CN1222623C

CN1222623C - 用于cAMP和腺苷酸环化酶的酶荧光测定方法

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Publication number: CN1222623C
Application number: CNB008051917A
Authority: CN
Inventors: 杉山笃
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-13
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2020-03-13
Also published as: DK1164199T3; PT1164199E; WO2000055356A1; US7807367B2; CA2367904A1; DE60028555D1; AU758115B2; DE60028555T2; US7247435B2; CA2367904C; US20070190589A1; ATE329052T1; JP3059435B1; AU2943000A; EP1164199A4; US6762026B1; KR100719600B1; US20040175750A1; CN1344330A; EP1164199A1

Abstract

本发明涉及一种在含有非环腺嘌呤核苷酸的生物样品中不使用放射性试剂而快速测定cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的方法。特别地，本发明提供了一种在含有非环腺嘌呤核苷酸的生物样品中测定cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的方法，其中所述的非环腺嘌呤核苷酸选自由内源性腺苷酸环化酶产生的cAMP、以及AMP、ATP、ADP及其混合物组成的组；该方法包括下列步骤：(1)将生物样品与有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷脱氨酶和碱性磷酸酶合并以便以酶促方式除去所述样品中非cAMP的非环腺嘌呤核苷酸并除去该样品中的葡糖-6-磷酸；(2)以酶促方式将cAMP转化成AMP；(3)不使用放射性试剂测定AMP的量。且本发明还涉及一种用于实施本方法的试剂盒。

Description

用于cAMP和腺苷酸环化酶的酶荧光测定方法

发明领域

本发明提供了一种在含有非环腺嘌呤核苷酸的生物样品中，在不使用放射性试剂的情况下，测定cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的方法，其中所述生物样品中含有由ATP通过内源性腺苷酸环化酶产生的cAMP、以及选自ATP(腺苷三磷酸)、ADP(腺苷二磷酸)，AMP(环腺苷-3′，5′-单磷酸)及其混合物组成的组的非环腺嘌呤核苷酸。更具体地说，本发明涉及一种包括下列步骤的方法：(1)将生物样品与有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷脱氨酶和碱性磷酸酶合并以便以酶促方式除去所述样品中非cAMP的非环腺嘌呤核苷酸并除去该样品中的葡糖-6-磷酸；(2)以酶促方式将cAMP转化成AMP；(3)不使用放射性试剂测定AMP的量。

腺苷酸环化酶(腺苷酸环化酶、腺苷酸环化酶，EC4.6.1.1)是一种在有Mg²⁺或Mn²⁺存在的情况下催化下列转化反应的酶：

ATP→cAMP

腺苷酸环化酶局部存在于细胞膜上并且作为大量基础激素和神经递质的信号转导级联起关键作用。

例如，已经使用腺苷酸环化酶活性的测定来研究由移植的人体心脏和在充血性心力衰竭中表现出的改变的生理学特性。参见M.R.Bristow等，NewEngl.J.Med.，307，205(1982)；K.G Lurie等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，86，195(1983)。

可以通过监测经腺苷酸环化酶的催化作用而由ATP合成的cAMP含量的变化来测定腺苷酸环化酶的活性。

然而，对腺苷酸环化酶生物作用的更加清楚的阐述已经受到准确监测cAMP组织水平改变中出现的困难的限制。

发现cAMP(环腺苷-3′，5′-单磷酸)是作为起肝细胞中肾上腺素和胰高血糖素的血糖升高功能的媒介作用的因子。[E.W.Sutherland等，J.Am.Chem.Soc.，79，3608(1957)]。且还发现cAMP介导激素诸如促肾上腺皮质激素(ACTH)、黄体生成素(LH)、酪氨酸刺激激素(TSH)和甲状旁腺素(PTH)这样的激素或者诸如前列腺素这样的生理活性物质的作用。因此，当肽激素类或活性胺类已经分泌出来且已经到达靶细胞时，cAMP向其转移信息以便进行酶促反应，即起第二信使的作用。

cAMP由ATP通过定位在活体膜上的腺苷酸环化酶来合成并通过磷酸二酯酶分解成5’-AMP。cAMP广泛存在于细菌或动物体内，但cAMP的浓度极低(稳态浓度为0.1-1nmol/g湿重)。作为cAMP的测定方法，便利地采用使用cAMP结合蛋白的测定方法或放射性免疫测定方法。cAMP含量取决于细胞的富营养、增殖、分化、适应性和灵敏度的改变。

各种哺乳动物和非哺乳动物组织和液体中cAMP的测定提供了一种用于评价细胞存活力、内分泌激素轴功能、腺苷酸环化酶活性和磷酸二酯酶活性的有用方式。此外，使用cAMP的测定来评价包括但不限于G族蛋白质(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)在内的大量信号转导蛋白的活性，所述的信号转导蛋白在信号转导、核糖体蛋白的合成、新生蛋白的转运和其它重要细胞功能中起主要作用。Bourne等，Nature，348，125(1990)。

此外，可以将cAMP的测定用于评价其它可以改变特定细胞、组织、器官或体液中的环核苷酸水平的内源性和外源性化合物(例如一氧化二氮)。

许多激素使用cAMP作为第二信使，它们包括但不限于：肾上腺素、去甲肾上腺素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管升压素、胰高血糖素、促甲状腺素和促黑激素，它们是活生物体内的一些主要的调节激素/蛋白质。可以使用本发明用于cAMP的方法测定组织、血清、体液和所有细胞培养物(细胞和培养基)内所有这些激素和调节物的活性。在激素失衡可导致特殊病理情况的各种疾病状态中进行这些激素的测定。

一旦激素或调节蛋白与特定受体发生相互作用，则在这种情况中，第二信使cAMP通过生化反应级联产生。在某些情况中，也可以通过使用cAMP的减少作为部分特异性激素信号转导途径的激素来特异性抑制cAMP的产生。这种调节蛋白或激素和受体相互作用的结果可以导致但并不限于下列情况：(1)例如，继发于离子通道改变的细胞透性的改变；(2)和对cAMP浓度敏感的酶催化反应速率的改变；以及(3)包括其它酶合成和降解在内的蛋白质合成速率的改变。在激素或调节蛋白与受体发生相互作用后可以使用一定量的cAMP来直接或间接监测结果。

特别地，可以测定尿或血液中的cAMP以便用作类似于氨茶碱或茶碱这样可通过防止内源性cAMP分解而刺激肾上腺素能神经系统的药物水平的标记。可以将在细胞培养物中测定cAMP用于评价cAMP代表信号转导过程中重要连接物的特异性激素、调节蛋白和药物。

还可以将cAMP用于在没有或有特异性激素或调节蛋白存在的情况下通过研究细胞而评价细胞存活力和稳定性。例如，可以将通过胰高血糖素测定肝脏细胞(肝细胞)中的cAMP用于评价肝细胞存活力。例如，这在例如心脏、肝、肺、肾、胰腺、皮肤和脑细胞移植这样的器官和/或细胞移植过程中是有用的。

