ES2252046T3 - Procedimiento para la deteccion de la guanilatociclasa soluble. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion de la guanilatociclasa soluble.Info
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Abstract
Ensayo luminométrico para la detección de una guanilatociclasa soluble, que comprende las etapas de procedimiento a) Preparación de una guanilatociclasa soluble y GTP como sustrato, y conversión de GTP en GMPc y pirofosfato; b) Preparación de una nicotinamida-mononucleótido- adeniltransferasa y nicotinamida dinucleótido (NAD+), y reacción con el pirofosfato de a) para dar ATP; c) Preparación de luciferasa y luciferina, y determinación luminométrica del ATP formado en b) por reacción con luciferina y luciferasa.
Description
Procedimiento para la detección de la
guanilatociclasa soluble.
La invención se refiere a un procedimiento para
la detección de guanilatociclasas solubles.
Las guanilatociclasas solubles son proteínas
heterodímeras. Están compuestas por una subunidad \alpha y una
subunidad \beta y contienen heme como grupo prostético. La unión
de la molécula de señal NO a heme activa la enzima. El GMPc formado
por la actividad enzimática de las guanilatociclasas solubles
interviene, entre otras, en la activación de las proteinquinasas
dependientes de GMPc, en la regulación de las fosfodiesterasas, o
de canales de iones. Para las subunidades se han descrito cuatro
isoformas. Éstas se diferencian entre sí en cuanto a su secuencia
así como a la expresión específica para tejidos y específica para
el desarrollo. Los subtipos \alpha_{1} y \beta_{1} se
encuentran, de manera predominante, en pulmones, riñones y cerebro.
La cadena \beta_{2} se expresa, predominantemente, en el hígado
y riñones, y \alpha_{2}, en la placenta. Para una
guanilatociclasa soluble catalíticamente activa es condición
indispensable que se produzca una dimerización de las subunidades.
Se conocen los heterodímeros \alpha_{1}/\beta_{1},
\alpha_{2}/\beta_{1} y \alpha_{1}/\beta_{2}. En
todas las subunidades se observa una fuerte homología en la región
de los dominios catalíticos.
La guanilatociclasa soluble (sGC) contiene un
heme por heterodímero. La unión del heme tiene lugar a través de
His-105 de la cadena \beta_{1}. Los mutantes que
no contienen en el extremo terminal N de la subunidad \beta_{1}
His-105, no son susceptibles de estimulación por
NO. El heme de las guanilatociclasas solubles está compuesto por
una parte de molécula orgánica y un átomo de hierro. La parte
orgánica, la protoporfirina IX, contiene cuatro anillos pirrol,
acoplados entre sí mediante puentes de metina en un sistema
tetrapirrol. El átomo de hierro en heme está unido a cuatro átomos
de nitrógeno en el centro del anillo de protoporfirina.
Adicionalmente, puede mostrar otras dos uniones. El hierro heme
puede estar presente en la fase de oxidación +2 (forma ferrosa) o
+3 (forma férrica; forma oxidada). La fase de oxidación del hierro
heme ejerce una influencia decisiva sobre la función enzimática de
la guanilatociclasa soluble. La enzima con el hierro heme en forma
trivalente muestra, al igual que la guanilatociclasa soluble sin
grupo heme, sólo una actividad enzimática basal y no es susceptible
de estimulación por NO. La preparación de una guanilatociclasa
soluble libre de heme se describe en Eur. J. Biochem. 240,
380-386 (1996).
La guanilatociclasa soluble (sGC) cataliza la
transformación de GTP en guanosin-monofosfato
cíclico (GMPc) y pirofosfato. GMPc actúa como mensajero
intracelular ("second messenger" = segundo mensajero). Los
segundos mensajeros están presentes en el interior celular en
reacciones en cascada. Su nivel está controlado por señales
extracelulares (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores, factores
de crecimiento, sustancias aromáticas, péptidos, luz). La
formación de segundos mensajeros sirve para la potenciación de
señales. El segundo mensajero transmite en la célula señales a
distintas proteínas celulares, dependientes del tipo de célula
(quinasas, fosfatasas, canales de iones y otras). La modulación de
la guanilatociclasa soluble conduce, por lo tanto, a través de su
influencia sobre el nivel de GMPc y sobre las proteínas diana
controladas por éste, a una serie de efectos farmacológicos.
Ejemplos de mecanismos sobre los que influye de esta forma son la
relajación de la musculatura lisa (por ejemplo, en las paredes de
los vasos sanguíneos), la inhibición de la activación de
trombocitos, la inhibición de la proliferación de células musculares
lisas, o la adhesión de leucocitos.
La guanilatociclasa soluble se detecta en órganos
tales como, por ejemplo, corazón, pulmones, hígado, riñones,
cerebro, de todos los mamíferos, incluido el ser humano. En procesos
de tipo patológico o relevantes para la enfermedad, la fase de
oxidación del hierro heme de la guanilatociclasa soluble puede
desempeñar una función esencial. Una fracción más elevada de
guanilatociclasa soluble con hierro heme oxidado tendría como
consecuencia una capacidad de activación menor de la
guanilatociclasa soluble por el NO endógeno. Esto podría conducir,
entre otros, a través de un incremento de la tensión arterial,
activación plaquetaria, aumento de la proliferación celular o
incremento de la adhesión celular, a una hipertensión prolongada,
angina de pecho estable o inestable, trombosis, infarto de
miocardio, ataques cerebrales, edemas pulmonares, disfunción
eréctil, crecimiento incontrolado de tejidos con formación de
tumores, diabetes, trastornos de la función renal, trastornos de la
función hepática, o disfunción vascular.
Las células endoteliales de las paredes
vasculares segregan NO como hormona paracrina, entre otros, para la
activación de la guanilatociclasa soluble. Para la estimulación de
la guanilatociclasa soluble se utilizan, con frecuencia,
compuestos que actúan como donadores de NO a través de una
liberación intermedia de NO. Ejemplos de éstos son los nitratos
orgánicos. Adicionalmente, se describen diversos compuestos que no
actúan mediante la liberación de NO, que modifican la actividad de
la guanilatociclasa.
