CN1495261A

CN1495261A - 咖啡因生物合成体系基因组的联合利用

Info

Publication number: CN1495261A
Application number: CNA031502431A
Authority: CN
Inventors: 上藤洋敬; 彦; 佐野浩; 小泉望; 新名惇彦
Original assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC
Current assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC
Priority date: 2002-07-23
Filing date: 2003-07-22
Publication date: 2004-05-12
Also published as: JP2004049162A; US20040128709A1; EP1386970A1

Abstract

提供一种在咖啡因生物合成反应体系中，联合利用分别催化这些反应的酶和分别编码这些酶的基因的方法。该方法为：将酶a.c.d.和细胞提取物b.的2个或2个以上组合，在生物体外，通过进行黄嘌呤核苷的甲基化、7－甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、7－甲基黄嘌呤的甲基化和/或可可碱的甲基化反应，生产7－甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因的方法。a.是催化在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化，具有序列1所示氨基酸序列的酶；b.是催化在嘌呤环9位的7－甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化，由大肠杆菌得到的细胞粗提取物；c.是催化在嘌呤环3位的7－甲基黄嘌呤的甲基化，具有序列4所示氨基酸序列的酶；d.是催化在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，具有序列7所示氨基酸序列的酶。

Description

咖啡因生物合成体系基因组的联合利用

技术领域

本发明涉及催化从黄嘌呤核苷开始经7-甲基黄嘌呤核苷、7-甲基黄嘌呤、可可碱从而生物合成咖啡因的一系列反应体系各步骤的黄嘌呤核苷甲基化酶、7-甲基黄嘌呤甲基化酶(可可碱合成酶)和3，7-二甲基黄嘌呤甲基化酶(咖啡因合成酶)，及联合利用编码这些酶的多个咖啡因生物合成体系基因的方法，即将上述多个酶以2个或2个以上组合使用的方法，以及将上述多个咖啡因生物合成体系基因的2个或2个以上组合使用的方法。

背景技术

咖啡因是在咖啡树(Coffea)、茶树(Camellia sinensis)、可乐树(colaacuminate)及古柯(Ilex paraguariensis)等植物物种中生物合成的嘌呤环生物碱。由于咖啡因具有中枢神经兴奋作用等各种药理作用，被作为医药品广泛应用。另外，由于这些化合物对昆虫等有厌食效果和杀虫效果，也有作为农药使用的可能性。

目前，咖啡因通过从上述植物中提取或化学合成方法制造。因此，为了更便宜、大规模地供给咖啡因，希望开发一种利用基因重组技术，使本来无法生物合成咖啡因的微生物或植物能生产咖啡因。另外，还期待将在植物中生产咖啡因的技术用作使植物直接避免食草动物虫害的方法。

咖啡树或茶树，以作为腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸的降解代谢中间产物的黄嘌呤核苷为原料，经7-甲基黄嘌呤核苷、7-甲基黄嘌呤、可可碱，最后生物合成为咖啡因(图1)。这一系列反应由黄嘌呤核苷甲基化酶、7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶、可可碱合成酶和咖啡因合成酶催化。编码可可碱合成酶的CaMXMT cDNA已经从咖啡树中分离出来(参见Ogawa et al.，J.Biol.Chem.，276，8213～8218(2001))。另外，在特开2001-37490号公报中记载了催化7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡因的2阶段的甲基化反应的甲基化酶的氨基酸序列及编码该酶的碱基序列。同一公报中还记载了在生物合成甲基黄嘌呤类(7-甲基黄嘌呤、1，7-二甲基黄嘌呤、可可碱和咖啡因)的植物中，导入具有所述碱基序列的DNA，改变甲基黄嘌呤类的组成的方法。但是，在本来不能生物合成甲基黄嘌呤类的生物物种中生产这些化合物的技术，目前还属未知。

发明内容

本发明的目的是提供一种催化从黄嘌呤核苷开始经由7-甲基黄嘌呤核苷、7-甲基黄嘌呤、可可碱从而生物合成咖啡因的一系列反应的酶，以及联合利用分别编码这些酶的基因的方法。例如，根据本发明能够实现以下目的。(1)将分别催化上述一系列咖啡因生物合成反应体系各步骤的多个酶以2个或2个以上组合使用，由黄嘌呤核苷生产甲基黄嘌呤类(7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因)。(2)改变本来无法生物合成甲基黄嘌呤类的生物的代谢，使其生产这些化合物。(3)利用上述(2)的方法，使植物防御食草动物的虫害。

本发明者们为解决上述课题进行了反复深入的研究，结果获得了以下发现。首先，通过PCR扩增具有序列表的序列号：2、5和8中所示碱基序列的DNA片段。然后，将这些DNA片段连接在表达载体中，之后将得到的重组载体导入大肠杆菌，使来自所述DNA的重组蛋白质大量表达。将所述重组蛋白质粗提或纯化，研究其酶学性质时可以确认如下事实：来自序列号：2的酶催化由黄嘌呤核苷的甲基化生成7-甲基黄嘌呤核苷的反应，来自序列号：5的酶催化由7-甲基黄嘌呤的甲基化生成可可碱的反应，来自序列号：8的酶催化由可可碱的甲基化生成咖啡因的反应。即，可以确认所述DNA组分别编码黄嘌呤核苷甲基化酶、可可碱合成酶和咖啡因合成酶。另外还可以确认大肠杆菌的细胞提取物催化由7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化生成7-甲基黄嘌呤的反应。即，可以确认本来无法生物合成甲基黄嘌呤类的大肠杆菌细胞提取物也具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶(7-甲基黄嘌呤核苷水解酶或7-甲基黄嘌呤核苷磷酸酸解酶)活性。还可以确认上述3种重组蛋白质与大肠杆菌细胞提取物的混合物催化由黄嘌呤核苷生成咖啡因的反应。即，可以确认使用3种所述甲基化酶活性与1种所述脱核糖化酶活性，在生物体外即无细胞体系中，能够再构成咖啡因的生物合成路径，也就是说能够人工构成。

所述咖啡因生物合成路径的再构成中使用的酶和细胞提取物，只要是具有与这些物质同等活性的，从任一种生物得到的物质都能够适用。例如代替从咖啡树得到的可可碱合成酶和咖啡因合成酶，可以使用特开2001-37490号公报中记载的、从茶树得到的催化7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡因的2阶段甲基化反应的甲基化酶。

另外，咖啡因生物合成路径的再构成，使用上述的酶及细胞提取物，不仅在无细胞体系内进行，也可以在将编码这些酶的基因导入任一生物物种得到的转化生物体内进行。咖啡因生物合成原料黄嘌呤核苷作为嘌呤核苷酸降解代谢的中间产物，不仅存在于咖啡树或茶树中，还存在于广泛的生物物种内。另外，已知嘌呤核苷酸脱核糖化酶通常不仅对特定的嘌呤核苷酸衍生物反应，也对各种嘌呤核苷酸衍生物反应(参见Guranowski，Plant Physiol.，70，344～349(1 982)；Parkin，J.Biol.Chem.，271，21713～21719(1996)；Ogawa et al.，Appl.Environ.Microbiol.，67，1783～1787(2001))，一般认为7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化反应可以由生物通常具有的嘌呤核苷酸脱核糖化酶催化。这一事实从本来无法生物合成甲基黄嘌呤类的大肠杆菌具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性可以容易地理解(参照本说明书的实施例)。即，在广范围的生物物种中，通过导入黄嘌呤核苷甲基化酶基因、可可碱合成基因和咖啡因合成基因，使其表达，能够再构成咖啡因生物合成路径。

本发明是在上述认识的基础上完成的。

下面详细说明本发明。

本申请的第1项发明是在下述酶(a)(c)(d)及细胞提取物(b)的2种或2种以上的组合的催化作用下，在生物体外，通过进行在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化、在嘌呤环9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化、和/或在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，生产7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因的方法。

(a)是具有催化在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化的活性，具有序列表的序列号：1中所示氨基酸序列的酶，

