナル強度は、理論吸光度の約３０倍であった。
（計算式）
理論吸光度（Ａ）＝６,３００ｘ２ｘＣｘ（０．０２／１．０２）ｘ１０－６
実施例６（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定：自動分析装置を用いた測定）
（第１試薬）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
２．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
（第２試薬）
１０８ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
６.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
２．３５ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　日立７０８０形自動分析装置にて、０，２，４，６，８，１０，２０μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を試料に用い、試料／第１試薬／第２試薬の添加量を３μＬ／１２０μＬ／４０μＬに設定し、１０分モードにて測定した。測光ポイントとして１７－２０ポイントの吸光度変化量を計算し、図６に示す。
実施例７（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定：逆回転反応）
（反応液）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＢＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
２ｍｍｏｌ／Ｌ　ヒポキサンチン
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ
１ｕ／ｍＬ　ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、旭化成ファーマ(株)試作品）
１．０５ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来組換え体、旭化成ファーマ(株)試作品）
　ヒポキサンチン→ＩＭＰ方向の反応、及びＧＭＰ→グアニン方向の反応を利用したサイクリング反応を進行せしめるために、ヒポキサンチンを含んだ上記反応液を調製した。ＧＭＰは、試料と上記反応液を混合し予備加温したのちに添加し、生成したＩＭＰを特異的に検出するために、ＩＭＰデヒドロゲナーゼを用い、還元型ＮＡＤの生成に基づく３４０ｎｍの吸光度変化をモニターした。すなわち、上記反応液１ｍＬに対し、０、０．４、０．８、１．２、１．６、２ｍｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を０．０２５ｍＬ加えて、３７度にて予備加温した。その後、２０ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＰ溶液を０．０１ｍＬ添加し、反応を開始させた。ＧＭＰ溶液添加後、３分目から５分目までの２分間の吸光度変化量を測定した。ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図７に示す。逆回転の場合との反応効率を比較するため、単位酵素当たりのサイクリング率を計算により求め、実施例４における結果と比較した。ヒポキサンチン→ＩＭＰ方向のサイクリング反応時が０．６回／ｕであったのに対し、ＩＭＰ→ヒポキサンチン方向では１７回／ｕであった。反応効率は低いものの、サイクリング反応が進行することは確認できた。
実施例８（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたホスホリボシルピロリン酸の測定）
（反応液）
実施例５に同じ
　日立７０８０形自動分析装置にて、０，２，４，６，８，１２，１６，２０μｍｏｌ／Ｌのホスホリボシルピロリン酸５ナトリウム（ＰＲＰＰ）（Ｃａｙｍａｎ社製）水溶液を試料に用い、試料／第１試薬／第２試薬の添加量を３μＬ／１２０μＬ／４０μＬに設定し、１０分モードにて測定した。測光ポイントとして１７－２０ポイントの吸光度変化量を計算し、図８に示す。
実施例９（ピロリン酸とホスホリボシルピロリン酸の測り分け）
（第１試薬）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
２．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
２ｕ／ｍＬ　ピロホスファターゼ（酵母由来：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｌｉｃｈ製）(±)
（第２試薬）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
６.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
２．３５ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
４０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸水素二カリウム（富士フイルム和光純薬(株)製）
　５－ホスホ－Ｄ－リボーシルピロリン酸五ナトリウム塩(Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）とピロリン酸ナトリウム１０水和物を用いてそれぞれ５，１０，１５，２０，２５μＭ水溶液を調製し、それぞれの濃度毎１対１で混合したものと、それぞれの濃度のピロリン酸水溶液と水を１対１で混合したものの２系列の試料を準備した（ＰＲＰＰ／ピロリン酸混液とピロリン酸溶液）。
　ピロホスファターゼ（酵母由来、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を第１試薬中で２ｕ／ｍＬになるように添加したものと添加しないもの２種類の第１試薬を調製した。次いで、上記組成の第２試薬を調製した。第２試薬中にはピロホスファターゼの活性を止めるためにリン酸水素二カリウム（４０ｍＭ）が添加されている。
