KR20230071520A - 자가혈당측정기 기반 lamp 모니터링 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 등온핵산증폭(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 모니터링 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 PGM을 통해 핵산 증폭 반응에 사용되는 dNTP를 검출하여 LAMP 반응 결과를 정량할 수 있는바, LAMP 모니터링이 요구되는 다양한 연구에 활용할 수 있다.
본 발명의 방법은 PGM을 통해 핵산 증폭 반응에 사용되는 dNTP를 검출하여 LAMP 반응 결과를 정량할 수 있는바, LAMP 모니터링이 요구되는 다양한 연구에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 모니터링 방법에 관한 것이다.
특정 핵산의 유무를 확인하기 위한 기술인 PCR(Polymerase chain reaction)은 우수한 민감도를 갖고 있으며 형광물질로 표지된 프로브를 이용해 실시간 검출 및 정량도 가능하여 코로나 바이러스 감염증을 비롯한 다양한 질병을 진단하는 데 일반적으로 사용되는 기술이다.
종래 PCR은 증폭 반응을 위해 열 순환이 필요하여 특수한 장비가 필요한 단점이 있어, 이러한 단점을 개선하기 위해 일정 온도에서 핵산을 증폭할 수 있는 RPA(recombinase polymerase amplification), LAMP(Loop-mediated isothermal amplification), NASBA(Nucleic acid sequence based amplification) 및 RCA(Rolling circle amplification) 등의 등온핵산증폭 기술이 개발된 바 있다.
이와 관련하여, 등온핵산증폭 산물을 정량화하기 위해 SYBR green I과 같은 형광 염료를 이용해 실시간 또는 정량 검출을 할 수 있으나 형광 측정을 위한 고가의 장비가 필요하다.
한편, 자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)는 장비가 작아서 휴대가 간편하고, 가격이 저렴하며 사용법 또한 간단하여 일반 대중들에게도 널리 보급되어 사용되고 있다. 또한, PGM는 기기 사용 방식이 편리하면서도 결과 도출이 신속한 바, 최근에는 혈액 내 혈당 측정뿐만 아니라 다른 물질을 글루코스와 연관시켜 범용성 높은 현장 진단 방법에 응용되고 있으며(US 8,945,943), 다양한 물질의 검출에도 응용되고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 고비용의 장비 없이도 쉽고 빠르게 등온핵산증폭 산물을 정량하는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, PGM을 이용하여 핵산 증폭 반응에 사용되는 dNTP를 검출하여 LAMP 산물을 정량할 수 있는 LAMP 모니터링 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) dNTP를 포함하는 조성물을 이용하여 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)를 수행하는 단계; (b) (a) 단계의 LAMP 수행 후 조성물 내 dNTP를 글루코오스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 dNTP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 단계; 및 (c) (b) 단계의 dNTP 검출용 조성물의 글루코오스 농도를 혈당측정기로 측정하여, 시료 내의 dNTP를 검출 또는 정량하는 단계;를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 LAMP 모니터링 또는 LAMP 산물 정량 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 dNTP 검출용 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 혈당측정기를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 LAMP 모니터링 또는 LAMP 산물 정량용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) dNTP를 포함하는 조성물을 이용하여 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)를 수행하는 단계; (b) (a) 단계의 LAMP 수행 후 조성물 내 dNTP를 글루코오스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 dNTP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 단계; 및 (c) (b) 단계의 dNTP 검출용 조성물의 글루코오스 농도를 측정하여, 시료 내의 dNTP를 검출 또는 정량하는 단계;를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 LAMP 모니터링 또는 LAMP 산물 정량 방법을 제공한다.
본 발명에서 "(a), (b), (c), (d) …"와 같은 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간 등 임의의 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어, "LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)"는 4-6개의 프라이머를 이용해 약 65℃에서 등온 증폭하는 방법으로, 추가적인 효소나 단백질이 요구되지 않으며 산물의 길이가 계속해서 길어지는 특징이 있다.
본 발명의 방법에 있어서, (a) 단계는 dNTP를 포함하는 조성물을 이용하여 LAMP를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, LAMP 수행시 조성물 내 dNTP의 농도는 1.4 내지 2.2 mM일 수 있으며, 구체적으로 1.8 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 1.8 mM 농도의 dNTP를 이용하여 LAMP를 수행하였을 때 최종 글루코스 농도 차이가 가장 큰 것을 확인하였다(도 3).
