MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE FORMAS OXIDADAS DE CICLASA DE GUANILATO SOLUBLE Y UM MÉTODO PAPA TAMIZAR POST ACTIVADORES DE Cl CLASA DE GUANILATO SOLUBLE CON HIERRO HEME OXIDADO
Un método para detecta-. formas oxidadas de ciclasa e guanilato soluble y un método para tamizar activadores de c?;lasa de guamlato soluble con hierro heme oxidado La invención se re aciona con un método para detectar ciclasa d^ guanilato soluble cuyo hierro formado en complejo heme s= oxida o que no contiene grupo heme, y además con un nótodo de tamizado para identificar compuestos capaces de activar ciclasa de guan: lato soluble con hierre heme oxidado, y además con una ayuda de diagnostico para detectar una ciclasa de guamlato soluble con hierro heme trivalente Las ciclasas de gua- lato -solubles son proteínas heterodunór i cas Consisten en cada caso de una subunidad a y una subunidad ß y contienen heme como grupo prostético El enlace de la molécula NO de señal al heme activa ia enzima El cGMP formado a través de la actividad enzimática de ciclasa de guanilato soluble se involucra entre otros en la act?\ ación de qumasas de proteína ciependienie de cGMP y en l regulación de
,¡,, i , j Í.Ü. . i » jn-am---*-» --» -.«----¡-La, * A < i -- - - - * »-•- • * *—- "-*•* u?. t ??? fosfodiesterasvis o de canales de ion Se han descrito cuatro isoformas de las subunidadis Estas difieren en su secuencia y en la expresión especifica de tejido y específica de desarrollo Los subtipos a< y ßt se encuentran principalmente en el pulmón riñon y cerebro La cadena ß-. 3? expresa principalmente en el hígado y
riñon y a2 en l a placenta La di enzación de las subumaades es una condición previa para una ciclasa de guarníate so ubLe catalíticamente activa Los heterodi eros ? ßt a2/ß? y GC?/ß2 son conocidos Con todas las subunidades un grado elevado de homología ee debe observar en ia rec on del dominio catalítico La iclasa de auanilato soluble (sGC) contiene un heme por heterodímero El enlace del heme ocurre a través de H ".-105 ? la cadena ßi Los mutantee que ya no
confieren HJS-J05 en el termino M ce la subu idad ßt no se pueden estimular por NO, El heme en ciclasa de guanilato soluble consiste de una parte orgánica de la molécula y un átomo de hierro La parte orgánica, protopo firma IX contiene cuatro anillos le pirrol que ostan enlazados mediante puentes de met a para proporcionar un sistema de tetrapirrol , El átomo de hierro en el heme está ligado a cuatro átomos de nitrógeno en el centro del anillo de protnpoi firma Es capaz ademas de acoplarse
- l 4±*F & *. ? en otros dos enlaces El estado de oxidación del hierro en el heme pueda ser +_ (forma ferrosa, o +3 (forma férrica, for.ia oxidada 1 El estado de oxidación del hierro en ei heme tiene un efecto crucial en la función enzimáiica ele ciclaea de guarníalo soluble La enzima con el hierro heme en la forma trivalente muestra solamente actividad enzimatica basal como una ciclasa de guaní lato soluble sin giupo heme, y no se pueae estimular mediante NO La preparación de ina ciclasa de guarníalo soluble libre de heme se describe en Eur. 3 Biochem 240, 330-336 (1995) La ciclasa de guanilato soluble (sGC. cataliza la con/ersión de GTF en monofosfato de guanos a cíclica ( cGMP . y pirofosíato, cGMP actúa como mensajero mtracelular (segundo mensa] er ;>) Los segundos mensa] eros se producen dentro de 'a célula en reacciones semejantes a cascada Su nivel se controla e?iante señales extracelulares (p r ejemplo hormonas neurotransmisores, factores de crecimiento, substancias olorosas peptidos, luz) La formación de segundos mensajeros sirve para mei orar la> seña Les El segundo mensaiero trmenite señales dentro de la célula a proteínas de blanco particulares (quinasas. fosfatasas, canales de ion y otros) que dependen ael tipo de célula La modulación de cic-asa oe guanilato soluble por lo
? fa-i . i - i--¡- ?k !? fe,¿-i--L., -ja.- , í íJ . . A-¿ . i tki tanto conduce, a través de la influencia en los niveles de cGMP y proteínas de blanco controladas por los mismos, a un número da efectos farmacológicos Los ejemplos de mecanismos influenciados de esta manera son la relajamiento de músculos suaves (por ejemplo en las paredes de los vasos sanguíneos), la inhibición de activación de plaqueta, la inhibición ele proliferación de células de múscul suave o la adhesión de leucocitos La ciclasa de guarníate soluble es detectable en órganos tales como por ejemplo, el corazón, pulmón hígado riñon cerebro en todos los mamíferos, incluyendo los humanos En procesos patológicos o aquellos relevantes para eventos patológicos el estado de oxidación del hierro heme en eiclcsa de guanilato soluble puede jugar una "Darte esencial Una proporción uperior de ciclasa de guanilato soluble con hierro heme oxidado resultaría en la po¿ibil?dad de activación de ciclasa de guaní i ato soluble rrediam-e NO encogeno que se disminuye Esto podría conducir entre otros, a través de un aumento en la presicn sanguínea, a activación de plaquetas, proliferación incre antada de células o adhesión mejorada de células a presión sanguínea elevada permanente angina de pecho estable o inestable, trombosis, infarto al miocardio, golpes, edemas pulmonares, disfunción eréctil, crecimiento A teiido no controlado con formación de
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tumor diaoetes disfunciones renales, disfunciones hepáticas o disfunción vascular. Las células endoteliales de paredes ele vaso secretan NO como hormona paracrina entre otros para activar la ciclasa de guanilato soluble Los compuestos usados frecuentemente para estimulo farmacológico de ciclasa de guanilato soluble actúan como donadores de NO a través de liberación de MO intermedia Los ejemplos de los mismos son los nitratos orgánicos. Además, diversos compuestos que no actúan a través de liberación de NO pero que modifican la actividad ele ciclase de guanilato soluble se han descrito, La activación de ciclasa de guanilato soluble mediante donadores de NO o NO libre ocurre exclusivamente en el estado reducido, es decir, que contiene (Fe2+), de hierro heme Esto es evidente de experimentos llevados a cabo por A. Schrammel y coi en Mol Pharmacol 50, 1 (1996) con ÍH- [1 , 2 , 4 ]oxad?azolo[ , 3~a]quinoxal?n-l-ona (=ODQ) ODQ es un inhibidor específico y altamente efectivo de ciclasa de guarulato soluble, ODQ interactúa con el grupo heme prostético. In vitro la substancia ocasiona oxidación irreversible del hierro heme de ciclasa de guanilato soluble. El tratamiento de ciclasa de guarníate soluble con ODQ resulta en el efecto de estímulo de NO en la enzima que se pierde La oxidación
