KR102610767B1 - 자가혈당측정기를 이용한 유전자 검출 방법 - Google Patents

자가혈당측정기를 이용한 유전자 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 유전자 및 또는/ 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 시료에 검출하고자 하는 표적(예를 들면, SARS, COVID 19, 암 유발 인자 등)의 핵산 염기서열이 존재하는 경우 해당 핵산 염기서열을 분해하여 PGM을 통해 신속하게 검출할 수 있고, 핵산 염기서열을 사용자의 목적에 따라 바꿈으로써 진단 대상 질환을 변경할 수 있어 다양한 질환의 진단에 범용적으로 사용 가능하다.

Description

자가혈당측정기를 이용한 유전자 검출 방법{Gene detection method using personal glucose meter}
본 발명은 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 유전자 및 또는/ 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
기존의 자가 현장 진단(Point of care tseting; POCT) 기기들은 대부분 사용 조건이 까다롭거나 구동 방식이 어려우며, 전문 지식을 필요로 하고, 현장 진단할 수 있는 물질들의 수가 한정적이어서 일반인을 대상으로 하는 현장에 실질적으로 적용하기 어려운 문제점이 있었다.
예컨대, CRISPR-Cas 단백질을 이용한 자가 현장 진단 기기의 경우, 표적 핵산 존재시 형광 또는 LFA 방법을 이용하여 확인하였으나, 형광 방법의 경우 형광을 확인할 수 있는 장비가 추가적으로 필요하며, LFA(Lateral Flow Immunoassay) 방법은 1회용으로 지속적인 사용이 불가능한 단점이 있었다.
이에, 전문 지식과 장비이 없는 일반인도 손쉬운 조작으로 빠른 시간 내 진단 결과를 도출할 수 있는 자가 현장 진단 기기 개발이 요구되어 왔다.
한편, 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)는 장비가 작아서 휴대가 간편하고, 가격이 저렴하며 사용법 또한 간단하여 일반 대중들에게도 널리 보급되어 사용되고 있다. 또한, PGM는 기기 사용 방식이 편리하면서도 결과 도출이 신속한 바, 최근에는 혈액 내 혈당 측정뿐만 아니라 다른 물질을 글루코스와 연관시켜 범용성 높은 POCT 방법에 응용되고 있다(US 8,945,943).
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 쉽고 빠른 범용적인 진단 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, PGM을 이용하여 시료 내 검출 표적의 핵산 염기서열이 존재하는 경우 해당 핵산 염기서열을 분해하여 검출할 수 있는 자가 현장 진단 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 시료 내 검출 대상 핵산을 가이드 RNA 및 표적 RNA의 존재하에서 Cas13 단백질에 의해 절단하여 AMP를 생산하는 단계; (b) (a) 단계의 AMP를 미오카이네이즈(Myokinase)를 이용하여 인산화시켜 ADP를 생산하는 단계; (c) (b) 단계의 ADP를 글루코스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 ATP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코스를 글루코스-6-인산으로 전환하는 단계; 및 (d) (c) 단계의 ATP 검출용 조성물의 글루코스 농도를 혈당측정기로 측정하여 ATP를 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질을 포함하는 제1 용기; 미오카이네이즈를 포함하는 제2 용기; 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 ATP 검출용 조성물을 포함하는 제3 용기; 및 혈당측정기를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) 시료 내 검출 대상 핵산을 가이드 RNA(gRNA) 및 표적 RNA의 존재하에서 Cas13 단백질에 의해 절단하여 AMP를 생산하는 단계; (b) (a) 단계의 AMP를 미오카이네이즈(Myokinase)를 이용하여 인산화시켜 ADP를 생산하는 단계; (c) (b) 단계의 ADP를 글루코스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 ATP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코스를 글루코스-6-인산으로 전환하는 단계; 및 (d) (c) 단계의 ATP 검출용 조성물의 글루코스 농도를 혈당측정기로 측정하여 ATP를 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명에서 "(a), (b), (c), (d) …"와 같은 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간 등 임의의 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, (a) 단계는 시료 내 검출 대상 핵산을 가이드 RNA 및 표적 RNA의 존재하에서 Cas13 단백질에 의해 절단하여 AMP를 생산하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하며, 검출 대상 핵산이 포함된 시료라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 검출 대상 핵산은 바이러스, 세균 및 종양유전자(oncogene)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 바이러스는 일예로, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), COVID 19, 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV), 인간면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV), Influenza 