본 발명의 방법에 있어서, (b) 단계는 (a) 단계의 LAMP 수행 후 조성물 내 dNTP를 글루코오스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 dNTP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 헥소카이네이즈와 피루베이트카이네이즈에 의한 CER(Cascade enzyme reactions)이 일어나는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "CER(Cascade enzyme reactions)"은 몇 가지의 효소가 생성물과 반응물을 공유하여 양성 피드백 작용이 일어나는 것을 의미하며, 시료 내 존재하는 검출 대상 핵산의 양이 극히 적더라도 상기 CER을 통해 양성 피드백 작용이 유도되어, 각 반응 단계를 거치면서 반응이 증폭됨으로써 핵산 검출이 용이할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 CER은 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈가 양성 피드백 작용을 일으키는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "헥소카이네이즈(hexokinase)"는 dNTP를 dNDP로 전환하는 효소를 의미한다.
본 발명에서 용어, "피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)"는 dNDP를 dNTP로 전환하고, 포스포에놀피루빅산(phosphoenolpyruvic acid, PEP)을 피루베이트(pyruvate)로 전환하는 효소를 의미한다.
구체적으로, 상기 헥소카이네이즈에 의해서 dNTP는 dNDP로 전환되고 글루코오스가 글루코오스-6-인산으로 전환되며, 상기 반응과 동시에 피루베이트 카이네이즈에 의해서 헥소카이네이즈 효소 반응으로 생성된 dNDP는 다시 dNTP로 전환되고, 포스포에놀피루빅산이 피루베이트로 전환되어, 양성 피드백 작용이 일어남으로써 CER이 유도되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈의 농도는 1.0x 내지 6.0x일 수 있고, 구체적으로 3.0x일 수 있다.
본 발명에 있어서, CER 시간은 10 내지 30분일 수 있고, 구체적으로 20분일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 효소 농도는 3.0x(각각 15 unit)일 때 글루코스 농도 차이의 변화가 발생하지 않았으며, CER 시간은 20분에서 가장 큰 차이가 발생함을 확인하여, 최적 효소 농도는 3x, 최적 CER 시간은 20분임을 확인하였다(도 4).
본 발명의 방법에 있어서, (c) 단계는 (b) 단계의 dNTP 검출용 조성물의 글루코오스 농도를 혈당측정기로 측정하여, 시료 내의 dNTP를 검출 또는 정량하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)"란, 혈액 속의 포도당이 당산화효소에 의해 산화되어 생기는 과산화수소가 산소로 바뀌면서 발생하는 전자를 전극을 사용하여 전류로 전환하고 정량화시켜 혈액 속의 혈당농도를 분석하는 기기를 의미한다. 혈당측정기의 평가는 검사실에서 사용하는 장비와 다른 표준화 방법으로 정확도 및 정밀도를 평가할 필요성이 대두되어 국제표준화 기구(International Organization for Standardization; ISO)에서 혈당측정기의 정확성을 ISO15197로 명기하고 있다. 상기 혈당측정기는 자가혈당측정기와 혼용될 수 있다.
본 발명에 있어서, LAMP 모니터링은 다음과 같은 기준으로 판단하는 것일 수 있다.
일예로, (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코오스 농도가 감소하는 경우 LAMP가 수행되지 않은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
다른 일예로, (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코오스 농도가 유지되는 경우 LAMP가 수행된 것으로 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, LAMP 산물 정량은 다음과 같은 기준으로 판단하는 것일 수 있다.
일예로, (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 5 mg/dL 이상, 구체적으로 약 10 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 유전자가 500 copy 이상, 구체적으로 약 1000 copy 이상인 것으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 글루코스 농도의 감소 수준이 5 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 유전자가 500 copy 이상, 600 copy 이상, 700 copy 이상, 800 copy 이상, 900 copy 이상, 1000 copy 이상, 1100 copy 이상, 1200 copy 이상, 1400 copy 이상, 1600 copy 이상, 1800 copy 이상 또는 2000 copy 이상인 것으로 판단하는 것일 수 있다.
