KR100818537B1 - 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화된 형태의 검출방법 - Google Patents

가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화된 형태의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헴의 철이 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 검출방법 및 가용성 구아닐레이트 사이클라제내에 존재하는 헴의 철이 적어도 부분적으로 3가 산화된 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 화학적 물질의 검출방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 헴의 3가 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하기 위한 진단제에 관한 것이다.
헴의 철, 3가 산화 상태, 가용성 구아닐레이트 사이클라제, 진단 보조제, 발광측정 검정법

Description

가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화된 형태의 검출방법{Method for the detection of oxidized forms of soluble guanylate cyclase}
본 발명은 헴-착화된 철이 산화되어 있거나 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 검출방법에 관한 것이고, 또한 산화된 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시킬 수 있는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이고, 더우기 헴의 3가 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 검출용 진단 보조제에 관한 것이다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제는 헤테로이량체성 단백질이다. 이들은, 각각의 경우, α 아단위와 β 아단위로 구성되어 있고, 헴을 보결 그룹으로서 함유한다. 시그널 분자 NO의 헴에의 결합은 효소를 활성화시킨다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 효소 활성을 통해 형성된 cGMP가 특히 cGMP-의존성 단백질 키나제의 활성화에 관련되고, 포스포디에스테라제 또는 이온 채널의 조절에 관련된다. 아단위의 네 가지 이소형태가 기재되어 있다. 이들은 이들의 서열과 조직-특이적 및 발생-특이적 발현면에서 상이하다. 아형 α1 및 β1은 주로 폐, 신장 및 뇌에서 발견된다. β2 쇄는 주로 간 및 신장에서, α2는 태반에서 발현된다. 아단위의 이량체화는 촉매적으로 활성인 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 대한 전제조건이다. 헤테로이량체 α1/β1, α2/β1 및 α1/β2는 공지되어 있다. 모든 아단위의 경우, 고도의 상동성이 촉매 도메인의 영역에서 관찰되어야 한다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제(sGC)는 헤테로이량체당 1개의 헴을 함유한다. 헴의 결합은 β1 쇄에서 His-105를 통해 발생한다. β1 아단위의 N 말단에서 His-105를 더 이상 함유하지 않는 돌연변이체는 NO에 의해 자극될 수 없다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴은 분자의 유기 부분 및 철 원자로 구성되어 있다. 유기 부분인 프로토포르피린 IX는 메틴 가교에 의해 연결되어 있는 4개의 피롤 환을 함유하여 테트라피롤 시스템을 제공한다. 헴내에서의 철 원자는 프로토포르피린 환의 중심에서 4개의 질소 원자에 결합되어 있다. 또한, 이는 2개의 다른 연결에 관여할 수 있다. 헴내에서의 철의 산화 상태는 +2(제일철 형태) 또는 +3(제이철 형태; 산화된 형태)일 수 있다. 헴내에서의 철의 산화 상태는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 효소 기능에 대해 결정적인 영향을 미친다. 3가 형태의 헴 철을 함유하는 효소는 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제와 거의 동등한 기초 효소 활성만을 나타내어, NO에 의해 자극될 수 없다. 헴 비함유 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 제조법은 문헌[참조: Eur. J. Biochem. 240, 380-386 (1996)]에 기재되어 있다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제(sGC)는 GTP의 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 및 피로포스페이트로의 전환을 촉매한다. cGMP는 세포내 메신저(제2 메신저)로서 작용한다. 제2 메신저는 캐스케이드형 반응으로 세포 내부에서 생성 된다. 이들의 수준은 세포외 시그널(예를 들어, 호르몬, 신경전달물질, 성장 인자, 방향성 물질, 펩타이드, 광선)에 의해 조절된다. 제2 메신저의 형성은 시그널을 증강시키는 작용을 한다. 제2 메신저는 세포 내부의 시그널을 세포 유형에 따라 특정 표적 단백질(키나제, 포스파타제, 이온 채널 등)에 전달한다. 따라서, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 조절은 이에 의해 조절되는 cGMP 수준 및 표적 단백질에 대한 효과를 통해 다수의 약리학적 효과를 유도한다. 이러한 방식으로 영향을 받는 메카니즘의 예는 평활근(혈관벽내)의 이완, 혈소판 활성화의 저해, 평활근 세포 증식의 저해 또는 백혈구의 유착이다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제는, 예를 들어, 사람을 포함한 모든 포유동물의 심장, 폐, 신장, 뇌와 같은 기관에서 검출 가능하다. 병리학적 과정 또는 병리학적 사건과 관련된 병리학적 과정에서, 가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴의 철의 산화 상태는 중요한 구실을 할 수 있다. 산화된 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 보다 높은 비율은 내생적 NO에 의한 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화의 가능성을 감소시킬 수 있다. 이는 특히 혈압 증가, 혈소판의 활성화, 세포의 증가된 증식 또는 세포의 증강된 유착을 통해 영구적인 고혈압증, 안정형 또는 불안정형 협심증, 혈전증, 심근경색증, 졸중, 폐 부종, 발기 부전증, 종양 형성으로 비조절된 조직 성장, 당뇨병, 신부전증, 간부전증 또는 혈관 부전증을 야기시킬 것이다.
혈관벽의 내피 세포는 특히 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키기 위한 측분비 호르몬으로서 NO를 분비한다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 약리학적 자극을 위해 빈번하게 사용되는 화합물은 중간 NO 방출을 통해 NO 공여체로서 작용한다. 이의 예는 유기 질산염이다. 또한, NO 방출을 통해서는 작용할 수 없지만, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 조절하는 각종 화합물이 기재되어 있다.