La activación de la guanilatociclasa soluble por
medio de donadores de NO o NO libre tiene lugar exclusivamente en
el estado reducido, es decir, que contiene (Fe^{2+}) del hierro
heme. Esto se deduce de ensayos llevados a cabo por A. Schrammel
et al., en Mol. Pharmacol. 50, 1 (1996), con
1H-[1,2,4]-oxadiazolo-[4,3-a]-quinoxalin-1-ona
(= ODQ). ODQ es un inhibidor específico y altamente activo de la
guanilatociclasa soluble. ODQ interactúa con el grupo heme
prostético. La sustancia provoca in vitro una oxidación
irreversible del hierro heme de la guanilatociclasa soluble. El
tratamiento de la guanilatociclasa soluble con ODQ tiene como
consecuencia la supresión de la acción estimulante de NO sobre la
enzima. La oxidación del hierro heme de la guanilatociclasa soluble
se puede producir también con
oxadiazolo(3,4-a)-benz(b)(1,4)oxacin-1-ona
(Olesen et al., British Journal of Pharmacology 123,
299-309 (1998)) o ferricianuro potásico (Koesling
et al., en "Reviews of Physiology Biochemistry and
Pharmacology", págs. 41-65, Editorial
Springer, 1999). Existen también activadores de la guanilatociclasa
soluble que no actúan a través de una liberación de NO. Éstos han
sido descritos, por ejemplo, por Vesely et al. en Eur. J.
Clin. Invest. 15, 258 (1985). Ignaro et al., en Adv.
Pharmacol. 26, 35 (1994) han demostrado una estimulación de la
guanilatociclasa soluble exenta de heme mediante protoporfirina IX.
El efecto de la protoporfirina IX no se inhibe con ODQ, sino que
resulta potenciada por dicho compuesto (Koesling y Friebe en
Physiol. Biochem. Pharmacol. 135, 41 (1999)). Los
activadores de la guanilatociclasa soluble conocidos hasta la fecha
estimulan solamente la actividad enzimática de ésta cuando el
hierro heme se encuentra presente en estado reducido, es decir, que
contiene (Fe^{2+}).
Recientemente, con las
N-arilamidas de ácido
sulfonilamino-carboxílico sustituidas con azufre,
se ha descrito una nueva clase adicional de compuestos (documento
WO 00/02851) cuyos representantes pueden activar la
guanilatociclasa soluble.
Hasta ahora, la detección de la actividad de la
guanilatociclasa soluble se ha llevado a cabo, por ejemplo,
mediante métodos enzimáticos para la detección de GMPc (por ejemplo,
en el documento US 5 618 665 A), así como de AMPc, o por
procedimientos fotométricos para la detección del grupo heme.
Para la comprobación de la dependencia de un
estado patológicamente alterado del estado de la guanilatociclasa
soluble no es suficiente demostrar únicamente la proteína por medio
de procedimientos de detección inmunológicos o del uso de técnicas
de marcado. También es importante conocer el estado redox del
hierro complejado del grupo heme. La información sobre la
funcionalidad de heme de la guanilatociclasa soluble se puede
comprobar, hasta ahora, por ejemplo, por la determinación del
estado redox del hierro heme complejado mediante mediciones de ESR
o por fotometría. Estas determinaciones tienen el inconveniente de
que dependen de la disponibilidad de un utillaje técnico en parte
complejo. Los métodos, adicionalmente, sólo son limitadamente
adecuados para mediciones específicas, porque se ven fácilmente
afectados por impurezas de otras proteínas que contienen heme.
Una misión de la presente invención consistió,
por consiguiente, en poner a disposición un procedimiento
simplificado y específico para la detección de la guanilatociclasa
soluble.
La presente invención se refiere a un ensayo
luminométrico para la detección de una guanilatociclasa soluble,
que comprende las etapas de procedimiento
- a)
- preparación de una guanilatociclasa soluble y GTP como sustrato, y conversión de GTP en GMPc y pirofosfato;
- b)
- preparación de una nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa y nicotinamida dinucleótido (NAD^{+}), y reacción con el pirofosfato de a) en ATP:
- c)
- Preparación de luciferasa y luciferina, y determinación luminométrica del ATP generado en b) por reacción de luciferina y luciferasa.
La guanilatociclasa soluble puede estar compuesta
por una mezcla de moléculas de guanilatociclasa soluble, en la que
no todas las moléculas de guanilatociclasa soluble están presentes
con un hierro heme en la fase de oxidación trivalente. En
particular, una parte de los grupos heme de las moléculas de
guanilatociclasa soluble puede encontrarse en fase de oxidación
trivalente, y otra parte, en fase de oxidación bivalente, de modo
que se obtiene una mezcla con distintas fracciones de los estados de
oxidación del hierro heme. El procedimiento para la detección de
una guanilatociclasa soluble, cuyo hierro heme está presente en
forma trivalente, se puede llevar a cabo, por ejemplo, por
comparación con valores de referencia. Entre otros, los valores de
referencia se pueden obtener, por ejemplo, de ensayos en los que ha
calculado la dependencia de la actividad de la guanilatociclasa
soluble de fracciones conocidas de guanilatociclasa soluble con
hierro heme trivalente. Una medida de la correspondiente fracción
de guanilatociclasa soluble con hierro heme trivalente se puede
obtener mediante el tratamiento previo de la guanilatociclasa
soluble con ODQ y subsiguiente determinación de la actividad de
esta guanilatociclasa soluble. Los valores de referencia calculados
se pueden utilizar, entonces, como curvas de calibración para las
determinaciones cuantitativas de guanilatociclasa soluble con hierro
heme en fase de oxidación trivalente.
La guanilatociclasa soluble se puede utilizar en
diferentes formas de estado, por ejemplo, en forma de diferentes
guanilatociclasas solubles heterodímeras. Básicamente, se puede
utilizar una guanilatociclasa soluble de cada especie, en
particular de cada especie de mamífero. Preferentemente, se utiliza
guanilatociclasa soluble de vacuno, aislada, preferentemente, de
tejido pulmonar. De forma especialmente preferida, se utiliza
guanilatociclasa soluble humana. La guanilatociclasa soluble
preparada puede estar compuesta, preferentemente, por una de las
subunidades \alpha, por ejemplo, la subunidad \alpha_{1} o
\alpha_{2}, y una subunidad \beta, por ejemplo, la subunidad
\beta_{1} o \beta_{2}. Para el procedimiento de la presente
invención, se pueden utilizar, preferentemente, subunidades de la
guanilatociclasa soluble. Las correspondientes informaciones sobre
secuencias se proporcionan en Giulli et al. (FEBS
Letters 304, 83-88 (1992)) para las dos
subunidades de la guanilatociclasa soluble aislada originalmente
de cerebro humano, o en Nakane et al. (Journal of
Biol.Chem. 265, 16481-16845 (1990)) para los
ADNc de la guanilatociclasa soluble de tejido pulmonar de rata, o en
Yuen et al. (Biochemistry 29,
10872-10878 (1990)) para una guanilatociclasa
soluble de riñón de rata.
