KR20010103023A - ｃＡＭＰ 및 아데닐산 시클레이즈의 효소적 형광정량분석법 - Google Patents

ｃＡＭＰ 및 아데닐산 시클레이즈의 효소적 형광정량분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내인성의 비-환상 아데닌뉴크레오티드류를 포함하는 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성을, 방사성 시약을 사용하지 않고 신속하게 측정하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 내인성 아데닐산 시클레이즈 활성에 의해 생성되는 cAMP와, ATP, AMP, ADP 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 내인성의 비-환상 아데닌뉴크레오티드류를 포함하는 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성을 측정하는 방법에 있어서, (1) 상기 시료중의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌뉴크레오티드류 및 글루코스-6-인산을 효소적으로 제거하기 위해서 에이피레이즈, 아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈의 유효량을 포함하고, (2) cAMP을 AMP로 효소적으로 변환하고, (3) 방사성 물질을 사용하는 것이 없이 AMP의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법 및 이 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다.

Description

ｃＡＭＰ 및 아데닐산 시클레이즈의 효소적 형광정량분석법{Enzymatic fluorimetric assay of cAMP and adenylate cyclase}
아데닐산 시클레이즈(아데니릴 시클레이즈, 아데닐 시클레이즈, EC 4.6.1.1)은 Mg2+또는 Mn2+의 존재하에
ATP →cAMP
를 촉매하는 효소이다.
아데닐산 시클레이즈는 세포막에 국소적으로 존재하고, 여러가지 기본적인 호르몬 및 신경전달물질의 시그날 형질도입 케스케이드로서 중요한 역할을 하고 있다.
예컨대, 아데닐산 시클레이즈 활성을 측정하는 것에 의해, 인간의 심장이식이나 울혈성 심질환 시에 나타나는 생리학적 변화를 이해하는 것이 가능하다[M. R. Bristow 등, New Engl. J. Med., 307권, 205항(1982); K.G.Lurie 등, J.Thorac.Cardiovasc.Surg. 86권, 195항(1983)].
이 아데닐산 시클레이즈 활성은 아데닐산 시클레이즈의 촉매작용에 의해 ATP로부터 합성되는 cAMP 양의 변화를 측정하는 것에 의해 구하는 것이 가능하다.
그러나, 아데닐산 시클레이즈의 생물학적 역할의 보다 명확한 해명은 cAMP의 조직 레벨에서의 변화를 모니터하는 것이 곤란하기 때문에 제한되고 있다.
cAMP(사이클릭아데노신-3',5'-일인산)은 1957년, 간장(liver)에 있어 아드레날린과 글루카곤의 혈당상승작용을 중개하는 인자로서 발견되었고[E.W.Sutherland 등, J.Am.Chem.Soc.79권, 3608항(1957)], 그후 부신피질호르몬(ACTH), 황체형성호르몬(LH), 갑상선자극호르몬(TSH), 부신상선자극호르몬(PTH), 등의 여러가지의 호르몬이나 프로스타그란딘 등의 생리활성물질도 cAMP를 매개하여 작용이 발휘되는 것이 명확해졌다. 즉, cAMP는 펩타이드 호르몬이나 활성 아민이 분비되는 목표의 세포에 도달할 때, 이들은 세포내에서 효소반응을 진행하기 위한 정보전달을 담당하여, 즉, 세컨드 메신저로서의 기능을 갖고 있다.
cAMP는 생체내에서는 막에 국소 존재하는 아데닐산 시클레이즈에 의해 ATP로부터 합성되고, 포스포디에스테레이즈에 의해 5'-AMP로 분해된다. 세군이나 동물계에서 광범위하게 존재하지만, 매우 미량으로 존재한다(정상 농도 0.1∼1n몰/습중량). cAMP의 정량법으로는 cAMP 결합 단백질을 이용하는 방법 또는 방사면역법이 간편한다. cAMP 함량은 세포의 영양, 증식, 분화, 적응상태에 좌우되어 민감하게 변동한다.
다종 다양한 포유동물 및 비포유동물의 조직이나 체액중의 cAMP를 측정하는 것은 세포생존도, 내분비호르몬 축(軸)기능, 아데닐산 시클레이즈 활성 및 포스포디에스테레이즈 활성을 평가하기 위해 유용한 방법을 얻을 수 있다. 더구나, cAMP 측정을 이용하여, 시그날 형질도입, 리보솜 단백질 합성, 발생기 단백질의 전위 및 다른 주요한 세포기능에서 주요한 역할을 하고 있는 G 단백질(구아닌뉴클레오티드 결합 단백질) 패밀리를 시작으로 하여, 여러가지의 시그날 형질도입 단백질의 활성을 평가하는 것이 가능하다[Bourne 등, Nature, 348권, 125항(1990)].
또한 cAMP의 측정은 특정의 세포, 조직, 기관 또는 체액중의 환상 뉴클레오티드의 값을 변동시킬 가능성이 있는 다른 내인성 및 외래성 화합물(예컨대, 일산화이질소)의 평가에 사용하는 것이 가능하다.
생물중의 주요한 조절 호르몬/단백질이 있다. 에피네프린, 노르에피네프린, 아드레노콜티코트로핀(ACTH), 바소프레신, 글루카곤, 티록신 및 갑상선 자극 및 멜라노사이트 자극 호르몬을 시작으로 하는 다수의 호르몬은 세컨드 메신저로서 cAMP를 사용한다. 이들 전체의 호르몬 및 조절물질의 활성은 본 발명의 측정방법을 적용하여 조직, 혈청, 체액 및 전체의 세포배양액(세포 및 배지)중에서 측정하는 것이 가능하다. 이들 호르몬의 측정은 호르몬 불균형에서 특정의 질환이 될 가능성이 있는 다종 다양한 질환상태에 있어서 실시하는 것이 가능하다.
호르몬 또는 조절 단백질이 특정의 수용체와 상호작용하면, 세컨드 메신저(cAMP)가 케스케이드로서 생성된다. cAMP의 생성은 경우에 따라서는 특정의 호르몬 시그날 형질도입 경로의 일부로서 cAMP의 감소를 사용하는 호르몬에 의해 특이적으로 억제하는 것도 가능하다. 이 조절 단백질 또는 호르몬과 수용체의 상호작용의 결과는 (1) 예컨대, 이온 채널의 변화에 의한 세포투과성의 변동, (2) cAMP 농도에 민감한 효소 촉매반응 속도의 변동, (3) 다른 효소의 합성 및 분해를 포함하는 단백질 합성속도의 변동이 고려될 수 있다. cAMP의 측정은 호르몬 또는 조절 단백질이 수용체와 상호작용을 한 후에, 이들의 결과를 직접 또는 간접적으로 측정하기 위해 사용하는 것이 가능하다.
구체적으로는 cAMP의 측정은 시료중의 cAMP의 분해를 방지하는 것에 의해 아드레날린 작동성 신경계를 자극하는 아미노필린 또는 테오필린과 같은 의약품 레벨의 마커로서 사용하는 것이 가능하다. 세포배양물 중의 cAMP의 측정을 사용하여 특정의 호르몬, 조절 단백질 또는 의약품을 평가하는 것이 가능하고, 이 때 cAMP는 시그날 형질도입 과정에서 생체결합을 나타낸다.
cAMP 측정 또는 특정의 호르몬 또는 조절 단백질의 부존재 혹은 존재하에서 세포를 시험하는 것에 의해, 세포의 존재도 및 안정성을 평가하기위해 사용하는 것이 가능하다. 예컨대, 글루카곤에 의해 간장세포(간세포)중의 cAMP를 측정하는 것에 의해, 간세포의 생존도를 평가할 수 있다. 이것은 예컨대, 기관 및/또는 세포의 이식, 예컨대 심장, 간장, 폐, 신장, 췌장, 피부 및 뇌의 세포이식에 유용하다.
세포내 cAMP 값을 높게 또는 낮게 하는 다종 다양한 호르몬, 조절 단백질 및 의약품으로 활성화한 후의 생체검사 시료로부터 얻어지는 세포의 응답성의 측정은 세포기능을 상세하게 평가하는 방법으로서 사용하는 것이 가능하다.
특수한 임상예로서는, 심근층의 응답을 평가하기 위해서 심장 생체검사에서 cAMP을 측정하는 것을 열거할 수 있다. 심근 병세의 심장 세포는 β-아드레날린 작독성 자극후의 cAMP 함유량이 상승하여도 응답하지 않는다. 심장 질환의 위중한 정도 및 몇 개의 의약품, 예컨대 β-아드레날린 작동성 차단제 및 안지오텐신 변환효소 저해제의 유효성의 판단은 정상의 심장과 심근 병세의 심장에서 얻어지는 생체 검사 시료의 응답성을 비교하는 것에 의해 행할 수 있다. 순환혈액세포중의 기저상태 또는 자극상태에서의 아데닐산 시클레이즈 활성 또는 cAMP의 측정은 환자의 치료의 지침에 이용하는 것이 가능하다. 또한 세포내 또는 동맥 혹은 정맥순환내에서의 cAMP 방출은 허혈, 저산소증 또는 의약품 혹은 호르몬 자극에 의한 다양한 다른 생리학적 및 비생리학적 스트레스에 대한 기관 및/또는 세포의 응답의 지표로서 사용하는 것이 가능하다. 조직 혹은 체액중의 cAMP 값은 이 방법을 이용하여 혈구 및 혈소판을 포함하는 거의 전체의 포유동물 세포 또는 체액중에서 측정하는 것이 가능하다. 몇 개의 조직에서는 잠재적 종양세포 시료의 경우에, 종양원성 및/또는 침투성에 대한 지표로서 특이적인 자극제로 응답하는 cAMP 값을 측정하는 것이 가능하다. 다른 경우에서는 cAMP 합성 또는 분해를 변화할 가능성이 있는 특이적인 치료법의 유효성을 결정하기 위해서 cAMP의 측정을 사용하는 것이 가능하다.