在通过提高或降低细胞cAMP水平的各种激素、调节蛋白和药物激活后，可以将根据活检样品细胞反应性测量值用作特异性评价细胞功能的方式。

特殊的临床实例是使用心脏活检组织中的cAMP测量值来评价心肌反应性。心肌病性心脏细胞不象正常心脏细胞那样对β-肾上腺素能刺激后cAMP含量的升高作出反应。通过比较来自正常心脏与心肌病性心脏的活检样品的反应性可以进行心脏病严重性的诊断并评价诸如β-肾上腺素能阻断剂和血管紧张肽转化酶抑制剂这样的某些药物的功效。可以将在血细胞中腺苷酸环化酶活性或cAMP的基础和/或刺激水平的测量值用于指导这类患者中进行的疗法。此外，可以将胞内释放的cAMP或释放入动脉或静脉循环的cAMP用作器官和/或组织对诸如局部出血、低氧症或药物或激素刺激这样的各种不同生理和非生理应激的反应的指示剂。可以用该手段测定几乎任何情况下的哺乳动物细胞或体液包括血细胞和血小板中的cAMP的组织或体液水平。在某些组织中，就潜在的肿瘤细胞样品而言，可以测定对特异性刺激物的反应的cAMP水平作为致癌性和/或侵染力的指标。在其它情况中，可以使用cAMP的测量值来确定可以改变cAMP合成或降解的特异性疗法的有效性。

如上所述，cAMP作为细胞内信息转移的第二信使起重要作用并且还具有不同的生理功能。显然可以在基础和临床医学领域测定通过腺苷酸环化酶的催化作用而由ATP合成的cAMP以便确定腺苷酸环化酶的活性或阐明cAMP的性能。

背景技术

通过定量测定由作为底物的ATP产生的cAMP来测量腺苷酸环化酶的活性。将cAMP的测定方法分成使用(1)标记的ATP和(2)未标记的ATP作为底物的两种方法。

在使用标记的ATP作为底物(1)的方法中，使用由放射性元素标记的ATP、例如[α-³²P]ATP作为底物并分离和测定由放射性标记的ATP生成的cAMP([³²P]cAMP)。参见Y.Salomon等，Anal.Biochem.，58，541(1974；R.A.Johnson等，In Method in Enzymology，195，3(1991))。本方法使用应用离子交换树脂和氧化铝柱的顺序亲和层析从[α-³²P]ATP中分离[³²P]cAMP。

尽管这种方法是灵敏的，但是它依赖于危险和昂贵的放射性标记的化合物。

另一方面，将使用未标记的ATP的方法分类成：(1)放射免疫测定法，其中使放射性标记的cAMP进行与包括由未标记的ATP产生的cAMP在内的抗血清的竞争性抗原-抗体反应且然后检测结合抗体的放射性以便确定cAMP含量；和(2)蛋白质结合测定法，其中使用cAMP-依赖性蛋白激酶与cAMP之间的特异性结合来测定与cAMP依赖性蛋白激酶结合的³H-cAMP的放射性。参见A.G.Gilman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，67，305(1970)。

使用未标记的ATP作为底物的方法不能通过环核苷酸磷酸二酯酶补偿cAMP的分解且由此本方法不适于包括强磷酸二酯酶活性的样品。

由于安全性和环境的关系，所以应避免使用放射性物质。存在对测定腺苷酸环化酶活性和作为腺苷酸环化酶活性指标的cAMP的高度灵敏的非放射性测定方法的需求。

然而，不使用放射性化合物测定cAMP是极为困难的，这是因为在大多数哺乳动物组织中cAMP的浓度极低。此外，由于生物样品中诸如AMP、ADP和ATP这样的非环腺嘌呤核苷酸以几百或几十万倍于cAMP的浓度存在且其化学结构与cAMP的化学结构类似，所以它们在cAMP测定中起干扰物质的作用。特别地，ATP以一亿倍于cAMP浓度存在且由此如果不完全除去内源性ATP那么就基本上不可能精确测定cAMP。

另一方面，通过磷酸二酯酶的作用将cAMP转化成AMP。已经公开了不使用放射性化合物测定AMP的方法。Lowry等已经开发了一种以还原的吡啶核苷酸荧光为基础的灵敏的测定方法。参见O.H.Lowry等，A FlexibleSystem of Enzymatic Analysis，Harcourt Brace Jovanovich，New York(1972)；F.M.Matschinsky等，J.Histochem.Cytochem，16，29(1968)。该测定方法所依赖的方面在于340nm处还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的吸光度为0.617/0.1mmol且根据样品的吸光度计算NADPH的绝对浓度。

公开了一种AMP的测定方法，它依赖于AMP对糖原磷酸化酶的刺激作用，这种酶在有无机磷酸(P_i)存在的情况下将糖原转化成葡糖-1-磷酸。参见E.Helmrich等，Biochemistry，52，647(1964)；同上，51，131(1964)；M.Trus等，Diabetes，29，1(1980)。按照本方法，根据由糖原产生的葡糖-1-磷酸的量来测定糖原磷酸化酶的活性且可以使用糖原磷酸化酶活性作为指标来检测AMP。Lurie还开发了一种AMP的灵敏的测定方法。参见K.Lurie等，Am.J.Physiol.，253，H662(1987)。

提高cAMP或腺苷酸环化酶的分析灵敏度和特异性的方法已经使用了非环腺嘌呤核苷酸的酶降解(degradatiom)方式或通过层析法将其除去。参见N.D.Goldberg等，Anal.Biochem.28，523(1969)；B.Mcl.Breckenridge，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，52，1580(1964)。

在常规分析中，由于不能完全除去干扰的内源性ADP或ATP，所以已经考虑到测定cAMP应是不可能的。因此，基本上不存在不使用放射性物质对cAMP含量和以cAMP量为基础的腺苷酸环化酶活性的高度灵敏的测定方法。

从完全不同的观点出发，本发明者和其它人预先尝试了开发用于腺苷酸环化酶活性和cAMP的测定方法，而作为广泛研究的结果，他们已经找到了一种仅使用酶促和化学反应对cAMP含量和以cAMP量为基础的腺苷酸环化酶活性的高度灵敏的测量方法，该方法包括下列步骤：使用酶选择性除去干扰物质即诸如ATP、ADP等这样的内源性非环腺嘌呤核苷酸；将AMP转化成ATP；将ATP通过果糖-6-磷酸转化成葡糖-6-磷酸；转化NADPH；测定NADPH的浓度并使之与cAMP浓度相关联(WO94/17198)。

按照本方法，可以以pmol或fmol的水平严格测量生物样品中μg等级的量的cAMP。参见A.Sugiyama等，Anal.Biochem.，218，20(1994)；A.Sugiyama等，J.Clin.Lab.，8，437(1994)；A.Sugiyama等，Anal.Biochem.，225，368(1995)；A.Sugiyama等，Yamanashi Med.J.，10，11(1995)。

上述常规方法的反应流程图如下所述。

步骤1：清除反应

(除去内源性非环状核苷酸和内源性葡糖-6-磷酸)

腺苷三磷酸双磷酸酶

步骤2：转化反应1

(将cAMP转化成AMP)

步骤3：转化反应2

(将AMP转化成ATP)

步骤4：通过ATP-ADP循环反应扩增

(测定方法的灵敏度扩增了6000-10000倍)

步骤5：检测反应

(NADPH的免疫光度测定)

就方法而论如上所述的方法作为定量分析的方法在方法原理极佳的且理论上是正确的。然而，本方法需要进行清除反应的时间较长或当循环反应后通过加热使酶失活时反应混合物变浑浊。