바이러스, Papilloma 바이러스, Hepatitis 바이러스, 아데노바이러스, 단순포진 제1형, 단순포진 제2형, Varicella-zoster 바이러스, Epstein-Barr 바이러스, Human cytomegalo 바이러스, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV), BK 바이러스, JC 바이러스(John Cunningham virus), 천연두 바이러스, 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노로바이러스, Coxsackie 바이러스, A형 간염 바이러스, Polio 바이러스, Rhino 바이러스, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV), 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, West Nile 바이러스, TBE 바이러스, 풍진 바이러스, 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), Lassa 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, Hantaan 바이러스, 에볼라 바이러스(Ebola Virus), Marburg 바이러스, Measles 바이러스, Mumps 바이러스, Parainfluenza 바이러스, 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RS 바이러스), Rabies 바이러스, 로타바이러스, Orbi 바이러스, Colti 바이러스 및 Banna 바이러스 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세균은 일예로, 대장균(Escherichia coli, E. coli), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 임질균(Gonorrhea), 레지오넬라(Legionella), 수막구균(Meningococcus), 백일해균(Pertussis), 예르시니아 페스트균(Yersinia pestis), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 프란시엘라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 탄저균(Anthrax), 디프테리아(Diphtheria), 장내구균(Enterococci), 돼지단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 노카르디아(Nocardia), 폐렴구균(Pneumococcus), 연쇄상구균(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 렙토스피라(Leptospira), 보렐리아(Borrelia), 모닐리포르미스사슬막대균(Moniliformis streptococcus), 악티노마이시즈 이스라엘리(Actinomyces israeli), 박테로이디즈(Bacteroides), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 및 파상풍균(Clostridium tetani) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 종양유전자는 일예로, c-myc, N-myc, L-myc, c-jun, jun-B, jun-D, c-fos, fos-B, ets-1, ets-2, myb, erbA, rel, ski, spi-1, evi-1, Ha-ras, Ki-ras, N-ras, erbB-1, erbB-2, erbB-2/neu, src, fms, mos, abl, ros, raf, yes, fps, trk, sis, Adeno E1A, Polyoma large T, Papilloma E7, SV40 large T 및 Polyoma middle T 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "Cas13(Cas13a) 단백질"은 gRNA와 결합되어 있을 때 표적 RNA(예컨대, 단일가닥 RNA(ssRNA))를 만나면 인식하고, 표적 RNA와 주변 ssRNA를 절단하는 단백질을 의미한다. 이때, gRNA의 존재 여부는 Cas13의 on, off와 같은 스위치 역할을 한다. Cas13과 gRNA가 결합되어 있을 때, 표적 RNA의 존재 여부는 Cas13의 on, off와 같은 스위치 역할을 한다. Cas13 반응에 의해 절단되는 핵산은 AMP와 구조가 유사한 Adenosine 2', 3'-cyclic Phosphate 이다.
본 발명의 일 구현예에서, 표적 RNA 및 형광표지(Cy5) 프로브(도 2)가 포함된 조성물을 이용하여 Cas 13a 단백질에 의해서 하나의 염기가 절단되는지를 확인한 결과, 표적 RNA 존재 유무에 따라 형광값에 차이가 있음을 확인하였으며(도 3), 표적 RNA가 존재하는 경우 형광 신호가 증폭되었는데 이는 Cas 반응으로 예상 절단 부위(도 2)로부터 AMP와 구조가 유사한 핵산인 Adenosine 2', 3'-cyclic Phosphate가 절단되어 rA 염기 1개가 떨어져 나와 형광이 발현되었기 때문임을 알 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 AMP를 생산하기 위해 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(T4 polynucleotide kinase, PNK)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, (b) 단계는 (a) 단계의 AMP를 미오카이네이즈를 이용하여 인산화시켜 ADP를 생산하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "미오카이네이즈(Myokinase)"는 ATP　+　AMP　⇔ 2　ADP의 반응을 촉매하는 효소로, AMP와 삼인산 오염기(triphosphate pentabasic)를 사용하여 ADP를 생성한다. 상기 미오카이네이즈는 ATP가 과량 존재하고 AMP가 소량 존재시 AMP를 합성하고, ATP가 소량 존재하고 AMP가 과량 존재시 ATP를 합성하여, ATP, AMP 및 ADP 간의 균형을 맞춰주는 효소이다.