La preparación de una guanilatociclasa soluble
puede llevarse a cabo por aislamiento, mediante métodos
bioquímicos, desde un material biológico. Especialmente en estos
casos, se presenta a menudo una mezcla de moléculas de
guanilatociclasa soluble con diferentes estados de oxidación del
hierro heme. Métodos bioquímicos pueden ser, entre otros: métodos
de exclusión para el material biológico, centrifugación,
separaciones cromatográficas, electroforesis sobre gel,
focalización isoeléctrica, métodos inmunológicos. El material
biológico puede contener células eucarióticas o células
procarióticas, residuos de las células, o preparaciones de residuos
celulares, células completas o partes o fracciones celulares.
Pertenecen a las células eucarióticas, por ejemplo, entre otras,
células de tejidos u órganos tales como corazón, vasos sanguíneos,
pulmones, sangre, cerebro, hígado, riñones, tejido adiposo, músculo
de animales vertebrados, incluido el ser humano, muestras de tejido
o sangre, así como también células de cultivos celulares humanos o
animales, así como cultivos de células de insectos. Como ejemplos
especiales cabe mencionar trombocitos, que se pueden obtener de
muestras de sangre humana o animal, así como células musculares
lisas que se pueden aislar, por ejemplo, de vasos sanguíneos de
origen animal o humano. Ejemplos adicionales son materiales de
biopsia, órganos y tejidos, y partes de éstos, sobrantes de
trasplantes, cordones umbilicales o placentas. Células procarióticas
pueden significar, por ejemplo, bacterias, entre otras,
Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis,
así como hongos tales como Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces pombe o Pichia pastoris. En una forma de
realización especial de la invención, la guanilatociclasa soluble
se puede preparar de forma recombinante, por ejemplo, por expresión
en células eucarióticas o procarióticas, en donde se incrementa la
concentración de guanilatociclasa soluble con o sin grupo heme
prostético, mediante vectores de expresión en el interior de las
células, o se segrega al medio exterior. En una forma de
realización especial, la guanilatociclasa soluble se aísla de
acuerdo con un procedimiento como el descrito en Humbert P. et
al., Methods of Enzymology 195, 384-391
(1991).
En una forma de realización, se pone a
disposición una guanilatociclasa soluble que ha sido tratada con un
agente de oxidación. En una forma de realización preferida, se pone
a disposición una guanilatociclasa soluble que ha sido tratada con
ODQ. La concentración de ODQ asciende, por ejemplo, a 0,001 mM
hasta 0,5 mM, preferentemente
0,005 mM hasta 0,1 mM y, de forma especialmente preferida, a 0,01 mM. Del mismo modo, se puede poner a disposición, preferentemente, una guanilatociclasa soluble que ha sido tratada con oxadiazolo(3,4-d)-benz(b)(1,4)-oxacin-1-ona o algún otro derivado de ODQ. En una forma de realización preferida adicional, se pone a disposición una guanilatociclasa soluble que ha sido tratada con ferricianuro potásico. El tratamiento de la guanilatociclasa soluble con oxidantes y/u ODQ y/u otros compuestos puede provocar una oxidación del hierro heme, es decir, una transferencia del hierro desde la fase de oxidación bivalente (Fe^{2+}) a la fase de oxidación trivalente (Fe^{3+}) en función de las condiciones seleccionadas, sólo parcialmente o, en formas de realización especiales, en todas las moléculas de guanilatociclasa soluble tratadas. En general, para la realización del procedimiento de la presente invención, se puede usar una forma de guanilatociclasa soluble en la que el hierro heme se encuentra presente en la fase de oxidación trivalente sólo en una parte de las moléculas de guanilatociclasa soluble o, en una forma de realización preferida, en todas las moléculas de guanilatociclasa soluble.
0,005 mM hasta 0,1 mM y, de forma especialmente preferida, a 0,01 mM. Del mismo modo, se puede poner a disposición, preferentemente, una guanilatociclasa soluble que ha sido tratada con oxadiazolo(3,4-d)-benz(b)(1,4)-oxacin-1-ona o algún otro derivado de ODQ. En una forma de realización preferida adicional, se pone a disposición una guanilatociclasa soluble que ha sido tratada con ferricianuro potásico. El tratamiento de la guanilatociclasa soluble con oxidantes y/u ODQ y/u otros compuestos puede provocar una oxidación del hierro heme, es decir, una transferencia del hierro desde la fase de oxidación bivalente (Fe^{2+}) a la fase de oxidación trivalente (Fe^{3+}) en función de las condiciones seleccionadas, sólo parcialmente o, en formas de realización especiales, en todas las moléculas de guanilatociclasa soluble tratadas. En general, para la realización del procedimiento de la presente invención, se puede usar una forma de guanilatociclasa soluble en la que el hierro heme se encuentra presente en la fase de oxidación trivalente sólo en una parte de las moléculas de guanilatociclasa soluble o, en una forma de realización preferida, en todas las moléculas de guanilatociclasa soluble.
La preparación de la guanilatociclasa soluble
comprende la elaboración de formas adecuadas para la incubación
con compuestos químicos preparados, en donde incubación significa
que la guanilatociclasa soluble y el compuesto químico se ponen en
contacto entre sí. La proteína se puede suspender o disolver, por
ejemplo, en disolventes acuosos suplementados con tampón, iones o
reactivos auxiliares. Asimismo, por ejemplo, se puede aplicar sobre
un material de soporte y, fijada de esta forma, utilizarla en
suspensión en disolventes.
Como compuestos químicos para estimular la
actividad de la guanilatociclasa soluble con hierro heme
trivalente, se pueden preparar compuestos químicos individuales o,
también, combinaciones de compuestos químicos. Los compuestos
químicos se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis o en forma de
sustancias naturales. Para la preparación se pueden utilizar,
básicamente, todos los compuestos químicos que estimulan la
actividad de una guanilatociclasa soluble cuando el hierro heme de
esta guanilatociclasa soluble se encuentra en forma
trivalente.
Para llevar a cabo el procedimiento para la
detección de guanilatociclasa soluble con un hierro heme en fase
de oxidación trivalente se puede utilizar, por ejemplo, el compuesto
químico
2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida.