发明内容

作为开发不使用放射性物质测定cAMP和腺苷酸环化酶的简便而快捷方法的深入研究结果，已经完成了本发明。

本发明已经使用本发明者和其它人预先开发的酶促反应和荧光强度(WO94/17198)对测定腺苷酸环化酶活性和对cAMP的定量分析的方法进行了改进。即(1)在使5’-核苷酸酶从所用酶中缺失的清除反应中，可以将1小时的反应期限极大地缩短至5-10分钟；(2)在循环反应中，通过用诸如EDTA这样的螯合剂而不是加热除去Mg²⁺而使所用的酶失活。反应混合物不会变浑浊并改进了下一步检测反应的精确度；(3)将转化反应从常规的2步转化反应变成了1步反应。操作可以更为简便；和(4)可以检查检测反应中所用的反应试剂的浓度以便使本方法最佳化。通过这些改进，可以提供快速和以高灵敏度测定cAMP或相应于cAMP的腺苷酸环化酶的酶荧光测定法或分光光度测定法。

附带地说，如下所述，可以将本方法用于测定鸟嘌呤调节蛋白和cAMP特异性磷酸二酯酶。

用于测定cAMP的本方法中使用的反应如下所示。

步骤1-清除反应

(除去内源性非环状核苷酸和内源性葡糖-6-磷酸)

步骤1-可选择的清除反应1

(除去果糖-6-磷酸)

步骤1-可选择的清除反应2

(除去生理样品中的内源性糖原)

步骤2-转化反应

(转化成AMP)

步骤2-可选择的转化反应1

(转化成ATP)

步骤3-检测反应1

(NADPH的荧光光度测定)

步骤3-可选择的检测反应

(6-磷酸葡糖酸内酯的降解)

步骤3-检测循环反应1

步骤3-检测反应2

(NADPH的荧光光度测定)

步骤3-检测循环反应2

(通过ATP-ADP循环反应扩增)

(测定灵敏度扩增了6000-10000倍)

步骤3-检测反应3

(ATP的检测)(荧光素酶反应)

上述图解中所说明的反应进一步在下面表述。

步骤1：清除反应

(除去内源性非环腺嘌呤核苷酸和葡糖-6-磷酸)

在本测定方法中包括下列步骤：用腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷脱氨酶和碱性磷酸酶的混合物以酶促方式除去非cAMP的带有非环状腺嘌呤基团的内源性化合物(腺苷、ATP、ADP和AMP)。优选本方法包括通过使用碱性磷酸酶以酶促方式将样品中的葡糖-6-磷酸转化成葡萄糖的步骤(清除反应)。

本发明的清除反应可以除去以远高于cAMP的浓度存在的所有内源性ATP、ADP和AMP且基本上增加了背景信号。由于在随后的检测反应中产生葡糖-6-磷酸，所以有利的是预先以酶促方式从样品中除去葡糖-6-磷酸以便改进测量的精确度。清除反应对提高灵敏度来说是重要的。

此外，通过使5’-核苷酸酶从已经用于常规清除反应步骤中的4种类型的酶即腺苷三磷酸双磷酸酶、5’-核苷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶中缺失而使清除反应期限大大缩短并简化。这就是说，已经发现可以将约1小时的常规清除反应期限缩短至仅为5-10分钟。

步骤1-可选择的清除反应1

(除去果糖-6-磷酸)

有利的是通过用碱性磷酸酶水解而预先从样品中除去在循环反应和检测反应中生成的果糖-6-磷酸。

步骤1-可选择的清除反应2

(除去样品中的内源性糖原)

更为有利的是从样品中除去通过使用葡糖氧化酶、糖原磷酸化酶和碱性磷酸酶转化成葡糖-6-磷酸的内源性糖原(可选择的反应)。根据这种可选择的清除反应，将属于检测反应中干扰物质的内源性糖原破坏，其中加入公知量的糖原。

步骤2-转化反应(转化成AMP)

接下来在清除反应后将磷酸二酯酶与反应混合物合并以便将cAMP转化成AMP(转化反应)。

步骤3-检测反应

(NADPH的荧光测定)

在转化反应后，将糖原和无机磷酸加入到反应混合物中并通过最终由糖原生成的葡糖-6-磷酸水平与由AMP激活的糖原磷酸化酶之间的关系来确定AMP的量。用磷酸葡糖变位酶将葡糖-1-磷酸转化成葡糖-6-磷酸且最终以酶促方式将葡糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯、NADPH和H⁺。例如，按照Trus等的方法[M.Trus等，Diabetes，29，1(1980)]，通过荧光测定法测定NADPH的浓度。

步骤3-可选择的检测反应

(6-磷酸葡糖酸内酯的降解)

此外，可以在体外在水溶液中加热而将6-磷酸葡糖酸内酯转化成6-磷酸葡糖酸且然后在体外有NADP⁺存在的情况下可以将6-磷酸葡糖酸转化成NADPH和5-磷酸核酮糖。通过可选择的反应可以增加NADPH的浓度且例如按照Trus等的方法[M.Trus等，Diabetes，29，1(1980)]，通过荧光测定法测定NADPH的浓度。

尽管使用改进的Salomon放射性方法和不使用碱性磷酸酶的本发明的荧光测定法测定了来自家兔心脏的相同制备物中的刺激的腺苷酸环化酶活性，但是结果是相似的。Weign等，Anal.Biochem.，208，217(1993)。使用放射性测定法获得的结果与本发明的荧光测定法获得的结果相差不大。尽管当将来自放射性测定法和荧光测定法的结果进行比较时绝对特异性活性不同，但是作为使用上述任一方法测定的腺苷酸环化酶的成倍刺激是相似的。特异性活性的差异因腺苷酸环化酶反应混合物中的少量因素而最为可能。也就是说，将未标记的cAMP用于放射性测定法中以便防止[³²P]cAMP通过内源性磷酸二酯酶降解，而将茶碱用于荧光测定法中以便抑制新近合成的cAMP的内源性磷酸二酯酶降解。

此外，使用如步骤3-检测循环反应2中所示的ATP-ADP循环反应对腺苷酸环化酶的测定值揭示出就放射性测定法和荧光测定法而言绝对特异性活性是相同的。

通过预先制备的试剂盒便利地实施本发明的方法，而这类试剂盒包括装有用于各反应步骤的酶、缓冲溶液等的小瓶。

特别地，本发明用于实施快速测定cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的方法的试剂盒以下列试剂盒为典型，该试剂盒包括：(1)清除反应用小瓶，它装有有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶以便除去生物样品中由ATP、ADP和AMP组成的内源性非环腺嘌呤核苷酸以及内源性葡糖-6-磷酸；(2)转化反应用小瓶，它装有有效量的磷酸二酯酶以便以酶促方式将所述生物样品中的cAMP转化成AMP；和(3)检测反应用小瓶，它装有有效量的：(a)用于将糖原转化成葡糖-1-磷酸的糖原、无机磷酸和糖原磷酸化酶；(b)用于将葡糖-1-磷酸转化成葡糖-6-磷酸的葡糖磷酸变位酶；和(c)用于将葡糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH的葡糖-6-磷酸脱氢酶和NADPH(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)⁺。

此外，本发明用于实施快速测定cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的方法的另一种试剂盒可以是这样一种试剂盒，它包括：(1)清除反应用小瓶，它装有有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷脱氨酶和碱性磷酸酶以便以酶促方式除去生物样品中由ATP、ADP和AMP组成的内源性非环腺嘌呤核苷酸以及内源性葡糖-6-磷酸；(2)转化反应用小瓶，它装有有效量的磷酸二酯酶、ATP、肌激酶、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶以便以酶促方式将所述生物样品中的cAMP转化成AMP；和(3)检测反应用小瓶，它装有有效量的：(a)用于将ATP转化成果糖-6-磷酸的果糖和己糖激酶；和(b)用于将果糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH的磷酸葡糖异构酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶和NADP⁺。