본 발명의 일 구현예에서, 미오카이네이즈에 의해서 ATP가 생성되는지를 확인한 결과, ATP가 존재하는 경우 ATP 신호가 측정되었으며, AMP가 존재하는 경우 ATP 신호가 측정되지 않았으나, AMP 존재 하에 미오카이네이즈가 첨가되면 ATP 신호가 발생하여 미오카이네이즈 반응을 통해 AMP가 ATP로 전환된 것을 확인하였다(도 4).
본 발명의 방법에 있어서, (c) 단계는 (b) 단계의 ADP를 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 함유하는 ATP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코스를 글루코스-6-인산으로 전환하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 미오카이네이즈 및 헥소카이네이즈와 피루베이트카이네이즈에 의한 CER(Cascade enzyme reactions)이 일어나는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "CER(Cascade enzyme reactions)"은 몇 가지의 효소가 생성물과 반응물을 공유하여 양성 피드백 작용이 일어나는 것을 의미하며, 시료 내 존재하는 검출 대상 핵산의 양이 극히 적더라도 상기 CER을 통해 양성 피드백 작용이 유도되어, 각 반응 단계를 거치면서 반응이 증폭됨으로써 핵산 검출이 용이할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 CER은 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈가 양성 피드백 작용을 일으키는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "헥소카이네이즈(hexokinase)"는 ATP를 ADP로 전환하는 효소를 의미한다.
본 발명에서 용어, "피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)"는 ADP를 ATP로 전환하고, 포스포에놀피루빅산(phosphoenolpyruvic acid, PEP)을 피루베이트(pyruvate)로 전환하는 효소를 의미한다.
구체적으로, 상기 헥소카이네이즈에 의해서 ATP는 ADP로 전환되고 글루코오스가 글루코오스-6-인산으로 전환되며, 상기 반응과 동시에 피루베이트 카이네이즈에 의해서 헥소카이네이즈 효소 반응으로 생성된 ADP는 다시 ATP로 전환되고, 포스포에놀피루빅산이 피루베이트로 전환되어, 양성 피드백 작용이 일어남으로써 CER이 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, (d) 단계는 (c) 단계의 ATP 검출용 조성물의 글루코스 농도를 혈당측정기로 측정하여 ATP를 검출 또는 정량하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)"란, 혈액 속의 포도당이 당산화효소에 의해 산화되어 생기는 과산화수소가 산소로 바뀌면서 발생하는 전자를 전극을 사용하여 전류로 전환하고 정량화시켜 혈액 속의 혈당농도를 분석하는 기기를 의미한다. 혈당측정기의 평가는 검사실에서 사용하는 장비와 다른 표준화 방법으로 정확도 및 정밀도를 평가할 필요성이 대두되어 국제표준화 기구(International Organization for Standardization; ISO)에서 자가혈당측정기의 정확성을 ISO15197로 명기하고 있다. 상기 혈당측정기는 자가혈당측정기와 혼용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 미오카이네이즈 및 헥소카이네이즈(hexokinase)와 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)에 의한 CER에 의해 AMP가 ATP로 전환되어 글루코스 농도 변화를 유도하는지를 확인한 결과, AMP 농도에 따라 글루코스 측정값이 선형적으로 감소하여, 미오카이네이즈와 CER에 의해 글루코스 농도가 변화한 것을 확인하였다(도 5).