Para llevar a cabo el procedimiento para la
detección de una guanilatociclasa soluble con hierro heme
trivalente se pueden utilizar compuestos químicos que estimulan
exclusivamente la guanilatociclasa soluble con hierro heme
trivalente. Igualmente, se pueden usar compuestos que, además de la
activación de la guanilatociclasa soluble con un hierro heme
trivalente, exhiben otros efectos sobre la guanilatociclasa
soluble. Por ejemplo, se pueden usar compuestos químicos que,
además de la activación de la guanilatociclasa soluble con hierro
heme trivalente, determinan también una activación de la actividad
basal de la guanilatociclasa soluble, o una activación de la
guanilatociclasa soluble con un hierro heme bivalente. Un
procedimiento para la detección de la guanilatociclasa soluble
mediante compuestos químicos que activan exclusivamente la forma de
enzima con hierro heme trivalente o, por ejemplo, también las
formas de enzima con hierro heme bivalente, tiene lugar con ayuda
de valores de referencia, curvas de calibración y/o en comparación
con sustancias capaces de activar exclusivamente una
guanilatociclasa soluble con hierro heme bivalente (por ejemplo,
donadores de NO). Para la creación de una curva de calibración se
puede incubar la guanilatociclasa soluble con diferentes
concentraciones de, por ejemplo, ODQ. En dependencia de la
concentración de ODQ aplicada en cada caso, se ajusta una
determinada relación de guanilatociclasa soluble con hierro heme
trivalente a guanilatociclasa soluble con hierro heme bivalente.
La concentración utilizada de ODQ se puede emplear directamente como
medida de la parte de enzima con hierro heme trivalente. La parte
absoluta de guanilatociclasa soluble con hierro heme trivalente se
puede comprobar, con fines de calibración, por medio de otros
procedimientos de medición, por ejemplo, por mediciones de ESR.
Las guanilatociclasas solubles pretratadas de manera diferente con
ODQ se activan en una etapa de activación a través de los
compuestos químicos. De esta manera, los compuestos que activan
exclusivamente una guanilatociclasa soluble con hierro heme
trivalente, proporcionan un valor que es directamente proporcional
a la cantidad de guanilatociclasa soluble con hierro heme
trivalente. Con el uso de compuestos químicos que activan, además
de la guanilatociclasa soluble con hierro heme trivalente, también
la forma con hierro heme bivalente, se requiere una curva de
calibración adicional con una sustancia que activa exclusivamente
una guanilatociclasa soluble en la forma bivalente. La parte de
guanilatociclasa soluble con hierro heme trivalente se obtiene,
entonces, mediante la comparación de las actividades que se logran
tras diferentes estimulaciones de una guanilatociclasa soluble
pretratada con ODQ. En este caso, se estimula la guanilatociclasa
soluble, por una parte, con un compuesto químico que activa
exclusivamente guanilatociclasas solubles con hierro heme
bivalente y, por otra parte, se estimula con un compuesto químico
que activa guanilatociclasas solubles tanto con hierro heme
trivalente como con hierro heme bivalente. La determinación de la
parte de guanilatociclasa soluble con hierro heme trivalente en una
muestra biológica a investigar se logra por comparación de la
actividad de la guanilatociclasa soluble de esta muestra tras la
incubación con un compuesto químico capaz de activar la
guanilatociclasa soluble de la forma anteriormente descrita, con los
valores de la curva de calibración.
La preparación de un compuesto químico puede
comprender también la disolución de este compuesto, en disolventes
adecuados tales como, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) o agua,
así como la elaboración de una formulación con reactivos
auxiliares.
La incubación puede tener diferentes duraciones y
llevarse a cabo a diferentes temperaturas. La duración y el ajuste
de temperaturas dependen de las formas de realización seleccionadas
en cada caso particular, así como de la elección de la
guanilatociclasa soluble preparada, el compuesto químico preparado,
y/u otras condiciones tales como la forma de preparación, la
concentración de la guanilatociclasa soluble utilizada y/o del
compuesto químico utilizado, así como de otras sustancias
adicionales. El tiempo de incubación puede ser de entre 1 minuto y
120 minutos, preferentemente el tiempo de incubación es de entre 1
minuto y 60 minutos y, de forma especialmente preferida, se
selecciona un tiempo de 30 minutos. La temperatura para la
incubación puede ser de entre 5ºC y 45ºC, preferentemente la
temperatura es de entre 20ºC y 42ºC y, en la forma de realización
especialmente preferida, es de 37ºC.
El ensayo comprende múltiples etapas de
procedimiento. Las etapas del procedimiento se pueden llevar a cabo
de manera secuencial o simultánea. El ensayo luminométrico se
compone de las siguientes etapas: a) preparación de una
guanilatociclasa soluble y GTP como sustrato, b) conversión del GTP
por medio de la guanilatociclasa soluble preparada, con lo que se
forman GMPc y pirofosfato, c) preparación de una
nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa
y nicotinamida dinucleótido (NAD^{+}), d) reacción del
pirofosfato formado en b) con la
nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa,
en presencia de nicotinamida dinucleótido (NAD^{+}), por medio de
la cual se forma ATP, e) preparación de una luciferasa y de su
sustrato luciferina, y f) determinación luminométrica del ATP
formado por reacción con luciferina bajo catálisis de luciferasa.