다른 일예로, (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 2 mg/dL 미만, 구체적으로 약 1 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 유전자가 50 copy 이하, 구체적으로 약 10 copy 이하인 것으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 글루코스 농도의 감소 수준이 2 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 유전자가 50 copy 이하, 40 copy 이하, 30 copy 이하, 20 copy 이하, 15 copy 이하, 10 copy 이하, 9 copy 이하, 8 copy 이하, 7 copy 이하, 6 copy 이하 또는 5 copy 이하인 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 PGM을 이용하여 LAMP 반응 결과를 정량한 결과, 도 5에 도시한 바와 같이 LAMP 수행에 따른 DNA 카피수를 PGM의 글루코스 농도로 정량하여 측정할 수 있으며, 구체적으로 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 10 mg/dL 이상인 경우 시료 내 유전자가 1000 copy 이상이고, 글루코스 농도의 감소 수준이 1 mg/dL 미만인 경우 시료 내 유전자가 10 copy 미만임을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 오이 actin RNA 농도에 비례하여 글루코스 농도가 확인되었으며(도 2b), 대조군으로 상용키트인 colorimetric LAMP kit를 이용하여 동일한 조건으로 실험해본 결과 색도 차이로 정량하는 colorimetric LAMP kit(도 2a)보다 본 실시예의 방법에 따라 글루코스 수치로 정량시 정확도가 높음을 알 수 있다.
LAMP는 metal indicator 또는 pH indicator를 이용한 colorimetric assay를 통해 특별한 장비 없이 검출 유무를 바로 확인할 수 있으나 정량은 불가능하며, SYBR green I과 같은 형광 염료를 이용해 실시간 또는 정량 검출을 할 수 있으나 형광 측정을 위한 고가의 장비가 필요하다.
이에, 본 발명은 기존 실시간 또는 정량 검출 방법처럼 다른 장비가 필요하지 않으면서 전문 지식이 없는 일반인도 손쉬운 조작으로 빠른 시간 내 정량 검출 결과를 도출할 수 있어, 종래 진단 기기 사용의 어려움을 개선한 것에 의의가 있다.
본 발명은 시료 처리 후 빠른 시간 내 결과를 정량적으로 확인할 수 있으며, CER을 이용한 반응 증폭을 통해 시료 내 존재하는 검출 대상인 dNDP의 양이 극히 적더라도 정확한 검출이 가능한 장점이 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 dNTP 검출용 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 혈당측정기를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 LAMP 모니터링 또는 LAMP 산물 정량용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 상기 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 dNTP 검출용 조성물을 함유하는 제1 용기 및 혈당측정기를 포함하여 시료 내 핵산의 검출 및 정량에 사용될 수 있는 도구를 의미한다. 상기 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈가 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있으며, 상기 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈는 각각 1회 투여 용량의 단위 용량 형태로 포장되어 있을 수 있다.
상기 키트 내의 상기 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈는 당업자의 실험 계획에 따라 적절한 시기에 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈 각각의 첨가량, 첨가 방법과 첨가 빈도 등을 기재한 사용설명서 및/또는 혈당측정기의 사용 방법을 기재한 사용설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 통해 핵산 증폭 반응에 사용되는 dNTP를 검출하여 등온핵산증폭(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 반응 결과를 정량할 수 있는바, LAMP 모니터링이 요구되는 다양한 연구에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 모니터링 방법의 모식도이다.
도 2는 상용키트를 이용한 표적 RNA 농도 및 LAMP 반응 시간에 따른 모니터링 결과(a) 및 본 발명의 방법으로 측정한 표적 RNA 농도에 따른 글루코스 농도(b)이다.
도 3은 dNTP 농도 최적화 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 CER(Cascade enzyme reactions)과 효소 시간 및 효소 농도 최적화 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 LAMP 수행에 따른 DNA 카피수를 PGM의 글루코스 농도 차이로 정량하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 상용키트를 이용한 표적 RNA 농도 및 LAMP 반응 시간에 따른 모니터링 결과(a) 및 본 발명의 방법으로 측정한 표적 RNA 농도에 따른 글루코스 농도(b)이다.