상기와 같이, cAMP는 세컨드 메신저로서 세포내 정보전달에 있어서, 중요한 역할을 하고 있는 것과 동시에 다양한 생리적 기능을 갖고 있는 것에서, 아데닐산 시클레이즈의 촉매작용에 의해 ATP에서 합성되는 cAMP의 양을 측정하고, 더구나 아데닐산 시클레이즈 활성을 구하거나, cAMP의 거동을 해명하는 것은 기초의학 연구분야뿐만 아니라 임상의학의 분야에 있어서도 특히 의미가 깊다고 할 수 있다.
아데닐산 시클레이즈 활성의 측정은 ATP를 기질로하여 생성된 cAMP를 정량하는 것에 의해 행한다. cAMP의 정량은 (1) 표식시킨 ATP를 기질로 하는 방법과 (2) 비표식 ATP를 기질로 하여 이용하는 방법으로 구분할 수 있다.
(1)의 표식시킨 ATP를 기질로 하는 방법에서는, 방사성 동위원소로 표식시킨 ATP(예컨대, [α-32P] ATP)를 기질로 하고, 아데닐산 시클레이즈의 작용에 의해 합성시킨 방사성 표지 cAMP([32P] cAMP)를 ATP로부터 분해하고, 이것의 방사활성을 측정한다[Y.Salomon 등, Anal.Biochem., 58권, 541항 (1974); R.A.Johnson 등, In Method in Enzymology, 195권, 3항 (1991)]. 이 방법에 있서서는, 이온 교환수지 및 산화알루미늄 컬럼을 이용한 연속 흡착 크로마토그라피를 이용하여 [α-32P] ATP와 [32P] cAMP를 분리하고 있다.
그러나 상기 (1)의 정량법은 고감도인 반면, 고가이고 위험성이 높은 방사성표식화합물을 사용하지 않으면 않된다.
한편, (2)의 비표식 ATP를 기질로 이용하는 방법은, ① 비표식 ATP로부터 생성된 cAMP를 방사성 물질로 표식시킨 cAMP와 경합적으로 대응하는 항혈청에 대한 항원항체반응을 시키고, 결합항체의 방사활성을 측정하여 cAMP를 정량한다. 즉, 방사면역측정법(Radioimmunometric Assay)과, ② cAMP 의존성 프로테인 키네이즈와 cAMP의 특이적 결합을 이용하고, cAMP 의존성 프로테인 키네이즈와 결합한3H-cAMP의 방사능을 측정한다. 프로테인 바인딩 분석법[A.G.Gilman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 67권, 305항 (1970)]으로 분류할 수 있다.
상기 (2)의 비표식 ATP 기질을 이용하는 방법은 환상 뉴클레오티드포스포디에스테레이즈에 의한 cAMP의 분해를 보정할 수 없기때문에, 포스포디에스테레이즈 활성이 강한 검체에는 부적당하다.
더구나, 안정성 및 환경에 미치는 영향을 고려하면, 이와 같은 방사성 물질의 사용은 극히 피해야 할 것이다. 따라서 아데닐산 시클레이즈 활성 및 이를 지표로 하는 cAMP의 정량을 위해서 고감도의 비방사성 정량법의 개발이 요구되고 있었다.
그러나, 대부분의 포유동물의 조직중에 있어서는, cAMP의 농도는 특히 낮기때문에, 방사성 물질을 이용하지 않고는 측정하는 것이 용이하지 않다. 또한 AMP나 ADP, ATP 등의 시료중의 비-환상 아데닌뉴클레오티드류가 cAMP의 수백배에서 수십만배 이상의 농도로 공존하고 있고, 게다가 화학구조가 유사한 것이 방해물질로서작용하여, cAMP의 정량을 더욱 곤란한 것으로 하게 한다. 특히 ATP는 cAMP의 1억배의 농도로 존재하는 것도 있고, 이와 같은 내인성의 ATP를 완전하게 제거하지 않는 한, 정확한 cAMP의 측정은 실질적으로 불가능하였다.
한편, cAMP는 포스포디에스테라세의 작용에 의해 AMP로 변환하지만, AMP의 측정에 있어서는 방사성물질을 이용하지 않는 방법이 개시되어 있다. Lowry 등은 환원형 피리딘뉴클레오티드의 형광을 이용한 고감도 정량법[O.H.Lowry 등, A Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, New York (1972); F.M.Matschinsky 등, J.Histochem. Cytochem., 16권, 29항 (1968)]을 개시하고 있다. 이것은 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)의 340nm에 있어서 흡광도가 0.1mmol이거나 0.617을 나타내는 것을 이용하여, 시료의 흡광도 값으로부터 NADH의 절대농도를 구하는 방법이다.
또한 글리코겐을 글루코스-1-인산으로 변환하는 효소에서 글리코겐포스포릴레이즈가 무기인산(Pi)의 존재하에서 AMP에 의해 활성화되는 것을 이용한 AMP의 측정도 제안되고 있다[E.Helmreich 등, Biochemistry, 52권, 647항(1964); 같은 저널, 51권, 131항(1964); M.Trus 등, Diabetes, 29권, 1항(1980)]. 이 방법에서는 글리코겐이 글루코스-1-인산으로 변환되는 양으로부터 글리코겐포스포릴레이즈 활성을 구하고, 이 활성을 지표로 하여, AMP의 양을 측정하는 것이 가능하다. 또한 AMP를 고감도로 측정하는 방법은 Lurie 등에 의해 개발되어 있다[K.Lurie 등, Ann.J.Physiol. 253권, H662항(1987)].
cAMP나 아데닐산 시클레이즈의 분석감도나 특이성을 구하기 위해서, 시료중의 비-환상 아데닌뉴클레오티드류를 효소분해 및/또는 크로마토그래피에 의해 제거하는 방법도 알려져 있다[N.D.Goldberg 등, Anal.Biochem., 28권, 523항(1969); B.Mcl.Breckenridge, Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 52권, 1580항(19640)].
그러나 이들 선행기술에 있어서는, 방해물질인 내인성의 ADP나 ATP를 완전하게는 제거할 수 없기 때문에 cAMP의 측정은 불가능하다고 결론짓고 있다. 그러므로 방사성물질을 이용하지 않고, 생물학적 시료중의 cAMP 양 및 이것에 기인한 아데닐산 시클레이즈 활성을 고감도로 구하는 수단은 실질적으로는 없는 것이 된다.
본 발명자는 우선 완전히 새로운 관점에서 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정 및 cAMP 양의 정량방법의 개발을 시도하여, 예의 검토한 결과, 방해물질인 ATP나 ADP, AMP 등의 시료중의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류나 글루코스-6-인산을 효소를 이용하여 선택적으로 제저한 후, 시료중의 cAMP를 AMP로 효소적으로 변환하고, 또한 AMP를 ATP로 변환하고, 그리고, 프럭토스-6-인산을 경유한 글루코스-6-인산으로 변환한 후, NADPH로 변환하고, 이 NADPH 농도를 형광광도법으로 측정하고, cAMP 농도와 상관시키는 것에 의해 유해한 방사성 물질을 이용하지 않고, 효소반응·화학반응만으로, cAMP 양 및 이것에 대응하는 아데닐산 시클레이즈 활성을 측정하는 것에 성공하였다(WO94/17198).
따라서, 이 방법을 이용하는 것에 의해, ㎍ 등급(order)의 생물학적 시료중의 cAMP 양을 pmol 또는 fmol 레벨로 정확하게 정량하는 것이 가능하였다[A.Sugiyama 등, Anal.Biochem., 218권, 20항(1994); A.Sugiyama 등,J.Clin.Lab., 8권, 437항(1994); A.Sugiyama 등, Anal.Biochem., 225권, 368항(1995); A.Sugiyama 등, Yamanashi Med.J., 10권, 11항(1995) 참조].
상기 종래방법의 반응식을 이하에 나타낸다.
공정 1 : 클리닝반응(시료중의 내인성 비-환상 뉴클레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산의 제거)
공정 2 : 변환반응 1(cAMP에서 AMP로의 변환)
공정 3 : 변환반응 2(AMP에서 ATP로의 변환)
공정 4 : ATP-ADP 사이클반응에 의한 증폭
(측정감도를 6000∼1만배로 증폭한다)
공정 5 : 검출반응(NADPH의 형광광도측정)
본 발명은 ATP로부터 내인성 아데닐산 시클레이즈(adenylate cyclase)에 의해 생성되는 cAMP(사이클릭아데노신-3',5'-일인산)과 ATP(아데노신-삼인산), AMP(아데노신-일인산), ADP(아데노신-이인산) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 내인성 비-환상의 아데닌뉴크레오티드류를 포함하는 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성을 방사성 시료를 사용하지 않고 측정하는 방법을 제공하는 것이고, 요약하면, (1) 상기 시료중의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌뉴크레오티드류 및 글루코스-6-인산을 효소적으로 제거하기 위해서 에이피레이즈(apyrase), 아데노신데아미네이즈(adenosine deaminase) 및 알칼리포스파테이즈(alkaline phosphatase)의 유효량을 포함하고, (2) cAMP을 AMP로 효소적으로 변환하고, (3) 방사성 물질을 사용하는 것이 없이 AMP의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 ATP의 표준시료에 있어 인큐베이션 시간에 대한 형광광도측정값을 나타낸 그래프이고,
도 2는 cAMP의 표준시료의 농도에 대한 흡광광도측정값을 나타낸 그래프이며,
도 3은 본 발명의 방법, 면역비색법 및 방사면역측정법을 이용한 cAMP 값을비교측정한 결과를 나타낸 막대 그래프이고,
도 4는 본 발명의 방법, 방사면역측정법 및 살로몬법을 이용한 아데닐산 시클레이즈 활성을 비교측정한 결과는 표시한 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 방법에 따라 정량되는 생물학적 시료는 바람직하게는 포유동물 유래의 것이 있고, 이것에는 조직, 혈구, 뼈를 포함하고, 또한 뇨, 혈액, 수액 등의 생물학적 유체가 포함된다. 이들 시료는 신선한 것도 있지만, 또한 냉동보전된 것도 좋다[Lowry 등, A Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, 뉴욕 (1972)].