본 발명에 있어서, 시료 내 핵산 검출은 다음과 같은 기준으로 판단하는 것일 수 있다.
일예로, (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도가 감소하는 경우, 시료 내 검출 대상 핵산이 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
다른 일예로, (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도가 유지되거나 증가하는 경우, 시료 내 검출 대상 핵산이 존재하지 않는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 시료 내 핵산 정량은 다음과 같은 기준으로 판단하는 것일 수 있다.
일예로, (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 30 mg/dL 이상, 구체적으로 약 43 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 1 uM 이상, 구체적으로 약 2 uM 이상의 농도로 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 30 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 1 uM 이상, 2 uM 이상, 3 uM 이상, 4 uM 이상, 5 uM 이상, 6 uM 이상, 7 uM 이상, 8 uM 이상, 9 uM 이상 또는 10 uM 이상의 농도로 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
다른 일예로, (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 2 mg/dL 미만, 구체적으로 약 1 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 150 nM 미만, 구체적으로 약 125 nM 미만의 농도로 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 2 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 150 nM 미만, 140 nM 미만, 130 nM 미만, 125 nM 미만, 120 nM 미만, 115 nM 미만, 110 nM 미만, 105 nM 미만 또는 100 nM 미만의 농도로 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 표적 유전자(25nM)를 이용하여 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP를 PGM의 글루코스 신호로 측정할 수 있는지를 확인한 결과, PGM을 통해 측정된 글루코스 농도의 감소 수준이 43 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 2 uM 이상의 농도로 존재하고, 글루코스 농도의 감소 수준이 1 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 125 nM 미만의 농도로 존재하는 것을 확인하였다(도 8). 이를 통해, 표적 핵산이 존재할 때 Cas13가 활성화 되고, 일련의 과정(CER)을 거쳐 글루코스 농도가 감소하면 PGM으로 신호의 변화를 확인할 수 있음을 알 수 있다.
기존의 자가 현장 진단(Point of care tseting; POCT) 기기들은 대부분 사용 조건이 까다롭거나 구동 방식이 어려우며, 전문 지식을 필요로 하고, 현장 진단할 수 있는 물질들의 수가 한정적이어서 일반인을 대상으로 하는 현장에 실질적으로 적용하기 어려운 문제점이 있었다.
예컨대, CRISPR-Cas 단백질을 이용한 자가 현장 진단 기기의 경우, 표적 핵산 존재시 형광 또는 LFA 방법을 이용하여 확인하였으나, 형광 방법의 경우 형광을 확인할 수 있는 장비가 추가적으로 필요하며, LFA(Lateral Flow Immunoassay) 방법은 1회용으로 지속적인 사용이 불가능한 단점이 있었다.
이에, 본 발명은 기존 형광 검출 방법처럼 다른 장비가 필요하지 않으면서 전문 지식이 없는 일반인도 손쉬운 조작으로 빠른 시간 내 진단 결과를 도출할 수 있어, 종래 진단 기기 사용의 어려움을 개선한 것에 의의가 있다.
본 발명은 시료 처리 후 5초 안에 결과를 정량적으로 확인할 수 있으며, 검출 대상 핵산의 종류에 따라 CRISPR의 가이드 RNA만 교체하면 많은 종류의 핵산을 검출할 수 있어 범용적인 사용이 가능하다. 또한, CER을 이용한 반응 증폭을 통해 시료 내 존재하는 검출 대상 핵산의 양이 극히 적더라도 정확한 검출이 가능한 장점이 있다.
본 발명은 일 구현예에서 SARS-CoV-2 유전자 서열 일부를 표적 RNA로 하여 PGM 신호를 통해 표적 RNA 유무를 검출한 바 있다(실시예 4-5).