La cantidad de ATP formado es proporcional a la concentración de
guanilatociclasa soluble. El procedimiento se inicia con la adición
de guanilatociclasa soluble en una mezcla de reacción que contiene
GTP como sustrato, además de otras sustancias. Sustancias
adicionales pueden ser, por ejemplo, tampón, iones o proteínas. El
procedimiento para la detección de la guanilatociclasa soluble es
apropiado, en una forma de realización preferida, para llevar a cabo
un rastreo de la adecuación de los compuestos químicos estudiados
para estimular la actividad de la guanilatociclasa soluble. La
ventaja de este procedimiento luminométrico, con respecto a los
procedimientos de detección utilizados hasta ahora para la
guanilatociclasa soluble (procedimientos inmunológicos, enzimáticos,
fotométricos), consiste en la posibilidad de poder rastrear
grandes cantidades de compuestos químicos investigados, en períodos
de tiempo esencialmente menores, en cuanto a su capacidad potencial
para la estimulación de la actividad de una guanilatociclasa
soluble con hierro heme trivalente. Para la realización del rastreo
se agrega el compuesto químico investigado antes de iniciar el
procedimiento, mediante la adición de la guanilatociclasa soluble
en la mezcla de reacción. El procedimiento es adecuado, en una
forma de realización especial del análisis, para ser aplicado
mediante un robot de laboratorio y, en una forma de realización
especialmente preferida adicional, para la realización manual. La
preparación de la guanilatociclasa soluble se puede efectuar de la
manera ya mencionada en párrafos anteriores para la
guanilatociclasa soluble. Una ventaja especial de este ensayo
luminométrico radica en que los componentes para la realización del
procedimiento, tales como GTP,
nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa,
NAD^{+}, luciferina o luciferasa, se pueden preparar en un
recipiente de reacción. La actividad de la guanilatociclasa
soluble se calcula por la determinación de la cantidad de ATP
formado. El inicio de la reacción se efectúa por la adición de
guanilatociclasa soluble. De esta forma, resulta posible llevar a
cabo el procedimiento en una reacción de un único recipiente. Éste
se puede utilizar y llevar a cabo de forma reproducible también en
un rastreo con elevado rendimiento de sustancias químicas a
investigar ("High Throughput Screening" = HTS, "Rastreo de
Alto Rendimiento"). Este ensayo luminométrico resulta
especialmente apropiado para la detección de cantidades reducidas
de pirofosfato. En una forma de realización preferida, se utiliza
el procedimiento para determinar la actividad de una
guanilatociclasa soluble. El ensayo luminométrico es adecuado
también para efectuar un procedimiento como el descrito en los
párrafos anteriores para detectar la guanilatociclasa soluble con
hierro heme trivalente, en cuyo caso el procedimiento contiene las
siguientes etapas de procedimiento:
- a)
- Preparación de una guanilatociclasa soluble;
- b)
- Preparación de al menos un compuesto químico, que estimula la actividad de una guanilatociclasa soluble, cuando el hierro de esta guanilatociclasa soluble se encuentra en fase de oxidación trivalente;
- c)
- Incubación de una guanilatociclasa soluble, preparada según a), con un compuesto químico, preparado según b);
- d)
- Determinación de la actividad de la guanilatociclasa soluble tras la incubación según c).
Los principios activos farmacéuticos existentes
hasta la fecha no activan una guanilatociclasa soluble cuando su
hierro heme se encuentra en estado trivalente. Hasta la fecha, no se
conocen compuestos químicos capaces de activar la guanilatociclasa
soluble cuando su hierro heme está presente en forma oxidada
trivalente. Estos compuestos químicos se podrían utilizar como
principios activos farmacéuticos en medicamentos para estimular
una guanilatociclasa soluble con un hierro heme trivalente. De la
misma manera, estos compuestos se podrían utilizar en el
procedimiento para la detección de formas oxidadas de la
guanilatociclasa soluble, como se describe de acuerdo con la
invención.
invención.
Una forma de realización adicional de la
invención se refiere, por lo tanto, a un procedimiento para
localizar un compuesto químico que estimula la actividad de una
guanilatociclasa soluble, cuando el hierro del heme de la
guanilatociclasa soluble está presente en fase de oxidación
trivalente, en donde el procedimiento contiene las siguientes
etapas de procedimiento:
- a)
- Preparación de una guanilatociclasa soluble, en la que el hierro heme de esta guanilatociclasa soluble está presente en fase de oxidación trivalente;
- b)
- Preparación de al menos un compuesto químico a investigar;
- c)
- Incubación de una guanilatociclasa soluble según a), con al menos un compuesto químico a investigar según b); y
- d)
- Determinación de la actividad de la guanilatociclasa soluble tras la incubación según c), de acuerdo con el ensayo luminométrico.
El procedimiento para localizar un compuesto
químico se denomina también rastreo. El uso y la preparación de la
guanilatociclasa soluble en el procedimiento de rastreo tienen lugar
de la forma ya mencionada en el procedimiento para la detección de
una guanilatociclasa soluble con hierro heme trivalente.
La preparación de la guanilatociclasa soluble
para el rastreo puede incluir la elaboración de formas adecuadas
para la incubación con uno de los compuestos químicos a investigar.
Por ejemplo, la guanilatociclasa soluble se puede suspender o
disolver en disolventes acuosos, suplementados con tampón, iones o,
también, reactivos auxiliares. Por ejemplo, también se puede
aplicar sobre material de soporte y, fijada de esta manera,
utilizarla suspendida en disolventes.
El compuesto químico a investigar en el rastreo
puede ser, por ejemplo, un compuesto químico sintetizado, o una
sustancia natural. El compuesto químico a investigar puede estar
presente en diferentes estados, por ejemplo, como sustancia
individual en forma purificada, como mezcla junto con otros
compuestos, que no necesitan estar exactamente caracterizados, como
mezcla de diferentes compuestos activos, como componente de una
mezcla de compuestos de origen biológico, o junto con organismos
eucarióticos y/o procarióticos. El procedimiento de rastreo se
puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de un robot de
laboratorio, o con la ayuda de máquinas. Los compuestos químicos a
investigar, que activan una guanilatociclasa soluble con hierro
heme trivalente, se pueden utilizar como principios activos
farmacéuticos para el tratamiento de estados patológicos tales
como, por ejemplo, cáncer, angina de pecho, diabetes, infarto de
miocardio, disfunción eréctil, insuficiencia cardiaca,
hipertensión arterial, trombosis, anemia o disfunción vascular. La
invención ofrece también acceso a un compuesto químico que, por
medio de este procedimiento de rastreo, se identifica como
activador de una guanilatociclasa soluble, cuyo hierro heme se
encuentra en fase de oxidación trivalente. De manera muy general,
la invención ofrece acceso a compuestos que pueden activar la
actividad de una guanilatociclasa soluble, cuyo hierro heme está
presente en fase de oxidación trivalente, y al uso de estas
sustancias, preferentemente como principios activos farmacéuticos,
que se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de estados
patológicos causados o agravados por la guanilatociclasa soluble
con hierro heme en fase de oxidación trivalente. Pueden pertenecer
a estos estados patológicos, por ejemplo, cáncer, angina de pecho,
diabetes, infarto de miocardio, disfunción eréctil, insuficiencia
cardiaca, hipertensión arterial, trombosis, disfunción vascular o
anemia.