-£ .- - J ~t*ú.? -J del hierro hene en ciclasa de gianilato soluble también se puede ocasionar con oxad?azolo(3 4-d ( benz(b . ( 1 ^ ) -oxaz?n-1-ona (Olesen y col British Journal of Pharmacology 123 299-309 (1996)) o femcianuro de potasio ( oerlmg y col en Rev?e?s of Physiology Biochemistry an Pharmacology pag 41-65 pnnger Verlag 1999 ¡ También a^ activadores de ciclasa de guarníate soluble que no actúan a través de liberación de NO Una descripción de las misrus se ha proporcionado por ejemplo oor Vesely y col en Eur J Clin Invest 15, 258 (1^85) El estímulo ce ciclasa de guanilato soluble libre de heme mediante rotopor firma IX se ha demostrado por Iinarro y coi en Adv Pharmacol 26 35 (19941 El efecto de protopor firma IX no se puede inhibir mediante ODQ, pero se mejora mediante el compuesto (Koeslmg y Griebe en Physiol Biochem Pharmacol 135 11 1999 i j Los ac x /adores descritos a la fecha para ciclasa de guarníalo soluble que estimulan la actividad enzi atica de la misma solamente si el hierio heme está en el estado reducido es decir, que contiene Fe2 Recientemente, otra clase de compuestos químicos se ha descrito (WO 00/32851) en la forma de N-arilamidas de acido cerboxilico substituioas con sul fd i lamino CL OS representantes son capaces de
? l -. L & . , a , , i i j i activar ciclasa de guaní lato soluble La actividad de ciclasa de guanilato soluble hasta la fecha se ha detectado, por ejemplo, utilizando métodos enzimáticos para detectar cGMP y cAMP o mediante métodos íoto étpeoe para detectar el grupc heme Para establecer la dependencia de una condición con un cambín patológico en el estado de ciclasa de guarníate soluble es insuficientemente solamente detectar la protema utilizando métodos de detección mmunologicos o mediante el uso de técnicas de etiquetado Es justamente tan ín portante conocer el estado de reducción por oxidación de hierro en comp ¡.e] o en el grupo heme Hasta la fecha ha sido posible encontrar información acerca de la funcionalidad del heme en ciclasa de guarníate soluble por ejemplo, determinando el estado de reducción por oxidación del hierro heme en complejo mediante mediciones de ESR o mediante fotometría Estas determinaciones tienen la desventaja de que dependen de la disponibilidad de aparato técnico que es en parte complejo Los métodos además tienen solamente apropiabilidad .imitada para mediciones específicas debido a impurezas de otras proteínas que contienen heme que interfieren fácilmente con los mismos Un objeto de la presente invención, por lo tanto fue propor ionar un método simplificado y
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L. & J i _< -il' a- t? t i ÉL especifico para detectar un estado de oxidación de ciclasa de guamlato soluble Otro objeto de la invención era proporcionar un método para encontrar una substancia química que active ciclasa de guamlato soluble cuando su hierro heme esta oxidado en el estado trivalente La invención también se relaciona con una ayuda de diagnóstico que es apropiada para identificar una ciclasa de guanilato soluble cuyo hierro heme está oxidade en el estado trivalente La presente invención se relaciona con un método para detectar una ciclasa ue guaní lato soluble en donde el hierro del heme en est-i ciclasa de guarníate soluble esta en ex estado de oxie ación trivalente, y en donde el método comprende los siguientes pasos al provisión de una ciclasa de guanilato soluble bl provisión de cuando menos un compuesto químico que estimule la actividad de una ciclasa de guarníate soluble cuando el hierro del heme en esta ciclasa de guarníalo soluble está en el estado de oxidación trivalente, ' c) incubación de una ciclaea de guanilato soluble propor ionada como en al con un compuesto químico proporcionado como en b., d) determinación de la actividad de ciclasa de
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guaní lato soluble después ele la incubación co o en c) La c-clasa de guanilato soluble puede consistir de una mezcla oe moléculas de ciclasa de gua?ilato soluble, con no todas las moléculas de ciclasa de guaní lato soluble estando presente-, con ?n hierro heme en el estado de oxidación trivalente En particular, algunos ele los grupos heme de las moléculas de ciclasa de guaniiato soluble pueden estar en el estado de oxidación trivalente y algunas otras en eL estado de oxidación divalente para resultar en una mezcla con proporciones variables de los estados de oxidación del hierro heme El método para detectar una ciclasa de ?ruanilato soluble cuyo hierro heme esta en la forma trivalente se puede llevar a cabo por ejemplo mediante comparación con valores de referencia Los valores de referencia se pueden obtener, entre otros, por ejemplo de experimentos en los que la dependencia de la actividad de cicLasa de guan lato soluble en proporciones conocidas de ciclasa de guaní lato soluble con hierro heme trivalente se ha determinado Una medida de la proporción particular de ciclasa de guaní] to soluble con hierro heme trivalente se puede obtener mediante tratamiento previo de la ciclasa de guarníate soluble coi ODQ y determinación subsecuente de la actividad de esta ciclasa de guanilato soluble Los valores de referencia determinados luego se
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pueden util mar co o trazos de calibración para determ naciones cuantitativas de ciclasa de guanilato soluble con hierro heme en el estado de oxidación trivalente 5 La ciclasa de guanilato soluble se puede utilizar en diversos estados de materia, por ejemplo, como ciclasa de guarníate soluble heterodimórica diversa. Es posible en principio emplear una ciclasa de guanilato soluble de cualquier especie, en particular cualquier
10 especie ele mamífero, La ciclasa de guanilato soluble de ganado se utiliza de preferencia y se aisla de preferencia ele tejido pulmonar. La ciclasa de guanilato soluble humana se utiliza particularmente de preferencia. La ciclasa de guanila o soluble proporcionada de
15 preferencia puede estar compuesta en cada caso de una subumaaa a por ejemplo ce la subunidad a¡ o a2, y de una
subunidad ß, por ejemplo de la subunidad ßt o ß . Ee
posible y preferible para las subunidades de la ciclasa de guarulato soluble que se utilicen para el método de la
20 presente invención, La información de secuencia correspondencia se indica por Giuili y col (FEBS Letters 304, 83-88 (1992)) para las dos subunidades de ciclasa de guanilato soluble originalmente aisladas del cerebro humano o en Nakane y col. (Journal of Biol. Chem 265,
25 16841-16645 (19901) para cDNAs de la ciclasa de guanilato