本发明的方法对测定重量低于0.1mg的少量生物样品中的cAMP来说具有足够的灵敏度且可以适合于测定0.1fmol cAMP/样品。根据本发明，将已知量的ATP加入到生物样品中且然后通过该样品中腺苷酸环化酶的作用将ATP转化成cAMP。在通过清除反应除去诸如内源性ATP这样的所有腺嘌呤核苷酸后可以通过测定转化的AMP来提供腺苷酸环化酶的活性。

在清除反应中由腺苷产生的铵离子使得清除反应基本上完成，从而防止样品中重新形成核苷酸。这些步骤提供了对荧光测定法的明显令人意外的改进。Weign等，Anal.Biochem.，208，217(1993)。

附图说明

附图1是表示不同反应期中荧光对ATP浓度的线性图。

附图2是如本发明实施方案测定的cAMP的吸光度对cAMP标准样品浓度的示意图。

附图3是表示如本荧光测定法(实心)和商业上可得到的免疫显色定量分析(阴影)和放射性免疫定量分析(空心)测定的在未处理和刺激的细胞内检测的cAMP的量的柱形图。

附图4是表示通过本荧光测定法(实心)和商业上可得到的放射性免疫定量分析(阴影)和Salomon法(空心)测定的腺苷酸环化酶活性的柱形图。

具体实施方式

使用本方法检测的生理物质优选获自哺乳动物来源，包括组织、血细胞、骨和诸如尿、血液、脊髓液等这样的生理液体；且它们可以是新鲜的或冷冻的。Lowry等，A Flexible System of Enzymatic Analysis，Harcourt BraceJovanovich，New York(1972)。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明包括下列步骤：

步骤1-清除反应(除去内源性非环核苷酸和葡糖-6-磷酸)

将包括cAMP、葡糖-6-磷酸和至少一种非环腺嘌呤核苷酸(即选自ATP、ADP、AMP及其混合物组成的组)的生理物质样品与包括腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷脱氨酶和碱性磷酸酶混合物的含水缓冲液混合以使所述的非环腺苷核苷酸(ATP、ADP和/或AMP)以酶促方式被转化而除去。

措词“更为快捷地”指的是将通常需要约1小时的清除反应期限缩短至约5-10分钟的范围内，即为所述反应期的1/12-1/6、至少为1/6。

步骤1-可选择的清除反应2

任选地，将所述的反应混合物与葡糖氧化酶和糖原磷酸化酶和碱性磷酸酶的混合物合并以便破坏所述样品中的全部糖原，而使cAMP保留在所述反应混合物中。这些步骤破坏了所有内源性糖原，这些糖原是添加已知量糖原的步骤3-检测反应(NADPH的荧光测定)中的干扰物质。

步骤2-转化反应(转化成AMP的反应)

将该反应混合物与磷酸二酯酶合并以便将所述的cAMP转化成AMP。

步骤3-检测反应

(NADPH的荧光测定)

在有糖原和无机磷酸酶存在的情况下进一步使所述的AMP与糖原磷酸化酶接触，使得在该反应混合物中产生葡糖-1-磷酸。然后在所述反应混合物中以酶促方式将葡糖-1-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯、NADPH就H⁺并按照荧光测定法测定NADPH的浓度。NADPH的浓度与腺苷酸环化酶、cAMP含量或AMP的浓度相关。

cAMP的测定方法基于通过裂解cAMP的3’，5’-磷酸二酯键产生的AMP刺激糖原磷酸化酶活性的机理。即，cAMP的量和腺苷酸环化酶活性相应于最终得自由cAMP产生的AMP激活的糖原磷酸化酶活性的NADPH的吸光度。

例如，通过校准曲线可以获得NADPH的最终浓度与AMP浓度的相关性。参见附图2。

在清除反应后，优选可以通过加热使清除反应中所用的酶失活。

在步骤1-清除反应后，进一步优选向反应混合物中加入磷酸二酯酶、糖原-磷酸化酶、葡糖-1，6-二磷酸、无机磷酸、糖原、NADP⁺、葡糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖磷酸变位酶和Mg²⁺的溶液且在原位依次进行步骤2的转化反应和步骤3的检测反应1。

步骤3-可选择的检测反应1

(磷酸葡糖酸内酯的降解)

通过下列步骤可以增加步骤3中生成的NADPH的浓度：通过加热步骤3-检测反应1的反应混合物而依次将6-磷酸葡糖酸内酯转化成6-磷酸葡糖酸且然后在有Mg²⁺存在的情况下使6-磷酸葡糖酸与添加的NADP^-和6-磷酸葡糖酸脱氢酶反应而产生5-磷酸核酮糖、NADPH、H⁺和CO₂。

步骤3-检测循环反应1

通过在循环反应系统中使用NADPH可以使在步骤3-检测反应1中生成的NADPH的有效浓度提高几个数量级。一种这类反应系统将添加到α-酮戊二酸中的NADPH转化成NADP⁺和谷氨酸。NADPH⁺依次将所添加的葡糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH。如上所述，可以使6-磷酸葡糖酸内酯水解(H₂O、加热)并在有6-磷酸葡糖酸脱氢酶存在的情况下转化成5-磷酸核酮糖和NADPH。Lowry等，A Flexible System of EnzymaticAnalysis，Harcourt Brace Jacovanovich，New York(1972)。

步骤2-可选择的转化反应1(转化成ATP的反应)

另一方面，在有肌激酶存在的情况下通过将步骤2-转化反应中由cAMP产生的AMP与微量的ATP合并可以将所述AMP转化成ADP。然后通过将产生的ADP与2-磷酸(烯醇)丙酮酸激酶合并而将所述ADP转化成ATP和丙酮酸。在该步骤中一个分子的AMP产生一个分子的ATP(转化成ATP的反应)。

可以在一步中依次进行将cAMP转化成AMP和将AMP通过ADP转化成ATP的步骤2-转化反应和步骤2-可选择的转化反应1。

步骤3-检测反应2

(NADPH的荧光测定)

此外，在由果糖存在的情况下通过与己糖激酶合并而将ATP转化成果糖-6-磷酸和ADP。在有磷酸葡糖酸异构酶存在的情况下将果糖-6-磷酸转化成葡糖-6-磷酸，以酶促方式将葡糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯、NADPH和H⁺。通过如上所述的Trus等的方法测定NADPH的浓度。M.Trus等，Diabetes，29，1(1980)。

步骤3-可选择的检测反应1

另一方面，如上所述，可以使6-磷酸葡糖酸内酯水解并进一步转化成6-磷酸葡糖酸，可以将6-磷酸葡糖酸转化成NADPH、H⁺、CO₂和5-磷酸核酮糖。

步骤3-检测循环反应2(ATP-ADP循环反应的扩增)

此外，使ATP进行ATP-ADP循环反应。即在由果糖存在的情况下通过将ATP与己糖激酶合并而将ATP转化成果糖-6-磷酸和ADP。然后在有丙酮酸激酶存在的情况下通过混合磷酸烯醇丙酮酸而将ADP转化成ATP和丙酮酸。由此产生的ATP再次转化成果糖-6-磷酸和ADP。通过重复这些反应，可以最终累积果糖-6-磷酸。