도 3은 dNTP 농도 최적화 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 CER(Cascade enzyme reactions)과 효소 시간 및 효소 농도 최적화 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 LAMP 수행에 따른 DNA 카피수를 PGM의 글루코스 농도 차이로 정량하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 모니터링 검증
자가혈당측정기(Personal glucose meter; PGM)를 이용한 LAMP 모니터링을 도 1에 도시된 바에 따라 수행하였다.
구체적으로, 검출 대상을 오이 actin RNA(서열번호 1) (농도: 28, 2.8, 0.28, 0 ng/μL)로 하는 RT(reverse transcription)-LAMP 수행을 위해, 0.2 mL PCR 튜브에 하기 표 1과 같이 제조한 조성물을 넣고 부드럽게 교반한 뒤 spin down시키고, PCR 장비에서 65℃ 30분, 이어서 80℃ 10분 반응시켰다(25 μL, lid Off- mineral oil을 사용하여 증발 방지).
다음으로, CER(Cascade enzyme reactions) 수행을 위해, 새로운 0.2 mL PCR 튜브에 하기 표 1과 같이 제조한 조성물을 넣고 부드럽게 교반한 뒤 spin down시키고, 앞서 제조한 RT-LAMP 반응물 20 uL를 첨가한 후 부드럽게 교반한 뒤 spin down하였다. 이를 PCR 장비에서 30℃ 30분 반응시키고 이어서 95℃ 10 분 반응시켜 효소 활성을 제거하였다(50 μL, lid 105℃). PGM을 이용하여 최종 반응물의 글루코스 농도를 측정하였다.
그 결과, 오이 actin RNA 농도에 비례하여 글루코스 농도가 확인되었으며(도 2b), 대조군으로 상용키트인 colorimetric LAMP kit를 이용하여 동일한 조건으로 실험해본 결과 색도 차이로 정량하는 colorimetric LAMP kit(도 2a)보다 본 실시예의 방법에 따라 글루코스 수치로 정량시 정확도가 높음을 알 수 있다.
실시예 2. dNTP 농도 최적화
상기 실시예 1의 dNTP 농도에 따른 글루코스 수치 차이를 비교하였다.
구체적으로, 실시예 1과 동일한 방법으로 실험하되, RT-LAMP 수행시 조성물을 하기 표 3의 조성물로 대체하고, 80℃ 10분 반응시 lid 105℃ 조건으로 수행하였다. dNTP 농도에 따라 반응된 LAMP 산물을 이용하여 CER을 수행하고, PGM을 이용하여 최종 반응물의 글루코스 농도를 측정한 뒤 아래 식을 이용하여 글루코스 수치 차이를 산출하였다.
ΔGlucose level = (반응 전 glucose level) - (반응 후 glucose level)
그 결과, 1.8 mM 농도의 dNTP에서 가장 큰 글루코스 농도 차이를 확인하였다(도 3).
실시예 3. CER 시간 및 효소 농도 최적화
서로 다른 CER 시간과 효소 농도(헥소카이네이즈, 피루베이트카이네이즈, 1.0x = 각각 5 unit) 조건 하에서 검출 대상인 오이 actin RNA 유무에 따른 글루코스 농도 차이를 비교하였다.
구체적으로, 실시예 1과 동일한 방법으로 실험하되, RT-LAMP 수행시 조성물을 하기 표 3의 조성물로 대체하고, 80℃ 10분 반응시 lid 105℃ 조건으로 수행하였다.
또한, dNTP 농도에 따라 반응된 LAMP 산물을 이용하여 CER 수행시 조성물을 하기 표 4의 조성물로 대체하고, 30℃(10, 20, 30) 분, 이어서 95℃ 10분 조건으로 수행하였다(각 효소의 농도는 표 4를 기준으로 1X). PGM을 이용하여 최종 반응물의 글루코스 농도를 측정한 뒤 상기 실시예 2와 동일한 식을 이용하여 글루코스 수치 차이를 산출하였다.
그 결과, 효소 농도는 3.0x(각각 15 unit)일 때 글루코스 농도 차이의 변화가 발생하지 않았으며, CER 시간은 20분에서 가장 큰 차이가 발생함을 확인하여, 최적 효소 농도는 3x, 최적 CER 시간은 20 분임을 확인하였다(도 4).