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soluble de tejido de pulmón de rata o en Yuen y col (Biocheustry 29, 10872-10878 (1990)) para una ciclasa de guarníate soluble de ríñones de rata La provisión de una ciclasa de guanilato soluble puede ocurrir mediante aislamiento de un material biológico utilizando métodos bioquímicos En estos casos en particular frecuentemente hay una mezcla de moléculas de ciciasa de guanilato soluble con diferentes estados de oxidación del hierro heme Los métodos bioquímicos pueden ser, e-ntre otros: métodos para desintegrar el material biolcgieo, centrifugación, separaciones cromatográficas, electroforesis de gel, enfoque isoeléctrico, métodos inmuno] ocíeos El material biológico puede comprender células eucarióticas o células procarióticas, desintegraciones de las células o preparaciones de desintegrados de las células células enteras o partes o fracciones de las células Las células eucarióticas incluyen entre otras, por ejemplo, células de tejidos u órganos tales como corazón, vasos sanguíneos, pulmón, sangre. cerebro, hígado, riñon, tejido adiposo, músculo de vertebrados incluyendo humanos muestras de tejido o de sangre, pero también células de cultivos de célula humana o animal, y cultivos de célula de insecto Los ejemplos específicos que se pueden mencionar son plaquetas que se pueden obtener de
, ... ü i -.--A.l^1 ¿¿ muestras de sangre humana o animal, y células de músculo suave que se pueden aislar, por ejemplo, de vasos sanguíneos de • origen animal o humano. Los ejemplos adicionales son material de biopsia. 'órganos y tejidos y partes ele los mismos que quedan después de trasplantes, cordones umbilicales o placentas, Las células procarióticas pueden ser, por ejemplo, bacterias, incluyendo Escherichia coli, Samonella typhimurium, Bacillus subtilis, asi como hongos tales como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe o Pichia pastoris. En una modalidad particular de la invención, la ciclasa ele guanilato soluble puede ser material recombinante preparado, por ejemplo, mediante expresión en células eucarióticas o procarióticas, en cuyo caso la ciclasa de guanilato soluble, con o sin grupo heme prostético, se acumula dentro de ias células o se excreta hacia el medio, utilizando vectores de expresión, En una modalidad específica, la ciclasa de guanilato soluble se aisla mediante un método como se describe por Hu bert P, y col, en Methods of Enzymology 195. 384-391 (1991), En ufia modalidad, se proporciona una ciclasa de guanilato soluble que se ha tratado con un agente oxidante, En una modalidad preferida, se proporciona una ciclasa de guanilato soluble que se ha tratado con ODQ. La concentración de ODQ es, por ejemplo, de 0.001 mM a
. í Sí±-Sííi..*,.,, . ?..ÁÍ,... . ¿-L i .i. kX O 5 mM de preferencia O 005 mM a 0 1 mM y, particularmente ce preferencia, O 01 mM También se puede preferir proporcionar una ciclasa de guanilato soluble que se ha tratado con oxadiazolo(3 4-d)benz(b) 5 ( 1 , 41 üxazm- l-ofia u oti. derivado de ODQ En otra modalidad preferida se proporciona una ciclisa de guanilato solu le que se ha tratado con ferr ícianuro de potasio £1 tratamiento de la ciclasa de guanilato soluble con agentes oxidantes y/u ODQ y/u otros
10 compuestos puede ocasionar oxidación del hierro heme es decir conversión del nierro del estado de oxidación divalente (Fe2+) al estado de oxidación trivalente (Fe3+) dependiendo de las condiciones seleccionadas ya sea para solamente algunas o, modalidades en particular para
15 todas las moléculas de ciclasa de guanilato sol-ubles tratadas Generalmente es posible para llevar a cabo el método de la presente invención usar una forma de ciclasa ele guanilato soluble en la que el hierro heme está en el estado de oxidación trivalente ya sea para
20 algunas ele las moléculas de ciclasa de guarníalo solubles o, en una modalidad preferida, en todas las moléculas de ciclasa de guai ileto soluble, La provisión de la ciclaba de guanilato soluble comprende la preparador de formas apropiadas para
25 incubación con con puestos químicos proporcionados, e?
!.tf-«---l---l--»-Mlá«. . . . , « ,_- - ,t j^,. , i 1 i t- i ¡ „ 1 i . h í u -til t donde incubación significa que la ciclasa de guarníalo soluble \ el compuesto químico se ponen en contacto entre sí La proteína ee puede suspender o disolver por ejemplo en solventes acuosos suplementados con lampones, iones o biei reacti/os auxiliares También, por ejemplo, se puede ínai a material portador y usai , inmovilizada en esia forma suspendida en solveí tes Los ccrnpi estos qui rucos quo se pueden proporcionar i ar wstimuiar la actividad de cielasa de guarníate soluble con hierro heme trivalente son compuestos químicos individuales o bien combinaciones de compuestos químicos Los corpi estos químicos pueden estar por ejemplo sintetizados o aislados de substancias naturales En principio es posible utilizar para la provisioi de todos los compuestos químicos que estimulan la actividad de una ciclasa de guanilato soluble cuando el hierro dt¡l heme de esta cicxasa de guarníalo soluble esta en el estado de oxidación trivalente Para a cabo el método para detectar ciclasa de guarníalo soluble con un hierro heme en el estado de oxidación tri /alenté, es posible utilizar, por ejemplo el compuesto químico 2-(l clorofenilsul fonil- ammo. 4 5-d?metox? -II- ( 4 - tiomor fol _n-4-sul fonil ) fenil - benza ida
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Para llevar a cabo el rnutodo para detectar una ciclasa de guanlato soluble con un hierro heme trivalente es posible utilizar corrpuestos químicos que estimulan exclusivamente la ciclaba de guamlato soluble con hierro heme trivalente asimismo es posible utilizar compuestos que ademas el© activación de la ciclasa de guanilato soluble con un hierro heme trivalente también muestren otros efectos sobre la ciclasa de guarníale soluble Por ejemplo, es posible utilizar compuestos químicos que ademas de activación de la ciclasa da juanilato soluble con un hierio heme trivalente también ocasionen activación de la actividad basal Je la c clasa de guarníate soluble o activación de la ciclasa de juanilaco soluble con un hierro heme divalente Ui método para detectar ciclasa de guanilato soluble usando compuestos químicos que activan exclusivamente la forma de enzima LO? hierro heme trivalente o poi ejemplo también formas de enzima con hierro heme diva Lente ee lleva e cabo con la abuela de valores de referencia, trazos de calibración y/o mediante compara!, ion con ouostancias que son capaces de activar exclusivamente una ciclasa de guanilato soluble con hierro heme divalente (por ejemplo donadores ue NO) Para construir un trazo de calibración la ciciasa de guarníalo soluole se puede incubar con diversas