바람직한 실시 태양에서는 본 발명은 이하와 같은 단계를 포함한다.
스텝 1-클리닝반응(시료중의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 글루코스-6-인산의 제거)
cAMP, 글루코스-6-인산 및 적어도 1종의 비-환상 아데닌뉴클레오티드류, 즉, ATP, ADP, AMP 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 생물학적 시료를 에이피레이즈, 아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈의 혼합물을 포함하는 수성 완충액과 혼합하여, 비-환상 아데닌뉴클레오티드류(ATP, ADP 및/또는 AMP) 및 글루코스-6-인산을 효소적으로 변환하여 제거한다..
「보다 신속하게」는 종래 약 1시간을 필요로 했던 클리닝반응이 약 5∼10분 이내로, 즉, 1/12∼1/6, 적어도 1/6의 반응시간으로 단축된 것을 말한다.
스텝 1-클리닝 옵션반응 2
또한 임의로, 상기 반응혼합물을 글루코스옥시데이즈, 글리코겐포스포릴레이즈 및 알칼리포스파테이즈로 혼합하여, 전체 시료중의 글리코겐을 분해, 제거한다. 이 때 cAMP는 반응혼합물중에 이것 그대로 보존된다. 이것에 의해, 스텝 3-검출반응 1(NADPH의 형광광도측정)에 있어서 이미 알고 있는 양의 글리코겐을 첨가하는 때의 방해물질로 되는 내인성 글리코겐이 소멸한다.
스텝 2-변환반응(AMP화 반응)
상기 반응혼합물을 포스포디에스테레이즈를 혼합시켜, 시료중의 cAMP를 AMP로 변환한다.
스텝 3-검출반응 1(NADPH의 형광광도측정)
또한, AMP를 글리코겐 및 무기인산의 존재하에 글리코겐포스포릴레이즈에 접촉시켜 글루코스-1-인산을 상기 반응 혼합물중에서 생성시키고, 상기 반응 혼합물중에 포스포글루코뮤테이즈를 반응시켜, 글루코스-6-인산을 생성시킨다. 이어서 6-포스포글루코노락톤, NADPH 및 H+로 효소적으로 변환하고, 상기 반응혼합물중의 NADPH 농도를 형광정량법으로 측정한다. 따라서 이 NADPH의 농도가 상기 시료중의 아데닐산 시클레이즈 활성, cAMP 양 또는 AMP 농도와 상관있다.
이 cAMP의 측정법은 cAMP의 3',5'-포스포에스테르 결합의 개열에 의해 생성된 AMP가, 글리코겐포스포릴레이즈 활성을 자극한다고 하는 원리에 기인한다. 즉, cAMP 및 아데닐산 시클레이즈 활성의 양은 cAMP로부터 생성된 AMP가 글리코겐포스포릴레이즈를 활성화하여 최종적으로 얻어진 NADPH의 흡광도에 대응한다.
NADPH의 최종 농도와 AMP 농도의 상관관계는 예컨대 검량선에 의해 구하는 것이 가능하다(도 2 참조).
바람직하게는 상기 스텝 1-클리닝반응 후에, 가열한 클리닝반응에서 사용했던 효소를 불활성화한다.
또한 바람직하게는 상기 스텝 1-클리닝반응에 계속하여 포스포디에스테레이즈, 글리코겐포스포릴레이즈, 글루코스-1,6-이인산, 무기인산, 글리코겐, NADP+, 글루코스-6-인산데히드로게네이즈, 포스포글루코뮤테이즈 및 Mg2+로 이루어진 액을 반응혼합물에 첨가하고, 상기 변환반응 및 검출반응의 공정을 인비트로에서 연속적으로 실시한다.
스텝 3-검출 옵션반응 1(6-포스포글루코노락톤의 분해)
임의로, 스텝 3-검출반응 1의 반응 혼합물을 가열하여 6-포스포글루코노락톤을 순차로 6-포스포글루콘산으로 변환하고, 그 후 Mg2+의 존재하에 NADP+및 6-포스포글루콘산데히드로게네이즈와 반응시켜, 상기에서 나타낸 것과 같이, 리불로스-5-인산, NADPH, H+및 CO2로서 상기 스텝 3 검출반응에서 생성된 NADPH의 농도를 높게하는 것도 가능하다.
스텝 3-검출 사이클반응 1
스텝 3-검출반응 1에서 생성된 NADPH의 유효농도는 이것을 사이클반응계에서 사용하는 것에 의해 수 등급 증가시키는 것이 가능하다. 즉, α-케토글루타르산의존재하에서 NADPH와 NADP+및 글루타민산으로 변환된다. NADP+는 이어서, 첨가되었던 글루코스-6-인산을 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로 변환한다. 상기한 바와 같이, 6-포스포글루코노락톤은 가수분해되고(H2O, 가열), 6-포스포글루콘산데히드로게네이즈 및 Mg2+의 존재하게 리불로스-5-인산 및 NADPH로 변환하는 것이 가능하다[Lowry 등, A Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich, 뉴욕 (1972)].
스텝 2-변환 옵션반응 1(ATP화)
또는 cAMP로부터 생성된 AMP는 흔적량의 ATP의 존재하에서 미오키네이즈와 혼합하는 것에 의해 ADP로 변환하는 것이 가능하다. 이어서 생성된 ADP는 2-포스포에놀피루빈산 및 피루빈산키네이즈로 처리하는 것에 의해 ATP와 피루빈산으로 변환된다. 이 반응에 의해 1분자의 AMP로부터 1분자의 ATP가 생성한다(ATP화 반응)
상기 cAMP로부터 AMP, ADP를 경유하여 ATP에 도달하는 스텝 2-변환반응 및 스텝 2-변환 옵션반응 1은 1단계로 행하는 것이 가능하다.
스텝 3-검출반응 2(NADPH의 형광광도측정)
또한 ATP는 우선 프럭토스의 존재하에 헥소키네이즈로 처리된 프록토스-6-인산 및 ADP로 전환된다. 생성된 프록토스-6-인산은 포스포글루코이소메레이즈의 작용에 의해 글루코스-6-인산으로 변환되고, 최종적으로 6-포스포글루코노락톤, NADPH 및 H+로 효소적으로 변환된다. 따라서 마찬가지로 NADPH 농도를 트러스 등의 방법[M.Trus 등, Diabetes, 29권, 1항(1980)]에 따라서 측정한다.
스텝 3-검출 옵션반응 1
또한 이상과 같이, 6-포스포글루코노락톤을 가수분해하여 6-포스포글루콘산으로 다시 변환하고, 이 6-포스포글루콘산을 NADP+의 존재하에 NADPH, H+, CO2및 리불로스-5-인산으로 변환하는 것도 좋다.
스텝 3-검출 사이클반응 2(ATP-ADP 사이클반응에 의한 증폭)
그리고 또한 ATP는 ATP-ADP 사이클반응에 제공된다. 즉, ATP는 우선 프럭토스의 존재하에 헥소키네이즈로 처리된 프럭토스-6-인산 및 ADP로 변환된다. 이어서 ADP는 포스포에놀피루빈산 및 피루빈산키네이즈의 작용에 의해 ATP 및 피루빈산으로 된다. 여기에 생성된 ATP는 다시 프럭토스-6-인산 및 ADP로 변환된다. 이 반응을 차례로 반응시키는 것에 의해, 최종적으로 프럭토스-6-인산이 축적된다.
사이클반응 종료시의 효소의 불활성화를 위해서, 킬레이트제를 첨가한다. 킬레이트제는 EDTA와 같은 폴리아미노칼본산, 구연산와 같은 옥시칼본산 등이 사용된다. 바람직하게는 EDTA이다.
사이클반응에서는 과잉의 프럭토스 및 포스포에놀피루빈산으로부터 얻어진 프럭토스-6-인산은 포스포글루코스이소메레이즈에 의해 글루코스-6-인산으로 변환된다. 이 글루코스-6-인산을 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 및 NADP+로 처리하는 것에 의해 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로 변환된다. 따라서 NADPH 농도를 트러스 등의 방법[M.Trus 등, Diabetes, 29권, 1항(1980)]에 따라서 측정한다(스텝 3-검출반응 2 참조).
스텝 3-검출반응 3
또한 본 발명에 있어서는 상기 스텝 2-변환 옵션반응 1의 ATP화 반응으로 생성된 ATP를 루시페레이즈 반응, 즉, 반디 루시페린을 사용한 화학적 형광분석법을 이용하여 흡광도 측정에 의해 검출하는 것도 좋다[Wulff 등, Methods of Enzymatic Analysis, H.U. Bergmeyer 편집, VCH(1985)]. ATP의 측정 값으로부터 AMP 및 cAMP 농도 및 이것에 대응하는 아데닐산 시클레이즈 활성을 산출하는 것이 가능하다. 이 반응의 진행은 특히 온화하지만, 반응수율(발광된 광자수와 변환된 ATP 분자수를 비교하여 정의된다)은 대략 100%이다. 발광강도는 ATP 농도와 정비례하고, 582nm에서 측정된다.
본 발명의 측정법은 반응계의 개념이 동일하다면, AMP 이외의 물질에 적용하는 것이 가능하다. 예컨대, GMP에 대응하는 효소를 적응하는 것에 의해, 구아닐산 시클레이즈 활성이나 사이클릭구아노신-3',5'-일인산(cGMP) 및 구아노신-3',5'-일인산(GMP)의 정량에 사용하는 것도 가능하다. 사용되는 반응식을 하기에 나타낸다.