(b)是具有催化在嘌呤环9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化的活性，由大肠杆菌得到的细胞粗提取物，

(c)是具有催化在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化的活性，具有序列表的序列号：4中所示氨基酸序列的酶，

(d)是具有催化在嘌呤环1位的可可碱的甲基化的活性，具有序列表的序列号：7中所示氨基酸序列的酶。

在第1项发明中，也可以将酶(a)(c)(d)及细胞提取物(b)中的至少一个替换为具有同等活性的物质。

接下来，就涉及根据本发明的转化生物体的咖啡因生物合成路径的再构成方法的第2～8项发明进行说明。

本发明的第2项发明是一种生产可可碱或咖啡因的方法，是使下述DNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合在宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。更详细地说就是，使下述DNA分子(a)(b)(c)中(a)+(b)的组合或(a)+(b)+(c)的组合在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

(a)是编码催化在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：2中所示碱基序列的DNA分子，

(b)是编码催化在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：5中所示碱基序列的DNA分子，

(c)是编码催化在嘌呤环1位的可可碱的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：8中所示碱基序列的DNA分子。

本发明的第3项发明是一种生产可可碱或咖啡因的方法，是使下述DNA分子(b)和(c)的组合在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

本发明的第4项发明是一种改变可可碱或咖啡因的产量的方法，是使下述DNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内表达，改变可可碱或咖啡因的产量的方法。

(b)编码催化在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：5中所示碱基序列的DNA分子，

第2～4项发明中也可以将DNA分子(a)(b)(c)中的至少一个替换为具有同等功能的物质。

本发明的第5项发明涉及一种生产可可碱或咖啡因的方法，是使下述RNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合在宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法，更详细地说就是，使下述RNA分子(a)(b)(c)中的(a)+(b)的组合或(a)+(b)+(c)的组合在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

(a)是编码催化在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：3中所示碱基序列的RNA分子，

(b)是编码催化在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：6中所示碱基序列的RNA分子，

(c)是编码催化在嘌呤环1位的可可碱的甲基化的酶的、具有序列表的序列号：9中所示碱基序列的RNA分子。

本发明的第6项发明是一种生产可可碱或咖啡因的方法，是使下述RNA分子(b)和(c)的组合在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

本发明的第7项发明是一种改变可可碱或咖啡因产量的方法，是使下述RNA分子(a)(b)(c)的2种或2种以上的组合在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内表达，改变可可碱或咖啡因的产量的方法。

本发明的第5～7项发明中可以将RNA分子(a)(b)(c)中的至少一个替换为具有同等功能的物质。

本发明的第8项发明是，在上述第2～7项发明中，宿主生物是植物，通过生产或增产可可碱或咖啡因，使宿主植物防御食草动物的虫害的方法。

第1项发明涉及无细胞体系的咖啡因生物合成路径的再构成方法，在下述酶(a)(c)(d)及细胞提取物(b)中的2种或2种以上的组合催化作用下，在生物体外，通过进行在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化、在嘌呤环9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化、和/或在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，生产7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因的方法。

本说明书中，将催化上述黄嘌呤核苷的甲基化的黄嘌呤核苷甲基化酶、催化7-甲基黄嘌呤的甲基化的可可碱合成酶和催化可可碱的甲基化的咖啡因合成酶总称为咖啡因合成体系甲基化酶。

第1项发明中，可以用具有与酶(a)(b)(c)及细胞提取物(b)同等活性的物质替换至少其中之一。例如代替从咖啡树得到的可可碱合成酶和咖啡因合成酶，可以使用特开2001-37490号公报中记载的由茶树得到的催化7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡因的2阶段甲基化反应的甲基化酶。

本说明书中，将上述(a)及与其同等的物质总称为黄嘌呤核苷甲基化酶，将(b)及与其同等的物质总称为7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶，将(c)及与其同等的物质总称为可可碱合成酶，将(d)及与其同等的物质总称为咖啡因合成酶。

作为上述的酶及细胞提取物的组合的例子可以举出用于从黄嘌呤核苷合成咖啡因的(a)+(b)+(c)+(d)的组合、用于从黄嘌呤核苷合成可可碱的(a)+(b)+(c)的组合、用于从7-甲基黄嘌呤合成咖啡因的(c)+(d)的组合。

与本发明的转化生物体的咖啡因生物合成路径的再构成方法有关的第2项发明是一种生产可可碱或咖啡因的方法，是使下述DNA分子(a)(b)(c)中的(a)+(b)的组合或(a)+(b)+(c)的组合，在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

第2项发明中，为从黄嘌呤核苷合成咖啡因使用(a)+(b)+(c)的组合，为从黄嘌呤核苷合成可可碱使用(a)+(b)的组合。

第3项发明是使下述DNA分子(b)和(c)的组合在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

第4项发明是使下述DNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内表达，改变可可碱或咖啡因的产量的方法。

第2～4项发明中，可以用具有与DNA分子(a)(b)(c)同等功能的物质替换至少其中之一。

第2～4项发明中，通过在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化、在嘌呤环9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化、和/或在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，得到7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因。

第5项发明是使下述RNA分子(a)(b)(c)中的(a)+(b)组合或(a)+(b)+(c)组合在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

第5项发明中，为了从黄嘌呤核苷合成咖啡因使用(a)+(b)+(c)的组合，为了从黄嘌呤核苷合成可可碱使用(a)+(b)的组合。

第6项发明是使下述RNA分子(b)和(c)的组合在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法。

第7项发明是使下述RNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内表达，改变可可碱或咖啡因的产量的方法。

第5～7项发明中，可以用具有与RNA分子(a)(b)(c)相同功能的物质替换至少其中之一。

第5～7项发明中，通过在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化、在黄嘌呤9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化、和/或在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，得到7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因。

本发明的第8项发明是，在第2～7项发明中，宿主生物是植物，通过生产或增产可可碱或咖啡因，使宿主植物防御食草动物的虫害的方法。

编码上述咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子，例如通过使用特异性杂交的寡核苷酸作为引物的PCR技术(《植物的PCR试验方法》(细胞工学增刊，植物细胞工学丛书2)秀润社(1995))，可以从生产咖啡因生物合成体系甲基化酶的生物分离出来。

对于编码上述咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子，将其全长或一部分用作探针，通过对从生产咖啡因生物合成体系甲基化酶的生物得到的cDNA文库或基因组文库进行杂交筛选(生物实验イラストレイテツド4，简易筛选方法(细胞工学增刊，目视实验手册系列)秀润社(1 997))，由此可以进行分离。

通过这样的PCR技术、杂交筛选方法或其他方法得到的编码咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子，只要其翻译产物具有目的甲基化酶活性，可以是任何碱基序列，不一定必需与序列号：2、5或8的任一碱基序列具有同源性。

为了分离编码上述咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子而使用的生物，可以使用任意一种能够生成甲基黄嘌呤类的生物，为了分离具有序列号：2、5或8的任一碱基序列的DNA分子、或与其具有同源性的DNA分子，优选咖啡树(Coffea)属植物、山茶(Camellia)属植物、可乐树(Cola)属植物、冬青树(Ilex)属植物和可可树(Theobroma)属植物等。

编码上述的咖啡因生物合成体系甲基化酶的RNA分子，可以如下得到：在称为Sp6 RNA启动子、T7启动子的RNA聚合酶识别的启动子的下游，连接用上述方法得到的咖啡因生物合成体系甲基化酶DNA，利用Sp6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶等转录来得到。通过在动物或植物病毒中插入编码咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA或RNA，或如后述那样通过在适当的基因表达盒内插入咖啡因生物合成体系甲基化酶DNA，形成重组分子，通过将此重组分子导入宿主生物，利用宿主生物的转录活性来得到。

为了从编码上述咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子或RNA分子表达、调节重组蛋白质，可以利用1)原核细胞表达体系、2)酵母表达体系、3)植物细胞表达体系、4)昆虫细胞表达体系、5)哺乳类细胞表达体系、6)体外转录/翻译体系等。