본 발명의 다른 하나의 양태는 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질을 포함하는 제1 용기; 미오카이네이즈를 포함하는 제2 용기; 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 ATP 검출용 조성물을 포함하는 제3 용기; 및 혈당측정기를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 상기 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질을 함유하는 제1 용기, 미오카이네이즈를 함유하는 제2 용기, 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 ATP 검출용 조성물을 함유하는 제3 용기 및 혈당측정기를 포함하여 시료 내 핵산의 검출 및 정량에 사용될 수 있는 도구를 의미한다. 상기 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 i) 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질 또는 ii) 미오카이네이즈 또는 iii) 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈가 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있으며, 상기 i) 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질 또는 ii) 미오카이네이즈 또는 iii) 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈는 각각 1회 투여 용량의 단위 용량 형태로 포장되어 있을 수 있다.
상기 키트 내의 상기 i) 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질 또는 ii) 미오카이네이즈 또는 iii) 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈는 당업자의 실험 계획에 따라 적절한 시기에 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 i) 가이드 RNA, 표적 RNA 및 Cas13 단백질 또는 ii) 미오카이네이즈 또는 iii) 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈 각각의 첨가량, 첨가 방법과 첨가 빈도 등을 기재한 사용설명서 및/또는 혈당측정기의 사용 방법을 기재한 사용설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 시료에 검출하고자 하는 표적(예를 들면, SARS, COVID 19, 암 유발 인자 등)의 핵산 염기서열이 존재하는 경우 해당 핵산 염기서열을 분해하여 혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 통해 신속하게 검출할 수 있고, 핵산 염기서열을 사용자의 목적에 따라 바꿈으로써 진단 대상 질환을 변경할 수 있어 다양한 질환의 진단에 범용적으로 사용 가능하다.
도 1은 본 발명의 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량 방법의 모식도이다.
도 2는 Cas 13 반응에서 사용된 형광표지 프로브의 구조를 나타낸 도이다. 상기 프로브는 단일가닥 RNA(ssRNA)로, Cas13a가 gRNA 및 표적 RNA가 존재함에 따라 활성화 되었을 때 주변의 표적 RNA(ssRNA)가 잘리는 활성을 평가하기 위한 형광표지 프로브이다. 프로브에서 rA는 RNA 아데닌, A는 DNA 아데닌이며, 5' 말단에 quencher가 고정되었고, 두번째 A에 형광물질로서 Cy5가 고정되었다.
도 3은 Cas 13 반응에서 표적 RNA 존재 유무에 따른 형광값을 나타낸 도이다.
도 4는 ATP 또는 AMP 존재 하에 미오카이네이즈 첨가 여부에 따른 ATP 신호를 나타낸 도이다. 1; ATP가 존재하는 경우 신호가 발생함. 2; AMP의 경우에는 신호가 발생하지 않음. 3; AMP에 미오카이네이즈가 첨가되면 AMP가 ATP로 전환되어 신호가 발생함.
도 5는 AMP 농도에 따른 글루코스 농도 변화를 PGM으로 측정한 결과이다.
도 6은 Cas 13 반응 및 CER(Cascade enzyme reactions) 반응을 이용한 표적 핵산 검출을 나타낸 모식도이다.
도 7은 Cas 13에 의한 절단 반응 및 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(T4 polynucleotide kinase, PNK) 반응 간접 검증 결과이다.
도 8은 표적 유전자(25nM) 유무에 따른 글루코스 신호 값을 PGM으로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. Cas 13 반응 검증
시료 내 핵산의 검출 또는 정량을 도 1에 도시된 바에 따라 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용하여 수행하였다.
도 1의 Cas 13 단백질에 의해서 하나의 염기가 절단되는지를 확인하기 위해, Cut smart buffer 3 μL, 0.5 uM Cas13a 3 μL, 0.5 uM gRNA(가이드 RNA) (서열번호 1) 1.5 μL 및 증류수(Nuclase free D.W.) 19.5 μL를 항온장치에 25℃에 30분 동안 두어 Cas13a 단백질 및 gRNA가 표적 RNA를 만나기 전 먼저 결합하도록 하였다. 이에 0.5 uM 표적 RNA 또는 증류수 1.5 μL 및 100 uM 형광표지(Cy5) 프로브(도 2) 1.5 μL를 넣어 총 부피가 30 μl이 되도록 한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 95℃에서 10분간 반응시켜 효소의 활성을 불활성화시켰다. 이때 먼저 결합한 Cas13a 단백질 및 gRNA와 표적 RNA가 결합하고, 활성화된 Cas13a가 표적 RNA와 형광표지된 프로브를 절단하면서 프로브로부터 형광이 발현되는 것을 관찰하였다.