NO 공여체 또는 유리 NO에 의한 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화는 전적으로 헴 철의 환원된, 즉, (Fe2+) 함유 상태에서 발생한다. 이는 문헌[참조: A. Schrammel et al., Mol. Pharmacol. 50, 1 (1996)]에서 1H-[1,2,4]옥사디아졸로[4,3-a]퀴녹살린-1-온(=ODQ)을 사용하여 수행된 실험으로부터 명백하다. ODQ는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 특이적이고 고도로 유효한 저해제이다. ODQ는 보결 헴 그룹과 상호작용한다. 시험관내에서, 당해 물질은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴 철의 비가역적 산화를 야기시킨다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 ODQ로의 처리는 효소에 대한 NO의 자극 효과를 상실시킨다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제내에서의 헴 철의 산화는 또한 옥사디아졸로(3,4-d)벤즈(b)(1,4)옥사진-1-온[참조: Olesen et al., British Journal of Pharmacology 123, 299-309 (1998)] 또는 페리시안화칼륨[참조: Koesling et al., "Reviews of Physiology Biochemistry and Pharmacology" pp. 41-65, Springer Verlag 1999]에 의해 일어날 수 있다. 또한, NO 방출을 통해 작용하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제가 존재한다. 이의 기술은 문헌[참조: Vesely et al., Eur. J. Clin. Invest. 15, 258 (1985)]에 의해 제공되어 있다. 프로토포르피린 IX에 의한 헴-비함유 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 자극은 문헌[참조: Ignarro et al., Adv. Pharmacol. 26, 35 (1994)]에 의해 입증되어 있다. 프로토포르피린 IX의 효과는 ODQ에 의해 저해될 수 없지만, 당해 화합물에 의해 증강된다[참조: Koesling and Friebe, Physiol. Biochem. Pharmacol. 135, 41 (1999)]. 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 대해 지금까지 개시된 활성화제는 헴 철이 환원된, 즉, Fe2+ 함유 상태로 존재하는 경우에만 이의 효소 활성을 자극한다.
최근에는, 또 다른 부류의 황 치환된 설포닐아미노 카복실산 N-아릴아미드 형태의 화학적 화합물이 문헌[참조: WO 00/02851]에 기재되어 있으며, 이의 전형은 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시킬 수 있다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성은 지금까지, 예를 들어, cGMP 및 cAMP를 검출하는 효소적 방법을 이용하거나 헴 그룹을 검출하는 광도측정법에 의해 검출하여 왔다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 상태에 대한 병리학적 변화를 갖는 상태의 의존성을 입증하기 위해, 단지 면역학적 검출방법을 이용하거나 라벨링 기술의 사용에 의해 단백질을 검출하는 것은 불충분하다. 헴 그룹내에 착화된 철의 산화환원 상태를 판단하는 것은 중요하다. 지금까지, 예를 들어, ESR 측정법 또는 광도측정법에 의해 착화된 헴의 철의 산화환원 상태를 측정함으로써 가용성 구아닐레이트 사이클라제내에서의 헴의 기능성에 관한 정보를 찾을 수 있었다. 이러한 측정법은 부분적으로 복잡한 공업 장치의 이용 가능성에 의존한다는 단점을 갖는다. 더우기, 이러한 방법들은 다른 헴 함유 단백질로부터의 불순물이 이들을 용이하게 방해하기 때문에 특이적인 측정법에 대해 단지 한정된 적합성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화 상태를 검출하기 위한 간소화되고 특이적인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴 철이 3가 상태로 산화되어 있는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키는 화학적 물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 헴의 철이 3가 상태로 산화된 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 동정하는 데 적합한 진단 보조제에 관한 것이다.
본 발명은 헴의 철이 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 당해 방법은
가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공하는 단계(a),
헴의 철이 3가 산화 상태로 존재하는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 1종 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계(b),
단계(a)에서 제공된 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 단계(b)에서 제공된 화학적 화합물과 항온반응시키는 단계(c) 및
단계(c)에서 항온반응시킨 후, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정하는 단계(d)를 포함한다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 혼합물로 구성될 수 있으며, 여기서 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자 모두가 3가 산화 상태의 헴 철을 함유하며 존재하는 것은 아니다. 특히, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 헴 그룹 중 일부는 3가 산화 상태로 존재하고, 나머지 일부는 2가 산화 상태로 존재할 수 있어, 헴의 철의 산화 상태의 비율이 다양한 혼합물을 생성시킬 수 있다. 헴 철이 3가 형태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 검출방법은, 예를 들어, 기준값과의 비교에 의해 수행할 수 있다. 기준값은 특히, 예를 들어, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 공지의 비율에 대한 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성의 의존성을 측정한 실험으로부터 획득할 수 있다. 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 특정 비율의 측정은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 ODQ로의 전처리 및 상기 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성의 후속적인 측정에 의해 획득할 수 있다. 다음, 측정된 기준값은 3가 산화 상태로 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 정량적 측정을 위한 보정 플롯으로서 사용할 수 있다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제는 다양한 물질 상태로, 예를 들어, 다양한 헤테로이량체성 가용성 구아닐레이트 사이클라제로서 사용할 수 있다. 