为了得到上述重组蛋白质的纯化试样，1)原核细胞表达体系最为有用，例如使用GST Gene Fusion System(Amersham Biosciences)时，从载体的构建到重组蛋白质的表达及纯化，可以完全按照附带的说明书进行。

为了鉴定编码上述咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子或RNA分子的功能，用上述方法获取重组蛋白质(粗提取物或纯化物)，培养由重组蛋白质、甲基受体(黄嘌呤核苷、7-甲基黄嘌呤或可可碱)和甲基供体(S-腺苷-L-蛋氨酸)组成的酶促反应液，用TLC或HPLC分析此酶促反应液中的产物。(参照本说明书的实施例)

通过联合利用编码上述咖啡因生物合成体系甲基化酶的DNA分子或RNA分子，能否再构成咖啡因生物合成路径，可以通过下述方法确定：用上述方法获取重组蛋白质(粗提取物或纯化物)，培养由2种或2种以上的重组蛋白质、甲基受体(黄嘌呤核苷或7-甲基黄嘌呤)和甲基供体(S-腺苷-L-蛋氨酸)组成的酶促反应液，用TLC或HPLC分析此酶促反应液中的产物。(参照本说明书的实施例)

根据本发明的转化生物体的咖啡因生物合成路径的再构成方法，只要能满足下述1)或2)中的任一条件即可以作为宿主使用。1)生物合成黄嘌呤核苷、具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性；2)生物合成7-甲基黄嘌呤。

即使是满足上述条件的生物物种中，对于甲基黄嘌呤类的毒性，植物一般较强，适合作为宿主使用。

就根据本发明的转化生物体的咖啡因生物合成路径的再构成方法，下面说明利用植物作为宿主的例子。

植物中的基因表达可以利用将含有下列1)-3)等的表达盒导入植物细胞内，将其进行转化的方法。1)能从宿主细胞内的DNA向mRNA转录的启动子，2)在启动子下游以有意(sense)方向连接的咖啡因生物合成体系甲基化酶DNA，3)含有根据需要连接在所述DNA下游的为稳定转录产物所需的聚腺苷酸化部分的终止密码子序列。

上述的表达盒可以含有用于使插入的DNA恒定地或诱导性地表达的启动子。作为用于恒定表达的启动子，例如可以举出花椰菜花叶病毒的35S启动子、水稻的肌动蛋白(actin)基因启动子等。作为用于诱导性表达的启动子可以举出通过病原菌的感染和侵入活化的水稻的壳多糖酶基因启动子、烟草的PR蛋白质基因启动子、通过侵害活化的烟草WIPK基因启动子等。

为了在植物细胞中导入表达盒，可以使用各种方法。这些方法中包括直接导入法(粒子轰击法、电穿孔法、显微注射法)，使用根癌土壤杆菌(Agrobacterim tumefaciens)作为转化子的T-DNA导入法，及其他可能的方法。

直接导入法中无需特别必要的载体。可以使用例如pUC衍生物等单纯的质粒。T-DNA导入法中必需使用含有T-DNA的边界序列的双元(binary)载体等。

通过表达盒的导入而转化的植物细胞，按照常法经过再生过程，能够转化为植物组织或植物体。

为了再构成咖啡因生物合成路径，必需在植物细胞内导入2种或2种以上的表达盒。

采用直接导入法时，通过向植物细胞导入含有多种表达盒的单一载体、或含有单一或多个表达盒的多个载体，能够得到再构成咖啡因生物合成路径的转化体。另外，向植物细胞内导入含有单一或多个表达盒的单一载体，通过将得到的转化体与其他的转化体交配，也能够得到再构成咖啡因生物合成路径的转化体。

使用T-DNA导入法时，通过导入含有多种表达盒的单一T-DNA，能够得到再构成咖啡因生物合成路径的转化体。另外向植物细胞内导入含有单一或多个表达盒的单一T-DNA，将得到的转化体与其他的转化体交配，由此能够得到再构成咖啡因生物合成路径的转化体。

由这些方法得到的植物体(包括组织或细胞)、或从繁殖材料(种子、块茎、切等)得到的植物体，再构成了咖啡因生物合成路径，可以生成甲基黄嘌呤类即7-甲基黄嘌呤、可可碱、咖啡因中的至少一种。

对于再构成咖啡因生物合成路径的植物，可以通过HPLC分析确定甲基黄嘌呤类的产量或生成比等。此HPLC分析可以在与本说明书的实施例中所示条件相同的条件下进行。

通过咖啡因生物合成路径的再构成而生成可可碱或咖啡因的植物，对食草动物(昆虫类、蛞蝓、蜗牛等)有厌食效果和杀虫效果。即，此植物有内在的农药效果。

附图说明

图1是表示咖啡树及茶树主要的咖啡因生物合成路径的流程图。结构式下面记载有化合物的名称。SAM表示S-腺苷-L-蛋氨酸、SAH表示S-腺苷-L-高半胱氨酸。(1)的反应通过黄嘌呤核苷甲基化酶催化，(2)的反应通过7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶催化，(3)的反应通过7-甲基黄嘌呤甲基化酶(可可碱合成酶)催化，(4)的反应通过3，7-二甲基黄嘌呤甲基化酶(咖啡因合成酶)催化。

图2是pGEX-CaMTL3载体、pGEX-CaMTL4载体及pGEX-CaMTL5载体的示意图。所述载体是如下构建的：在通过tac启动子(Ptac)控制的谷胱甘肽S-转移酶基因(GST)的下游，连接作为推断的甲基化酶基因(MTL)的CaMTL3 cDNA(序列号：2)、CaMTL4 cDNA(序列号：5)或CaMTL5 cDNA(序列号：8)。图中示出了氨苄青霉素抗性基因(Amp^r)、Lac抑制体基因(LacI^q)、pBR322复制起点(pBR322ori)。

图3示出了通过SDS-PAGE分析检测重组蛋白质。将GST的粗提试样、GST与CaMTL3的融合蛋白质(GST-MTL3)的粗提试样(图3中表示为粗提试样MTL3)、GST纯化试样、GST与CaMTL3的融合蛋白质(GST-MTL3)的纯化试样(图3中表示为纯化试样MTL3)、GST与CaMTL4的融合蛋白质(GST-MTL4)的纯化试样(图3中表示为纯化试样MTL4)及GST与CaMTL5的融合蛋白质(GST-MTL5)的纯化试样(图3中表示为纯化试样MTL5)用9％凝胶分离后，通过考马斯亮蓝染色检测蛋白质。星形标记表示重组蛋白质带。

图4示出了通过薄层色谱法(TLC)分析检测酶促反应产物。使用图3所示重组蛋白质试样，进行酶促反应。左侧的板表示展开酶促反应液后，通过放射自显影检出的附加甲基(¹⁴C标记)的酶促反应产物的点的状态。左侧板上部示出了酶促反应中使用的甲基受体，左侧板下部示出了酶促反应的特异性产物。右侧的板表示标准品展开后，通过紫外光照射检出的标准品的点的状态。左例和右侧的板是将一块TLC板展开后分成2块形成的。左侧和右侧的板之间示出原点和迁移率。XR表示黄嘌呤核苷、7mXR表示7-甲基黄嘌呤核苷、7mX表示7-甲基黄嘌呤、SAM表示S-腺苷-L-蛋氨酸。

图5示出通过TLC分析检测酶促反应产物。使用图3所示重组蛋白质试样进行酶促反应。左侧板示出酶促反应液展开后，通过放射自显影检出附加甲基(¹⁴C标记)的酶促反应产物的点的状态。左侧板的上部表示酶促反应中使用的甲基受体，左侧板下部表示酶促反应的特异性产物。右侧板示出展开标准品后，通过紫外线照射检出标准品的点的状态。左侧和右侧的板是将一块TLC板展开后分成2块形成的。左侧和右侧的板之间示出原点和迁移率。7mX表示7-甲基黄嘌呤、Tb表示可可碱、Px表示1，7-二甲基黄嘌呤、Cf表示咖啡因、SAM表示S-腺苷-L-蛋氨酸。