加入螯合剂以便在循环反应终止时使酶失活。螯合剂的典型实例可以是诸如EDTA这样的聚氨基羧酸、诸如柠檬酸这样的氧化羧酸，优选EDTA。

使用磷酸葡糖异构酶将所得的由循环反应中所用过量果糖和磷酸(烯醇)丙酮酸产生的果糖-6-磷酸转化成葡糖-6-磷酸并通过使葡糖-6-磷酸接触葡糖-6-磷酸脱氢酶和NADP⁺而将其转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH。然后通过Trus等的方法测定NADPH的浓度。M.Trus等，Diabetes，29，1(1980)。参见如上所述的步骤3-检测反应2。

步骤3-检测反应3

根据本发明，能够使用应用荧光素酶反应和萤火虫荧光素的化学发光测定法而以吸光测定方式检测如步骤2-可选择的转化反应1中所示产生的ATP。Wulff等，Methods of Enzymatic Analysis，Bergmeyer H.U.编辑，VCH(1985)。根据ATP的测定结果，可以计算AMP的浓度和相应于cAMP和腺苷酸环化酶的cAMP浓度和腺苷酸环化酶的活性。

尽管该反应的速率极低，但是反应的产率(定义为发射的光子数与转化的ATP分子数之比)几乎为100％。发射光的强度与ATP浓度成正比并在582nm处测定。

如果反应系统的原理相同，那么本发明的该方法可以适合于通过施用相应于GMP的合适的酶来测定非AMP的任何物质，例如鸟苷酸环化酶的活性、鸟苷3’，5’-环一磷酸(cGMP)

和鸟苷3’，5’-一磷酸(GMP)。所用的反应图解如下所示。

步骤(i)-清除反应

步骤(ii)-转化反应

步骤(iii)-循环反应

步骤(iv)-检测反应

步骤(i)-清除反应

如上所述，在清除反应中使用碱性磷酸酶、核苷磷酸化酶和鸟嘌呤酶的清除用混合物。可以将碱性磷酸酶用于便诸如葡糖-6-磷酸和非环核苷酸这样的可以在cGMP测定过程中增加空白值的化合物去磷酸化(清除反应)。

在清除反应中，使样品中的GTP转化成GMP和2Pi，随后转化成鸟苷和Pi。将鸟苷转化成鸟嘌呤和1-磷酸核糖并将鸟嘌呤转化成黄嘌呤和氨。同样在用于测定cAMP的清除反应中，最终清除反应中形成的铵(或NH₄ ⁺)使一系列连接的反应基本上完成、确保了干扰的核苷酸的除去。

在下一步(ii)-转化反应前，例如通过加热使清除反应中所用的酶失活。

步骤(ii)-转化反应

接下来用磷酸二酯酶将样品中存在的cGMP转化成GMP。在有鸟嘌呤一磷酸激酶存在的情况下将GMP与ATP混合以便产生鸟苷-5’-二磷酸(GDP)和ADP。

步骤(iii)-循环反应

在有过量PEP、琥珀酰CoA和无机磷酸(Pi)存在的情况下使用GDP而产生一定量的丙酮酸(循环反应)。

步骤(iv)-检测反应

通过加入在有酸存在情况下转化成乳酸和NAD⁺的已知量的NADH而对这种丙酮酸进行间接定量。因此，指示剂样品的荧光以与用于检测cGMP、GMP或鸟苷酸环化酶的样品中产生的丙酮酸的量直接成比例的方式减弱。此外，为了提高检测灵敏度，在用酸使过量NADH分解后，可以用碱将形成的NAD⁺转化成具有较高荧光强度的2-羟基烟醛(2-hydroxy-nicotinicaldehyde)。K.Scya等，Anal.Biochem.，272，243(1999)。

根据本发明，测定GMP的另一种方式是测定由步骤(ii)-转化反应中鸟嘌呤一磷酸激酶分解的ATP的量。可以通过如上所述的一种公知方法测定ATP的量。

除改进检测灵敏度外，使用本发明的酶测定方法测定腺苷酸环化酶活性或鸟苷酸环化酶活性还可显著降低成本、减少消耗的时间；此外，因为不使用放射性物质，所以对于操作者来说更为安全且更有利于环境。

最后，本发明的测定方法可以便利地适合于测定生物样品中内源性或外源性磷酸二酯酶的量。即将单一的预选量的cAMP加入到含有未知浓度的磷酸二酯酶的样品中。如果需要可以加入对磷酸二酯酶具有特异性的任何抑制剂。通过向不同预选的已知量的磷酸二酯酶中加入单一预选过量的cAMP而产生标准曲线。在固定的反应时间(5-60分钟)后，其中用磷酸二酯酶将一定量而非全部添加的cAMP转化成AMP，终止该反应。可以同时使用cAMP标准曲线检验正在进行的反应是否合适。启动清除反应以便使所有的非环腺嘌呤核苷酸降解。剩余的cAMP与天然和添加的磷酸二酯酶成反比。然后通过常规测定方法将cAMP转化成AMP。

特别地，将组织样品溶于SET缓冲液(蔗糖0.5M、Tris 0.03M、EDYA2mM)并向所得混合物中加入双倍体积的PDE混合物(Tris 50mM、cAMP50μM)且在37℃下培养20分钟。在80℃下将该反应混合物加热30分钟。将体积为组织样品4倍的清除反应混合物加入到该反应混合物中并在37℃下培养1小时。在80℃下将该反应混合物加热30分钟。将体积为组织样品10倍的转化反应混合物加入到该反应混合物中并在室温下培养1小时。使用检测反应测定所得NADPH的荧光强度。

本发明提供了一种包括将以试剂盒形式使用的酶或缓冲液的制剂。例如，可以将各步骤中的反应物质便利地制成试剂盒，诸如清除反应混合物试剂盒、转化反应混合物试剂盒、循环反应混合物试剂盒、检测反应混合物试剂盒。

例如，以装在诸如由合适的玻璃或塑料制成的小瓶、ample这样的容器内的水溶液、冻干或固体制剂的形式提供本发明所用的酶制剂。

可以将酶溶于缓冲液、电解质、蒸馏水中或可以将它们分别置于不同容器内并可以在使用前将它们彼此混合。

可以适当添加诸如防腐剂、稳定剂、染料、赋形剂、pH调节剂等这样的添加剂。

除本发明的扩增反应外，本发明中所述的测定方法还可以使用合适的自动分析仅。

本发明提供了一种用于腺苷酸环化酶活性和cAMP以及cAMP特异性磷酸二酯酶活性和G调节蛋白生物活性的新型非放射性酶荧光测定法。此外，本发明提供了一种用于鸟苷酸环化酶活性和cGMP的非放射性酶荧光测定法。

与用于测定腺苷酸环化酶活性等的常规方法相比，本发明的方法具有相对于目前可得到的方法的几个优点。不同于由Y.Salomon等在Anal.Biochem.， 58，541(1974)和Adv.Cyclic Nucleotide Res.， 10，35(1979)中预先公5开的测定方法，本测定方法不使用任何放射性物质。此外，本测定方法比以前的检测方法更灵敏且操作更简单。

此外，根据本发明，与本本发明者和其它人先前开发的方法相比，本方法中的反应期限可以大大缩短且操作变得更为简便。参见A.Sugiyama等，Anal.Biochem.，218，20(1994)；A.Sugiyama等，J.Clin.Lab.，8，437(1994)；A.Sugiyama等，Anal.Biochem.，225，368(1995)；A.Sugiyama等，Yamanashi Med.J.，10，11(1995)。此外，通过使用诸如EDTA这样的螯合剂解决了在常规方法中不可避免的样品中出现浑浊的难题。且可以以pmol或fmol的水平准确测定生物样品中以μg级计的cAMP含量。