원칙적으로, 특정 종, 특히 특정 포유동물 종 유래의 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 사용할 수 있다. 소의 가용성 구아닐레이트 사이클라제가 바람직하게 사용되고, 이는 바람직하게는 폐 조직으로부터 분리된다. 사람의 가용성 구아닐레이트 사이클라제가 특히 바람직하게 사용된다. 제공된 가용성 구아닐레이트 사이클라제는 바람직하게는, 각각의 경우, α 아단위, 예를 들어, α1 또는 α2 아단위와 β 아단위, 예를 들어, β1 또는 β2 아단위로 구성될 수 있다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 아단위를 본 발명의 방법에 사용하는 것이 가능하고 바람직하다. 상응하는 서열 정보는 사람 뇌로부터 원래 분리된 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 2종의 아단위에 대해서는 문헌[참조: Giuili et al., FEBS Letters 304, 83-88 (1992)], 랫트 폐 조직 유래의 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 cDNA에 대해서는 문헌[참조: Nakane et al., Journal of Biol. Chem. 265, 16841-16845 (1990)] 또는 랫트 신장 유래의 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 대해서는 문헌[참조: Yuen et al., Biochemistry 29, 10872-10878 (1990)]에 나타나 있다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 제공 단계는 생화학적 방법을 이용하여 생물학적 재료로부터 분리되어 수행할 수 있다. 이러한 경우, 특히 상이한 산화 상태의 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 혼합물이 빈번하게 존재한다. 생화학적 방법은 특히 생물학적 재료의 분해법, 원심분리법, 크로마토그래피 분리법, 겔 전기영동법, 등전성 포커싱, 면역학적 방법일 수 있다. 생물학적 재료는 진핵 세포 또는 원핵 세포, 상기 세포들의 분해물, 또는 상기 세포들의 분해물, 전세포 또는 세포의 조작 또는 분획로부터의 제제를 포함할 수 있다. 진핵 세포는 특히, 예를 들어, 사람을 포함한 척추동물 유래의 심장, 혈관, 폐, 혈액, 뇌, 간, 신장, 지방 조직, 근육과 같은 조직 또는 기관으로부터의 세포, 조직 또는 혈액 샘플, 또한 사람 또는 동물 세포 배양물 및 곤충 세포 배양물로부터의 세포를 포함한다. 언급할 수 있는 구체적인 예는 사람 또는 동물 혈액 샘플로부터 획득할 수 있는 혈소판, 예를 들어, 동물 또는 사람 기원의 혈관으로부터 분리할 수 있는 평활근 세포이다. 추가의 예는 생검 재료, 기관 및 조직, 및 이식 후 잔류된 이들의 절편, 제대 및 태반이다. 원핵 세포는, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한 세균뿐만 아니라, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 진균일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 가용성 구아닐레이트 사이클라제는, 예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포내에서의 발현에 의해 제조된 재조합 재료일 수 있으며, 이 경우, 보결 헴 그룹을 함유하거나 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 발현 벡터를 사용하여 세포내에 축적시키거나 배지로 배출시킨다. 특정 양태에 있어서, 가용성 구아닐레이트 사이클라제는 문헌[참조: Humbert P. et al., Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991)]에 언급한 바와 같은 방법에 의해 분리한다.
특정 양태에 있어서, 산화제로 처리한 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공한다. 바람직한 양태에 있어서, ODQ로 처리한 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공한다. ODQ의 농도는, 예를 들어, 0.001 내지 0.5mM, 바람직하게는 0.005 내지 0.1mM, 특히 바람직하게는 0.01mM이다. 또한, 옥사디아졸로(3,4-d)벤즈(b)(1,4)옥사진-1-온 또는 ODQ의 또 다른 유도체로 처리한 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 페리시안화칼륨으로 처리한 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공한다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화제 및/또는 ODQ 및/또는 다른 화합물로의 처리는, 처리된 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 단지 일부에 대해 또는 특정 양태에서는 처리된 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 전체에 대해 선택된 조건에 따라 헴의 철의 산화, 즉 철이 2가 산화 상태(Fe2+)로부터 3가 산화 상태(Fe3+)로 전환되는 것을 야기시킬 수 있다. 일반적으로는, 헴 철이 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 단지 일부에 대해 또는 특정 양태에서는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 분자의 전체에 대해 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 형태를 사용하는 본 발명의 방법을 수행하는 것이 가능하다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 제공 단계는 제공된 화학적 화합물과 항온반응시키기에 적합한 형태의 제조를 포함하며, 여기서, 항온반응은 가용성 구아닐레이트 사이클라제 및 화학적 화합물을 서로 접촉시킴을 의미한다. 단백질은, 예를 들어, 완충제, 이온 또는 이외의 보조 시약이 보충된 수성 용매에 현탁시키거나 용해시킬 수 있다. 또한, 이는, 예를 들어, 담체 재료에 부착시키고, 용매에 현탁된 상기 형태로 고정화시켜 사용할 수 있다.
3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하기 위해 제공할 수 있는 화학적 화합물은 단일 화학적 화합물 또는 달리 화학적 화합물의 배합물이다. 화학적 화합물은, 예를 들어, 합성하거나 천연 물질로부터 분리할 수 있다. 원칙적으로, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴의 철이 3가 산화 상태로 존재하는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 모든 화학적 화합물을 제공 단계에 사용할 수 있다.
3가 산화 상태의 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 검출방법을 수행하기 위해, 예를 들어, 화학적 화합물 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시-N-(4-(티오모르폴린-4-설포닐)페닐)벤즈아미드를 사용할 수 있다.