그 결과, 표적 RNA 존재 유무에 따라 형광값에 차이가 있음을 확인하였으며(도 3), 표적 RNA가 존재하는 경우 형광 신호가 증폭되었는데 이는 Cas 반응으로 예상 절단 부위(도 2)로부터 AMP와 구조가 유사한 핵산인 Adenosine 2', 3'-cyclic Phosphate가 절단되어 rA 염기 1개가 떨어져 나와 형광이 발현되었기 때문임을 알 수 있다.
실시예 2. 미오카이네이즈(Myokinase) 반응 검증
도 1의 미오카이네이즈에 의해서 ATP가 생성되는지를 확인하기 위해, 하기 표 1에 나타낸 시료들을 혼합하여 항온장치에서 30℃로 16시간 동안 반응시키고 95℃에서 10분간 반응시켜 효소의 활성을 불활성화시켰다. 생성된 ATP를 검증하기 위해 ATP 어세이 키트를 사용하여 반응이 끝난 시료에서 발광 정도를 측정하였다. 발광 측정을 위해 사용한 플레이트는 화이트 웰이며 40 μL의 시료, 60 μL 1X reaction buffer 및 100 μL ATP assay mixture를 넣고 560 nm에서 발광 정도를 측정하였다. 하기 표 1에서, 삼인산 오염기(triphosphate pentabasic) 및 포스포에놀피루빅산(phosphoenolpyruvic acid, PEP)는 ADP와 ATP 순환에 연료같은 존재로 cycle이 돌아가도 신호 감소 폭을 높게 유지해 주는 역할을 하였다.
그 결과로, ATP가 존재하는 경우 ATP 신호가 측정되었으며, AMP가 존재하는 경우 ATP 신호가 측정되지 않았으나, AMP 존재 하에 미오카이네이즈가 첨가되면 ATP 신호가 발생하여 미오카이네이즈 반응을 통해 AMP가 ATP로 전환된 것을 확인하였다(도 4).
reaction Ⅰ volume
10X reaction buffer 5 μL
100 mM phosphoenolpyruvic acid (PEP) 1 μL
1 uM AMP (or ATP) 5 μL
10 uM triphosphate pentabasic 5 μL
D.W. 24 μL
1 kU/mL myokinase 5 μL
1 kU/mL pyruvate kinase 5 μL
total reaction volume 50 μL
실시예 3. 미오카이네이즈 및 CER(Cascade enzyme reactions) 반응 검증
도 1의 미오카이네이즈 및 헥소카이네이즈(hexokinase)와 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)에 의한 CER에 의해 AMP가 ATP로 전환되어 글루코스 농도 변화를 유도하는지를 확인하기 위해, 하기 표 2 및 표 3에 나타낸 시료들을 각각 혼합하였다. 표 2의 시료 혼합물에 AMP를 0.5, 1, 1.5, 2 uM로 첨가하고 30℃에서 30분 동안 반응시킨 후, PGM으로 남은 글루코스 양을 측정하였다.
그 결과, AMP 농도에 따라 글루코스 측정값이 선형적으로 감소하여, 미오카이네이즈와 CER에 의해 글루코스 농도가 변화한 것을 확인하였다(도 5).
실시예 4. Cas 13에 의한 절단 반응 및 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(T4 polynucleotide kinase, PNK) 반응 검증
표적 핵산 유무에 따른 Cas 13 활성 및 PNK 유무에 따른 PNK 활성을 확인하여 Cas 13에 의한 절단 반응과 PNK 작용에 의해 AMP가 생성되는지를 검증하고자 하였다.