图6示出了通过TLC分析检测酶促反应产物。使用图3所示重组蛋白质试样进行酶促反应。左侧板示出酶促反应液或其纯化物(以星形标记表示的道)展开后，通过放射自显影检出的附加甲基(¹⁴C标记)的酶促反应产物的点的状态。左侧板的上部表示酶促反应中使用的甲基受体，下部表示酶促反应的特异性产物。右侧板示出标准品展开后，通过紫外光照射检出标准品的点的状态。左侧和右侧的板是将一块TLC板展开后分成2块形成的。左侧和右侧的板之间示出原点和迁移率。7mX表示7-甲基黄嘌呤、Tb表示可可碱、Px表示1，7-二甲基黄嘌呤、Cf表示咖啡因、SAM表示S-腺苷-L-蛋氨酸。

图7示出通过HPLC分析检测酶促反应产物。使用图3所示重组蛋白质试样，作为甲基受体仅使用黄嘌呤核苷进行酶促反应。(A)表示仅使用粗提MTL3进行的酶促反应液的色谱图，(B)表示使用粗提MTL3及纯化MTL4进行的酶促反应液的色谱图，(C)表示使用粗提MTL3、纯化MTL4及纯化MTL5进行的酶促反应液的色谱图。(D)表示标准品的色谱图。黑色箭头表示特异性产物及标准品峰。白色箭头表示杂质峰。7mX表示7-甲基黄嘌呤、Tb表示可可碱、Cf表示咖啡因。

实施例

通过下述实施例具体地说明本发明。但是本发明的范围不被实施例所限定。

(1)从来自咖啡树的mRNA合成双链cDNA

通过CTAB法(参照Chang et al.，Plant Mol.Biol.Rep.，11，113～116(1993))，从5g的咖啡树(Coffea arabica)未成熟果实提取总RNA。使用PolyATtract mRNA Isolation System III(Prome ga)从100μg的总RNA纯化mRNA。使用5μg的mRNA和ZAP-cDNA合成试剂盒(Synthesis Kit，Stratagene)合成双链cDNA。

(2)分离与CaMXMT cDNA和CaMTL3 cDNA具有同源性的新型cDNA

合成以CaMXMT cDNA(DDBJ/GenBank/EMBL accession numberAB048794)和CaMTL3 cDNA(序列号：5、DDBJ/GenBank/EMBLaccession number AB048793)的保存序列为基础设计的CaCS-N2引物(5-ATGG AGCTCCAAGAAGTCCT-3)和CaCS-C1引物(5-CTTTTACACGTCTGACT TCTCTG-3)。使用上述cDNA、上述引物和Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造)进行PCR，扩增cDNA片段组。将此cDNA片段组插入载体pBluescript II KS-(Stratagene)的EcoRV位点，制成质粒文库。对从质粒文库中任意选择的质粒克隆，进行碱基序列测定，分离CaMTL3 cDNA(序列号：2)及与其具有高度同源性的新型CaMTL4 cDNA(序列号：5)及CaMTL5 cDNA(序列号：8)。

(3)构建GST融合蛋白质表达载体

从质粒克隆中切出CaMTL3 cDNA、CaMTL4 cDNA及CaMTL5cDNA，将其分别插入pGEX-4T-2载体(Amersham Biosciences)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游。通过上述操作，构建用于表达GST与CaMTL3的融合蛋白质(GST-MTL3)的pGEX-CaMTL3载体，用于表达GST与CaMTL4的融合蛋白质(GST-MTL4)的pGEX-CaMTL4载体，及用于表达GST与CaMTL5的融合蛋白质(GST-MTL5)的pGEX-CaMTL5载体。这样得到的pGEX-CaMTL3载体、pGEX-CaMTL4载体及pGEX-CaMTL5载体示意性地表示于图2中。图2中，各载体是在通过tac启动子(Ptac)控制的谷胱甘肽-S-转移酶基因(GST)的下游，连接作为推定的甲基化酶基因(MTL)的CaMTL3cDNA(序列号：2)、CaMTL4 cDNA(序列号：5)、CaMTL5 cDNA(序列号：8)，从而构建成的。

(4)生产重组蛋白质

用载体pGEX-4T-2、pGEX-CaMTL3、pGEX-CaMTL4、pGEX-CaMTL5，对大肠杆菌BL21菌株进行转化。将所有的转化株都放入1 00mL的2xYT液体培养基(含有100mg/L的氨苄青霉素)，在37℃下进行振荡培养，至培养液的吸光度(A600)达到约0.7为止。向此培养液中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，再在20℃下振荡培养16小时。通过上述操作，在大肠杆菌中进行重组蛋白质(GST、GST-MTL3、GST-MTL4和GST-MTL5)的生产。

(5)重组蛋白质的粗提取和纯化

通过离心分离回收生产重组蛋白质的大肠杆菌，混悬于10mL的破碎洗涤液(50mMTris-HCl[pH8.0]、1mM EDTA、5mM二硫代苏糖醇)中。之后的操作在冰上或4℃下进行。得到的混悬液经超声波破碎处理后，加入Triton X-100使终浓度为1％，培养30分钟。得到的破碎液离心分离为上清液与沉淀，以上清液作为重组蛋白质的粗提取试样。在粗提取试样中加入100μL的谷胱甘肽琼脂糖4B树脂(AmershamBiosciences)，将整体平稳地搅拌30分钟。通过离心分离回收结合有重组蛋白质的谷胱甘肽琼脂糖4B树脂，用1mL的破碎洗涤液洗涤3次后，在同一树脂中加入100μL的洗脱液(50mMTris-HCl[pH8.5]、1mMEDTA、5mM二硫代苏糖醇、10mM谷胱甘肽)，将此混合物平稳地搅拌15分钟。通过离心分离，从混合物中回收洗脱液，将其作为重组蛋白质的纯化试样。通过SDS-PAGE分析确认粗提试样和纯化试样中是否含有重组蛋白质。通过SDS-PAGE分析的重组蛋白质检测结果如图3所示。

(6)通过薄层色谱法(TLC)鉴定酶促反应产物

对纯化GST、粗提GST、纯化GST-MTL3、粗提GST-MTL3、纯化GST-MTL4、纯化GST-MTL5，进行如下的酶促反应实验及TLC分析。将由100mM Tris-HCl[pH8.0]、200μM MgCl₂、500μM基质(黄嘌呤核苷[XR]、7-甲基黄嘌呤[7mX]或可可碱[Tb])、16.8μM S-腺苷-L-[甲基-¹⁴C]蛋氨酸[SAM][2.2GBq/mmol；Amersham Biosciences]及重组蛋白质试样(50μg的粗提试样或5μg的纯化试样)组成的含酶混合液25μL在27℃下培养16小时。

将培养后的酶促反应液用过滤杯(ULTRAFREE-MC 10000NMWL；Millipore)过滤。将2μL的过滤液与2μL的甲醇混合，将得到的混合液点在TLC板(Silicagel 60 F254；Merck)上。

或在培养后的酶促反应液中加入250μL的氯仿，将整体剧烈搅拌，回收氯仿层，通过浓缩干燥纯化反应产物。将此纯化物混悬于4μL的50％甲醇中，点在TLC板上。

代替酶促反应液及其纯化物，使用作为标准品的7-甲基黄嘌呤核苷[7mXR]、[7mX]、[Tb]、咖啡因[Cf]及S-腺苷-L-蛋氨酸[SAM](分别为1mM水溶液)，进行与上述同样的TLC分析。将4μL的标准品和4μL的甲醇的混合液点在TLC板上。

之后，作为展开溶剂使用水/乙酸/正丁醇(2∶1∶4，v/v/v)，进行1.5小时的展开。向反应产物展开部分喷雾增敏剂(En3 Hance；DupontNEN)，使用X射线胶片(BioMax Ms；Kodak)进行放射自显影(-80℃下曝光3天)，检出附加¹⁴C标记甲基的酶促反应产物的点。用紫外光照射标准品展开部分，检出标准品的点。利用TLC进行分析的结果在图4-6中给出。