concentraciones por ejemplo, de ODQ. La relación particular de ciclasa de guamlato soluble con trivalente a ciclasa de guaní lato soluble con hierro heme divalente depende de la concentración de ODQ empleada en cada caso La concentración de ODQ utilizada se puede usar directamente como una medida de la proporción de enzima con hierro heme trivalente La proporción absoluta de ciclasa de guanilato soluble con hierro heme trivalente se puede comprobar para propósitos de calibración usando otros métodos ce medición, por ejemplo mediante mediciones de ESR Las ciclasas de guanilato solubles tratadas previamente de manera diferente con ODQ se activan mediante los compuestos químicos on un paso ele incubación En esto los compuestos que activan exclusivamente una ciclasa de guanilato soluble con hierro heme trivalente proporcionan un valor que es directamente piopcrcional a la cantidad de ciclasa de guanilato soluble con hierro heme trivalente. Durante el uso de compuestos químicos que, además de la ciclase de guanilato soluble con hierro heme trivalente, también activan la forma con hierro heme envalente, un trazo de calibración adicional se requiere con una substancia que active una ciclasa de guarníate soluble exclusivamente en la forma divalente La proporción de ciclasa de guarníate soluble con hierro heme trivalente luego emerge
» -*._» ¿ -comparando las actividades obtenidas después de diferente estímulo de una ciclasa de guanilato soluble tratada previamente con CDQ. Para esto, la ciclasa de guanilato soluble se estimula una vez con un compuesto químico que activa exclusi a nte ciclasa de guanilato soluble con hierro heme divalente y por otra parte, un compuesto químico que activa ciciasa de guarníate soluble con hierro heme trivalente y divalen ce se utiliza para el estímulo La determinación de le proporción de ciclasa de guanilato soluble con hierro heme trivalente en una muestra biológica que se va a investigar resulta de la comparación de la actividad de la ciclasa de guanilato soluble' de esta muestra después de incubación con un compuesto químico que es capaz de activar ciclasa de guanilato soluble corno se describe arriba con valores en un trazo de calibración La provisión de un compuesto químico también puede comprender disolver este compuesto en solventes apropiados tales como por ejemplo sulfóxido de dimetilo (DMSO) o agua, y preparación de una formulación con reactivos auxiliares, El tiempo para la incubación puede variar en longitud, y se puede llevar a cabo a diversas temperaturas. El tiempo requerido y el ajuste de temperatura dependen de las modalidades seleccionadas en cada caso con respecto a ambos la selección ele la ciclasa de guanilato soluble proporcionada, el compuesto químico proporcionado y/u otras condiciones tales como la forma de preparación, la concentración de la ciclasa de guarníalo soluble empleada y/o el compuesto químico empleado y ntrc>s aditivos E, tiempo de incubación puede ser por e emplo entre 1 minuto y 120 minutos, un tiempo de incubación preferido es entre 1 minuto y 60 minutos y un tiempo de 30 minutos se selecciona de manera particulaimente preferente La temperatura para la incubacior puede ser entre 5SC y 45EC, y la temperatura ee de preferencia entre 20aC y 40SC y, en la modalidad particularmente preferida, es 37BC. La detección de la actividad de la ciclasa de guanilato soluble puede ocurrir, por ejemplo, mediante un ensayo de enzima o un ensayo funcional subsecuente o un ensayo de enlae , por ejemplo en células aisladas o cultivos de célula En una modalidad específica, esta detección de la actividad puede ocurrir encontrando la inhibición dt> agregación de plaqueta utilizando un Lumiaggregometer El agregado de plaquetas menos después de la activación de la ciclasa de guarníate soluble y del incremento de cGMP mtracelular ocasionado por la ciclasa de guanilato sol ble La extensión de la inhibición de agregación de plaqueta es proporcional a la activación de
. -J ~ fe i ciclasa de quanilato soluble y, por lo tanto, proporciona una medida de la activación de enzima En esta modalidad de la invención, la ciclasa de guanilato soluble no se proporciona en forma aislada smo que está presente en la plaqueta La ciclasa de guarnlato soluble puede en principio, utilizarse también en los métodos en esta forma es decir, presente en células enteras En otra modalidad preferida, la actividad de ciclasa de guanilato soluble también se puede medir determinando el cGMF formado utilizando un RÍA (radioinmunoensayo. o EIA (inmunoensayo de enzima) En ot a modalidad preferida, la actividad se determina a través del efecto de los compuestos químmos en la formación de cGMP en células de músculo suave Las células de músculo suave son un constituyente, por ejemplo, de paredes de vaso sanguíneo Estas células de músculo ee relajan cuando aumenta el nivel 'le cGMP intracelular Esto puede ocurrir a través de activación de ciclasa de guaní lato soluble La relajación de las células de músculo suave, por lo tanto, se puede utilizar para delectar activadores de ciclasa de guaní lato soluble Una ciciasa de guanilato soluble ya no se puede activar mediante los ingredientes farmacéuticos activos descritos a la fecha cuando su hierro heme esta en el estado trivalente Los compuestos químicos capaces de activar ciclase de guanilato soluble cuando su hierro heme se oxida en el estado trivalente no se han descrito anteriormente Estos compuestos químicos se podrían utilizar como ingredientes farmacéuticos activos en farmacéuticos para estimular eielaea de guanilato soluble, por ejemplo en un estado patológico ocasionado por una ciclase de guaní lato soluble con un hierro heme trivalente Asimismo podría ser posible utilizar estos compuestos en el método para detectar formas oxidadas de ciclasa de guarníate soluble como se describe de conformidad con la invención Otra modalidad de la invención, por lo tanto, se relaciona con un método para encontrar un compuesto químico que estimula la actividad de una ciclasa de guanilato soluble cuando el hierro del heme de la ciclasa de guanilato scluble está en el estado de oxidación trivalente, el método comprendiendo los siguientes pasos a) provisión de una ciclasa de guanilato soluble en donde el hierro del heme de esta ciclasa de guarníalo soluble está en el estado de oxidación trivalente , b) provisión de cuando menos un compuesto químico que se va a investigar, c. incubación de una ciclasa de guarníate soluble de confor nielad con a) con cuando menos un