3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 검출방법을 수행하기 위해, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제만을 자극하는 화학적 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화 이외에, 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 대한 다른 효과를 나타내기도 하는 화합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화 이외에, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 기초 활성의 활성화 또는 2가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화를 야기시키기도 하는 화학적 화합물을 사용할 수 있다. 3가 헴 철을 함유하는 효소 형태만을 활성화시키거나 2가 헴 철을 함유하는 효소 형태도 활성화시키는 화학적 화합물을 사용하여 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하는 방법은 기준값, 보정 플롯의 보조 및/또는 2가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제만을 활성화시킬 수 있는 물질(예를 들어, NO 공여체)과의 비교에 의해 수행한다. 보정 플롯을 작도하기 위해, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를, 예를 들어, 다양한 농도의 ODQ와 항온반응시킬 수 있다. 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 대 2가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 특정 비는 각각의 경우에 사용되는 ODQ 농도에 따라 달라진다. 사용되는 ODQ 농도는 3가 헴 철을 함유하는 효소의 비의 척도로서 직접적으로 사용할 수 있다. 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 절대비는 다른 측정법을 이용하여, 예를 들어, ESR 측정법에 의해 보정 목적을 위해 조사한다. ODQ로 상이하게 전처리된 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 항온반응 단계에서 화학적 화합물에 의해 활성화시킨다. 여기서, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제만을 활성화시키는 화합물은 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 양에 직접적으로 비례하는 값을 제공한다. 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 이외에, 2가 헴 철을 함유하는 형태도 활성화시키는 화학적 화합물의 사용시, 추가의 보정 플롯이 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 2가 형태에서만 활성화시키는 물질과 함께 필요하다. 다음, ODQ로 전처리된 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 상이한 자극 후, 획득된 활성을 비교함으로써 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 비를 나타낸다. 이 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 2가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제만을 활성화시키는 화학적 화합물로 일단 자극하고, 한편, 3가 및 2가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키는 화학적 화합물을 자극에 사용한다. 조사할 생물학적 샘플 중에서의 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 비의 측정은 상기한 바와 같은 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성시킬 수 있는 화학적 화합물과 항온반응시킨 후, 당해 샘플로부터의 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 보정 플롯에서의 값과 비교함으로써 수행한다.
또한, 화학적 화합물의 제공 단계는 당해 화합물을, 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 물과 같은 적합한 용매에 용해시키고, 보조 시약을 함유하는 제형을 제조함을 포함할 수 있다.
항온반응에 대한 시간의 길이는 변화할 수 있고, 이는 다양한 온도에서 수행할 수 있다. 필요로 하는 시간과 온도 세팅은 제공된 가용성 구아닐레이트 사이클라제, 제공된 화학적 화합물의 선택 둘 다 및/또는 다른 조건, 예를 들어, 제제 형태, 사용되는 가용성 구아닐레이트 사이클라제 및/또는 사용되는 화학적 화합물의 농도, 및 다른 첨가제와 관련하여 각각의 경우에 선택된 양태에 따라 달라진다. 항온반응 시간은, 예를 들어, 1분 내지 120분일 수 있고, 바람직한 항온반응 시간은 1분 내지 60분이고, 30분의 시간이 특히 바람직하게 선택된다. 항온반응에 대한 온도는 5 내지 45℃일 수 있고, 온도는 바람직하게는 20 내지 40℃이고, 특히 바람직한 양태에서는 37℃이다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성의 검출은, 예를 들어, 분리된 세포 또는 세포 배양물내에서 효소 검정법 또는 후속적인 기능 검정법 또는 결합 검정법에 의해 수행할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 활성의 검출은 발광응집측정기(Lumiaggregometer)를 이용하여 혈소판 응집의 저해를 발견함으로써 수행할 수 있다. 혈소판은 가용성 구아닐레이트 사이클라제 및 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 의해 야기된 세포내 cGMP 증가의 활성화 후, 보다 적게 응집된다. 혈소판 응집의 저해 정도는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화에 비례하고, 따라서, 효소 활성화의 척도를 제공한다. 본 발명의 당해 양태에 있어서, 가용성 구아닐레이트 사이클라제는 분리된 형태로 제공되지 않으나, 혈소판내에 존재한다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제는 원칙적으로 상기 형태로 당해 방법에서 사용되며, 즉 전세포내에 존재한다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성은 또한 RIA(방사성면역검정법) 또는 EIA(효소 면역검정법)를 이용하여 형성된 cGMP를 측정함으로써 측정할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 활성은 평활근 세포내에서의 cGMP 형성에 대한 화학적 화합물의 효과를 통해 측정한다. 평활근 세포는, 예를 들어, 혈관벽의 구성 성분이다. 이러한 근육 세포는 세포내 cGMP 수준이 증가하는 경우에 이완된다. 이는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화를 통해 수행할 수 있다. 따라서, 평활근 세포의 이완은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제를 검출하는 데 사용할 수 있다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제는 이의 헴 철이 3가 상태로 존재하는 경우, 지금까지 개시된 활성 약제학적 성분에 의해 더 이상 활성화시킬 수 없다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴 철이 3가 상태로 산화되어 있는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시킬 수 있는 화학적 화합물은 이전에 개시된 바 없다. 이러한 화학적 화합물은, 예를 들어, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 의해 야기된 병리학적 상태에서 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 자극하기 위한 약제 중의 활성 약제학적 성분으로서 사용할 수 있었다. 또한, 상기 화합물을 본 발명에 따라 언급한 바와 같은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화된 형태를 검출하는 방법으로 사용하는 것이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴의 철이 3가 상태로 산화되어 있는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키는 화학적 물질을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 당해 방법은
가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴의 철이 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공하는 단계(a),
조사할 1종 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계(b),
단계(a)에 따르는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 단계(b)에 따르는 조사할 1종 이상의 화학적 화합물과 항온반응시키는 단계(c) 및
단계(c)에서 항온반응시킨 후, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정하는 단계(d)를 포함한다.
화학적 화합물을 검출하는 방법은 또한 스크리닝으로도 불린다. 스크리닝 방법에 대한 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 사용 및 제공 단계는 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하는 방법에 대해 전술한 바와 같이 수행한다.
스크리닝에 대한 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 제공 단계는 조사할 화학적 화합물과의 항온반응에 적합한 형태의 제조를 포함할 수 있다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제는, 예를 들어, 완충제, 이온 또는 이외의 보조 시약이 보충된 수성 용매에 현탁시키거나 용해시킬 수 있다. 또한, 이는, 예를 들어, 담체 재료에 부착시키고, 용매에 현탁된 상기 형태로 고정화시켜 사용할 수 있다.