스텝(i)-클리닝반응
스텝(ii)-변환반응
스텝(iii)-사이클반응
스텝(iv)-검출 반응
상기 반응을 보다 구체적으로 설명한다.
스텝(i)-클리닝반응
즉, 상기 식으로 표시된 것과 같이, 알칼리포스파테이즈, 뉴클레오티드포스포릴레이즈 및 구아네이즈로 이루어진 클리닝 혼합물이 사용된다. 알칼리포스파테이즈는 cGMP의 측정중에 블랭크 값들 높게할 가능성이 있는 화합물, 예컨대 글루코스-6-인산이나 비-환상 아데닌뉴클레오티드를 탈인산화하는데도 사용할 수 있다(클리닝반응).
클리닝반응은 시료중 GTP와 GMP + 2Pi로 변환된 후, 구아노신과 Pi로 변환된다. 구아노신은 구아닌과 리보오스-1-인산으로 변환되고, 따라서 구아닌은 크산틴과 암모니아로 변환된다. cAMP의 측정에 있어 클리닝반응과 마찬가지로, 최종의 클리닝반응에 있어 암모늄(또는 NH4+)은 일련의 클리닝반응을 본질적으로 종료시켜, 그 결과 간섭 뉴클레오티드를 확실하게 제거한다.
바람직하게는 클리닝반응에서 사용되는 효소는 이하 스텝(ii)- 변환반응 전에, 예컨대 가열에 의해 불활성화시킨다.
스텝(ii)-변환반응
다음으로, 포스포디에스테레이즈를 사용하여 시료중에 존재하는 cGMP를 GMP로 변환한다. GMP를 구아닌모노포스파테이즈의 존재하에 ATP와 혼합하면 구아노신-5'-이인산(GDP)과 ADP가 얻어진다.
스텝(iii)-사이클반응
GDP는 과잉의 포스포에놀피루빈산, 숙시닐-CoA 및 무기인산(Pi)의 존재하에 일정량의 피루빈산을 생성한다(사이클반응).
스텝(iv)-검출 반응
이 피루빈산은 산의 존재하에 유산 및 NAD+로 변환된 이미 알고 있는 양의 NADH를 첨가하여 간접적으로 정량된다. 이리하여 지표 시료의 형광은 cGMP, GMP 또는 구아닐산 시클레이즈에 대해 분석되는 시료중에 생성된 피루베이트의 양에 정비례하여 감소한다. 또한 과잉의 NADH를 산으로 분해한 후, 변환된 NAD+를 알칼리를사용하여 보다 형광강도가 높은 2-히드록시니코틴알데히드로 변환하는 것에 의해 측정감도를 향상시키는 것이 가능하다[K.Scya 등, Anal.Biochem., 272권, 243항(1999)].
본 발명에서는 스텝(ii)-변환반응에 있어서, 구아닌모노포스페이트키네이즈에 의해 분해한 ATP 양을 측정하여, GMP 양을 구하는 것도 가능하다. ATP는 상기에 나타낸 것처럼, 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 효소적 수법을 이용한 아데닐산 시클레이즈 활성 또는 구아닐산 시클레이즈 활성의 측정은 고감도이고, 비용도 현저하게 싸고, 또한 단시간에 결과를 얻는 것이 가능하다. 또한 방사성 물질을 사용하지 않기때문에 조작자에 있어 안전하고, 따라서 환경에 대하여도 바람직하다.
마지막으로 본 발명의 측정방법은 생물학적 시료중 내인성 또는 외래성의 포스포디에스테레이즈의 양을 측정하도록 적합화시킨 것도 용이하다. 즉, cAMP를 미리 선택된 단일 량을 미지농도의 포스포디에스테레이즈를 포함하는 시료에 첨가한다. 이 때 포스포디에스테레이즈에 대한 특이적인 저해제를 필요에 따라 첨가하는 것도 좋다. cAMP의 미리 선택된 단일의 과잉량을 여러 종류의 미리 선택된 이미 알고 있는 양의 포스포디에스테레이즈에 첨가하는 것에 의해 표준곡선이 얻어진다. 첨가된 cAMP의 몇개의 포스포디에스테레이즈에 의한 AMP로 전환되는 반응시간(5∼60분) 후에, 반응을 정지시킨다. cAMP 표준곡선을 동시에 실시하여 반응이 적절하게 진행되는 것을 증명하는 것이 가능하다. 클리닝반응을 개시하여, 비-환상 아데닌뉴클레오티드를 곧 분해한다. 잔존 cAMP는 천연 + 첨가 포스포디에스테레이즈에 반비례한다. 다음에 cAMP를 통상의 방법으로 AMP로 변환하고, 측정한다.
구체적으로는 시료 조직을 SET 완충액(0.5M의 슈크로즈, 0.03M의 트리스, 2mM의 EDTA)에 용해하고, 2배량의 PDE 혼합물(50mM의 트리스, 50μM의 cAMP)을 첨가하고, 37℃에서 20분간 인큐베이션한다. 이 반응 혼합물을 80℃에서 30분간 가열한다. 조직에 대하여 4배량의 클리닝반응 혼합물을 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션 한다. 이 반응 혼합물을 80℃에서 30분간 가열한다. 이어서 조직에 대하여 10배량의 변환반응 혼합물을 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션을 한 후 검출반응에 의해 NADPH의 형광광도를 측정한다.
본 발명에 있어서는, 사용되는 효소나 완충액 등이 미리 키트화 된 제제로서 제공된다. 이경우, 클리닝반응 혼합물 바이탈, 교환반응 혼합물 바이탈, 사이클반응 혼합물 바이탈, 검출반응 혼합물 바이탈과 같이, 각 반응 공정마다 바이탈을 조제하여 키트화하는 것이 편리하다.
본 발명에 사용되는 효소 등은 적당한 유리제 또는 프라스틱제 용기의 바이탈, 앰플에, 예컨대 액제, 냉동건조제 또는 고형제의 형상으로 충전되며, 제공된다.
효소류는 미리 완충액, 전해질액, 증류수 등에 용해시킨 것이 좋다. 혹은 복실(複室)용기에 효소와 용해액을 별도로 수용하여 두고, 사용직전에 혼합하는 것도 좋다.
또한 적절한 보존제, 안정화제, 착색제, 부형제, pH조절제 등의 첨가물을 첨가하는 것도 가능하다.
본 발명의 측정방법은 본 명세서에 기재된 증폭반응을 사용하는 것 외에, 적당한 자동분석장치를 사용하여 행하여도 좋다.
본 발명은 아데닐산 시클레이즈 활성 및 cAMP 및 cAMP 특이적 포스포디에스테레이즈 활성 및 G조절 단백질의 생물학적 활성에 관한 비방사성의 효소적 형광정량법을 제공한다. 또한 본 발명은 구아닌산 시클레이즈 활성 및 cGMP의 비방사적 측정을 제공한다.
본 발명의 방법은 현재 이용되고 있는 아데닐산 시클레이즈 활성 등의 측정방법에 비하여 몇가지 이점을 가진다. 즉, 본 발명은 Y.Salomon 등에 의해 개시된 종래법[Anal.Biochem.58권, 541항(1974); Adv.Cyclic Nucleotide Res., 10권, 35항(1979)]과 다르며, 방사성 물질을 일절 사용하지 않는다. 또한 본 발명의 측정방법은 종래법에 비해서 고감도이고 조작이 매우 간단하다.
게다가 본 발명자들이 이미 개발한 효소반응을 이용한 측정방법[A.Sugiyama 등, Anal.Biochem, 218권, 20항(1994); A.Sugiyama 등, J.Clin.Lab. 8권, 437항(1994); A.Sugiyama 등, Anal.Biochem, 225권, 368항(1995); A.Sugiyama 등, Yamanashi Med.J., 10권, 11항(1995)]과 비교하여도, 반응시간이 현저하게 단축되고, 조작도 보다 간편하게 되어 있다. 또한 종래 방법에서는 회피할 수 없었던 시료의 백탁화를 EDTA 등의 킬레이트제를 사용하는 것으로 해결하였다. 따라서 본 방법을 이용하는 것으로, ㎍ 등급의 생물학적 시료중의 cAMP 양을 pmol 또는 fmol 레벌로 정확하게 정량하는 것이 가능하다.
본 발명의 클리닝반응은 cAMP보다 매우 고농도로 있고, 제저하지 않으면 실질적으로 블랭크를 높게할 우려가 있는 전체의 시료중의 내인성 ATP, ADP 및 AMP를 제거하는 것이 가능하다. 더불어 이와 같은 방해물질로서 작용하는 시료중의 글루코스-6-인산 및 글루코겐도 완전히 제거하는 것이 가능하다. 이들 클리닝반응은 검출감도의 향상을 위해서 중요하다.
또한 본 발명에서는 종래 클리닝반응에 사용되었던 4종류의 효소(에이피레이즈, 5'-뉴클레오티데이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈)의 중, 5'-뉴클레오티데이즈의 사용을 취하지 않는 것에 의해, 1시간을 필요로 하였던 반응시간이 겨우 5분 내지 10분간 정도로 현저하게 단축할 수 있는 것을 발견하였다.
또한 사이클반응 후 킬레이트제에 의한 Mg2+를 트랩하기 때문에, 가열하는 것 없이 과일의 효소가 불활성화하는 것이 가능하고, 시료가 백탁하지 않는다.
본 발명의 측정방법의 감도는 반응용량을 감소시키는 것에 의해 높이는 것도 가능하다. 이 감도는 Meinrich 등 또는 E. Helmrich 등[E. Helmrich 등, Biochemistry, 52권, 647항(1964)]의 방법을 이용하는 것에 의해 반응 혼합물중의 글리코겐 및 무기인산의 농도를 변환하는 것에 의해 다시 높이는 것도 가능하다. 본 발명은 10㎍ 정도의 미량의 포유동물 조직의 막 단백질중의 아데닐산 시클레이즈 활성을 측정하는 것이 가능하다.