从图4可知，GST-MTL3的纯化试样，在作为甲基受体的[XR]及甲基供体的[SAM]存在下，生成[7mXR]。即，此试样催化通过[XR]的甲基化进行的[7mXR]生成反应。

GST-MTL3的粗提试样，在作为甲基受体的[XR]及作为甲基供体的[SAM]存在下，生成作为[7mXR]的脱核糖体的[7mX]。即，这一试样催化通过[XR]的甲基化生成[7mXR]、及通过[7mXR]的脱核糖化生成[7mX]的2个反应。

由图5可知，GST-MTL4的纯化试样，在作为甲基受体的[7mX]及甲基供体的[SAM]存在下，生成[Tb]。即，此试样催化由[7mX]的甲基化进行的[Tb]生成反应。

GST-MTL4的纯化试样，在作为甲基受体的1，7-二甲基黄嘌呤[Px]及作为甲基供体的[SAM]存在下，生成[Cf]。即，此试样催化由[Px]的甲基化进行的[Cf]生成反应。

由图6可知，GST-MTL5的纯化试样，在作为甲基受体的[Tb]及作为甲基供体的[SAM]存在下，生成[Cf]。即，此试样催化由[Tb]的甲基化进行的[Cf]生成反应。

GST-MTL5的纯化试样，在作为甲基受体的[7mX]及甲基供体的[SAM]存在下，生成[Tb]。即，此试样催化由[7mX]的甲基化进行的[Tb]的生成反应。

GST-MTL5的纯化试样，在作为甲基受体的[Px]及甲基供体的[SAM]存在下，生成[Cf]。即，此试样催化由[Px]的甲基化进行的[Cf]的生成反应。

作为对照使用的GST不催化纯化试样及粗提试样的任一甲基化反应。

如上可知，CaMTL3蛋白质、CaMTL4蛋白质及CaMTL5蛋白质、及编码这些蛋白质的基因组分别是咖啡因生物合成路径的构成要素。

(7)体外咖啡因生物合成路径的再构成

将由100mM Tris-HCl[pH8.0]、200μM MgCl₂、500μM黄嘌呤核苷[XR]、1.5mM S-腺苷-L-蛋氨酸[SAM]及重组蛋白质试样(200μg的粗提试样或20μg的纯化试样)组成的含酶混合液100μL在27℃下培养16小时。将上述重组蛋白质试样按下述组合用于酶促反应：(A)只是粗提GST-MTL3、(B)粗提GST-MTL3及纯化GST-MTL4、(C)粗提GST-MTL3、纯化GST-MTL4及纯化GST-MTL5。

培养后的酶促反应液中加入1mL的氯仿，整体剧烈搅拌，回收氯仿层，通过浓缩干燥纯化反应产物。将此纯化物混悬于200μL的HPLC展开溶剂(50mM磷酸钠[pH6.0]/甲醇[4∶1，v/v]中，将其中的20μL用于HPLC分析。进行HPLC分析时使用Puresil C18(Waters)柱，按1mL/分的流速展开混悬液。通过紫外光(270nm)的吸光度检出酶促反应产物。代替酶促反应产物，使用7-甲基黄嘌呤[7mX]、可可碱[Tb]、咖啡因[Cf]作为标准品，进行与上述同样的HPLC分析。HPLC分析结果如图7所示。

由图7-A可知，GST-MTL3的粗提试样，在作为甲基受体的[XR]及甲基供体的[SAM]存在下，生成作为[7mXR]的脱核糖体的[7mX]。即，此试样即使在与TLC分析同样进行的HPLC分析中也可以确认为催化了由[XR]的甲基化生成[7mXR]的反应、及由[7mXR]的脱核糖化生成[7mX]的反应这样2个反应。

由图7-B可知，GST-MTL3的粗提试样及GST-MTL4的纯化试样的组合，在[XR]及[SAM]存在下，生成[7mX]及[Tb]。即，此试样的组合催化了由[XR]的甲基化生成[7mXR]的反应、由[7mXR]的脱核糖化生成[7mX]的反应、及由[7mX]的甲基化生成[Tb]的反应这样3个反应。

由图7-C可知，GST-MTL3的粗提试样、GST-MTL4的纯化试样及GST-MTL5的纯化试样的组合，在[XR]及[SAM]存在下，生成[7mX]、[Tb]及[Cf]。即，此试样的组合催化了由[XR]的甲基化生成[7mXR]的反应、由[7mXR]的脱核糖化生成[7mX]的反应、由[7mX]的甲基化生成[Tb]的反应、及由[Tb]的甲基化生成[Cf]的反应这样4个反应。

如上所述可知，通过联合利用CaMTL3蛋白质、CaMTL4蛋白质、CaMTL5蛋白质及大肠杆菌的粗提取物，能够在体外再构成咖啡因生物合成路径。

利用本发明能够得到如下效果。

(1)将分别催化一系列咖啡因生物合成反应体系各步骤的多个酶以2种或2种以上组合使用，能够在生物体外，通过进行在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化、在嘌呤环9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化、及/或在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，可以生产7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因。

(2)将编码催化一系列咖啡因生物合成反应体系各步骤的多个酶的多个咖啡因生物合成体系基因以2个或2个以上组合使用，通过使此组合在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内表达，能够改变可可碱或咖啡因的产量。

(3)将编码催化一系列咖啡因生物合成反应体系各步骤的多个酶的多个咖啡因生物合成体系基因以2个或2个以上组合使用，通过使此组合在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，能够生产可可碱或咖啡因。

(4)将编码催化一系列咖啡因生物合成反应体系各步骤的多个酶的多个咖啡因生物合成体系基因以2个或2个以上组合使用，通过使组合在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物体内表达，改变所述宿主生物的代谢，能够生产可可碱或咖啡因。

(5)利用上述(3)或(4)的方法，改变本来无法生物合成可可碱或咖啡因的生物的代谢，能够使其生产这些化合物。

(6)通过将上述(3)或(4)的方法实施于植物，能够使植物防御食草动物的虫害。

序列表

<110>奈良先端科学技术大学院大学(NARA INSTITUTE OF SCIENCE AND

TECHNOLOGY)

<120>咖啡因生物合成基因的联合应用

<130>19-025

<140>

<141>

<150>JP 2002-213655

<151>2002-07-23

<160>9

<170>Microsoft Word

<210>1

<211>372

<212>PRT

<300>

<301>Ogawa，M.，Herai，Y.，Koizumi，N.，Kusano，T.，and Sano，H.

<302>咖啡树的7-甲基黄嘌呤甲基转移酶。基因分离和酶特性。

<303>生物化学杂志(Journal of Biological Chemi stry)

<304>276

<305>11

<306>8213-8218

<307>2001-03-16

<308>BAB39215

<309>2000-09-11

<400>1

Met Glu Leu Gln Glu Val Leu Arg Met Asn Gly Gly Glu Gly 14

Asp Thr Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Asn Gln Leu Val 28

Leu Ala Lys Val Lys Pro Val Leu Glu Gln Cys Val Arg Glu 42

Leu Leu Arg Ala Asn Leu Pro Asn Ile Asn Lys Cys Ile Lys 56

Thr Val Arg Asp Ile Val Gln Ser Ile Asp Lys Val Gly Gln 84

Glu Lys Lys Asn Glu Leu Glu Arg Pro Thr Ile Gln Ile Phe 98

Leu Asn Asp Leu Phe Pro Asn Asp Phe Asn Ser Val Phe Lys 112

Leu Leu Pro Ser Phe Tyr Arg Lys Leu Glu Lys Glu Asn Gly 126

Arg Lys Ile Gly Ser Cys Leu Ile Gly Ala Met Pro Gly Ser 140

Phe Tyr Ser Arg Leu Phe Pro Glu Glu Ser Met His Phe Leu 154

His Ser Cys Tyr Cys Leu Gln Trp Leu Ser Gln Val Pro Ser 168

Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Ile Ser Thr Asn Lys Gly Ser 182