本发明的清除反应可以除去以远高于cAMP浓度存在的所有内源性ATP、ADP和AMP，否则这些物质将大大增加空白。另外，清除反应可以除去作为样品中干扰物质的所有内源性葡糖-6-磷酸和糖原。这些清除反应对改进检测灵敏度来说是重要的。

已经发现通过使5’-核苷酸酶从已经用于常规清除反应的4种酶即腺苷三磷酸双磷酸酶、5’-核苷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶中缺失可以将采用常规方法的1小时反应期限显著缩短至约5-10分钟。

在循环反应后，由于螯合剂捕捉到了Mg²⁺且不经加热而使过量酶失活，所以样品不会变浑浊。

还可以通过减少反应体积来改进本检测方法的灵敏度。正如Meinrich等和E.Helmrich等在Biochemistry，52，647(1964)中所报导的，通过改变反应混合物中糖原和无机磷酸盐的浓度也可以进一步提高本检测方法的灵敏度。根据本发明，在包括低至10.0μg膜蛋白的哺乳动物组织活检样品中测定腺苷酸环化酶活性是可能的。

不同于放射性方法，其中灵敏度受到[α-³²P]cAMP的特异性活性和层析分离用的体积大小等的限制，对进一步提高本荧光测定方法的灵敏度来说不存在明显的障碍。例如，已经测定了1fmol-1mmol宽浓度范围内的cAMP。

实施例

参照下列具体的实施例来进一步描述本发明，其中除腺苷三磷酸双磷酸酶和5’-核苷酸酶来自Sigma Co.，St.Louis，MO外，所用的酶、底物和辅因子均获自Boehringer Mannheim CO.。[α-³²P]ATP、³H-cAMP和水溶胶闪烁混合物均商购自New England Nuclear。中性层析氧化铝WN-3获自Bio-Rad。

实施例1

清除反应期的测定

将3uL体积的ATP标准物(0、10、100、1000和10000pmol/管)加入到10×57 Pyrex^_检测管内。当在室温下时，向各检测管内加入25μL清除反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0；2mM MgCl₂；2U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶；10U/mL腺苷脱氨酶；40U/mL碱性磷酸酶)。在37℃下将该混合物培养0、5、10、15和20分钟。然后依次进行步骤2-转化反应(转化成AMP)、可选择的转化反应(转化成ATP)、步骤3-检测循环反应2，并测定340nm处的荧光强度以便确定ATP完全消失时的培养期限。结果如附图1中所示。从这些结果中可以发现，在至多10分钟的培养后干扰物质即ATP基本上消失。

对比实施例

进行本试验以便将本发明的清除反应与含有5’-核苷酸酶的清除反应相比较。

含有5’-核苷酸酶的清除反应混合物的制备

将Tris-HCl(pH8.0)、MgCl₂、5’-核苷酸酶、腺苷三磷酸双磷酸酶和碱性磷酸酶混合并向该混合物中加入水至总体积为25μL。制备具有如表1中所示终浓度的清除反应混合物。

表1

含有5’-核苷酸酶的清除反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HCl pH8.0 100mM

MgCl₂ 2mM

5’-核苷酸酶 2.5U/mL

腺苷三磷酸双磷酸酶 2U/mL

腺苷脱氨酶 10U/mL

碱性磷酸酶 20U/mL

水加至总体积为25μL

可以用下列反应流程图表示清除反应。

清除反应期的测定

使用上述如实施例1中所述制备的清除反应混合物进行清除反应。

将3μL体积的ATP标准物(0、10、100、1000和10000pmol/管)加入到10×57Pyrex^_检测管内。当在室温下时，向各检测管内加入25μL清除反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0；2mM MgCl₂；2U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶；2.5U/mL 5’-核苷酸酶；0.1U/mL腺苷脱氨酶；20U/mL碱性磷酸酶)。在37℃下培养该混合物。然后进行如下面实施例2中所述的步骤2-转化反应、循环反应和检测反应，并测定340nm处的吸光度以便确定ATP完全消失时的培养期。结果发现在培养约1小时后ATP完全消失。

实施例2

使用酶荧光测定方法在组织培养物中测定微量cAMP

(1)样品和反应混合物的制备

A.生物样品的制备

(心室肌细胞的制备)

分离的心室肌细胞得自在原代培养物中培养的1天龄大鼠的心脏。每个心脏中约有5百万个存活的心肌细胞。在以约1百万个细胞/100mm的密度进行铺板后，使培养皿中的细胞生长在具有含5％胎牛血清细胞的Hanks平衡盐溶液的最小必需培养基中。Simpsom等，Cir.Res.，51，787(1982)。在第4天时，改变培养基。培养物中含有＞90％心肌细胞且随着时间推移细胞数量保持恒定。Simpsom等，Cir.Res.，51，787(1982)；Rocha-Singh，J.Clin.Invest.，88，204(1991)；和Rocha-Singh，J.Clin.Invest.，88，706(1991)。

将6个平板的肌细胞随机划分成2组(n＝3个平板/组)。将磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBXM)加入到各组培养基中以使最终浓度为2μM。5分钟后，将异丙基肾上腺素加入到刺激组中以使最终浓度为1μM，而对照组不接受其它药物。5分钟后，用总计5mL的100％乙醇洗脱来自所有6个平板的细胞和不含细胞的培养基平板。从各平皿中除去1/10的洗脱液(0.5mL)并在12×75mm硼硅酸盐玻璃试管内风干且在-80℃下储存。类似地，将剩余的4.5mL风干并储存。在检测时，将沉淀融化并重新悬浮于100μL的0.5N高氯酸中。在4℃下将提取物搅拌2分钟并使用超声波仪(Branson Cleaning Equipment Co.A Smith-Kline Co.，USA)超声处理1分钟。将该提取物用25μL的2N KOH中和、以2000g离心30分钟并取出80μL上清液用于检测。

B.清除反应混合物的制备

(参见步骤1-清除反应)

将1摩尔400μL Tris-HCl(pH 8.0)、0.2mM 40μL MgCl₂、500U/mL 32μL腺苷三磷酸双磷酸酶、400U/mL 100μL腺苷脱氨酶、4000U/mL 4μL碱性磷酸酶混合并向该混合物中加入水至总体积为4mL以便制备清除反应混合物(表2)。

表2清除反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HCl pH8.0 100mM

MgCl₂ 2mM

腺苷三磷酸双磷酸酶 4U/mL

腺苷脱氨酶 10U/mL

碱性磷酸酶 40U/mL

水加至总体积为4mL

在冰上将实施例2(1)中制备的大鼠心室肌细胞制备物冷却后，向所述制备物(preparation)中加入0.4μL步骤1-可选择的清除反应的反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0；3mM MgCl₂；3U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶；150μg/mL腺苷脱氨酶；30U/mL碱性磷酸酶和75μg/mL糖原磷酸化酶-α)以便除去所有的内源性腺嘌呤核苷酸、糖原和葡糖-6-磷酸。在37℃下培养小时后，通过在80℃下加热30分钟使酶失活。

C.转化反应混合物的制备

(参见步骤2-转化反应和步骤2-可选择的转化反应)

将400μL 1M Tris-HCl(pH 8.0)、40μL 0.2mM MgCl₂、10μL 40％牛血清清蛋白、600μL 1M KCl、80μL 0.01M二硫苏糖醇、16μL 0.1μM ATP、24μL0.5M磷酸烯醇丙酮酸、24μL 2U/mL磷酸二酯酶、24μL 720U/mL肌激酶和160μL 2000U/mL丙酮酸激酶混合并向该混合物中加入水至总体积为4mL以便制备转化反应混合物(表3)。