먼저, PNK 유무에 따른 PNK 활성을 확인하기 위해 Cut smart buffer 2 μL, 0.5 uM Cas13a 2 μL, 0.5 uM gRNA(서열번호 1) 1 μL 및 Nuclase free D.W 1 μL를 혼합하여 25℃에서 30분 동안 배양하여 반응시켰다. 상기 반응물에 하기 표 2에 나타낸 시료들을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 반응물에 하기 표 3에 나타낸 시료들을 첨가하고 30℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜 미오카이네이즈 및 CER 반응을 유도한 후 PGM으로 글루코스 농도를 측정하였다.
0.5 uM SARS-CoV-2유전자 서열(target RNA) (서열번호 3) 1 μL
100uM AMP probe (rArUTCCCA) (서열번호 2) 8 μL
10kU/ml PNK or free D.W. 5 μL
total reaction volume 20 μl
Reaction Ⅱ Volume
Reaction Ⅰ 20 μL
1 kU/mL Myokinase Rabbit 5 μL
50 mM glucose 5 μL
10μM triphosphate pentabasic 5 μL
1 kU/mL pyruvate kinase 5 μL
1 kU/mL hexokinase 5 μL
Cut smart buffer 3 μL
100 mM PEP 1 μL
Nuclase free D.W 1 μL
total reaction volume 50 μl
표적 핵산 유무에 따른 Cas 13 활성을 확인하기 위해 Cut smart buffer 2 μL, 0.5 uM Cas13a 2 μL, 0.5 uM gRNA(서열번호 1) 1 μL 및 Nuclase free D.W 1 μL를 혼합하여 25℃에서 30분 동안 배양하여 반응시켰다. 상기 반응물에 하기 표 4에 나타낸 시료들을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시키고 상기와 동일한 방법으로 미오카이네이즈 및 CER 반응을 유도한 후 PGM으로 글루코스 농도를 측정하였다.
0.5 uM target RNA (서열번호 3) or free D.W. 1 μL
100uM AMP probe (rArUTCCCA) (서열번호 2) 8 μL
10kU/ml PNK 5 μL
total reaction volume 20 μl
상기 과정을 통해, 먼저 결합된 gRNA 및 Cas13a가 표적 RNA와 만나면 AMP 프로브(rArUTCCCA) (서열번호 2)에 의해 부수적으로 rA가 절단되어 cAMP(Adenosine-2',3'-cyclic monophosphat)가 생성되었다. cAMP는 PNK와 작용하여 미오카이네이즈 및 CER 반응의 시작물질인 AMP로 전환되었다(제1 단계). 전환된 AMP는 미오카이네이즈와 반응하여 ADP, ADP는 피루베이트카이네이즈와 반응하여 ATP, 헥소카이네이즈는 ATP와 글루코스를 소모하여 ADP 생성하며(제2 단계), 이 과정에서 글루코스 농도가 낮아져 PGM 신호를 통해 확인이 가능하였다(도 6).
그 결과로, PNK 활성 실험 결과에서는 표적 RNA가 존재하더라도, PNK가 존재해야만 글루코스 농도가 감소하였으며, 이를 통해 PNK의 cAMP에서 AMP로의 전환을 간접적으로 확인하였다(도 7).
PNK 활성 실험 결과에서는 표적 RNA가 존재할 때 글루코스 농도가 감소하였으며(도 7), 구체적으로 표적 RNA 존재시 Cas13가 활성화되어 부수적 절단으로 cAMP를 생성하고, cAMP는 PNK와 작용하여 AMP로 전환되었다. AMP는 CER을 통해 ATP와 ADP의 형태로 순환되고, 이 과정에서 글루코스가 소모되면서 글루코스 농도가 낮아져 이를 PGM 신호로 확인할 수 있다.
실시예 5. 한 단계 반응(One-pot reaction) 검증
상기 실시예 4에서 검증한, Cas 13에 의한 절단 반응과 PNK 작용에 의해 AMP가 생성되는 제1 단계 및 제2 단계의 CER 반응을 한 단계 반응(One-pot reaction)으로 수행하여 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP를 PGM의 글루코스 신호로 측정할 수 있는지를 확인하였다.