Ile Tyr Ser Ser Lys Ala Ser Arg Leu Pro Val Gln Lys Ala 196

Tyr Leu Asp Gln Phe Thr Lys Asp Phe Thr Thr Phe Leu Arg 210

Ile His Ser Glu Glu Leu Phe Ser His Gly Arg Met Leu Leu 224

Thr Cys Ile Cys Lys Gly Val Glu Leu Asp Ala Arg Asn Ala 238

Ile Asp Leu Leu Glu Met Ala Ile Asn Asp Leu Val Val Glu 252

Gly His Leu Glu Glu Glu Lys Leu Asp Ser Phe Asn Leu Pro 266

Val Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Glu Val Lys Cys Ile Val Glu 280

Glu Glu Gly Ser Phe Glu Ile Leu Tyr Leu Glu Thr Phe Lys 294

Val Leu Tyr Asp Ala Gly Phe Ser Ile Asp Asp Glu His Ile 308

Lys Ala Glu Tyr Val Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Tyr Glu 322

Pro Ile Leu Ala Ser His Phe Gly Glu Ala Ile Ile Pro Asp 336

Ile Phe His Arg Phe Ala Lys His Ala Ala Lys Val Leu Pro 350

Leu Gly Lys Gly Phe Tyr Asn Asn Leu Ile Ile Ser Leu Ala 364

Lys Lys Pro Glu Lys Ser Asp Val 372

<210>2

<211>1316

<212>DNA

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<220>

<221>CDS

<222>(45)…(1163)

<300>

<308>AB048793

<309>2000-09-11

<400>2

ctttggcagt cccaatttga tttatgtaca agtcctgcat atgaatggag 50

ctccaagaag tcctgcggat gaatggaggc gaaggcgata caagctacgc 100

caagaattca gcctacaatc aactggttct cgccaaggtg aaacctgtcc 150

ttgaacaatg cgtacgggaa ttgttgcggg ccaacttgcc caacatcaac 200

aagtgcatta aagttgcgga tttgggatgc gcttctggac caaacacact 250

tttaacagtt cgggacattg tccaaagtat tgacaaagtt ggccaggaaa 300

agaagaatga attagaacgt cccaccattc agatttttct gaatgatctt 350

ttcccaaatg atttcaattc ggttttcaag ttgctgccaa gcttctaccg 400

caaacttgag aaagaaaatg gacgcaaaat aggatcgtgc ctaatagggg 450

caatgcccgg ctctttctac agcagactct tccccgagga gtccatgcat 500

tttttacact cttgttactg tcttcaatgg ttatctcagg ttcctagcgg 550

tttggtgact gaattgggga tcagtacgaa caaagggagc atttactctt 600

ccaaagcaag tcgtctgccc gtccagaagg catatttgga tcaatttacg 650

aaagatttta ccacatttct aaggattcat tcggaagagt tgttttcaca 700

tggccgaatg ctccttactt gcatttgtaa aggagttgaa ttagacgccc 750

ggaatgccat agacttactt gagatggcaa taaacgactt ggttgttgag 800

ggacatctgg aggaagaaaa attggatagt ttcaatcttc cagtctatat 850

accttcagca gaagaagtaa agtgcatagt tgaggaggaa ggttcttttg 900

aaattttata cctggagact tttaaggtcc tttacgatgc tggcttctct 950

attgacgatg aacatattaa agcagagtat gttgcatctt ccgttagagc 1000

agtttacgaa cccatcctcg caagtcattt tggagaagct attatacctg 1050

acatattcca caggtttgcg aagcatgcag caaaggttct ccccttgggc 1100

aaaggcttct ataataatct tatcatttct ctcgccaaaa agccagagaa 1150

gtcagacgtg taaaagtttg tttttgtgtt ggggaaagga ataagtgccg 1200

ttgggggtct ttcgggtatt gtgcttttta tattatattg ttttgtatcc 1250

gtaataaaag tggtgtgtaa gaataagata tttgacatat attattttca 1300

aaaaaaaaaa aaaaaa 1316

<210>3

<211>1316

<212>RNA

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<220>

<221>CDS

<222>(45)…(1163)

<300>

<308>AB048793

<309>2000-09-11

<400>3

cuuuggcagu cccaauuuga uuuauguaca aguccugcau augaauggag 50

cuccaagaag uccugcggau gaauggaggc gaaggcgaua caagcuacgc 100

caagaauuca gccuacaauc aacugguucu cgccaaggug aaaccugucc 150

uugaacaaug cguacgggaa uuguugcggg ccaacuugcc caacaucaac 200

aagugcauua aaguugcgga uuugggaugc gcuucuggac caaacacacu 250

uuuaacaguu cgggacauug uccaaaguau ugacaaaguu ggccaggaaa 300

agaagaauga auuagaacgu cccaccauuc agauuuuucu gaaugaucuu 350

uucccaaaug auuucaauuc gguuuucaag uugcugccaa gcuucuaccg 400

caaacuugag aaagaaaaug gacgcaaaau aggaucgugc cuaauagggg 450

caaugcccgg cucuuucuac agcagacucu uccccgagga guccaugcau 500

uuuuuacacu cuuguuacug ucuucaaugg uuaucucagg uuccuagcgg 550

uuuggugacu gaauugggga ucaguacgaa caaagggagc auuuacucuu 600

ccaaagcaag ucgucugccc guccagaagg cauauuugga ucaauuuacg 650

aaagauuuua ccacauuucu aaggauucau ucggaagagu uguuuucaca 700

uggccgaaug cuccuuacuu gcauuuguaa aggaguugaa uuagacgccc 750

ggaaugccau agacuuacuu gagauggcaa uaaacgacuu gguuguugag 800

ggacaucugg aggaagaaaa auuggauagu uucaaucuuc cagucuauau 850

accuucagca gaagaaguaa agugcauagu ugaggaggaa gguucuuuug 900

aaauuuuaua ccuggagacu uuuaaggucc uuuacgaugc uggcuucucu 950

auugacgaug aacauauuaa agcagaguau guugcaucuu ccguuagagc 1000

aguuuacgaa cccauccucg caagucauuu uggagaagcu auuauaccug 1050

acauauucca cagguuugcg aagcaugcag caaagguucu ccccuugggc 1100

aaaggcuucu auaauaaucu uaucauuucu cucgccaaaa agccagagaa 1150

gucagacgug uaaaaguuug uuuuuguguu ggggaaagga auaagugccg 1200

uugggggucu uucggguauu gugcuuuuua uauuauauug uuuuguaucc 1250

guaauaaaag ugguguguaa gaauaagaua uuugacauau auuauuuuca 1300

aaaaaaaaaa aaaaaa 1316

<210>4

<211>

<212>PRT

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<400>4

Met Glu Leu Gln Glu Val Leu His Met Asn Glu Gly Glu Gly 14

Asp Thr Ser Tyr Ala Lys Asn Ala Ser Tyr Asn Leu Ala Leu 28

Ala Lys Val Lys Pro Phe Leu Glu Gln Cys Ile Arg Glu Leu 42

Leu Arg Ala Asn Leu Pro Asn Ile Asn Lys Cys Ile Lys Val 56

Ala Asp Leu Gly Cys Ala Ser Gly Pro Asn Thr Leu Leu Thr 70

Val Arg Asp Ile Val Gln Ser Ile Asp Lys Val Gly Gln Glu 84

Glu Lys Asn Glu Leu Glu Arg Pro Thr Ile Gln Ile Phe Leu 98

Asn Asp Leu Phe Gln Asn Asp Phe Asn Ser Val Phe Lys Leu 112

Leu Pro Ser Phe Tyr Arg Lys Leu Glu Lys Glu Asn Gly Arg 126

Lys Ile Gly Ser Cys Leu Ile Ser Ala Met Pro Gly Ser Phe 140

Tyr Gly Arg Leu Phe Pro Glu Glu Ser Met His Phe Leu His 154

Ser Cys Tyr Ser Val His Trp Leu Ser Gln Val Pro Ser Gly 168

Leu Val Ile Glu Leu Gly Ile Gly Ala Asn Lys Gly Ser Ile 182

Tyr Ser Ser Lys Ala Ser Arg Pro Pro Val Gln Lys Ala Tyr 196

Leu Asp Gln Phe Thr Lys Asp Phe Thr Thr Phe Leu Arg Ile 210

His Ser Lys Glu Leu Phe Ser Arg Gly Arg Met Leu Leu Thr 224

Cys Ile Cys Lys Val Asp Glu Tyr Asp Glu Pro Asn Pro Leu 238

Asp Leu Leu Asp Met Ala Ile Asn Asp Leu Ile Val Glu Gly 252

His Leu Glu Glu Glu Lys Leu Ala Ser Phe Asn Leu Pro Phe 266

Phe Thr Pro Ser Ala Glu Glu Val Lys Cys Ile Val Glu Glu 280

Glu Gly Ser Phe Glu Ile Leu Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Ala 294