또한, 상기 실시예의 방법에 따라 PGM을 이용하여 LAMP 반응 결과를 정량한 결과, 도 5에 도시한 바와 같이 LAMP 수행에 따른 DNA 카피수를 PGM의 글루코스 농도로 정량하여 측정할 수 있으며, 구체적으로 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 10 mg/dL 이상인 경우 시료 내 유전자가 1000 copy 이상이고, 글루코스 농도의 감소 수준이 1 mg/dL 미만인 경우 시료 내 유전자가 10 copy 미만임을 확인하였다.
상기 실시예의 결과에 따라, 본 발명의 방법에 따라 PGM을 이용하여 시료 내 dNTP 농도를 간접적으로 측정하여 LAMP 반응 결과를 정량할 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<223> Cucumis sativus actin RNA
<400> 1
atggcagatg gtgaagatat tcaacctctt gtctgtgata atggaactgg aatggtcaag 60
gctggatttg ctggtgacga tgctccaagg gctgtgtttc ctagtatcgt tggtagacca 120
cgtcatactg gtgtgatggt tggaatgggc cagaaggatg cctatgttgg tgatgaagct 180
cagtcaaaaa gaggtattct tacattgaaa tacccaattg aacatggaat tgttagcaac 240
tgggatgaca tggaaaagat ttggcatcac accttctaca atgagcttcg tgttgcacct 300
gaagagcatc cggtacttct tactgaagca ccacttaacc caaaggcaaa cagggagaag 360
atgactcaga tcatgtttga aacctttgat gtacctgcca tgtatgttgc aatccaggct 420
gttttatctc tctatgccag tggtcggaca acaggtattg tgttggattc tggtgatgga 480
gtgagtcaca cagtgcccat atacgagggg ttttcactcc ctcatgctat cctacgtctc 540
gaccttgctg gtcgtgattt gactgatgct ttgatgaaaa tccttaccga aagaggttac 600
atgttcacaa caacggcaga acgggaaatt gtccgtgatg tgaaggagaa acttgcatat 660
gtggcccttg attacgagca agaactggaa actgccagga ctagttcagc cattgagaaa 720
agctatgaac tacccgacgg gcaggtgatt acgatcggag ctgagagatt ccgttgccca 780
gaagtgttgt tccaaccgtc tctgattggg atggaatctt ctggaattca tgaaaccact 840
tacaactcca tcatgaagtg tgatgttgat atcaggaagg acttatatgg taacatcgtc 900
ctcagtggcg gtacaacaat gttcccaggc attgctgatc gtatgagcaa agaaatcaca 960
gctctcgctc ccagcagcat gaagatcaag gttgttgctc ctcccgaaag gaagtacagt 1020
gtttggattg gaggatccat cctagcatcc ctcagtacct tccaacagat gtggataacg 1080
aaggctgaat acgacgagtc gggtccagct atagttcaca ggaaatgctt ctaa 1134
Claims (9)
- (a) dNTP를 포함하는 조성물을 이용하여 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)를 수행하는 단계;
(b) (a) 단계의 LAMP 수행 후 조성물 내 dNTP를 글루코오스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트카이네이즈(pyruvate kinase)를 함유하는 dNTP 검출용 조성물에 첨가하여, 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 단계; 및
(c) (b) 단계의 dNTP 검출용 조성물의 글루코오스 농도를 측정하여, 시료 내의 dNTP를 검출 또는 정량하는 단계;를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 LAMP 모니터링 또는 LAMP 산물 정량 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 dNTP 농도는 1.4 내지 2.2 mM인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈의 농도는 1.0x 내지 6.0x인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 dNTP를 dNTP 검출용 조성물에 첨가하는 시간은 10 내지 30분인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 (c) 혈당측정 결과 글루코오스 농도가 감소하는 경우 LAMP가 수행되지 않은 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코오스 농도가 유지되는 경우 LAMP가 수행된 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 5 mg/dL 이상인 경우, 시료 내 유전자가 500 copy 이상인 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계의 혈당측정 결과 글루코스 농도의 감소 수준이 2 mg/dL 미만인 경우, 시료 내 유전자가 50 copy 이하인 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 글루코스, 헥소카이네이즈 및 피루베이트카이네이즈를 포함하는 dNTP 검출용 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 혈당측정기를 포함하는, 혈당측정기를 이용한 LAMP 모니터링 또는 LAMP 산물 정량용 키트.
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