종래의 [α-32P] cAMP의 비활성 및 크로마토그라피 분리 등의 용량 사이즈에 의해 감도가 제한되는 방사활성측정방법과는 다르며, 본 발명의 형광정량방법에 있어서는 감도를 높게하는 것에 대하여 현저한 장해는 존재하지 않는다. 예컨대, cAMP는 광범위한 농도 범위(1fmol∼1pmol)에서 측정가능하다.
상기의 종래 기술의 방법은 원리적으로 특히 우수한 cAMP의 정량수단이고, 또한 이론적으로도 정확한 것이지만, 클리닝반응에 필요한 시간이 길고, 사이클반응 후에 가열에 의한 효소를 불활성화시킬 때에 반응 혼합물의 백탁이 발생하는 등의 점에서 개선의 여지가 있다.
본 발명은 보다 간편하고, 신속한 cAMP 양이나 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정 수단으로서, 게다가 방사성 물질을 사용하지 않는 측정방법의 개발을 목적으로 예의 연구한 결과 완성한 것이다.
본 발명은 우선 본 발명자들이 개시했던 효소 반응 및 형광광도법을 채용한 아데닐산 시클레이즈 활성 측정법 및 cAMP 정량법(WO94/17198)의 개선을 도모한 것이다. 즉, (1) 클리닝반응에 있어서, 5'-뉴클레오티데이즈의 사용을 취하지 않는 것에 의해, 반응시간을 1시간에서 5분 내지 10분간으로 극적으로 단축하는 것을 완성하고, (2) 사이클반응에 있어서, 반응 후의 효소의 불활성화 방법을 가열을 대신하여 EDTA 등의 킬레이트제를 이용하여 시료중의 Mg2+를 킬레이트 처리하여 제거하고, 효소를 불활성화하는 것에 의해, 시료의 백탁을 방지하였다. 이것에 의해 계속적으로 행하는 검출반응의 정밀도가 향상되었다. 또한 (3) 종래 2단계로 되었던 변환반응을 1단계로 하는 것으로, 보다 간편한 조작을 가능하게 하였다. 또한 (4) 검출반응에 있어서 시약 등의 농도를 재검토하여, 적정화하였다. 이것들의 개량을 가하는 것에 의해 생물학적 시료중의 cAMP 양 및 이것에 대응하는 아데닐산 시클레이즈 활성을 보다 신속, 또한 고감도로 측정할 수 있는 효소적 형광정량분석법 또는 분광광도분석법을 제공하는 것이 가능하였다.
또한 본 발명은 후술하는 것과 같이, 구아닌 조절 단백질 및 cAMP 특이적 포스포디에스테레이즈의 활성을 측정하기 위해서 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 cAMP의 측정에 이용되는 반응을 이하에 기재한다.
스텝 1-클리닝반응(시료중의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 글루코스-6-인산의 제거)
스텝 1-클리닝 옵션반응 1
(프럭토스-6-인산의 제거)
스텝 1-클리닝 옵션반응 2
(시료중의 내인성 글리코겐의 제거)
스텝 2-변환반응(AMP화 반응)
스텝 2-변환 옵션반응 1(ATP화 반응)
스텝 3-검출반응 1(NADPH의 형광광도측정)
스텝 3-검출 옵션반응 1(6-포스포글루코노락톤의 분해)
스텝 3-검출 사이클반응 1
스텝 3-검출반응 2(NADPH의 형광광도측정)
스텝 3-검출 사이클반응 2(ATP-ADP 사이클반응에 의한 증폭)
(측정감도를 6000∼1만배로 증폭한다)
스텝 3 : 검출반응 3(ATP의 검출)(루시페레이즈 반응)
상기의 반응을 보다 상세하게 설명한다.
스텝 1-클리닝반응(시료중의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 글루코스-6-인산의 제거)
본 발명은 에이피레이즈, 아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈의 혼합물에 의해, 시료중의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌잔기를 갖는 화합물(아데노신, ATP, ADP 및 AMP)을 효소적으로 제거하는 공정을 포함한다. 따라서 바람직하게는 알칼리포스파테이즈를 이용하여 시료중의 글루코스-6-인산을 글루코스로 효소적으로 변환하는 공정을 포함한다(클리닝반응).
본 발명의 클리닝반응은 cAMP보다 매우 고농도로 있고, 제거하지 않으면 실질적으로 블랭크를 높게할 우려가 있는 전체의 시료중의 내인성 ATP, ADP 및 AMP를 제거하는 것이 가능하다. 글루코스-6-인산은 후에 검출반응에서 생성하기때문에, 시료중의 글루코스-6-인산을 미리 효소적으로 제거하는 것은 본 측정방법의 정밀도를 향상시키는 데에 바람직하다. 이들 클리닝반응은 검출감도의 향상을 위해서 중요하다.
그리고 본 발명에서는 종래 클리닝반응에 이용되었던 4종류의 효소(에이피레이즈, 5'-뉴클레오티데이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈)의 중, 5'-뉴클레오티데이즈의 사용을 취하지 않는 것에 의해, 반응시간이 현저하게 단축되고, 간략화된다. 즉, 약 1시간을 필요로 하였던 반응시간이 겨우 5분 내지 10분간 정도로 현저하게 단축할 수 있는 것을 발견하였다.
스텝 1-클리닝 옵션반응 1
(프럭토스-6-인산의 제거)
또한, 마찬가지로 사이클반응 및 검출반응에서 생성된 프럭토스-6-인산도 알칼리포스파테이즈로 가수분해하고, 제거하여 두는 것이 바람직하다.
스텝 1-클리닝 옵션반응 2
(시료중의 내인성 글리코겐의 제거)
더욱 바람직하게는 글루코스옥시데이즈, 글리코겐포스포릴레이즈 및 알칼리포스파테이즈를 이용하여, 글루코스-6-인산으로 변환시킨 시료중의 내인성 글리코겐을 제거한다(옵션반응). 이것에 의해 스텝 3-검출반응 1(NADPH의 형광광도측정)에 있어서 이미 알고 있는 양의 글리코겐을 첨가하는 때의 방해물질로 되는 내인성 글리코겐이 소실한다.
스텝 2-변환반응(AMP화 반응)
다음으로, 클리닝반응 후의 시료에서 포스포디에스테레이즈를 작용시켜, cAMP를 AMP로 변환한다(변환반응).
스텝 3-검출반응 1(NADPH의 형광광도측정)
상기 변환반응후, 글리코겐 및 무기인산을 첨가하고, AMP가 글리코겐포스포릴레이즈를 활성화하여 글리코겐으로부터 글루코스-1-인산을 생성하는 과정을 지표로 하고, AMP를 정량한다. 즉, 글루코스-1-인산은 포스포글루코뮤테이즈에 의해 글루코스-6-인산으로 변환되고, 글루코스-6-인산은 최종적으로 6-포스포글루코노락톤, NADPH 및 H+로 효소적으로 변환된다. 최후에 NADPH 농도를 예컨대, 트러스 등의 방법[M.Trus 등, Diabetes, 29권, 1항(1980)]에 따라서, 형광정량법을 이용하여 측정한다.
스텝 3-검출 옵션반응 1(6-포스포글루코노락톤의 분해)
또한, 6-포스포글루코노락톤은 수성용매중, 인비트로에서 가열하여 6-포스포글루콘산으로 변환하는 것이 가능하며, 또한 6-포스포글루콘산은 NADP+의 존재하에 인비트로에서 NADPH 및 리불로스-5-인산으로 변환하는 것이 가능하다. 이것에 의해 NADPH의 농도를 높게하는 것이 가능하다. 이 NADPH 농도를 상기와 같이 예컨대, 트러스 등의 방법[M.Trus 등, Diabetes, 29권, 1항(1980)]에 따라서, 형광정량법을 이용하여 측정한다.
토끼 심장으로부터 얻은 동일 시료에 대한 자극된 아데닐산 시클레이즈 활성을 수정 살로몬(Salomon) 방사활성방법 및 알칼리포스파테이즈를 이용하지 않는 형광정량법 두가지 방법으로 측정하였더니, 측정결과는 유사하였다[Weign 등, Anal.Biochem. 208권, 217항(1993)]. 방사활성측정법과 형광정량법으로 얻은 결과를 비교하면, 절대적인 비활성은 다르지만, 아데닐산 시클레이즈의 자극배율은 유사하다. 비활성의 차이는 아마도 아데닐산 시클레이즈 반응 혼합물에 있어 미세한 펙터에 의한 것으로 생각된다. 즉, 방사활성 측정에서는 시료중 포스포디에스테레이즈에 의한 [32P]cAMP 분해를 방지하기 위한 비표지 cAMP가 사용되고, 한편 형광정량법에서는 새롭게 합성된 cAMP의 시료중 포스포디에스테레이즈에 의한 분해를 억제하기 위하여 테오필린이 사용되고 있다.
또한 스텝 3-검출사이클반응 2로 나타낸 ATP-ADP 사이클반응을 사용한 아데닐산 시클레이즈의 측정에 의하여 절대적인 비활성은 방사활성 및 형광정량법의 양 방법에서 동일한 것이 명확하게 되었다.
본 발명의 방법은 각 반응공정 마다 사용된 효소나 완충액 등을 바이알 등에넣고, 미리 키트로서 조제하면, 보다 간편하게 실시하는 것이 가능하다.