His Tyr Asp Ala Gly Phe Ser Ile Asp Asp Asp Tyr Pro Val 308

Arg Ser His Phe Gln Val Tyr Gly Asp Glu His Ile Lys Ala 322

Glu Tyr Val Ala Ser Leu Ile Arg Ser Val Tyr Glu Pro Ile 336

Leu Ala Ser His Phe Gly Glu Ala Ile Met Pro Asp Leu Phe 350

His Arg Leu Ala Lys His Ala Ala Lys Val Leu His Leu Gly 364

Lys Gly Cys Tyr Asn Asn Leu Ile Ile Ser Leu Ala Lys Lys 378

Pro Glu Lys Ser Asp Val 384

<210>5

<211>1155

<212>DNA

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1152)

<400>5

atggagctcc aagaagtcct gcatatgaat gaaggtgaag gcgatacaag 50

ctacgccaag aatgcatcct acaatctggc tcttgccaag gtgaaacctt 100

tccttgaaca atgcatacga gaattgttgc gggccaactt gcccaacatc 150

aacaagtgca ttaaagttgc ggatttggga tgcgcttctg gaccaaacac 200

acttttaaca gtgcgggaca ttgtgcaaag tattgacaaa gttggccagg 250

aagagaagaa tgaattagaa cgtcccacca ttcagatttt tctgaatgat 300

cttttccaaa atgatttcaa ttcggttttc aagttgctgc caagcttcta 350

ccgcaaactc gagaaagaaa atggacgcaa gataggatcg tgcctaataa 400

gcgcaatgcc tggctctttc tacggcagac tcttccccga ggagtccatg 450

cattttttgc actcttgtta cagtgttcat tggttatctc aggttcccag 500

cggtttggtg attgaattgg ggattggtgc aaacaaaggg agtatttact 550

cttccaaagc aagtcgtccg cccgtccaga aggcatattt ggatcaattt 600

acgaaagatt ttaccacatt tctaaggatt cattcgaaag agttgttttc 650

acgtggccga atgctcctta cttgcatttg taaagtagat gaatacgacg 700

aaccgaatcc cctagactta cttgacatgg caataaacga cttgattgtt 750

gagggacatc tggaggaaga aaaattggct agtttcaatc ttccattctt 800

tacaccttca gcagaagaag taaagtgcat agttgaggag gaaggttctt 850

ttgaaatttt atacctggag acttttaagg cccattatga tgctggcttc 900

tctattgatg atgattaccc agtaagatcc catttccaag tatacggcga 950

tgaacatatt aaagcagagt atgtggcatc attaattaga tcagtttacg 1000

aacccatcct cgcaagtcat tttggagaag ctattatgcc tgacttattc 1050

cacaggcttg cgaagcatgc agcaaaggtt ctccacttgg gcaaaggctg 1100

ctataataat cttatcattt ctctcgccaa aaagccagag aagtcagacg 1150

tgtaa 1155

<210>6

<211>1155

<212>RNA

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1152)

<400>6

auggagcucc aagaaguccu gcauaugaau gaaggugaag gcgauacaag 50

cuacgccaag aaugcauccu acaaucuggc ucuugccaag gugaaaccuu 100

uccuugaaca augcauacga gaauuguugc gggccaacuu gcccaacauc 150

aacaagugca uuaaaguugc ggauuuggga ugcgcuucug gaccaaacac 200

acuuuuaaca gugcgggaca uugugcaaag uauugacaaa guuggccagg 250

aagagaagaa ugaauuagaa cgucccacca uucagauuuu ucugaaugau 300

cuuuuccaaa augauuucaa uucgguuuuc aaguugcugc caagcuucua 350

ccgcaaacuc gagaaagaaa auggacgcaa gauaggaucg ugccuaauaa 400

gcgcaaugcc uggcucuuuc uacggcagac ucuuccccga ggaguccaug 450

cauuuuuugc acucuuguua caguguucau ugguuaucuc agguucccag 500

cgguuuggug auugaauugg ggauuggugc aaacaaaggg aguauuuacu 550

cuuccaaagc aagucguccg cccguccaga aggcauauuu ggaucaauuu 600

acgaaagauu uuaccacauu ucuaaggauu cauucgaaag aguuguuuuc 650

acguggccga augcuccuua cuugcauuug uaaaguagau gaauacgacg 700

aaccgaaucc ccuagacuua cuugacaugg caauaaacga cuugauuguu 750

gagggacauc uggaggaaga aaaauuggcu aguuucaauc uuccauucuu 800

uacaccuuca gcagaagaag uaaagugcau aguugaggag gaagguucuu 850

uugaaauuuu auaccuggag acuuuuaagg cccauuauga ugcuggcuuc 900

ucuauugaug augauuaccc aguaagaucc cauuuccaag uauacggcga 950

ugaacauauu aaagcagagu auguggcauc auuaauuaga ucaguuuacg 1000

aacccauccu cgcaagucau uuuggagaag cuauuaugcc ugacuuauuc 1050

cacaggcuug cgaagcaugc agcaaagguu cuccacuugg gcaaaggcug 1100

cuauaauaau cuuaucauuu cucucgccaa aaagccagag aagucagacg 1150

uguaa 1155

<210>7

<211>384

<212>PRT

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<400>7

Met Glu Leu Gln Glu Val Leu His Met Asn Gly Gly Glu Gly 14

Asp Thr Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Phe Tyr Asn Leu Phe Leu 28

Ile Arg Val Lys Pro Ile Leu Glu Gln Cys Ile Gln Glu Leu 42

Leu Arg Ala Asn Leu Pro Asn Ile Asn Lys Cys Ile Lys Val 56

Ala Asp Leu Gly Cys Ala Ser Gly Pro Asn Thr Leu Leu Thr 70

Val Arg Asp Ile Val Gln Ser Ile Asp Lys Val Gly Gln Glu 84

Lys Lys Asn Glu Leu Glu Arg Pro Thr Ile Gln Ile Phe Leu 98

Asn Asp Leu Phe Gln Asn Asp Phe Asn Ser Val Phe Lys Ser 112

Leu Pro Ser Phe Tyr Arg Lys Leu Glu Lys Glu Asn Gly Arg 126

Lys Ile Gly Ser Cys Leu Ile Gly Ala Met Pro Gly Ser Phe 140

Tyr Gly Arg Leu Phe Pro Glu Glu Ser Met His Phe Leu His 154

Ser Cys Tyr Cys Leu His Trp Leu Ser Gln Val Pro Ser Gly 168

Leu Val Thr Glu Leu Gly Ile Ser Ala Asn Lys Gly Cys Ile 182

Tyr Ser Ser Lys Ala Ser Arg Pro Pro Ile Gln Lys Ala Tyr 196

Leu Asp Gln Phe Thr Lys Asp Phe Thr Thr Phe Leu Arg Ile 210

His Ser Glu Glu Leu Ile Ser Arg Gly Arg Met Leu Leu Thr 224

Trp Ile Cys Lys Glu Asp Glu Phe Glu Asn Pro Asn Ser Ile 238

Asp Leu Leu Glu Met Ser Ile Asn Asp Leu Val Ile Glu Gly 252

His Leu Glu Glu Glu Lys Leu Asp Ser Phe Asn Val Pro Ile 266

Tyr Ala Pro Ser Thr Glu Glu Val Lys Cys Ile Val Glu Glu 280

Glu Gly Ser Phe Glu Ile Leu Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Val 294