스크리닝에서 조사할 화학적 화합물은, 예를 들어, 화학적으로 합성된 화합물 또는 천연 생성물일 수 있다. 조사할 화학적 화합물은 각종 물질 상태로, 예를 들어, 정제된 형태의 단일 물질, 상세하게 특성화시킬 필요가 없는 다른 화합물과의 혼합물로서, 각종 활성 화합물의 혼합물로서, 생물학적 기원의 화합물의 혼합물의 구성 성분으로서 또는 진핵 및/또는 원핵 유기체와 함께 존재할 수 있다. 스크리닝 방법은, 예를 들어, 실험실용 로봇에 의해 또는 기계의 보조로 수행할 수 있다. 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키는, 조사할 화학적 화합물은, 예를 들어, 암, 협심증, 당뇨병, 심근경색증, 발기 부전증, 심부전증, 고혈압증, 혈전증, 빈혈증 또는 혈관 부전증과 같은 병리학적 변화를 갖는 상태를 치료하기 위한 활성 약제학적 성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 헴 철이 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제로서 동정된, 조사할 화학적 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 매우 일반적으로 헴 철이 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 활성화시킬 수 있는 화합물 및 바람직하게는 활성 약제학적 성분으로서의 이들 물질의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 헴 철이 3가 산화 상태로 존재하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시킬 수 있고, 따라서, 3가 산화 상태의 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 의해 야기되거나 중증도가 증가하는 병리학적 상태의 치료 또는 예방을 위한 활성 약제학적 성분으로 사용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 이러한 병리학적 상태는, 예를 들어, 암, 협심증, 당뇨병, 심근경색증, 발기 부전증, 심부전증, 고혈압증, 혈전증, 혈관 부전증 또는 빈혈증을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴의 철의 산화 상태를 측정하는 방법을 수행하기 위한 진단 보조제에 관한 것이다. 상기 목적용 진단 보조제는 다음 성분 중의 1종 이상을 포함할 수 있다: a) 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴의 철이 3가 산화 상태로 존재하는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극할 수 있는 1종 이상의 화학적 화합물 및 b) 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정하기 위한 용액 및/또는 시약. 진단 보조제에서 사용할 수 있는 화학적 화합물의 예는 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시-N-(4-(티오모르폴린-4-설포닐)페닐)벤즈아미드이다. 활성은 위에서 미리 언급한 방법 중의 하나에 의해 측정할 수 있다.
또한, 진단 보조제는, 예를 들어, 가용성 구아닐레이트 사이클라제, 헴 철이 2가 상태로 존재하는 경우에만 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키는 화학적 화합물, 산화제 및/또는 ODQ를 포함할 수 있다. 이들 구성 성분은 단독으로 또는 배합물로 사용하여, 3가 산화 산태로 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 정량적 또는 정성적 측정을 위한 기준값 또는 보정 플롯을 설정할 수 있다.
진단 보조제는, 에를 들어, 생물학적 샘플 중의 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 함량을 측정하기 위해 사용할 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 척추동물 또는 사람의 조직 또는 기관 유래의 세포로 구성될 수 있다. 이들 세포는 유기체로부터 채취할 수 있거나, 세포 배양 기술에 의해 생육시킬 수 있다. 선택될 수 있는 공여 유기체는 건강하거나 병리학적 변화를 나타내는 조직 또는 기관을 보유한 개체이다. 예를 들어, 기관 샘플, 조직 샘플, 혈액 샘플, 세포 또는 생검 재료는 사람 또는 동물 유기체로부터 의료 기술을 이용하여 채취할 수 있다. 또한, 상이한 개체로부터 생물학적 샘플을 이들의 상이한 생활 및 섭식 습관의 관점에서 가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴의 철의 산화 상태와 관련하여 비교 분석하는 것이 가능하다. 이와 같이, 예를 들어, 흡연자 및 비흡연자의 세포를 획득하여 분석할 수 있다. 흡연자의 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 2가 헴 철 대 3가 헴 철의 비의 차이에 대해 비흡연자의 것과 비교할 수 있다.
본 발명은 바람직한 양태에 있어서 진핵 유기체로부터 채취한 생물학적 샘플 중의 가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴의 철의 산화 상태를 측정하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 진핵 유기체로부터 채취한 생물학적 샘플은, 예를 들어, 세포 배양물, 조직 또는 기관 유래의 건강하거나 병리학적으로 변화된 세포를 함유할 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따라 언급한 진단 보조제를 시험관내 방법을 수행하는 데 사용할 수 있다. 병리학적 변화를 갖는 가능한 생물학적 상태의 예는 암, 협심증, 당뇨병, 발기 부전증, 심근경색증, 심부전증, 고혈압증, 혈전증, 빈혈증, 혈관 부전증 등이다. 또한, 예를 들어, 흡연 또는 알콜 소비와 같은 특정의 생활 또는 섭식 습관을 가용성 구아닐레이트 사이클라제내의 헴의 철의 산화 상태에 미치는 효과에 대해 조사할 수 있다.
건강한 생물학적 상태에서, 특성화에 사용되는 파라미터는 정상 범위내에 포함된다. 정상 범위를 설정하기에 적합한 정보는, 예를 들어, 임상화학 교과서[참조: Keller, Herbert: Klinisch-chemische Labordiagnostic fur die Praxis; Thieme-Verlag, Stuttgart]에서 찾아볼 수 있다.