구체적으로는 (1) 생물학적 시료중의 내인성 ATP, ADP 및 AMP로 이루어진 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산를 제거하는데 효과적인 양의 에이피테이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈를 포함하는 클리닝반응용 바이알 키트, (2) 생물학적 시료중의 cAMP를 AMP로 효소적으로 변환하는데 유효한 양의 포스포디에스테레이즈를 포함하는 변환반응용 바이알 키트 및 (3)(a) 글리코겐을 글루코스-1-인산으로 변환하기 위한 글리코겐, 무기 인산 및 글리코겐포스포릴레이즈, (b) 글루코스-1-인산을 글루코스-6-인산으로 변환하기 위한 포스포글루코뮤테이즈, 디에스테레이즈 및 (c) 글루코스-6-인산을 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로 변환하기 위한 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 및 NADP+를 포함하는 검출반응용 바이알 키트를 포함하는 생물학적 시료중의 cAMP 양 및 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정용 키트이다.
또한 (1) 생물학적 시료중의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산을 효소적으로 제거하는데 유효한 양의 에이피레이즈, 아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈를 포함하는 클리닝반응용 바이알 키트, (2) 생물학적 시료중의 cAMP로부터 ATP의 효소적 변환하는데 유효량의 포스포디에스테레이즈, ATP, 미오키네이즈, 포스포에놀피루빈산 및 피루빈산키네이즈를 포함하는 변환반응용 바이알 키트 및 (3)(a) ATP를 글루코스-6-인산으로 변환하기 위한 프록토스 및 헥소키네이즈, (b) 글루코스-6-인산을 6-포스포글루코노락톤 및NADPH로 변환하기 위한 포스포글루코이소메레이즈 및 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 및 NADP+를 포함하는 검출반응용 바이알 키트를 포함하는 생물학적 시료중의 cAMP 양 및 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정용 키트를 열거하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 0.1mg 미만의 극미량의 시료중의 cAMP 양을 측정하는 것이 가능하고, 따라서 1fmol 미만의 cAMP/시료를 측정하는 것이 가능하다. 또한 본발명에 있어서는 생물학적 시료에서 이미 알고 있는 양의 ATP를 첨가하고, 이 ATP를 시료중의 아데닐산 시클레이즈의 작용으로 cAMP로 전환되고, 다음의 클리닝반응에 의한 내인성의 ATP 등의 아데닌뉴클레오티드류를 완전히 제거한 후, 변환된 cAMP 양을 구하는 것에 의해 아데닐산 시클레이즈 활성을 산출하는 것이 가능하다.
클리닝반응에 있어서는, 아데노신으로부터 생성된 암모늄이온은 일련의 클리닝반응을 본질적으로 완료시키고, 시료중의 뉴클레오티드류가 재형성하는 것을 방해한다. 이들의 조작에 의해, 지금까지의 형광정량분석법에서는 기대할 수 없는 현저한 개선효과를 얻었다[Weign 등, Anal Biochem, 208권, 217항(1993)].
본 발명은 이하의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명된다. 이들 실시예에 있어서 사용된 효소, 기질 및 코펙터는 Boehringer Mannheim 사로부터 구입하였다. 단 에이피레이즈 및 5'-뉴클레오티데이즈는 시그마사로부터 구입하였다. [α-32P] cAMP,3H-cAMP 및 아쿠아졸 신틸레이션 칵텔은 New England Neclear사로부터 구입하였다. Neutral Chromatographic Alumina WN-3은 바이오-래드사 제품을 사용하였다.
실시예 1 클리닝반응 시간의 설정
3μL의 ATP 표준품(0, 10, 100, 1000 및 10000pmol/관)을 10 ×57의 파이렉스(상품명) 제조 분석관에 넣었다. 실온에서 클리닝반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl, pH8.0; 2mM의 MgCl2; 2U/mL의 에이피레이즈; 10U/mL의 아데노신데아미네이즈; 40U/mL의 알칼리포스파테이즈) 25μL를 각 분석관에 넣었다. 이 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였다(0, 5, 10, 15 및 20분간). 이하, 스텝 2-변환반응(AMP화 반응) 및 변환 옵션반응(ATP화 반응), 스텝 3-검출사이클반응 2를 행하고, 340nm에서의 형광도를 측정하고, ATP가 완전하게 소실되는 인큐베이션 시간을 구하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 길게는 10분간의 인큐베이션에서 방해물질인 ATP는 거의 소실하는 것으로 판단되었다.
비교실험
본 발명의 클리닝반응과 5'-뉴클레오티데이즈를 이용한 클리닝반응을 비교하기 위해 행하였다.
5'-뉴클레오티데이즈를 포함하는 클리닝반응 혼합물의 조제
트리스-HCl(pH8.0), MgCl2, 5'-뉴클레오티데이즈, 에이피레이즈, 아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈에 물을 첨가하여 전체 용량을 25μL로 하고, 표 1에 나타난 최종 농도를 갖는 크리닝 반응 혼합물을 조제하였다.
표 1. 클리닝반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
MgCl22mM
5'-뉴클레오티데이즈 2.5U/mL
에이피레이즈 2U/mL
아데노신데아미네이즈 10U/mL
알칼리포스파테이즈 20U/mL
물 -
이 클리닝반응은 이하의 식으로 표시할 수 있다.
클리닝반응 시간의 설정
상기에서 조제된 클리닝반응 혼합물을 이용하고, 실시예 1의 방법으로 준비된 클리닝반응을 행하였다.
3μL의 ATP 표준품(0, 10, 100, 1000 및 10000pmol/관)을 10 ×57의 파이렉스(상품명) 제조 분석관에 넣었다. 실온에서 상기에서 조제된 클리닝반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 2mM의 MgCl2; 2U/mL의 에이피레이즈; 2.5U/mL의 5'-뉴클레오티데이즈; 0.1U/mL의 아데노신데아미네이즈; 20U/mL의 알칼리포스파테이즈) 25μL를 각 분석관에 넣었다. 이 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 이하, 실시예 2에 기재된 변환반응, 사이클반응 및 검출반응을 행하고, 340nm에서의 형광도를 측정하고, ATP가 완전하게 소실되는 인큐베이션 시간을 구하였다. 그 결과, ATP를 완전하게 소실시키기 위해서는 약 1시간을 필요로 하였다.
실시예 2 효소적 형광정량에 의한 조직 배양물에서의 미량 cAMP 측정
(1) 시료 및 반응 혼합물의 조제
A. 생물학적 시료의 조제(심실 근세포의 조제)
초대(初代)배양으로 증식시킨 1일령의 래트의 심장으로부터 심실 근세포를 채취하였다. 심장 당 약 500만개의 심근세포가 생존하였다. 100mm 당 약 100만개의 세포밀도로 펼친 후, 혈액세포를 5% 소 혈청 세포를 포함하는 행크스 평형염류용액(Hank's balanced salt solution)을 갖는 최소 필수배지중에서 증식시켰다[Simpson 등, Cir.Res., 51권, 787항(1982)]. 4일째에 배지를 교환하였다. 배양물은 90% 이상의 심근세포를 포함하고 있고, 세포수는 기간중 일정하였다[Simpson 등, Cir.Res., 51권, 787항(1982); Rocha-Singh 등, J.Clin.Invest., 88권, 204항(1991); Rocha-Singh 등, J.Clin.Invest., 88권, 706(1991)].
6 플레이트의 근세포를 2군(n=3플레이트/군)으로 무작위 추출하였다. 포스포디에스테레이즈 저해제, 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)을 각 군의 배지에 2μM의 최후 농도가 되도록 첨가하였다. 5분 후, 한 쪽의 군에 이소프로테레놀을 1μM의 최종농도가 되도록 첨가하고, 자극군으로 하였다. 다른 쪽의 군에서는 추가적인 약품을 첨가하지 않았다. 5분 후, 6개의 전체 플레이트의 세포 및 세포 없는 배양배지 플레이트를 합계 5mL의 100% 에탄올로 용출하였다. 각 혈액으로부터 얻은 용출물의 10분의 1(0.5mL)를 취하고, 12 ×75mm의 붕규산(borosilicate) 유리관중에서 바람으로 건조하고, -80℃에서 저장하였다. 남아있는 4.5mL도 마찬가지로 바람으로건조하고, 저장하였다. 측정시에 플레이트를 해동하고, 0.5N의 과염소산 100μL에 다시 현탁하였다. 추출액을 4℃에서 2분간 교반하고, 초음파처리기(Branson Cleaning Equipment사, A Smith-Kline사, 미국)를 사용하여 1분간 초음파처리하였다. 추출물을 25μL의 2N KOH로 중화하고, 2000g에서 30분간 원심분리한 후, 상청액(上淸液) 80μL를 분석용으로 채취하였다.
B. 클리닝반응 혼합물의 조제(스텝 1 클리닝반응 참조)
1M의 트리스-HCl(pH8.0) 400μL, 0.02M의 MgCl240μL, 500U/mL의 에이피레이즈 32μL, 400U/mL의 아데노신데아미네이즈 100μL 및 4000U/mL의 알칼리포스파테이즈 40μL에 물을 첨가하여 전체 용량을 4mL로 하고, 크리닝 반응 혼합물을 조제하였다(표 2).
표 2. 클리닝반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
MgCl22mM
에이피레이즈 4U/mL
아데노신데아미네이즈 10U/mL
알칼리포스파테이즈 40U/mL
물 -
실시예 2 (1)에서 조제된 래트 심실 근세포조제물을 차게한 후, 0.4μL의 스텝 1-클리닝 옵션반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 3mM의 MgCl2; 3U/mL의 에이피레이즈; 150㎍/mL의 아데노신데아미네이즈; 30U/mL의 알칼리포스파테이즈 및 75㎍/mL의 글리코겐포스포릴레이즈-α)를 넣고, 곧 내인성 아네닌뉴클레오티드, 글리코겐 및 글루코스-6-인산을 제거하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 80℃에서 30분간 가열하여 효소를 불활성화하였다.