JU*.-.* compuesto químico que se va a investigar, de acuerdo con b); y d) determinación de la actividad de la ciclasa de guanilato soluble después de incubación co o en c), Un método para encontrar un compuesto químico también se refiere como tamizado, El uso y provisión de la ciclasa de guanilato soluble para el método de tamizado ocurre como ya se manifestó para el método para detectar una ciclase de guanilato soluble con hierro heme 10 trivalente La provisión de la ciclasa de guanilato soluble para ei tamizado puede incluir la preparación de formas apropiadas para La incubación con un compuesto químico que se va a investigar. La ciclase de guanilato soluble, 15 por ejemplo, ee puede suspender o disolver en solventes acuosos suplemer. tados por tampones, iones o bien reactivos auxiliares. Por ejemplo, también se puede fijar a material portador y utilizarse inmovilizada en esta forma suspendida en solventes 20 El compuesto químico que se va a investigar en el tamizado puede ser, por ejemplo, un compuesto químicamente sintetizado o un producto natural. El compuesto quíirico a investigar puede estar presente en varios estados de materia, por ejemplo co o substancia 25 única en forma purificada corno mezcla con otros
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compuestos que no necesitan caracterizarse en detalle como mezcla de diversos compuestos activos, como constituyente de una mezcla de compuestos de origen biológico o juntó con organismos eucarióticos y/o procarióticos El método de tamizado se puede llevar a cabo, por ejemplo mediante un robot de laboratorio o con la ayuda de maquilas Los compuestos químicos que se van a investigar que activan una ciclasa de guanilato soluble con un 1 ierro heme trivalente se pueden usar
10 como ingredientes farmacéuticos activoe para tratar condiciones con cambios patológicos tales como por ejemplo cáncer, angina ae pecho diabetes, infarto al miocardio, dir función er?ctil, falla cardíaca, presión sanguínea elevara, trombosis, anemia o disfuncion
15 vascular La invención también se relaciona con el compuesto químico que se va a investigar que se identilica me-diciite este método de tamizado como activador de una ciclasa de guanilato soluble cuyo hierro heme está en el estado de oxid ición trivalente La
20 invención se relaciona muy generalmente con compuestos que son capaces d? activar la actividad de una ciclasa de guarníate soluble cuyo hierro hem^ está en el estado de oxidación trivalente y al uso de estas substancias de preferencia como ingredientes rarmaceulicos activos 5 Consecuentemente, la invención también se relaciona con
Id ,? ? J J AÉSÍ-,.» &__* A..„ ., ^ l su - Í.Í compuestos que son capaces de activar una ciclasa de guanilato soluble cuyo hierro heme está en el estado de oxidación trivalente, y que per lo tanto, se puede emplear como ingredientes farmacéuticos activos para el tratamiento o prevención de estados patológicos ocasionados o intensificados por ciclasa de guanilato soluble con hierro heme en el estado de oxidación trivalente, Esios estados patológicos pueden incluir por ejemplo cáncer, angina de pecho, diabetes, infarto al miocardio diefunción eréctil, falla cardíaca, presión sanguínea elevaca, trombosis disfuncion vascular o anemí a La invención también se relaciona con una ayuda de diagnóstico para llevar a cabo un método para determinar el estado de oxidación de Hierro heme en una ciclase de guanxleto soluble La ayuda de diagnostico puede para ette proposito comprender cuando menos uno o más ele los siguientes componentes a. por lo menos un compuesto químico que estimula la actividad de ciclasa de guaní lato soluble cuando el hiepo heme ae esta ciclasa de guarníate soluble está en el estado de oxidación trivalente, y b) soluciones y/o reactivos para determinar la actividad de una ciclasa de juanilato soluble Un ejemplo de un conpuesto químico que se puede utilizar en la ayuda de diagn stico es 2- ( 4-clorofemlsulfonilammo )-
. ti J - ,. ia-i.--ti.Jt-.
4 , 5-d?metox?-N-( 4-t?omor folme-4-sul fonil ) fenil )benzan?da La actividad ee puede determinar mediante uno de los métodos ya descritos arriba La ayuda de diag stico también puede 5 comprender, per ejemplo, ciclasa ce guanilato soluble, un compuesto químico que activa un.- ciclasa de guanilato soluble solamente cuando el hierre heme está en el estado divalente uri agente oxidante y/u ODQ Estos constituyentes se pueden utilizar solos o en combinación
10 para establecer un valor de referencia o un trazo de calibración pera detern nación cuantitativa o cualitativa de ciclasa de guanilato soluble con un hierro heme en el estado de oxidación trivalente La ayuc a de diagnóstico se puede utilizar, por
15 ejemplo para determinar el contenido de cicJasa de guanilato soluble con hierro heme trivalente en una muestra biológica Una muestra biológica puede consistir, por ejemplo, de célula-' de un tejido u órgano de un verterrado o de un humano Estas células podrían
20 haber sido to adas de un organierr. o haberse desarrollado mediante técn.cas de cultivo de célula Los organismos donadores que se pueden seleccioiar son individuos con tejidos u órganos que soi saluda des o muestran cambios patológicos Por ejemplo muestras de órgano, muestras
25 de tejido muestras ele sangre c lulas o material de
biopsia se pueden tornar utilizando técnicas médicas de organismos humanos o animales y servir como muestra biológica Tamtión es posible llevar a cabo análisis comparativo de las muestras biológicas de diferentes individuos en ccnexión con el estado de oxidación del hierro heme en la ciclase de guanilato soluble en la luz de sus diferentes hábitos de vida y alimenticios, De esta manera, por ejemplo, las células de fumadores y no fumadores se podrían obtener y analizar. Las ciclases de
10 guanilato solubles de los fumadores se podrían comparar con aquellas de no fumadores para diferencias en la relación de hierro heme divalente a hierro heme trivalente . La invención se relaciona en una modalidad
15 preferida con un método in vitro para determinar el estado de oxidación del hierro heme en una ciclasa de guanilato soluble en una muestra biológica que se ha tomado de un organismo eucariótico La muestra biológica tomada de un organismo eucariótico puede contener, por
20 ejemplo, células saludables o pa ológicamente cambiadas de cultivos de cé Lulas, tejidos u órganos. En otra modalidad preferida, una ayuda de diagnóstico descrita de conformidad con la invención se puede utilizar para llevar a cabo el método in vitro.