또한, 본 발명은 발광측정 검정법을 이용하여 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 당해 검정법은 몇 가지 단계를 포함한다. 당해 단계들은 연속적으로 또는 동시에 수행할 수 있다. 발광측정 검정법은 다음 단계를 포함한다: 가용성 구아닐레이트 사이클라제, 및 기질로서의 GTP를 제공하는 단계(a), 제공된 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 의해 GTP를 cGMP 및 피로포스페이트로 전환시키는 단계(b), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제 및 니코틴아미드 디뉴클레오티드(NAD+)를 제공하는 단계(c), 단계(b)에서 형성된 피로포스페이트를 니코틴아미드 디뉴클레오티드(NAD+)의 존재하에 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제에 의해 전환시켜, ATP를 형성시키는 단계(d), 루시페라제 및 이의 기질 루시페린을 제공하는 단계(e) 및 형성된 ATP를 루시페라제 촉매작용하에서의 루시페린과의 반응에 의한 발광측정법을 수행하는 단계(f). 형성된 ATP의 양은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 농도에 비례한다. 당해 방법은 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 기타 물질 이외에 기질로서 GTP를 함유하는 반응 혼합물에 첨가함으로써 개시한다. 기타 물질은, 예를 들어, 완충제, 이온 또는 단백질일 수 있다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 검출방법은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 데 대한 적합성에 대해 조사할 화학적 화합물의 스크리닝을 수행하기 위한 바람직한 양태에서 적합하다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하기 위해 이전에 사용된 방법(면역학적, 효소적, 광도측정 방법)과 비교하여 당해 발광측정법의 이점은 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 상당히 보다 짧은 시간내에 자극하는 잠재적인 능력에 대해 조사할 대량의 화학적 화합물을 스크리닝할 수 있는 가능성에 있다. 스크리닝을 수행하기 위해, 조사할 화학적 화합물을 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 첨가에 의해 방법을 개시하기 전에 반응 혼합물에 가한다. 당해 방법은 스크리닝의 특정 양태에 있어서 실험용 로봇에서 사용하기에 적합하고, 또 다른 특히 바람직한 양태에 있어서 수동식 수행에 적합하다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 제공 단계는 가용성 구아닐레이트 사이클라제에 대한 상기 섹션에서 상술한 바와 같이 수행할 수 있다. 이러한 발광측정 검정법의 특정 이점은 당해 방법을 수행하기 위한 성분, 예를 들어, GTP, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제, NAD+, 루시페린 또는 루시페라제를 반응 용기 속에 제공할 수 있다는 점이다. 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성은 형성된 ATP의 양을 측정함으로써 설정한다. 반응은 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 첨가에 의해 개시한다. 이로써 당해 방법을 단일 포트 반응으로 수행할 수 있게 된다. 또한, 당해 방법은 조사할 화학적 물질을 고효율 스크리닝(HTS: high throughput screening)하는 데 적용시킬 수 있고, 재현 가능하게 수행할 수 있다. 이러한 발광측정 검정법은 소량의 피로포스페이트를 검출하는 데 특히 적합하다. 당해 방법은 바람직한 양태에서 사용하여 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정할 수 있다. 또한, 발광측정 검정법은 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하기 위해 선행 섹션에서 언급한 바와 같은 방법을 수행하는 데 적합하다.
또한, 본 발명은 가용성 구아닐레이트 사이클라제가 헴 그룹을 함유하지 않는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공하는 단계(a), 가용성 구아닐레이트 사이클라제가 헴 그룹을 함유하지 않는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극할 수 있는 1종 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계(b), 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극할 수 있는 화학적 화합물과 항온반응시키는 단계(c) 및 화학적 화합물과 항온반응시킨 후, 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정하는 단계(d)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 가용성 구아닐레이트 사이클라제가 헴 그룹을 함유하지 않는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 화학적 화합물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공하는 단계(a), 조사할 1종 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계(b), 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 조사할 1종 이상의 화학적 화합물과 항온반응시키는 단계(c) 및 항온반응 후, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정하는 단계(d)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 가용성 구아닐레이트 사이클라제가 헴 그룹을 함유하지 않는 경우, 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 1종 이상의 화학적 화합물을 포함하는, 헴 그룹을 함유하는 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 산화 상태를 측정하기 위한 진단 보조제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 측정하는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 당해 방법은 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극할 수 있는 1종 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극할 수 있는 화학적 화합물과 항온반응시키는 단계 및 화학적 화합물과 항온반응시킨 후, 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 제공하는 방법은 문헌[참조: Foerster, J. et al., Eur. J. Biochem. 240, 380-386 (1996)]에 기재되어 있다. 헴 그룹을 함유하지 않는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 자극하기에 적합한 화학적 화합물의 예는 화학적 화합물 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시-N-(4-티오모르폴린-4-설포닐)페닐)벤즈아미드이다.
실시예 1:
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 검출하는 발광측정 방법
가용성 구아닐레이트 사이클라제(sGC)는 GTP의 cGMP 및 피로포스페이트로의 전환을 촉매한다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제(NAT, EC 2.7.7.1)의 존재하에서, 피로포스페이트를 ATP 및 니코틴아미드 모노뉴클레오티드로 전환시킨다. 형성된 ATP는 미세역가 플레이트에서 루시페라제의 보조하에 발광측정에 의해 정량화시킬 수 있다.
조사할 기질을 DMSO에 용해시키고, 검정 혼합물 중의 최종 농도가 50μM로 되도록 DMSO/물로 희석시킨다. 검정 혼합물 중의 DMSO 농도는 5%(v/v)를 초과하지 않아야 한다.