La invención da a conocer también un elemento de
diagnóstico para la realización de un procedimiento para detectar
la fase de oxidación del hierro heme de una guanilatociclasa
soluble. Con este fin, el elemento de diagnóstico puede contener
al menos uno o varios de los siguientes componentes: a) al menos un
compuesto químico que estimula la actividad de la guanilatociclasa
soluble cuando el hierro heme de esta guanilatociclasa soluble se
encuentra en fase de oxidación trivalente, así como b) soluciones
y/o reactivos para la determinación de actividad de una
guanilatociclasa soluble. Como compuesto químico en el elemento de
diagnóstico se puede utilizar, por ejemplo,
2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida.
La determinación de la actividad se efectúa por medio del ensayo
luminométrico.
El elemento de diagnóstico puede contener, por
ejemplo, también guanilatociclasa soluble, un compuesto químico
que sólo activa una guanilatociclasa soluble cuando el hierro heme
está presente en estado bivalente, un agente de oxidación y/u ODQ.
Estos componentes se pueden usar de forma individual o combinada
para calcular un valor de referencia o una curva de calibración,
para la determinación cuantitativa o cualitativa de la
guanilatociclasa soluble con un hierro heme en fase de oxidación
trivalente.
El elemento de diagnóstico se puede utilizar, por
ejemplo, para la determinación de la parte de guanilatociclasa
soluble con hierro heme trivalente en una muestra biológica. Una
muestra biológica puede estar compuesta, por ejemplo, por células
de un tejido u órgano de un animal vertebrado o de un ser humano.
Estas células podrían haber sido extraídas de un organismo o haber
sido cultivadas, mediante técnicas de cultivo celular. Como
organismos donadores se pueden seleccionar individuos con tejidos u
órganos sanos o patológicamente alterados. Por ejemplo, se pueden
tomar muestras de órganos, muestras de tejido, muestras de sangre,
células o material de biopsia de organismos humanos o animales, por
medio de técnicas médicas, que sirven como muestras biológicas.
También se pueden analizar las muestras biológicas de diversos
individuos, comparándolas con respecto a sus diferentes hábitos de
vida o de alimentación en relación con el estado de oxidación del
hierro heme de la guanilatociclasa soluble. De esta forma, por
ejemplo, se podrían obtener y analizar las células de fumadores y
no fumadores. Se podrían comparar las guanilatociclasas solubles de
fumadores con las de los no fumadores con respecto a diferencias en
la relación del hierro heme bivalente al hierro heme
trivalente.
La invención da a conocer, en una forma de
realización preferida, un procedimiento in vitro para la
determinación de la fase de oxidación del hierro heme de una
guanilatociclasa soluble en una muestra biológica, tomada de un
organismo eucariótico. La muestra biológica tomada de un organismo
eucariótico puede contener, por ejemplo, células sanas o
patológicamente afectadas de cultivos celulares, tejidos u
órganos.
En una forma de realización preferida adicional,
se puede utilizar para la realización del procedimiento in
vitro un elemento de diagnóstico como el que se ha descrito
anteriormente. Estados biológicos patológicamente alterados pueden
ser, por ejemplo, cáncer, angina de pecho, diabetes, disfunción
eréctil, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, hipertensión
arterial, trombosis, anemia, disfunción vascular, y otros.
Asimismo, se pueden investigar también los efectos de determinados
hábitos de vida o de alimentación tales como, por ejemplo,
tabaquismo o consumo de alcohol, sobre el estado de oxidación del
hierro heme de la guanilatociclasa soluble.
En estados biológicos sanos, los parámetros
aplicados para la caracterización se encuentran dentro de los
niveles normales. Los correspondientes datos para establecer los
niveles normales se encuentran, por ejemplo, en libros de texto de
química clínica (por ejemplo, Keller, Herbert:
Klinisch-chemische Labordiagnostik für die
Praxis; Editorial Thieme, Stuttgart).
La invención se refiere también a un
procedimiento para la detección de guanilatociclasa soluble, en
donde la guanilatociclasa soluble está presente sin grupo heme. El
procedimiento puede comprender como etapas de procedimiento: a)
preparación de una guanilatociclasa soluble sin grupo heme, b)
preparación de al menos un compuesto químico capaz de estimular la
actividad de la guanilatociclasa soluble cuando la guanilatociclasa
soluble está presente sin grupo heme, c) incubación de una
guanilatociclasa soluble con un compuesto químico capaz de
estimular la actividad de una guanilatociclasa soluble sin grupo
heme, y d) determinación de la actividad de la guanilatociclasa
soluble sin grupo heme tras la incubación con un compuesto químico
según el ensayo luminométrico.
Un procedimiento para la preparación de una
guanilatociclasa soluble sin grupo heme se describe en Foerster,
J. et al., Eur. J. Biochem. 240,
380-386 (1996). Como compuesto químico para la
estimulación de una guanilatociclasa soluble sin grupo heme resulta
adecuado, por ejemplo, el compuesto químico
2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida.
La guanilatociclasa soluble (sGC) cataliza la
conversión de GTP en GMPc y pirofosfato. En presencia de
nicotinamida-adenina-dinucleótido
(NAD^{+}) y
nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa
(NAT, EC 2.7.7.1) se transforma pirofosfato para dar ATP y
nicotinamida-mononucleótido. El ATP formado se puede
cuantificar de forma luminométrica con ayuda de una luciferasa en
placas de microtitulación.
La sustancia a analizar se disuelve en DMSO y se
diluye con DMSO/agua hasta una concentración final de
50 \muM en la mezcla de ensayo. La concentración de DMSO en la mezcla de ensayo debe ser de 5% en volumen como máximo.
50 \muM en la mezcla de ensayo. La concentración de DMSO en la mezcla de ensayo debe ser de 5% en volumen como máximo.
100 \mul de mezcla de reacción deben contener
tampón TEA 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 3 mM, GSH 3 mM, GTP
0,1 mM, IBMX (isobutil-metil-xantina) 1 mM, NAD^{+} 0,2 mM, NAT 0,4 mU, solución enzimática de sGC adecuadamente diluida (aislada de pulmón de vacuno según Humbert P. et al., Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991)), así como la sustancia de prueba o disolvente (para la determinación de la actividad enzimática basal). La reacción se inicia por medio de la adición de la sGC. La mezcla de reacción se incuba durante 60 min a temperatura ambiente y, entonces, se detiene mediante enfriamiento con hielo y adición de EDTA 50 mM, pH 8,0. Para la determinación de ATP se agregan 20 \mul de MgCl_{2} 100 mM, y 50 \mul de Reactivo de Ensayo de ATP (luciferina 0,035 mM y 10.000 U/ml de luciferasa en tris-acetato 62,5 mM a pH 7,75, EDTA 1,9 mM, ditiotreitol 0,05 mM, BSA al 0,1%). Las Unidades de Luminiscencia Relativas (RLU, siglas en alemán) se pueden medir con un luminómetro de placas de microtitulación.