구체적으로, Cut smart buffer 2 μL, 0.5 uM Cas13a 2 μL 및 0.5 uM gRNA(서열번호 1) 1 μL을 혼합하여 25℃에서 30분 동안 배양하여 반응시켰다. 상기 반응물에 하기 표 5에 나타낸 시료들을 첨가하고 37℃에서 0~2시간 동안 반응시켜 미오카이네이즈 및 CER 반응을 유도하였다.
그 결과, 표적 유전자(25nM) 유무에 따라 글루코스 신호 값에 차이가 발생하며, 구체적으로 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 43 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 2 uM 이상의 농도로 존재하고, 글루코스 농도의 감소 수준이 1 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 125 nM 미만의 농도로 존재하는 것을 확인하였다(도 8).
이를 통해, 표적 핵산이 존재할 때 Cas13가 활성화 되고, CER을 거쳐 글루코스 농도가 감소하면 PGM으로 신호의 변화를 확인할 수 있음을 확인하였다.
0.5 uM target RNA (서열번호 3) or DEPC D.W. 1 μL
100uM AMP probe (rArUTCCCA) (서열번호 2) 9 μL
10kU/ml T4 polynucleotide kinase (PNK) 5 μL
1 kU/mL Myokinase Rabbit 5 μL
50 mM glucose 5 μL
10μM triphosphate pentabasic 5 μL
1 kU/mL pyruvate kinase 5 μL
1 kU/mL hexokinase 5 μL
Cut smart buffer 3 μL
100 mM PEP 1 μL
DEPC D.W 1 μL
total reaction volume 50 μl
본 발명의 방법에 따라 PGM을 이용하여 시료 내 검출 표적의 핵산 염기서열이 존재하는 경우 해당 핵산 염기서열을 분해하여 검출할 수 있음을 알 수 있다. 상기 방법은 검출 속도가 5초 이하로 신속하고, 핵산 염기서열을 사용자의 목적에 따라 바꿈으로써 진단 대상 질환을 변경할 수 있어 다양한 질환의 진단에 범용적으로 사용 가능함을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> Gene detection method using personal glucose meter <130> KPA211136-KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 128 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 1 rgrarururu rargrarcru rarcrcrcrc rarararara rcrgrararg rgrgrgrarc 60 rurararara rcrgrcrarg rcrarcrcra rgrcrurgru rcrcrararc rcrurgrara 120 rgrararg 128 <210> 2 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMP probe <400> 2 rarutccca 9 <210> 3 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 gene sequence <400> 3 rcrururcru rurcrargrg rururgrgra rcrargrcru rgrgrurgrc rurgrc 56

Claims (8)

  1. (a) 시료 내 검출 대상 핵산에 포함된 표적 RNA 및 가이드 RNA의 존재하에서 Cas13 단백질에 의해 AMP 프로브를 절단하여 AMP를 생산하는 단계;
    (b) (a) 단계의 AMP를 미오카이네이즈(Myokinase)를 이용하여 인산화시켜 ADP를 생산하는 단계;
    (c) (b) 단계의 ADP를 글루코스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 ATP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코스를 글루코스-6-인산으로 전환하는 단계; 및
    (d) (c) 단계의 ATP 검출용 조성물의 글루코스 농도를 혈당측정기로 측정하여 ATP를 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 검출 대상 핵산은 바이러스, 세균 및 종양유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도가 감소하는 경우, 시료 내 검출 대상 핵산이 존재하는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도가 유지되거나 증가하는 경우, 시료 내 검출 대상 핵산이 존재하지 않는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 30 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 1 uM 이상의 농도로 존재하는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (d) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 2 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 Cas13 반응에 의해 생성된 AMP가 150 nM 미만의 농도로 존재하는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  8. 가이드 RNA, 표적 RNA, AMP 프로브 및 Cas13 단백질을 포함하는 제1 용기; 미오카이네이즈를 포함하는 제2 용기; 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 ATP 검출용 조성물을 포함하는 제3 용기; 및 혈당측정기를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 시료 내 핵산의 검출 또는 정량용 키트.
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