表3转化反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HCl pH8.0 100mM

MgCl₂ 2mM

牛血清清蛋白 0.01％

KCl 150mM

二硫苏糖醇 2mM

ATP 40nM

磷酸烯醇丙酮酸 3mM

磷酸二酯酶 12mU/mL

肌激酶 4.5U/mL

丙酮酸激酶 80U/mL

水加至总体积为4mL

D.循环反应混合物的制备

(参见步骤3-检测循环反应2)

将400μL 1M Tris-HCl(pH8.0)、40μL 0.2mM MgCl₂、10μL 4％牛血清清蛋白、30μL 0.1M果糖、160μL 1500U/mL己糖激酶混合并向该混合物中加入水至总体积为4mL以便制备循环反应混合物(表4)。

表4循环反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HCl pH8.0 100mM

MgCl₂ 2mM

牛血清清蛋白 0.01％

果糖 3mM

己糖激酶 60mM

水加至总体积为4mL

E.检测反应混合物的制备

(参见步骤3-检测反应2)

将2000μL 1M Tris-HCl(pH8.0)、320μL 0.2mM EDTA、120μL 0.1MNADP⁺、6μL 3500U/mL磷酸葡糖异构酶、6μL 1750U/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶混合并向该混合物中加入水至总体积为4mL以便制备循环反应混合物(表5)。

表5检测反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HCl pH8.0 100mM

EDTA 3.2mM

NADP⁺ 0.01％

磷酸葡糖异构酶 1U/mL

葡糖-6-磷酸脱氢酶 0.5U/mL

水加至总体积为4mL

(2)使用酶荧光测定法在组织培养物中测定微量cAMP

根据包括一系列清除反应、转化反应、循环反应和检测反应在内的酶荧光测定法测定作为样品的(A)中制备的心室肌细胞制备物中的cAMP。

1)清除反应

(步骤1-清除反应)

将3μL体积的中和的肌细胞提取物(来自100mm平板的2.4％或0.24％的总洗脱液)或3μL的ATP标准物(0、3.6、7.2、14.4、21.6和28.8pmol/20μL)加入到10×57Pyrex^_检测管(Iwaki Glass Co.)内。当在室温下时，向各检测管内加入25μL由(B)制备的清除反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0；2mMMgCl₂；2U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶；10U/mL腺苷脱氨酶；40U/mL碱性磷酸酶)。在37℃下将该混合物培养10分钟。然后通过在90℃下加热30分钟使酶失活。按照类似方式制备内部组织空白对照。

2)转化反应

(步骤2-转化反应(转化成AMP)和可选择的转化反应(转化成ATP))

向来自清除反应的各检测管内加入25μL体积的由(C)制备的转化反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0、2mM MgCl₂、0.01％牛血清清蛋白、150mMKCl、2mM二硫苏糖醇、40nM ATP、3mM磷酸烯醇丙酮酸、12U/mL磷酸二酯酶、4.5U/mL肌激酶和80U/mL丙酮酸激酶)。在室温下将该混合物培养过夜。通过在90℃下将检测管加热5分钟使反应终止。

3)循环反应

(步骤3-检测循环反应2)

向来自转化反应的各检测管内加入25μL体积的由(D)制备的循环反应混合物(100mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM MgCl₂、0.01％牛血清清蛋白、3mM果糖、60U/mL己糖激酶)。鉴于每次反应中酶的浓度较高，所以重要的是在0℃下设定这些反应以便确保所有检测管具有相同的起始时间。在37℃下将该混合物培养2小时(约4000-10000次循环)。

4)检测反应

(步骤3-检测反应2)

向来自循环反应的各检测管内加入125μL体积的由(E)制备的检测反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0、3.2mM EDTA、0.6mM NADP⁺、1U/mL磷酸葡糖异构酶、0.5U/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶)。在室温下20分钟后，使用荧光计(Optical Technology Devises，Inc.，NY)测定NADPH的最终浓度。设定该荧光计使得10个荧光单位的读数相当于溶于900μL缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0)中的1nmol NADPH溶液。

使用已知浓度的合适底物通过同时检测内部对照来检验各测定步骤，例如，使用另外的ATP来检测清除反应、使用AMP标准曲线来评估转化反应并使用ATP标准曲线来评估循环反应。

5)结果

在340nm处来自cAMP标准物(0、3.6、7.2、14.4、21.6和28.8pmol/20μL)的吸光度测量值产生了附图2中所示的cAMP标准曲线。

对照组没有接收附加的药物，使用cAMP标准曲线(附图2)测定来自各平板细胞的1/10洗脱液的来自(1)A的异丙基肾上腺素刺激的细胞的cAMP值，从而得到cAMP的实际值为680pmol/100mm平板。

使用本发明的荧光测定法、免疫显色定量分析(Amersham InternationalCo.)和放射性免疫测定法(Amersham International Co.)，对cAMP含量的测定结果如附图3中所示。测定cAMP产生的数据与商业上可得到的放射性测定法获得的数据充分一致，变异性通常低于5％。

此外，由使用本发明的测定法、放射性免疫测定法和Salomon的方法对cAMP的定量测定结果来确定腺苷酸环化酶的活性。来自运三种方法的数据如附图4中所示。通过每分钟由1mg蛋白质产生的cAMP的量(pmol)来评估腺苷酸环化酶活性的值。

实施例3

将各适量的1M Tris-HCl(pH8.0)、0.2mM MgCl₂、1M K₂HPO₄、0.1mMAMP、4000U/mL碱性磷酸酶和10mg/mL糖原磷酸化酶混合并向该混合物中加入水以便制备如下所示的最终浓度的清除反应混合物。

表6清除反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HCl pH8.0 100mM

MgCl₂ 2mM

K₂HPO₄ 5mM

AMP 0.1mM

碱性磷酸酶 20U/mL

糖原磷酸化酶 10μg/mL

水

将各适量的1M Tris-HCl(pH8.0)、0.1mM MgCl₂、1M K₂HPO₄、0.1MAMP、0.1M二硫苏糖醇、1mM葡糖-1，6-二磷酸、4％牛血清清蛋白、0.1MNADP和10mg/mL糖原磷酸化酶、10mg/mL葡糖磷酸变位酶以及5mg/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶混合并向该混合物中加入水以便制备如下所示的最终浓度的转化反应混合物。

表7转化反应混合物

化合物最终反应浓度

Tris-HC1 pH8.0 100mM

MgCl₂ 2mM

K₂HPO₄ 5mM

AMP 0.1mM

二硫苏糖醇 1mM

葡糖-1，6-二磷酸 4μM

牛血清清蛋白 0.01％

NADP 0.2mM

糖原磷酸化酶 20μg/mL

葡糖磷酸变位酶 4μg/mL

葡糖-6-磷酸脱氢酶 2μg/mL

水 -

1)清除反应

(步骤1-可选择的清除反应2)

制备包括206μM糖原的糖原水溶液并将其分布入12Pyrex^_检测管(Iwaki Glass Co.，10×57mm)内，以0、20、40和80μL量各装3只试管，且向各检测管内加入水至总体积为80μL。在室温下，向各检测管内加入500μL的清除反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0；2mM MgCl₂；5mMK₂HPO₄；0.1mM AMP；20U/mL碱性磷酸酶和10μg/mL糖原磷酸化酶)。将该混合物在37℃下培养60分钟。