0,1 mM, IBMX (isobutil-metil-xantina) 1 mM, NAD^{+} 0,2 mM, NAT 0,4 mU, solución enzimática de sGC adecuadamente diluida (aislada de pulmón de vacuno según Humbert P. et al., Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991)), así como la sustancia de prueba o disolvente (para la determinación de la actividad enzimática basal). La reacción se inicia por medio de la adición de la sGC. La mezcla de reacción se incuba durante 60 min a temperatura ambiente y, entonces, se detiene mediante enfriamiento con hielo y adición de EDTA 50 mM, pH 8,0. Para la determinación de ATP se agregan 20 \mul de MgCl_{2} 100 mM, y 50 \mul de Reactivo de Ensayo de ATP (luciferina 0,035 mM y 10.000 U/ml de luciferasa en tris-acetato 62,5 mM a pH 7,75, EDTA 1,9 mM, ditiotreitol 0,05 mM, BSA al 0,1%). Las Unidades de Luminiscencia Relativas (RLU, siglas en alemán) se pueden medir con un luminómetro de placas de microtitulación.
La actividad de la sGC se obtiene tras la
sustracción del valor en vacío de RLU (incubación sin enzima) del
valor de medición de RLU. La activación de la sGC por una sustancia
de prueba se expresa en porcentaje de la actividad enzimática
basal (control de disolvente) y se calcula de acuerdo con la
fórmula siguiente:
100 x
(\DeltaRLU_{\text{sustancia de prueba}} /
DRLU_{\text{control}}) - 100 = % de
activación
La sGC aislada se encuentra en solución en una
forma heme que contiene Fe^{2+} (reducida), susceptible de
estimulación con NO, y en una forma heme que contiene Fe^{3+}
(oxidada), no susceptible de estimulación con NO. La parte de cada
forma se ha podido determinar hasta ahora con ayuda de mediciones
de ESR.
El monóxido de nitrógeno (NO) y los donadores de
NO activan exclusivamente el estado reducido de la sGC. En una
incubación en presencia de, por ejemplo,
1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona
(ODQ), que oxida in vitro la sGC de manera irreversible,
muestra una completa pérdida de su efecto estimulante. Un nuevo
activador de la sGC, independiente de NO,
1-bencil-3-(2-hidroximetil-fur-5-il)-indazol
(YC-1), activa igualmente la forma reducida de la
sGC y se puede inhibir con ODQ.
Por el contrario, ODQ no potencia ni influye
sobre la capacidad de estimulación por medio de sustancias que
activan de manera exclusiva o predominante la forma oxidada, según
la parte de la forma oxidada en la mezcla.
A menudo, estas sustancias muestran también una
activación de la forma libre de heme de la sGC. La preparación de
una sGC libre de heme se lleva a cabo de acuerdo con J. Foerster,
et al., Eur. J. Biochem. 240,
380-386
(1996).
(1996).
Se puede preparar una guanilatociclasa soluble
con hierro heme trivalente conservando la enzima recién preparada
durante aprox. 7 días a 4ºC. Si la guanilatociclasa soluble
pretratada de esta forma se incuba con
2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida,
se obtiene una estimulación de 17,6 veces de la actividad. El valor
de CE_{50} asciende a 0,5 \mumol/l. Si se utiliza una
guanilatociclasa soluble libre de heme, se obtiene una estimulación
de 58,2 veces. La afinidad, en este caso, es de 2,4 \mumol/l.
El efecto fisiológico del monóxido de nitrógeno
(NO) tal como, por ejemplo, la inhibición de la agregación
trombocitaria y relajación de la musculatura vascular lisa, es
consecuencia de una activación directa de la guanilatociclasa
soluble (reducida) por NO, con una formación aumentada de GMPc.
ODQ, un inhibidor selectivo de la sGC, inhibe
mediante la oxidación de la sGC el incremento de GMPc y el efecto
antiagregante de los donadores de NO sobre trombocitos humanos
lavados (M.A. Moro et al., PNAS 93,
1480-1485 (1996)).
Para la preparación de trombocitos humanos
lavados (WP, siglas en inglés) se extrae sangre de la vena
antecubital y se anticoagula en la jeringuilla con ácido
cítrico/citrato sódico. Tras centrifugación a 16 x g durante 15
min, el sobrenadante está compuesto por plasma rico en plaquetas
(PRP). El PRP se acidifica, los trombocitos sedimentan por
centrifugación durante 20 min a 400 x g y se recolectan en solución
de Tyrode. Estos trombocitos lavados
(WP, 3x10^{5}/\mul) se utilizan en los ensayos.
(WP, 3x10^{5}/\mul) se utilizan en los ensayos.
La inhibición de la agregación por medio de
activadores de sGC se determina en un agregómetro de luminiscencia.
Los WP se incuban en presencia de CaCl_{2} 0,5 mM con la
sustancia de ensayo a 37ºC, y la reacción se inicia por la adición
de, por ejemplo, 0,3 \mug/ml de colágeno. El efecto de las
sustancias sobre la agregación se analiza en ausencia y en
presencia de ODQ. Los activadores de la sGC deberían inhibir, de
forma dependiente de la dosis, la agregación trombocitaria inducida
por el colágeno. Los activadores que estimulan la forma oxidada de
la sGC, deberían exhibir en presencia de ODQ un efecto antiagregante
más intenso. El valor de CI_{50} para la inhibición de la
agregación debería desplazarse hacia concentraciones más
reducidas.
Para determinar la concentración intracelular de
GMPc, se incuban WP durante 15 min en presencia de
isobutil-metil-xantina (IBMX) 0,1
mM a 37ºC. La incubación se interrumpe por centrifugación, y se
trata el precipitado con ácido perclórico 1M y ultrasonido durante
1 min. Tras una nueva centrifugación durante 15 min a 13.000 x g,
se neutraliza el sobrenadante con KOH 1M y se determina la
concentración de GMPc con un inmunoensayo enzimático disponible en
el comercio (por ejemplo, Amersham) para GMPc. La concentración de
proteína se determina en el precipitado por el método de
Bradford.