반응 혼합물 100㎕는 50mM TEA 완충액(pH 7.4), 3mM MgCl2, 3mM GSH, 0.1mM GTP, 1mM IBMX(이소부틸메틸크산틴), 0.2mM NAD+, NAT 0.4mU, 적합하게 희석된 sGC 효소 용액(문헌[참조: Humbert P. et al., Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991)]에 언급한 바와 같이 소의 폐로부터 분리) 및 시험 기질 또는 용매(기초 효소 활성 측정용)를 함유하여야 한다. 반응은 sGC의 첨가에 의해 개시한다. 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 항온반응시킨 다음, 얼음 중에서 냉각시키고, 50mM EDTA(pH 8.0)를 첨가함으로써 중지시킨다. ATP 측정을 위해, 100mM MgCl2 20㎕ 및 ATP 검정 시약(62.5mM 트리스 아세테이트(pH 7.75) 중의 0.035mM 루시페린 및 10,000U/mL 루시페라제, 1.9mM EDTA, 0.05mM 디티오트레이톨, 0.1% BSA) 50㎕. 상대적 발광 단위(RLU: relative luminescence units)는 미세역가 플레이트 발광측정기로 측정할 수 있다.
sGC 활성은 측정된 RLU로부터 블랭크 RLU(효소 부재하에 항온반응)를 공제함으로써 획득한다. 시험 기질에 의한 sGC의 활성화는 기초 효소 활성(용매 대조군)의 백분율로서 나타내며, 다음 식에 의해 계산한다:
100 × (△RLU시험 기질/DRLU대조군) - 100 = % 활성화
실시예 2
헴 철의 산화 후 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화
분리된 sGC는 NO에 의해 자극할 수 있는 헴 Fe2+ 함유(환원된) 형태 및 NO에 의해 자극할 수 없는 헴 Fe3+ 함유(산화된) 형태로 용액 중에 존재한다. 각각의 형태의 생성은 현재 ESR 측정법에 의해 측정할 수 있다.
산화질소(NO) 및 NO 공여체는 sGC의 환원된 상태만을 활성화시킨다. 예를 들어, sGC를 시험관내에서 비가역적으로 산화시키는 0.01mM 1H-[1,2,4]옥사디아졸로[4,3-a]퀴녹살린-1-온(ODQ)의 존재하에 항온반응시, 이들은 자극 효과의 완전한 상실을 나타낸다. sGC의 신규한 NO 의존성 활성화제인 1-벤질-3-(2-하이드록시메틸-5-푸릴)인다졸(YC-1)은 또한 sGC의 환원된 형태를 활성화시키고, ODQ에 의해 저해할 수 있다.
이와는 대조적으로, 산화된 형태를 전적으로 또는 우세하게 활성화시키는 기질에 의한 자극은 혼합물 중의 산화된 형태의 비율에 따라 ODQ에 의해 증강되거나 영향을 받지 않을 수 있다.
이들 기질은 또한 빈번하게 sGC의 헴 비함유 형태의 활성화를 나타내다. 헴 비함유 sGC의 제조는 문헌[참조: J. Foerster et al., Eur. J. Biochem. 240, 380-386 (1996)]에 따라 수행한다.
3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제는 갓 제조된 효소를 4℃에서 약 7일 동안 저장함으로써 제조할 수 있다. 이러한 방식으로 전처리된 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시-N-(4-(티오모르폴린-4-설포닐)페닐)벤즈아미드와 항온반응시킬 경우, 활성은 17.6배 자극된다. EC50은 0.5μmol/ℓ이다. 헴 비함유 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 사용시 자극은 58.2배에 이른다. 이 경우, 친화도는 2.4μmol/ℓ이다.
실시예 3:
혈소판 응집에 대한 효과를 측정함으로써 헴 철의 산화 후 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 자극의 검출
예를 들어, 혈소판 응집 저해 및 혈관 평활근의 이완과 같은 산화질소(NO)의 생리학적 효과는 cGMP의 증가된 형성과 함께 NO에 의한 가용성(환원된) 구아닐레이트 사이클라제의 직접 활성화의 결과이다.
선택적 sGC 저해제인 ODQ는 sGC의 산화를 통해 cGMP의 증가 및 세척된 사람 혈소판에서의 NO 공여체의 항응집 효과를 저해한다[참조: M.A. Moro et al., PNAS 93, 1480-1485 (1996)].
세척된 사람 혈소판(WP)을 제조하기 위해, 혈액을 전주 정맥으로부터 채취하고, 시트르산/시트르산나트륨이 함유된 주사기내에서 항응고시킨다. 16 ×g에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액은 혈소판 풍부한 혈장(PRP)으로 구성된다. PRP를 산성화시키고, 혈소판을 400 ×g에서 20분 동안 원심분리하여 침전시켜, 타이로드 용액에 용해시킨다. 당해 세척된 혈소판(WP, 3 ×105/μL)을 시험에 사용한다.
sCG 활성화제에 의한 응집의 저해는 발광응집측정기로 측정한다. WP는 0.5mM CaCl2의 존재하에 37℃에서 시험 기질과 항온반응시키고, 당해 반응은, 예를 들어, 0.3㎍/mL 콜라겐의 첨가에 의해 개시한다. 응집에 대한 기질의 효과를 ODQ의 부재 및 존재하에 조사한다. sGC 활성화제는 콜라겐 유도된 혈소판 응집의 투여량 의존성 저해를 나타내야만 한다. sGC의 산화된 형태를 자극하는 활성화제는 ODQ의 존재하에 보다 강한 항응집 효과를 나타내야만 한다. 응집의 억제에 대한 IC50은 보다 낮은 농도로 이동되어야 한다.