25 Los ejemplos de posibles estados biológicos con cambios
-.t i ..I. tí í patológicos son cáncer, angina de pecho, diabetes, disfuncion ereclil infarto al miocardio falla cardíaca, presión sanguínea elevada, trombo is anemia, disfunción vascular y otros También es posible investigar ciertos hábitos de vida o alimenticios tales como, por ejemplo, fumar o consumo de alcohol para los efectos sobre el estado de oxidación de nierro heme en la ciclas a de guanilato soluble En estados biológicos saludables, los parámetros usados para la caracterización quedan dentro de la escala normal La mfoimacion apropiada para establecer las escalas normales debe encontrarse, por ejemplo en libros de texto de química clínica (por ejemplo Keller Herber1*- Kl isch-chemische Labordiagnostik für die Praxis, Thieme-Verlag , Stuttgart j Le invención también se relaciona con un método para detectar una ciclase de guaní lato soluble utilizando un ensayo luir mcmecrico El ensayo comprende varios pasos Los pasos se pueden llevar a cabo sucesivamente o en forma simultanea El ensayo lu mométrico consiste de los siguientes pasos' a) provisión de una ciclasa de guaní lato soluble y GTP como substrato, b) conversión del GTP mediante la ciclase de guanilato soluble proporcionada para formar cGMP y pirofosfato, c) provisión de una adenil transferasa de mononucleótido de nicot amide y d ucleótido de nicot amida (NAD+1, d) conversión del pirofosfato formado en b) mediante la adenil transferesa de mononucleótido de nicot amida en presencia de dmucleótido de nicotmarnida (NAD+) para formar TP, e) provisión de una lucí ferasa y su lucí ferina de substrato y f) determinación 1uminornétrice del ATP formado mediante reacción con lucí ferina bajo catálisis de luciferase La cantidad de ATP formado es proporcional a la concentración de ciclaea de guanilato soluble £1 método se inicia añadiendo ciclasa de guanilato soluóie a una mezcla de reacción que, además de otras substancias, contiene GTP como substrato Otras substancias pueden ser, por ejemplo, tampones, iones o proteínas El método pare detectar la ciclasa de guanilato soluble es apropiado en una modalided preferida para llevar a cabo un tamizado de compuestos químicos que se van a investigar para su caoacidad apropiada para estimular la actividad de ciclasa de guanileto soluble La ventaja de este método lummométrico comparado con métodos anteriormente utilizados para detectar ciclasa e guamlato soluble (métodos munológicoe , enzimáticos, fotometr icos ) consiste en la posibilidad de ser capaz de tamizar cantidades grandes de compuestos químicos que se van a investigar pera su capacidad potencial para estimular la actividad de una ciclase de guenilato soluble con hierro heme trivalente en tiempos considerablemente más cortos Fara llevar a cabo el tamizado el compuesto químico a investigar se añade a la mezcla de reacción antes del inicio del método mediante adición de ciclase de guanilato soluble El método es apropiado en una modalidad particular del tamizado para uso en un robot de laboratorio y en otra modalidad particularmente preferida para funcionamiento manual La provisión de la ciclase ae guanilato soluble puede ocurrir como ya se manifestó en les secciones anteriores para la ciclasa de guanilato soluble Una ventaja particular de este ensayo luminomótrico es que los componentes para llevar a cabo el método, tales como GTP, adeniltrensferasa de mononucleót ida de nicotinanuda , MAD+, lucí ferina o lucí ferasa, se puede proporcionar en un recipiente de reacción La actividad de ciclase de guanilato soluble se establece determinando la cantidad de ATP formado La reacción se rucia añadiendo ciclasa de guamlato soluble Esto hece posible llevar a cabo el método en una reacción de un recipiente Esto también se puede aplicer a tamizado con producción elevede de substancias químicas a investigar (tamizado de producción elevada HTS) y se puede llegar a cabo de manera reproducible Este ensaye lu mo etrico es muy apropiado
en particular para detectar cantidades pequeñas de pirofosfato El método en una odelidad preferida, puede utilizarse para determinar la actividad de una ciclasa de guaní lato soluble El ensayo lummométrico tambi n es apropiado pera llover a cabe un método como se describe en las secciones precedentes para detectar ciclasa de guaní lato soluble con hierro heme trivalente La inveicicn también se relaciona con un método para detectar una cíclese de guerilato soluble en donde la ciclasa de guenilato soluble no tiene grupo heme El método puede comprender co o pases a) provisión de una ciclase de guenilato soluble sin grupo heme, b) provisión de cuando menos m compiesto qulírico capaz de estimular le actividad de ciclasa de guaní lato soluble cuando la ciclasa de guanilato soluble no tiene grupo heme, c) incubación de una ciclasa de guanilato soluble con un compuesto químico capaz ce estimular la actividad de una ciclesa de guanilato soluble sin grupo heme y d) determinación de la actividad de la ciclasa de guanilato soluble sin grupc heme después de incubación con el compuesto químico La invención también se relaciona con un método para encontrar un compuesto químico que estimule la actividad de una ciclasa de guanilato soluble en donde la ciclase de guaní la* o soluble no tiene grupo heme Este
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método puede comprender como pasos a) provisión de una ciclasa de guarníalo soluble que no tiene grupo heme, bl provisión de cuando menos un compuesto químico a investigar, c) incubación de una ciclasa de guanilato soluble sin grupo líeme con cuanco menos un compuesto químico a investigar y d) determinación de la actividad de la ciclasa de guanilato soluble después de la incubación Le invención tembién se relaciona con una ayuda
10 de diagnostico paia determinar el estado de oxidación de una cicleea de guanilato soluble sin grupo heme, que comprende cuendo menos un compuesto químico que estimula le actividad de una ciclasa de guarnlato soluble en donde la ciclas^ de guanileto soluble no tiene grupo heme La
15 invención también se relacione con un método vitro para de terminal una ciclasa de guarníate soluble que no tiene grupo heme en una muestra biológica en donde el método pueae co p'-wraer como paso- la previsión de una muestra biológica que contiene una ciclasa dß guarníalo
20 soluble sm grupo heme, la provisión de cuando menos un compuesto químico capaz ele estimular la actividad de una ciclasa de guaní lelo soluble sin grupo heme, le incubación de una ciclasa de guanilato soluble sin grupo heme con un compuesto químico capaz de estimular la
25 actividad do una ciclase de guanilato soluble, y la
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determinación de la actividad de la ciclasa de guanilato soluble sin grupo heme después de la incubación con el compuesto químico Un método para la provisión de una ciclasa de guarníate soluble sin grupo heme se describe en Foerster, J. y col,, Eur. J. Biochem. 240, 380-386 (1996). Un ejemplo ele un compuesto químico apropiado para estimular una ciclase de guanilato soluble sin grupo heme es el compuesto químico 2- ( 4~clorofen i lsulfo ilemino ) -4,5- dimetox?-N-( 4-tionorfolm-4-sulfoml ) fenil ) benzamida .