Los compuestos químicos que estimulan la
actividad de la guanilatociclasa soluble deberían conducir a un
incremento, dependiente de la concentración, de la concentración
intracelular de GMPc. Si la incubación se lleva a cabo en
presencia de ODQ, se debería poder obtener con compuestos químicos
que estimulan la actividad de la guanilatociclasa soluble con
hierro heme trivalente, niveles de GMPc significativamente más altos
que sin ODQ, es decir, ODQ debería potenciar el efecto de las
sustancias.
Se aíslan y cultivan células musculares lisas
(VSMC) de la aorta de rata de acuerdo con el método de J.H.
Chamley et al., Cell Tissue Res. 177,
503-522 (1977).
Las células se siembran en placas de 6 pocillos y
se incuban durante 15 min en tampón Hepes-Tyrode
(pH 7,4 con 200 U de SOD, IBMX 0,3 mM) a 37ºC. El efecto de las
sustancias sobre los VSMC se investiga en ausencia y presencia de
ODQ. La incubación se interrumpe por la aspiración con succión del
sobrenadante y adición de nitrógeno líquido, y las células se
congelan profundamente en placas de 6 pocillos. Para la
determinación de GMPc, se descongelan las placas, se recubren los
pocillos individuales con tampón, y se determina la concentración
de GMPc en el sobrenadante por medio de un inmunoensayo enzimático
disponible en el comercio (por ejemplo, Amersham) para GMPc. La
concentración de proteína se determina tras la disolución de la
proteína en los pocillos con NaOH 0,1M con el método de
Bradford.
Los compuestos químicos que estimulan la
actividad de la guanilatociclasa soluble deberían conducir a un
incremento, dependiente de la concentración, de la concentración
intracelular de GMPc. SI la incubación se lleva a cabo en
presencia de ODQ, se debería poder obtener con compuestos químicos
que estimulan la actividad de la guanilatociclasa soluble con
hierro heme trivalente, niveles de GMPc esencialmente más altos. ODQ
debería potenciar el efecto de los compuestos activadores.
Se disolvieron 33,71 g (0,32 mol) de carbonato
sódico en 250 ml de agua, y se calentó a 50ºC. Se incorporaron a
la solución 25,00 g (0,13 mol) de ácido
2-amino-4,5-dimetoxi-benzoico
y se agregaron a esta solución, durante un espacio de tiempo de 15
min, 29,55 g (0,14 mol) de cloruro de
4-cloro-bencenosulfonilo en
porciones. Después de enfriar la mezcla, se aspiró con succión, el
residuo se recogió en una solución al 1% de hidrógenocarbonato
sódico, se filtró, y el producto precipitó por la adición de ácido
clorhídrico 1N. Se obtuvieron 25,90 g (55%) de
ácido 2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico, con un punto de fusión de 212-214ºC. Se depositaron 25,90 g (0,07 mol) de ácido 2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico en 75 ml de tolueno, se agregaron 17,30 g (0,08 mol) de pentacloruro de fósforo, y la mezcla se agitó durante 2,5 h a 40-45ºC. A continuación, se concentró al vacío hasta la mitad del volumen, se aspiró con succión el producto precipitante, y se lavó nuevamente con poco tolueno. Se obtuvieron 25,30 g (93%) de cloruro del ácido 2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico, con un punto de fusión de 175-177ºC.
ácido 2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico, con un punto de fusión de 212-214ºC. Se depositaron 25,90 g (0,07 mol) de ácido 2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico en 75 ml de tolueno, se agregaron 17,30 g (0,08 mol) de pentacloruro de fósforo, y la mezcla se agitó durante 2,5 h a 40-45ºC. A continuación, se concentró al vacío hasta la mitad del volumen, se aspiró con succión el producto precipitante, y se lavó nuevamente con poco tolueno. Se obtuvieron 25,30 g (93%) de cloruro del ácido 2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico, con un punto de fusión de 175-177ºC.
Se depositaron 10,00 g (25,6 mol) de cloruro del
ácido
2-(4-cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoico
en 300 ml de tolueno, se agregaron 4,49 g (25,6 mmol) de fluoruro
del ácido 4-amino-bencenosulfónico,
y la mezcla se calentó a reflujo durante 4 h. Después de enfriar,
se aspiró con succión el precipitado depositado, y se lavó con
tolueno. Se obtuvieron 11,71 g (87%) del compuesto del título, con
un punto de fusión de 216-219ºC.
Se disolvieron 500 mg (0,95 mmol) de fluoruro del
ácido cloruro del ácido
4-((2-(4--cloro-fenil-sulfonilamino)-4,5-dimetoxi-benzoil)-amino)-bencenosulfónico
en 1 ml de tiomorfolino y se calentó a 90ºC durante 30 min. Para el
procesamiento, se vertió sobre 50 ml de hielo/ácido clorhídrico
1N, el precipitado se aspiró con succión, se secó en un armario de
secado al vacío sobre pentóxido de fósforo, y se cristalizó en
hexano/éster acético. Se obtuvieron 378 mg (65%) del compuesto del
título, con un punto de fusión de 241ºC.
Claims (4)
1. Ensayo luminométrico para la detección de una
guanilatociclasa soluble, que comprende las etapas de
procedimiento
- a)
- Preparación de una guanilatociclasa soluble y GTP como sustrato, y conversión de GTP en GMPc y pirofosfato;
- b)
- Preparación de una nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa y nicotinamida dinucleótido (NAD^{+}), y reacción con el pirofosfato de a) para dar ATP;
- c)
- Preparación de luciferasa y luciferina, y determinación luminométrica del ATP formado en b) por reacción con luciferina y luciferasa.
2. Ensayo luminométrico para la detección una
guanilatociclasa soluble según la reivindicación 1, en el que se
introducen GTP, NAD^{+},
nicotinamida-mononucleótido-adeniltransferasa,
luciferina y luciferasa en un recipiente de reacción, la reacción
se inicia por la adición de la guanilatociclasa soluble, se mide la
cantidad de ATP formado, y se determina a partir de la misma la
actividad de la guanilatociclasa soluble.
3. Uso de un ensayo luminométrico según la
reivindicación 1 ó 2, para la detección de una guanilatociclasa
soluble, para determinar la actividad de la guanilatociclasa
soluble.
4. Uso de un ensayo luminométrico según la
reivindicación 1, 2 ó 3, para la detección de una guanilatociclasa
soluble, cuyo hierro heme se encuentra presente en fase de
oxidación trivalente.
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