2)检测反应

(步骤3-检测反应1)

向各检测管内加入500μL体积的转化反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0、2mM MgCl₂、5mM K₂HPO₄、0.1mM AMP、1mM二硫苏糖醇、4μM葡糖-1，6-二磷酸、0.01％牛血清清蛋白、0.2mM NADP、和20μg/mL糖原磷酸化酶、4μg/mL葡糖磷酸变位酶以及2μg/m葡糖-6-磷酸脱氢酶)。将该混合物在37℃下培养30分钟。在340nm的发射(exiting)波长处测定各检测管460nm的荧光波长。结果是，数据证实了通过清除反应完全除去了糖原溶液中的糖原。

实施例4

螯合剂对浑浊的预防作用

在实施例2中的循环反应后向各检测管内加入125μL体积的不含EDTA的检测反应混合物(100mM Tris-HCl，pH8.0、0.6M NADP⁺、1U/mL磷酸葡糖异构酶和0.5U/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶)。将该混合物在90℃下培养30分钟并使酶失活。用肉眼观测测试溶液中的浑浊情况。将来自实施例2的加入了含有EDTA的检测混合物的溶液用作对照物。在室温下用EDTA使对照物中的酶失活。

结果是，当对照物澄清时，通过加热失活的混合物变浑浊。

工业实用性

本发明提供了一种不使用放射性试剂下测定生物样品中cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的方法。

即，本发明的清除反应可以选择性且有效地除去作为cAMP测定中起干扰物质作用的诸如ATP、ADP和AMP这样的内源性非环腺嘌呤核苷酸以及葡糖-6-磷酸。在将样品中的cAMP转化成AMP后，将AMP以酶促方式转化成ATP。然后通过果糖-6-磷酸将ATP转化成葡糖-6-磷酸以便获得NADPH，最终通过荧光测定法测定NADPH的浓度。通过与NADPH的最终浓度的相关性，仅通过酶促或化学反应而不使用放射性试剂可以安全地获得cAMP含量或腺苷酸环化酶活性。

特别地，根据本发明，用于清除反应的酶限于腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷磷酸酶。此外，通过调节其浓度，本发明成功地使测定方法更为简便且其反应期限被大大缩短至约5-10分钟内，即为常规方法的1/12-1/6。

由于cAMP含量取决于细胞的富营养、增殖、分化、适应性以及灵敏度的改变，所以cAMP的测定提供了一种用于评估细胞存活力、内分泌激素轴功能、腺苷酸环化酶活性和磷酸二酯酶活性的有用方式。因此，cAMP含量的数值可以是基础医学和临床医学领域中的极佳指标。

按照本发明的方法，可以安全且以高灵敏度方式测定cAMP含量和相应于cAMP的腺苷酸环化酶活性。

Claims

1.一种除去生物样品中由内源性ATP、ADP和AMP组成的非环腺嘌呤核苷酸以及内源性葡糖-6-磷酸的方法，该方法包括用有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶处理所述样品以便除去所述的非环腺嘌呤核苷酸和葡糖-6-磷酸的步骤。

2.一种测定生物样品中cAMP含量的方法，该方法包括下列步骤：

清除反应：将生物样品与有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶合并以便除去由内源性ATP、ADP和AMP组成的非环腺嘌呤核苷酸以及内源性葡糖-6-磷酸；

转化反应：通过磷酸二酯酶将所述生物样品中的cAMP酶促转化成AMP；和

检测反应：在不使用放射性试剂的情况下测定AMP的量。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述的清除反应中进一步包括将所述生物样品与有效量的葡糖氧化酶、糖原磷酸化酶和碱性磷酸酶合并以便以酶促方式从所述生物样品中除去内源性糖原的步骤。

4.根据权利要求2所述的方法，其中在转化成AMP后用螯合剂使用于所述cAMP转化成AMP的转化反应中的酶失活。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的螯合剂是EDTA。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述的检测反应包括下列步骤：在有加入到所述样品中的无机磷酸存在的情况下通过使糖原磷酸化酶与糖原接触而使糖原转化成葡糖-1-磷酸并在体外用所述AMP激活所述转化反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的检测反应进一步包括下列步骤：将所述样品与有效量的葡糖磷酸变位酶合并以便将葡糖-1-磷酸转化成葡糖-6-磷酸且然后将所述样品与有效量的葡糖-6-磷酸脱氢酶合并而将葡糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADP⁺以便将葡糖-1-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH。

8.一种测定生物样品中cAMP含量的方法，该方法下列步骤：

清除反应：将生物样品与有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶合并以便以酶促方式除去非cAMP的内源性非环腺嘌呤核苷酸并除去内源性葡糖-6-磷酸；

转化反应：联合应用磷酸二酯酶、肌激酶和丙酮酸激酶将所述生物样品中的cAMP酶促转化成ATP；和

检测反应：联合应用己糖激酶和丙酮酸激酶将ATP酶促转化成果糖-6-磷酸，然后联合应用磷酸葡糖异构酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶将果糖-6-磷酸酶促转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH，并且在不使用放射性试剂的情况下测定NADPH的浓度。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述的清除反应中进一步包括将所述生物样品与有效量的葡糖氧化酶、糖原磷酸化酶和碱性磷酸酶合并以便以酶促方式从所述生物样品中除去内源性糖原的步骤。

10.根据权利要求8所述的方法，其中在所述的清除反应中，非cAMP的内源性非环腺嘌呤核苷酸是ATP、ADP、AMP及其混合物中的一种或多种。

11.根据权利要求8所述的方法，其中在所述的检测反应中，在转化非环腺嘌呤核苷酸后用一种螯合剂使用于将ATP转化成果糖-6-磷酸的酶失活。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的螯合剂是EDTA。

13.根据权利要求1、2或8所述的方法，其中所述的生物样品是一种哺乳动物组织。

14.根据权利要求1、2或8所述的方法，其中所述的生物样品是一种生理液体。

15.一种用于测定生物样品中cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的试剂盒，它包括：

(1)清除反应用小瓶，它装有有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶以便除去生物样品中由内源性ATP、ADP和AMP组成的非环腺嘌呤核苷酸以及内源性葡糖-6-磷酸；

(2)转化反应用小瓶，它装有有效量的磷酸二酯酶以便以酶促方式将生物样品中的cAMP转化成AMP；和

(3)检测反应用小瓶，它装有用于将糖原转化成葡糖-1-磷酸的糖原、无机磷酸和糖原磷酸化酶、用于将葡糖-1-磷酸转化成葡糖-6-磷酸的葡糖磷酸变位酶和用于将葡糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH的葡糖-6-磷酸脱氢酶和NADP⁺。

16.一种用于测定生物样品中cAMP含量或腺苷酸环化酶活性的试剂盒，它包括：

(1)清除反应用小瓶，它装有有效量的腺苷三磷酸双磷酸酶、碱性磷酸酶和腺苷脱氨酶以便以酶促方式除去生物样品中非cAMP的内源性非环腺嘌呤核苷酸并除去内源性葡糖-6-磷酸；

(2)转化反应用小瓶，它装有有效量的磷酸二酯酶、ATP、肌激酶、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶以便以酶促方式将所述生物样品中的cAMP转化成ATP；和

(3)检测反应用小瓶，它装有用于将ATP转化成果糖-6-磷酸的果糖和己糖激酶、用于将果糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖酸内酯和NADPH的磷酸葡糖异构酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶和NADP⁺。