C. 변환반응 혼합물의 조제(스텝 2-변환반응 및 스텝 2-변환 옵션반응 참조)
1M의 트리스-HCl(pH8.0) 400μL, 0.2M의 MgCl240μL, 4%의 소 혈청 알부민 10μL, 1M의 KCl 600μL, 0.1M의 디티오토레이톨 80μL, 0.1μM의 ATP 16μL, 0.5M의 포스포에놀피루빈산 24μL, 2U/mL의 포스포디에스테레이즈 24μL, 720U/mL의 미오키네이즈 24μL 및 2000U/mL의 피루빈산키네이즈 160μL에 물을 첨가하여 전체 용량을 4mL로 하고, 변환반응 혼합물을 조제하였다(표 3).
표 3. 변환반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
MgCl22mM
소 혈청 알부민 0.01%
KCl 150mM
디티오토레이톨 2mM
ATP 40nM
포스포에놀피루빈산 3mM
포스포디에스테레이즈 12U/mL
미오키네이즈 4.5U/mL
피루빈산키네이즈 80U/mL
물 -
D. 사이클반응 혼합물의 제조(스텝 3-검출 사이클반응 2)
1M의 트리스-HCl(pH8.0) 400μL, 0.2M의 MgCl240μL, 4%의 소 혈청 알부민 10μL, 0.1M의 프럭토스 30μL 및 1500U/mL의 헥소키네이즈 160μL에 물을 첨가하여 전체 용량을 4mL로 하고, 사이클반응 혼합물을 조제하였다(표 4).
표 4. 사이클반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
MgCl22mM
소 혈청 알부민 0.01%
프럭토스 3mM
헥소키네이즈 60mM
물 -
E. 검출 반응 혼합물의 제조(스텝 3-검출반응 2 참조)
1M의 트리스-HCl(pH8.0) 2000μL, 0.2M의 EDTA 320μL, 0.1M의 NADP+120μL, 3500U/mL의 포스포글루코이소메레이즈 6μL 및 1750U/mL의 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 6μL에 물을 첨가하여 전체 용량을 4mL로 하고, 검출반응 혼합물을 조제하였다(표 5).
표 5. 검출반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
EDTA 3.2mM
NADP+0.01%
포스포글루코이소메레이즈 1U/mL
글루코스-6-인산데히드로게네이즈 0.5U/mL
물 -
(2) 조직배양물에서의 효소적 형광정량에 의한 미량 cAMP 측정
A에서 조제한 심실 근세포 조제물을 시료로 하고, 클리닝반응, 교환반응, 사이클반응 및 검출반응으로 이루어진 일련의 효소적 형광정량법에 의해 cAMP를 구하였다.
1) 클리닝반응(스텝 1-클리닝반응)
중화한 3μL 용량의 근세포 추출물(100mm 플레이트로부터 얻어진 총 용출물의 2.4% 또는 0.24%의 어느 쪽) 또는 3μL의 cAMP 표준품(0, 3.6, 7.2, 14.4, 21.6및 28.8pmol/20μL)을 10 ×57의 파이렉스제 분석관(이와시로쇼코 제품)에 넣었다. 실온에서 B에서 조제한 25μL의 클리닝반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 2mM의 MgCl2; 2U/mL의 에이피레이즈; 10U/mL의 아데노신데아미네이즈; 40U/mL의 알칼리포스파테이즈)을 각 분석관에 넣었다. 이 혼합물을 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 이어서, 90℃에서 30분간 가열하여 효소를 불활성화하였다. 마찬가지로 내부 조직 블랭크를 제조하였다.
2) 변환반응(스텝 2-변환반응(AMP화 반응) 및-변환 옵션반응(ATP화 반응))
클리닝반응의 각 분석관에 C에서 조제한 변환반응 혼합물(100M의 트리스-HCl(pH8.0); 2mM의 MgCl2, 0.01%의 소 혈청 알부민; 150mM의 KCl; 2mM의 디티오토레이톨; 40nM의 ATP; 3mM의 포스포에놀피루빈산; 12mU/mL의 포스포디에스테레이즈; 4.5U/mL의 미오키네이즈; 80U/mL의 피루빈산키네이즈) 25μL를 첨가하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 분석관을 90℃에서 5분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
3) 사이클반응(스텝 3-검출사이클반응 2)
변환반응의 각 분석관에 D에서 제조한 사이클반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 2mM의 MgCl2;0.01%의 소 혈청 알부민; 3mM의 프럭토스; 60U/mL의 헥소키네이즈) 25μL를 첨가하였다. 반응당 효소농도가 높은 것을 고려하여, 이들 반응물을 0℃에서 장치하고 전체의 분석관의 개시시간을 확실하게 동일하게 하는 것이 중요하였다. 37℃에서 2시간 인규베이션하였다(약 4000∼10000사이클).
4) 검출반응(스텝 3-검출반응 2)
사이클반응의 각 분석관에 E에서 제조한 검출반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 3.2mM의 EDTA; 0.6mM의 NADP+; 1U/mL의 포스포글루코이소메레이즈; 0.5U/mL의 글루코스-6-인산데히드로게네이즈) 125μL를 첨가하였다. 실온에서 20분간 반응 후, 플루오메타(Optical Technology Devises사, 유럽)를 사용하여 NADPH의 최종 농도를 측정하였다. 플루오메타는 10형광 단위로 독해되는 완충액(50mM의 트리스-HCl(pH8.0)) 900μL중 1nmol의 NADPH와 등가가 되도록 설치하였다.
또한 각각의 분석과정은 이미 알고 있는 농도의 적당한 기질을 사용한 내부대조를 동시에 분석하는 것에 의해 확인하였다(예컨대, 클리닝반응을 체크하기 위하여 ATP를 추가적으로 사용하고, 변환반응을 평가하기 위해서 AMP 표준직선을 사용하고, 사이클반응을 평가하기 위해서 ATP 표준직선을 사용하였다)
5) 측정결과
340nm에서의 흡광측정에 의한 cAMP 표준품(0, 3.6, 7.2, 14.4, 21.6 및 28.8pmol/20μL)으로부터 도 2에 나타낸 표준 cAMP 직선을 얻었다.
또한 (1)의 A에서 조제한 시료에 대하여, 추가적인 약제를 첨가하지 않은 대조군 및 이소프로테레놀 자극군중의 cAMP 함량을, 각 시료의 플레이트의 1/10의 용리액(溶離液)에 관계하고, 얻어진 표준 cAMP 직선(도 2)를 이용하여 측정하고, cAMP 680pmol/100mm 플레이트의 실측치를 얻었다.
본 발명의 방법, 면역비색키트(아마샤무·인터내셔날제) 및 방사면역측정키트(아마샤무·인터내셔날제)를 이용하여 cAMP를 측정한 결과를 도 3에 나타낸다.cAMP 함량의 측정결과는 공지의 방법의 방사활성측정방법에 의해 얻어진 결과와 잘 일치하였고, 그 차이는 통상 5% 이하였다.
또한 cAMP의 정량결과로부터 아데닐산 시클레이즈 활성을 본 발명의 방법, 방사면역측정법 및 살로몬(Salomon)법에 의해 구하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 아데닐산 시클레이즈 활성은 1분간 당 단백질 1mg에서의 cAMP의 생성량(pmol)을 나타낸다.
실시예 3
1M의 트리스-HCl(pH8.0) 0.2M의 MgCl2, 1M의 K2HPO4, 0.1M의 AMP, 4000U/mL의 알칼리포스파테이즈 및 10mg/mL의 글리코겐포스포릴레이즈의 적량을 취해서, 물을 첨가하여 최종농도가 이하와 같이 클리닝반응 혼합물을 조제하였다.
표 6. 클리닝반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
MgCl22mM
K2HPO45mM
AMP 0.1mM
알칼리포스파테이즈 20U/mL
글리코겐포스포릴레이즈 10㎍/mL
물 -
1M의 트리스-HCl(pH8.0), 0.1M의 MgCl2, 1M의 K2HPO4, 0.1M의 AMP, 0.1M의 디티오토레이톨, 1mM의 글루코스-1,6-이인산, 4%의 소 혈청 알부민, 0.1M의 NADP, 10mg/mL의 글리코겐포스포릴레이즈, 10mg/mL의 포스포글루코뮤테이즈, 5mg/mL의 글루코스-6-인산데히드로게네이즈의 적량을 취하고, 물을 첨가하여 최종 농도가 이하가 되도록, 변환반응 혼합물을 조제하였다.
표 7. 변환반응 혼합물
화합물 최종농도
트리스-HCl(pH8.0) 100mM
MgCl22mM
K2HPO45mM
AMP 0.1mM
디티오토레이톨 1mM
글루코스-1,6-이인산 4μM
소 혈청 알부민 0.01%
NADP 0.2mM
글리코겐포스포릴레이즈 20㎍/mL
포스포글루코뮤테이즈 4㎍/mL
글루코스-6-인산데히드로게네이즈 2㎍/mL
물 -
1) 클리닝반응(스텝 1-클리닝 옵션반응 2)
206μM의 글리코겐을 포함하는 글리코겐 용액을 제조하고, 12개의 파이렉스제 분석관(이와시로쇼코 제품)에 나누어 주입하고(0, 20, 40 및 80μL를 각 3개), 증류수를 첨가하여 전체 용량을 80μL로 하였다. 실온에서 500μL의 클리닝반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 2mM의 MgCl2; 5mM의 K2HPO4; 0.1mM의 AMP; 20U/mL의 알칼리포스파테이즈; 10㎍/mL의 글리코겐포스포릴레이즈)을 각 분석관에 넣었다. 이 혼합물을 37℃에서 60분간 인큐베이션 하였다.