Ej mplos Ejemplo i Método luminomótrico para detectar la actividad de ciclasa de guanilato soluble La ciclasa de guanilato soluble (sGC) cataliza la conversión de GTP en cGMP y pirofosfato En presencia de di nucleótido ele adenina de nicotinamide (NAD*) y adeniltransf eraea de mononucleótido de nicotinamida (NAT, EC 2 7 7,1), el pirofosfato se convierte en ATP y mononucleótido ele nicotinamida . El ATP formado se puede cuantif icar lummomé tri carnente con ayuda de una lucif rase en placas de microtítulo La substancia a investigar se disuelve en DMSO y se diluye con DMSO/agua liaste una concentración final
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de 50 uM en la mezcla de ensayo La concentración de DMSO en la mezcla de ensayo no debe exceder de 5% (v/v) 100 ul de mezcla de reacción debe contener 50 mM de campón TEA ( pH 7.4), 3 mM de MgCl2 3 mM de GSH, 0,1 M de GTP, 1 ?tM ce IBMX ( isobuti lmet ilxan t me ) , 0,2 mM de NAD*, 0 4 U e NAT, solución de enzima de sGC apropiadamente diluida (aislada de pulmón bovino como se describe por Humbert P. y col., Methods of Enzymológy 195, 384-391 (1991)) y la substancia de prueba o solvente (para determinar la ectivided de enzime basal). La reacción se inic a añadiendo la sGC. La mezcla de reacción se incuba a temperature ambiente durente 60 min y luego se detiene mediente enfriemiento en hielo y agregendo 50 mM de EDTA, pH 8.0, Para la determinación de ATP, 20 ul de 10 mM de MgCl2 y 50 ul de reactivo de ensayo de ATP (0.035 mM de luci ferina y 10,000 U/mL de lucí ferase en 62 5 mM de tris acetato pH 7 75 1.9 mM de EDTA, 0 05 mM de ditiotreitol, 0 1% de BSA). Las unidades de luminiscencia relativas (RLU) se pueden medir en un lummómetro e placa de microtítulo. La actividad de sGC se obtiene después de substraer le ELU de modelo (incubación sin enzima) de la RLU medida Le activación de la sGC mediante una substancia de prueba se indica como un porcentaje de la actividad de enzima basal (control de solvente) y se
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calcula mediante la siguiente fórmula: 100 x (substancia de prueba de ?RLU / control de DRLU) - 100 - % de activación,
Ejemplo 2 Activación de cíclese de guanilato soluble después de oxidación del hierro heme, la sGC aislada está presente en solución en una forma que contiene Fe2* (reducida) que se puede estimular
10 mediante NO y une forma que contiene Fe3* heme (oxidedo) que no se puede estimular por NO, La proporción de cada forma se puede determinar a la fecha mediante mediciones de ESR Óxido nítrico (NO) y donadores de NO activen exclusivamente el estado reducido de sGC . Durante la
15 incubación en presencia por ejemplo, ele 0.01 mM de ÍH- [ 1 , 2 , ] oxadiazolo [ , 3-a] quinoxalin-1-ona (ODQ), que oxida irreversiblemente sGC ín vitro muestran pérdida completa de su efecto estimúlente Un activador independiente de NO novedoso de sGC, l-bencil-3- ( 2- 20 hidrox?metil-5-furil ) indezol (YC-1), asimismo ectiva la forma reducide de sGC y se puede inhibir mediante ODQ1 En contraste con esto, el estímulo mediente substancias que activan exclusive o predominantemente le forma oxidada se mejora o no se afecta mediante ODQ, ^5 dependiendo de la proporción de la
?ASí i , - ftafc-I.rt.4 i»iB»r.l-t . .-»&. i i .. . .. . Í it .a. — . -. jjfcí.,-.- 1.;,„-,-« -.-i i-í-j "* H/& 34 -
forma oxidada en ..a mezcla Estas substancias asimismo muestran frecuentemente une activación de la forma libre de heme de sGC La prepareción de une sGC libre de heme se lleva a cabo de conformidad con J Foerster y col , Eur J,
Biochem 240 380-386 (1996) Une ciclase de guarníate soluble con un hierro heme trivalente se puede prepai ar almacenando enzima recientemente preparada a 49C durante aproximadamente 7 días La incubación ele ciclasa de guanileto soluble tratada previamente de esta manera con 2- ( -cloro fenilsul foni lamíno . --4 , 5-dimetox?-N-( 4-( t íoformolm-4-sul fonil ) -fenil ) benzemida resulta en estímulo de 17,6 vecee de ia actividad El ECiO es 0.5 urnol/i El estimulo en uso de una ciclasa de guarníate soluble libre de heme alcanza 58 2 veces La al inidad en este caso es 2.4 umol/1.