　まず２種類の試料それぞれ０．０２ｍＬに対し、ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）を含まない第１試薬０．７５ｍＬを混合し、３７度にて５分加温した。そののち、第２試薬を０．２５ｍＬ加えて、３７度にてサイクリング反応を開始し、第２試薬添加後３分目から４分目までの１分間の吸光度変化量を測定した。次いで、ピロホスファターゼ(ＰＰａｓｅ)を添加した第１試薬を用い、ピロリン酸のみが含まれている試料を用いて同様の操作を実施した。それぞれの結果を図９に示す。ピロホスファターゼが添加されていないときの測定結果は、ピロリン酸とＰＲＰＰの合計量を、ピロホスファターゼが添加されたときの測定結果は、ＰＲＰＰ量のみを反映した結果となり、ピロリン酸はピロホスファターゼ(ＰＰａｓｅ)によって処理できること、及びこれによりＰＲＰＰとピロリン酸の測り分けができることが示された。
実施例１０（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたピロリン酸測定）
（第１試薬）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ５．８）
２．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ
０．０９５ｍｍｏｌ／Ｌ　グアニン
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
２．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＭＰ
（第２試薬）
１６０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
６.６ｕ／ｍＬ　キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨＩＩ、旭化成ファーマ製）
０．０５％　ＢＳＡ
５．６ｕ／ｍＬ　ＨＧＰＲＴ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来組換え体、旭化成ファーマ試作品）
　上記第１試薬０．１２ｍＬに対しそれぞれ０，０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，１２μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液を０．００３ｍＬ加えて、３７度にて５分間加温した。そののち、上記第２試薬０．０４ｍＬを加え、３７度にてサイクリング反応を開始し、第２試薬添加直後の１分間の吸光度変化量を測定した。
　ピロリン酸ナトリウム１０水和物水溶液濃度をＸ軸、吸光度変化量をＹ軸として測定結果をプロットしたものを図１０に示す。このとき、サイクリング率は約１００回/分であり、また０．５μｍｏｌ／Ｌのピロリン酸が検出できることが確認された。
実施例１１（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属由来ＨＧＰＲＴを用いたＰＣＲ反応産物中に含まれるピロリン酸の測定）
　プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（＋）１μｇのマルチクローニングサイト（２２８ｂｐ）を、プライマーとしてＭ１３－２０およびＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅを、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ－ｐｌｕｓ－ｎｅｏを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応産物を得た。ＰＣＲサイクル数は５，１０，１５，２０，３０回とした。
　これらのＰＣＲ反応産物をサンプルとして用い、実施例１０における第２試薬中のＨＧＰＲＴを９．５ｕ／ｍＬとした点以外は実施例１０と同様の試薬を用い、ＰＣＲ反応により生成したピロリン酸が検出可能かを確認した。ＰＣＲサイクル数２０回、３０回のサンプルについては生理食塩水でそれぞれ２倍希釈、２０倍希釈して測定を行った。その結果、ＰＣＲサイクル数５回、および１０回のサンプルではピロリン酸の検出ができなかったが、ＰＣＲサイクル数１５回、２０回、および３０回のサンプルではピロリン酸の検出が可能であった。この時、既知濃度のピロリン酸測定結果と比較して、ＰＣＲサイクル数１５回、２０回、および３０回のサンプル中に含まれるピロリン酸の濃度はそれぞれ８．９μｍｏｌ／Ｌ、２８μｍｏｌ／Ｌ、２０５μｍｏｌ／Ｌと計算された（図１１）。

Claims (18)

  1. 　下記の工程（１）～（３）を含む、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法。
    （１）ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）からピロリン酸(ＰＰｉ)を生成する正反応及びその逆反応を触媒するヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下、前記正反応の基質Ａ及び前記逆反応の基質Ｂを試料に接触させて、下記式（Ｉ）の酵素サイクリング反応を行なう工程
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    （２）前記基質Ａ、前記基質Ａが作用して生じた化合物Ａ’、前記基質Ｂ及び前記基質Ｂが作用して生じた前記基質Ａとは異なる化合物である化合物Ｂ’のいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程
    （３）検出されたシグナルの変化量に基づき、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の量を算出する工程
  2. 　前記基質Ａがグアニン（Ｇｕａ）であり、前記化合物Ａ’がグアニン５’－モノリン酸（ＧＭＰ）であり、前記基質Ｂがイノシン５’－モノリン酸（ＩＭＰ）又はキサントシン５’－モノリン酸（ＸＭＰ）であり、前記化合物Ｂ’がヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）又はキサンチン（Ｘａｎｔｈｉｎｅ）であり、
    　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（II）であり、
    　前記工程（２）が、グアニン、ＧＭＰ、ＩＭＰ及びヒポキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はグアニン、ＧＭＰ、ＸＭＰ及びキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項１に記載の測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