4) 검출반응(스텝 3-검출반응 1)
클리닝반응의 각 분석관에 변환반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl(pH8.0); 2mM의 MgCl2;5mM의 K2HPO4;0.1mM의 AMP; 1mM의 디티오토레이톨; 4μM의 글루코스-1,6-이인산; 0.01%의 소 혈청 알부민; 0.2mM의 NADP; 20㎍/mL의 글리코겐포스포릴레이즈; 4㎍/mL의 포스포글루코뮤테이즈; 2㎍/mL의 글루코스-6-인산데히드로게네이즈) 500μL를 첨가하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 각 분석관 당 여기파장 340nm에서의 460nm의 형광파장을 측정하였다. 그 결과, 글리코겐 용액중의 글리코겐이 완전히 클리닝반응에 의해 소실되는 것을 확인하였다.
실시예 4
킬레이트에 의한 백탁 방지효과
실시예 2의 사이클반응 후의 분석관에 EDTA를 포함하지 않는 검출반응 혼합물(100mM의 트리스-HCl, pH8.0; 0.6mM의 NADP+; 1U/mL의 포스포글루코이소메레이즈; 0.5U/mL의 글루코스-6-인산데히드로게네이즈) 125μL를 첨가하고, 90℃에서 30분간 가열하고, 효소를 불활성화시켰다. 시료액의 백탁의 정도를 눈으로 관찰하였다. 또한 실시예 2에서 얻어진 검출반응 혼합물 첨가용액(EDTA-실온으로 효소를 불활성화시킨 것)을 대조하였다.
그 결과, 가열하여 불활성화한 경우는 시료용액이 백탁된 것에 대하여, EDTA를 사용한 경우는 시료용액은 맑았다.
본 발명에 의해 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성을 방사능시약을 사용하지 않고서 측정하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명에 의하면, 방해물질인 ATP나 ADP, AMP 등의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류나 글루코스-6-인산을 효소를 이용한 클리닝반응에 의해 선택적 또는 효율적으로 제거할 수 있다. 그리고 시료중의 cAMP를 AMP로 효소적으로 변환한 후, ATP로 변한한다. 그리고 또한 ATP를 프럭토스-6-인산을 경유하여 글루코스-6-인산을 변환 후, NADPH로 변환하고, 이 NADPH 농도를 형광광도법으로 측정하고, cAMP 농도와 상관시키는 것에 의해, 유해한 방사성 물질을 이용하지 않고, 효소반응·화학반응만으로 안전하게 cAMP 양 및 이것에 대응하는 아데닐산 시클레이즈 활성을 측정할 수 있다.
특히 본발명에 있어서는, 클리닝반응에 사용한 효소를 에이피레이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈로 한정하고, 게다가 그 농도를 조정하는 것에 의해 조작을 간편하게 하여 반응시간을 1/6∼1/12로 극적으로 단축하는 것에 성공하였다.
cAMP 양은 세포의 영양, 증식, 분화, 적응상태에 좌우되어 민감하게 변동하는 것으로부터, cAMP 양을 측정하는 것에 의해, 세포의 생존도, 내분비호르몬 축기능, 아데닐산 시클레이즈 활성, 포스포디에스테레이즈 활성을 평가하는 것이 가능하고, 이들 평가값은 기초의학 및 임상의학 분야에 있어서 중요한 지침이 될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하는 것에 의해, 이러한 cAMP 양 및 이것에 대응하는 아데닐산 시클레이즈의 활성을 안전하고 고감도로 측정하는 것이 가능하다.

Claims (22)

  1. 생물학적 시료중의 내인성 ATP, ADP 및 AMP로 이루어진 비-환상 아데닌뉴크레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산을 보다 신속하게 제거하는 방법에 있어서, 생물학적 시료를 비-환상 아데닌뉴크레오티드류 및 글루코스-6-인산을 제거하는데 효과적인 양의 에이피레이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈를 이용하여 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정방법에 있어서,
    클리닝반응: 생물학적 시료를 내인성 ATP, ADP 및 AMP로 이루어진 비-환상 아데닌뉴크레오티드류 및 글루코스-6-인산을 제거하는데 효과적인 양의 에이피레이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈를 이용하여 처리하는 공정,
    변환반응: 생물학적 시료중의 cAMP를 AMP로 효소적으로 변환하는 공정,
    검출반응: 방사성 시약을 이용하지 않고 AMP 양을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 클리닝반응에서 상기 시료에 추가적으로 유효량의 글루코스옥시데이즈, 글리코겐포스포릴레이즈 및 알칼리포스파테이즈를 첨가하여 처리하고, 상기 시료로부터 내인성 글리코겐을 효소적으로 제거하는 것을 포함하는방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 변환반응은 상기 시료를 유효량의 포스포디에스테레이즈에 의한 처리에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, cAMP로부터 AMP로의 상기 변환반응의 효소는 cAMP를 변환시킨 후에 킬레이트제에 의해 불활성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 킬레이트제는 EDTA인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 검출반응은 첨가된 무기인산의 존재하에, 같이 첨가된 글리코겐을 글리코겐포스포릴레이즈와 접촉시켜 글루코스-1-인산으로 변환되는 것을 포함하고, 이 변환이 시료에 포함된 AMP에 의해 인비트로에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출반응에서 추가적으로 글루코스-1-인산을 글루코스-6-인산으로 변환하는데 유효한 양의 포스포글루코뮤테이즈로 상기 시료를 처리하고, 이어서 글루코스-6-인산을 6-포스포글루코노락톤으로 변환하는데 유효한 양의 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 및 NADP+로 상기 시료를 처리함으로써 글루코스-1-인산을 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로 변환하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출반응에서 추가적으로 상기 시료를 물의 존재하에 가열하여, 6-포스포글루코노락톤을 6-포스포글루콘산으로 변환하고, 이어서 이 6-포스포글루콘산을 리불로스-5-인산 및 NADPH로 변환하는데 유효한 양의 NADP+를 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  10. 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성을 측정하는 방법에 있어서,
    클리닝반응: 생물학적 시료를 상기 시료중의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산을 효소적으로 제거하는데 유효한 양의 에이피레이즈, 아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈로 처리하는 공정,
    변환반응: 생물학적 시료중의 cAMP를 ATP로 효소적으로 변환하는 공정,
    검출반응: ATP를 프럭토스-6-인산으로 효소적으로 변환하고, 프럭토스-6-인산을 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로 효소적으로 변환 후, 방사성 물질을 이용하지 않고 NADPH 농도를 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 클리닝반응에서 추가적으로 상기 시료를 유효량의 글루코스옥시데이즈, 글리코겐포스포릴레이즈 및 알칼리포스파테이즈로 처리하고, 상기 시료로부터 내인성 글리코겐을 효소적으로 제거하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 검출반응에서 프럭토스-6-인산을 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로 효소적으로 변환 후, 계속하여 반응 혼합물을 가열하고, 그리고 상기 반응 혼합물에 6-포스포글루콘산데히드로게네이즈 및 NADP+를 첨가함으로써 상기 6-포스포글루코노락톤을 리불로스-5-인산 및 NADPH로 변환하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 클리닝반응의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류는 ATP, ADP, AMP의 1종 또는 그 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 변환반응에서 cAMP로부터 ATP의 변환은 유효량의 포스포디에스테레이즈, 미오키네이즈 및 피루빈산키네이즈를 조합시켜서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 검출반응에서 ATP로부터 프럭토스-6-인산의 변환은 헥소키네이즈 및 피루빈산키네이즈를 조합시켜서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 검출반응에서 프럭토스-6-인산으로부터 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH의 변환은 포스포글루코이소메레이즈 및 글루코스-6-인산데히드로게네이즈를 조합시켜서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 검출반응에서 ATP를 프럭토스-6-인산으로 변환하는 효소는 비-환상 아데닌뉴클레오티드류의 변환 후에 킬레이트제에 의해 불활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 킬레이트제는 EDTA인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항, 제2항 또는 제10항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 포유동물 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항, 제2항 또는 제10항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 생물학적 액체인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정용 키트에 있어서,
    (1) 생물학적 시료중의 내인성 ATP, ADP 및 AMP로 이루어진 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산을 제거하는데 효과적인 양의 에이피레이즈, 알칼리포스파테이즈 및 아데노신데아미네이즈를 포함하는 클리닝반응용 바이알 키트,
    (2) 생물학적 시료 중의 cAMP를 ATP로 효소적으로 변환하기 위한 유효량의 포스포디에스테레이즈를 포함하는 변환반응 바이알 키트, 및
    (3) 글루코겐으로부터 글루코스-1-인산으로의 변환을 위한 글리코겐, 무기인산, 글리코겐포스포릴레이즈, 글루코스-1-인산으로부터 글루코스-6-인산으로의 변환을 위한 포스포글루코뮤테이즈, 및 글루코스-6-인산으로부터 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH로의 변환을 위한 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 및 NADP+를 포함하는 검출반응용 바이알 키트
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 생물학적 시료중의 cAMP 양 또는 아데닐산 시클레이즈 활성의 측정용 키트에 있어서,
    (1) 생물학적 시료 중의 cAMP 이외의 내인성 비-환상 아데닌뉴클레오티드류 및 내인성 글루코스-6-인산을 효소적으로 제거하는데 유효한 양의 에이피레이즈,아데노신데아미네이즈 및 알칼리포스파테이즈를 포함하는 클리닝반응용 바이알 키트,
    (2) 생물학적 시료 중의 cAMP로부터 ATP의 효소적 변환을 위한 유효량의 포스포디에스테레이즈, ATP, 미오키네이즈, 포스포에놀피루빈산 및 피루빈산키네이즈를 포함하는 변환반응 바이알 키트, 및
    (3) ATP로부터 프럭토스-6-인산의 변환을 위한 프럭토스 및 헥소키네이즈, 프럭토스-6-인산으로부터 6-포스포글루코노락톤 및 NADPH의 변환을 위한 포스포글루이소메레이즈, 글루코스-6-인산데히드로게네이즈 및 NADP+를 포함하는 검출반응용 바이알 키트
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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