세포내 cGMP 농도를 측정하기 위해, WP를 0.1mM 이소부틸메틸크산틴(IBMX)의 존재하에 37℃에서 15분 동안 항온반응시킨다. 항온반응을 원심분리에 의해 중지시키고, 침전물을 1M 과염소산으로 처리하고, 1분 동안 초음파 처리한다. 13,000 ×g에서 15분 동안 다시 원심분리한 후, 상등액을 1M KOH로 중화시키고, cGMP 농도를 cGMP에 대해 산업용 효소 면역검정법[예를 들어, 아머샴(Amersham)]을 이용하여 측정한다. 침전물 중의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 측정한다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 활성화시키는 화학적 화합물은 세포내 cGMP 농도의 농도 의존성 증가를 유도하여야 한다. 항온반응이 ODQ의 존재하에 수행되는 경우, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 화학적 화합물을 ODQ의 부재하에 사용하는 것보다 상당히 높은 cGMP 수준을 획득할 수 있으며, 즉, ODQ는 기질의 효과를 증강시켜야 한다.
실시예 4:
랫트 대동맥 유래의 평활근 세포에 대한 효과를 측정함으로써 헴 철의 산화 후 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 자극의 검출
랫트 대동맥 유래의 평활근 세포(VSMC)를 문헌[참조: J.H. Chamley et al., Cell Tissue Res. 177, 503-522 (1977)]의 방법에 의해 분리하고 항온반응시킨다.
세포를 6웰 플레이트에 접종하고, 헤페스-타이로드 완충액(pH 7.4, 200U SOD, 0.3mM IBMX 함유) 중에서 37℃에서 15분 동안 항온반응시킨다. VSMC에 대한 기질의 효과는 ODQ의 부재 및 존재하에 조사한다. 상등액을 흡인하고, 액체 질소의 첨가에 의해 항온반응을 중지시키고, 세포를 6웰 플레이트내에서 급속 냉동시킨다. cGMP를 측정하기 위해, 플레이트를 해동시키고, 개별 웰을 완충액으로 충전시키고, 상등액 중의 cGMP 농도를 cGMP에 대해 산업용 효소 면역검정법(예를 들면, 아머샴)을 이용하여 측정한다. 단백질 농도는 웰 중의 단백질을 0.1M NaOH로 용해시킨 후, 브래드포드 방법에 의해 측정한다.
가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 화학적 화합물은 세포내 cGMP 농도의 농도 의존성 증가를 유도하여야 한다. 항온반응이 ODQ의 존재하에 수행되는 경우, 3가 헴 철을 함유하는 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 자극하는 화학적 화합물을 ODQ의 부재하에 사용하는 것보다 상당히 높은 cGMP 수준을 획득할 수 있다. ODQ는 화합물을 활성화시키는 효과를 증강시켜야 한다.
실시예 5:
2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시-N-(4-티오모르폴린-4-설포닐)페닐)벤즈아미드의 제조
탄산나트륨 33.71g(0.32mmol)을 물 250ml에 용해시키고, 60℃로 가열한다. 2-아미노-4,5-디메톡시벤조산 25.00g(0.13mol)을 용액에 유입하고, 4-클로로벤젠설포닐 클로라이드 29.55g(0.14mol)을 15분의 기간에 걸쳐 상기 용액에 분할 첨가한다. 혼합물을 냉각시킨 다음, 잔사를 흡인 여과하고, 1% 농도의 중탄산나트륨 용액에 용해시키고, 여과 후, 생성물을 1N 염산의 첨가에 의해 침전시킨다. 융점 212 내지 214℃의 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시벤조산 25.90g(55%)을 수득한다. 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시벤조산 25.90g(0.07mol)을 톨루엔 75ml에 현탁시키고, 오염화인 17.30g(0.08mol)을 첨가한 후, 혼합물을 40 내지 45℃에서 2.5시간 동안 교반한다. 다음, 이를 진공하에 1/2 용적으로 농축시키고, 침전된 혼합물을 흡인 여과하고, 소량의 톨루엔으로 세척한다. 융점이 175 내지 177℃인 2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시벤조일 클로라이드 25.30g(93%)을 수득한다.
2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시벤조일 클로라이드 10.00g(25.6mol)을 톨루엔 300ml에 현탁시키고, 4-아미노벤젠설포닐 플루오라이드 4.49g(25.6mmol)을 가하고, 혼합물을 환류하에 4시간 동안 가열한다. 냉각 후, 분리된 침전물을 흡인 여과하여, 톨루엔으로 세척한다. 융점이 216 내지 219℃인 표제 화합물 11.71g(87%)을 수득한다.
4-((2-(4-클로로페닐설포닐아미노)-4,5-디메톡시벤조일)아미노)벤젠설포닐 플루오라이드 500mg(0.95mmol)을 티오모르폴린 1ml에 용해시키고, 90℃에서 30분 동안 가열한다. 후처리를 위해, 혼합물을 얼음/1N 염산 50ml에 주입하고, 침전물을 흡인 여과시키고, 오산화인 상에서 진공 건조기로 건조시키고, 헥산/에틸 아세테이트로부터 재결정화시킨다. 융점이 241℃인 표제 화합물 378mg(65%)을 수득한다.

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  25. 가용성 구아닐레이트 사이클라제, 및 기질로서의 GTP를 제공하고, GTP를 cGMP 및 피로포스페이트로 전환시키는 단계(a),
    니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제 및 니코틴아미드 디뉴클레오티드(NAD+)를 제공하고, 단계(a)로부터의 피로포스페이트를 ATP로 전환시키는 단계(b) 및
    루시페라제 및 루시페린을 제공하고, 루시페린 및 루시페라제와의 반응에 의해 단계(b)에서 형성된 ATP를 발광측정하는 단계(c)를 포함하는, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하기 위한 발광측정 검정법.
  26. GTP, NAD+, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제, 루시페린 및 루시페라제를 반응 용기에 도입하고, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 첨가함으로써 반응을 개시하고, 형성된 ATP의 양을 측정하고, 이로부터 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성을 측정함을 포함하는, 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 검출하기 위한 발광측정 검정법.
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