  3. 　前記工程（２）が、ＧＭＰ及び／又はヒポキサンチン、又はＧＭＰ及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項２に記載の測定方法。
  4. 　前記工程（２）が、グアニンには基質特異性を有さないが、ヒポキサンチン又はキサンチンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、ヒポキサンチン又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項２に記載の測定方法。
  5. 　前記検出用酵素がキサンチンデヒドロゲナーゼである請求項４に記載の測定方法。
  6. 　前記基質Ａがヒポキサンチンであり、前記化合物Ａ’がＩＭＰであり、前記基質ＢがＧＭＰ又はＸＭＰであり、前記化合物Ｂ’がグアニン又はキサンチンであり、
    　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（III）であり、
    　前記工程（２）が、ヒポキサンチン、ＩＭＰ、ＧＭＰ及びグアニンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はヒポキサンチン、ＩＭＰ、ＸＭＰ及びキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項１に記載の測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      
  7. 　前記工程（２）が、ＩＭＰ及び／又はグアニン、又はＩＭＰ及び／又はキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項６に記載の測定方法。
  8. 　前記工程（２）が、ＧＭＰ及びＸＭＰには基質特異性を有さないが、ＩＭＰには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、ＩＭＰの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項６に記載の測定方法。
  9. 　前記検出用酵素がＩＭＰデヒドロゲナーゼである請求項８に記載の測定方法。
  10. 　前記工程（２）が、ヒポキサンチンには基質特異性を有さないが、グアニンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、グアニンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項６に記載の測定方法。
  11. 　前記基質Ａがキサンチンであり、前記化合物Ａ’がＸＭＰであり、前記基質ＢがＧＭＰ又はＩＭＰであり、前記化合物Ｂ’がグアニン又はヒポキサンチンであり、
    　前記工程（１）の酵素サイクリング反応が、下記式（IV）であり、
    　前記工程（２）が、キサンチン、ＸＭＰ、ＧＭＰ及びグアニンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量、又はキサンチン、ＸＭＰ、ＩＭＰ及びヒポキサンチンのいずれか１つ以上の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項１に記載の測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
      
  12. 　前記工程（２）が、ＸＭＰ及び／又はグアニン、又はＸＭＰ及び／又はヒポキサンチンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項１１に記載の測定方法。
  13. 　前記工程（２）が、キサンチンには基質特異性を有さないが、グアニンには基質特異性を有する検出用酵素を用いて、グアニンの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項１１に記載の測定方法。
  14. 　下記の（１）～（３）を少なくとも含有する、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための測定用組成物。
    （１）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
    （２）グアニン
    （３）ＩＭＰ又はＸＭＰ
  15. 　下記の（４）～（５）をさらに含有する請求項１４に記載の測定用組成物。
    （４）グアニンに基質特異性を有さず、ヒポキサンチン及び／又はキサンチンに基質特異性を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ
    （５）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
  16. 　下記の（１）～（３）を少なくとも備えた、ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸を測定するための試薬キット。
    （１）ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
    （２）グアニン
    （３）ＩＭＰ又はＸＭＰ
  17. 　下記の（４）～（５）をさらに備えた請求項１６に記載の試薬キット。
    （４）グアニンに基質特異性を有さず、ヒポキサンチン及び／又はキサンチンに基質特異性を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ
    （５）ＮＡＤ又はチオＮＡＤ
  18. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載の工程（１）からなるピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の増幅方法。
PCT/JP2022/039733 2021-10-27 2022-10-25 ピロリン酸又はホスホリボシルピロリン酸の測定方法、これらを測定するための測定用組成物及び試薬キット並びにこれらの増幅方法 WO2023074687A1 (ja)

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