Ejemplo 3. Detección clel sf mulo de ciclasa de guanilato soluble después de oxideción del hierro heme determinando el efecto en agregeción de plaqueta. El efec.o fisiológico de óxido nítrico (NO) tal como, por ejemplo inhibición de agregación de plaqueta y relajación de músculos vasculares suaves es la consecuencia de une activación directa de ciclasa de
h t. . ~ í-t?AA?it¿. i?iMiA*i.?.»,~ ^ --.-, . ,.- - . - * ? .X -U- -..^ -, i , . -. liJl guaní lato soluble (reducida) medíante NO con formación incrementada de cGMP . ODQ. un inhibidor de sGC selectivo, mhibe, a través de oxidación de la eGC, el aumento en cGMP y el efecto ant iagí ega torio de donadores de NO en plaquetas humanas levadas (M A. Moro y coi,, PNAS 93, 1480-1485 ( 1996 ) 1 Pare preparar plaquetas humanas lavadas (WP). se tome sengre de la vena antecubi al y se ant i coagula en la jeringa con ácido cí trico/ci trato de sodio. Después de centrifugación a 51 x g durante 15 mm, el sobrenadante consiste en plasma rico en plaquetas (PRP) . El PRP se acide fice, y las plaquetas se sedimentan mediante centrifugación a 400 x g durante 20 min y se toman en solución de Tyrode Estas plaquetas lavadas (WP, 3xl0s/ull se emplean en las pruebas. La inhibición de agregación de activadores de sGC se determina en un medidor Lumiaggregometer . Las WPs se incuban con la substancia se prueba en presencia de 0,5 mM de CaCl. a 37aC, y la reacción se inicia añediendo. por ejemplo, 0.3 ug/mL de colágeno. El efecto de las substancias durante la agregación se investiga en ausencia y presencia de ODQ, Los activadores de sGC deben mostrar inhibición dependiente de dosis de agregación de plaqueta inducida por colágeno, Los
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activadores que estimulen la forma oxidada de sGC deben mostrar un efecto antiagregatorio más fuerte en presencia de ODQ El IC5, pare la inhibicxón e agregación debe desplazarse a concentreciones inferiores Para determinar la concentración de cGMP intracelular, las WPs se incuban en presencia de 0 1 mM de isobut ílmetilxantine (IBMX) a 37SC durante 15 mm La incubación se detiene mediante centrifugación, y el precipitado se trata con 1M de ácido perclórico y ultrasonido durante 1 trun Después ele centrifugación renovada a 13,000 x g durante 15 mm, el sobrenadante se neutraliza con 1M de KOH, y la concentración de cGMP se determina utilizendo un munoensayo de enzima comercial (por ejemplo Amersham) para cGMP La concentración de proteína en el precipitado se determina mediante el método Bradford Los compuestos químicos que activan la actividad de ciclase de guenileto soluble deben conducir a une concentración - eumento dependiente en la concentración de cGMP mtracelular .i la incubación se lleva a cabo en presencia de ODQ, debe ser posible obtener niveles de cGMP ignificativamente superiores que sin ODQ utilizando compuestos químicos que estimulan la actividad de ciclase de guanilato soluble con hierro heme trivalente es decir, ODQ debe mejorar el efecto de las
-.-,-i-i .--_fa.ti.iL -fa.. - --. -----t-j-jj ¡- . S.Í.- ..!- ;iij substancias
Ejemplo 4 Detección del estímulo de ciclase de guanileto soluble despuée de oxidación del hierro heme determinando el efecto en células de músculo suave de aorta de rata Las células de músculo suave (VSMC) de aorta de rate se aislan y cultivan mediante el método tíe J.H. Chamley y col , Cell Tissue Res 177, 503-522 (1977) Las células se siembran en placas de 6 pozos y se incuben en tampón Hepes-Tyrode ( pH 7 4 con 200 U SOD, 0.3 M de 1BMX) a 37aC durante 15 min. El efecto de las substancias en les VSMC se investiga en ausencia y presencia de ODQ La incubación se detiene aspirando el sobrenadente y añadiendo nitrógeno líquido, y las células se congelan por inmersión en las placas de 6 pozos Para determinar el cGM? las placas se descongelan, los pozos individuales se cargan con tampón, y la concentración de cGMP en el sobrenadante se determina con un ímunoensayo de enzima comercial (por ejemplo Amersham) para cGMP . La concentración de proteína se determina mediante el método Bradford después de que la proteína en los pozos se ha disuelto con 0.1 V de NaOH Los compuestos químicos que estimulan la actividad de ciclasa de quanilato soluble deben conducir
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a un aumento dependiente de concentración en la concentración de cGMP mtracelular Si la incubación se lleva a cabo en presencia de ODQ debe ser posible obtener niveles de cGMP considerablemente superiores con compuestos químicos que estimulan la actividad de la ciclasa de guarníate soluble con un hierro heme trivalente ODQ debe mejorar el efecto de los compuestos de activación
10 Ejemplo 5. Preparación de 2- ( 4-cloro£en?lsul fonilamino ) -4 , 5- dimetoxi-N- ( 4-( tiomor folín-4-sul fon ll ) fenil )benzam?da 33 71 g (0,32 mol) de carbonato de sodio se disolvieron en 25U ml de agua y se calentaron a 60SC 25
15 g (0 13 mol) de acido 2-ammo- , 5-d?metox?benzo?co se introdujeron en La solución, y 29 55 g (0 14 mol) de cloruro de 4-clorobencensul fonilo se añadieron en porciones a esta solución durante el curso de 15 mm Después de la mezcla se había enfriado, el residuo se
20 eliminó por filtración con succión y se tomó en solución de bicarbonato de sodio de 1% de resistencia y, después de la filtración, el producto se precipitó añadiendo 1 N de ácido clorhídrico 25 90 g (55%) de ácido 2-(4- clorofern lsul fonilemino) - , 5-d?metox?benzo?co de punto de
25 fusión de 212-;i4sC se obtuvieron 25.90 g (0 07 mol)
de ácido 2- ( 4-clorofeml-sulfonilen ino)-- , 5-d?metox?- benzoico se suspendieron en 75 ml de tolueno y, después de le adición de 17 30 g (0 08 mol) de pentacloruro de fósforo, la mezcle se egitó a 40-45sC durante 2 5 h Luego se concentró a la mitad del volumen en vacío, y el producto precipit ido se separó por filtración con succión y se lavó con poco tolueno 25 30 g (93%) de cloruro de 2-(4-clorofen?l-sulfon?lammo)-4, 5-di metoxibenzol lo de punto ele fusión de 175-177BC se obtuvieron 10 00 g
10 (25 6 mmol) de cloruro de 2- ( 4-clorofenilsul fonilammo ) - , 5-d?metox?benzo?lo se suspendieron en 300 rnl de tolueno, 4 49 g (25 6 mmol) de fluoruro de 4-ammobencen-sul i'onilo se añadieron, y la mezcla se calentó bajo reflujo durante 4 horas Después de
15 enfriar el precipitado que se había separado se separó por filtración con succión y se lavó con tolueno 11 71 g (87%l del compuesto del titulo de punto de fusión de 216-2199C se obtuvieron 500 mg (0,95 mmol de fluoruro de 4-((2-(4- 20 clorof enilsul fonil emino ) -4 5-dimetoxibenzoil )ammo) - bencensul fonilo se disolvieron en 1 ml de tiomor folma y se calentaron a 90Bc durante 3C min Para trabajo la mezclase vertió en 50 ml de hielo/1 N de ácido clorhídrico y e> precipitado se separó por filtración
25 con succión, se secó en secador de vacío soore pentoxido
m^ 40
de fosforo y se ^ecristal izó de hexano/acetato de etilo Se obtuvieron 378 mg (65%) del compuesto del titulo de punto de fusión de 2419C
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