Pro Tyr Asp Ala Gly Phe Ser Ile Asp Asp Asp Tyr Gln Gly 308

Arg Ser His Ser Pro Val Ser Cys Asp Glu His Ala Arg Ala 322

Ala His Val Ala Ser Val Val Arg Ser Ile Phe Glu Pro Ile 336

Val Ala Ser His Phe Gly Glu Ala Ile Met Pro Asp Leu Ser 350

His Arg Ile Ala Lys Asn Ala Ala Lys Val Leu Arg Ser Gly 364

Lys Gly Phe Tyr Asp Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Lys Lys 378

Pro Glu Lys Ser Asp Val 384

<210>8

<211>1155

<212>DNA

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1152)

<400>8

atggagctcc aagaagtcct gcatatgaat ggaggcgaag gcgatacaag 50

ctacgccaag aactcattct acaatctgtt tctcatcagg gtgaaaccta 100

tccttgaaca atgcatacaa gaattgttgc gggccaactt gcccaacatc 150

aacaagtgca ttaaagttgc ggatttggga tgcgcttctg gaccaaacac 200

acttttaaca gttcgggaca ttgtacaaag tattgacaaa gttggccagg 250

aaaagaagaa tgaattagaa cgtcccacca ttcagatttt tctgaatgat 300

cttttccaaa atgatttcaa ttcggttttc aagtcgctgc caagcttcta 350

ccgcaaactt gagaaagaaa atggacgcaa aataggatca tgcctgatag 400

gcgcaatgcc tggctctttc tacggcagac tcttccccga ggagtccatg 450

cattttttac actcttgtta ctgtttgcat tggttatctc aggttcccag 500

cggtttggtg actgaattgg ggatcagtgc gaacaaaggg tgcatttact 550

cttccaaagc aagtcgtccg cccatccaga aggcatattt ggatcaattt 600

acgaaagatt ttaccacatt tcttaggatt cattcggaag agttgatttc 650

acgtggccga atgctcctta cttggatttg caaagaagat gaattcgaga 700

acccgaattc catagactta cttgagatgt caataaacga cttggttatt 750

gagggacatc tggaggaaga aaaattggac agtttcaatg ttccaatcta 800

tgcaccttca acagaagaag taaagtgcat agttgaggag gaaggttctt 850

ttgaaatttt atacctggag acttttaagg tcccttatga tgctggcttc 900

tctattgatg atgattacca aggaagatcc cattccccag tatcctgcga 950

tgaacatgct agagcagcgc atgtggcatc tgtcgttaga tcaattttcg 1000

aacccatcgt cgcaagtcat tttggagaag ctatcatgcc tgacttatcc 1050

cacaggattg cgaagaatgc agcaaaggtt cttcgctccg gcaaaggctt 1100

ctatgatagt cttatcattt ctctcgccaa aaagccagag aagtcagacg 1150

tgtaa 1155

<210>9

<211>1155

<212>RNA

<213>咖啡树(Coffea arabica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1152)

<400>9

auggagcucc aagaaguccu gcauaugaau ggaggcgaag gcgauacaag 50

cuacgccaag aacucauucu acaaucuguu ucucaucagg gugaaaccua 100

uccuugaaca augcauacaa gaauuguugc gggccaacuu gcccaacauc 150

aacaagugca uuaaaguugc ggauuuggga ugcgcuucug gaccaaacac 200

acuuuuaaca guucgggaca uuguacaaag uauugacaaa guuggccagg 250

aaaagaagaa ugaauuagaa cgucccacca uucagauuuu ucugaaugau 300

cuuuuccaaa augauuucaa uucgguuuuc aagucgcugc caagcuucua 350

ccgcaaacuu gagaaagaaa auggacgcaa aauaggauca ugccugauag 400

gcgcaaugcc uggcucuuuc uacggcagac ucuuccccga ggaguccaug 450

cauuuuuuac acucuuguua cuguuugcau ugguuaucuc agguucccag 500

cgguuuggug acugaauugg ggaucagugc gaacaaaggg ugcauuuacu 550

cuuccaaagc aagucguccg cccauccaga aggcauauuu ggaucaauuu 600

acgaaagauu uuaccacauu ucuuaggauu cauucggaag aguugauuuc 650

acguggccga augcuccuua cuuggauuug caaagaagau gaauucgaga 700

acccgaauuc cauagacuua cuugagaugu caauaaacga cuugguuauu 750

gagggacauc uggaggaaga aaaauuggac aguuucaaug uuccaaucua 800

ugcaccuuca acagaagaag uaaagugcau aguugaggag gaagguucuu 850

uugaaauuuu auaccuggag acuuuuaagg ucccuuauga ugcuggcuuc 900

ucuauugaug augauuacca aggaagaucc cauuccccag uauccugcga 950

ugaacaugcu agagcagcgc auguggcauc ugucguuaga ucaauuuucg 1000

aacccaucgu cgcaagucau uuuggagaag cuaucaugcc ugacuuaucc 1050

cacaggauug cgaagaaugc agcaaagguu cuucgcuccg gcaaaggcuu 1100

cuaugauagu cuuaucauuu cucucgccaa aaagccagag aagucagacg 1150

uguaa 1155

Claims

1、一种生产7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因的方法，是在下述酶(a)、(c)、(d)和细胞提取物(b)的2种或2种以上组合的催化作用下，在生物体外，进行在嘌呤环7位的黄嘌呤核苷的甲基化、在嘌呤环9位的7-甲基黄嘌呤核苷的脱核糖化、在嘌呤环3位的7-甲基黄嘌呤的甲基化、和/或在嘌呤环1位的可可碱的甲基化，生产7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因的方法，

2、如权利要求1所述的方法，其中将酶(a)(c)(d)及细胞提取物(b)中的至少一个替换为具有同等活性的物质。

3、一种生产可可碱或咖啡因的方法，是在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物体内，使下述的DNA分子(a)(b)(c)的(a)+(b)的组合或(a)+(b)+(c)的组合表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法，

4、一种生产可可碱或咖啡因的方法，是在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内，使下述的DNA分子(b)和(c)的组合表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法，

5、一种改变可可碱或咖啡因产量的方法，是在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内，使下述的DNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合表达，改变可可碱或咖啡因产量的方法，

6、如权利要求3～5中任一项所述的方法，其中将DNA分子(a)(b)(c)中的至少一个替换为具有同等功能的物质。

7、一种生产可可碱或咖啡因的方法，是在生物合成黄嘌呤核苷、且具有7-甲基黄嘌呤核苷脱核糖化酶活性的宿主生物体内，使下述的RNA分子(a)(b)(c)的(a)+(b)的组合或(a)+(b)+(c)的组合表达，改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法，

8、一种生产可可碱或咖啡因的方法，是在生物合成7-甲基黄嘌呤的宿主生物体内，使下述的RNA分子(b)和(c)的组合表达，通过改变所述宿主生物的代谢，生产可可碱或咖啡因的方法，

9、一种改变可可碱或咖啡因产量的方法，是在生物合成可可碱或咖啡因的宿主生物体内，使下述的RNA分子(a)(b)(c)中的2种或2种以上的组合表达，改变可可碱或咖啡因产量的方法，

10、如权利要求7～9中任一项所述的方法，其中将RNA分子(a)(b)(c)中的至少一个替换为具有同等功能的物质。

11、如权利要求3～10中任一项所述的方法，其中宿主生物是植物，通过生产或增产可可碱或咖啡因，使宿主植物防御食草动物的虫害。