SU876715A1

SU876715A1 - Способ вы влени распределени гуанилатциклазы в ткан х

Info

Publication number: SU876715A1
Application number: SU802879203A
Authority: SU
Inventors: Владимир Аркадьевич Шахламов; Татьяна Григорьевна Бархина; Михаил Николаеввич Ляпин
Original assignee: Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР
Priority date: 1980-02-08
Filing date: 1980-02-08
Publication date: 1981-10-30

Description

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РАСПРЕдаЛЕНИЯ ГУАНИЛАТЦИКД1АЗЫ

1

изобретение относитс к медицине, а именно к цитЪхимии, и може быть использовано дл электронно-микроскопического вы влени гуанилатциклазы .

Известен способ вы влени распределени гуанилатциклазы в ткан х 1.

Однако такой способ позвол ет получить только количественный анализ определени активности фермента и не обеспечивает возможности локализации и органной специфичности гуанилатциклазы в клетке в норме и патологии.

Цель изобретени - повышение точности способа и упрощение его.

Указанна цель достигаетс тем, что при осуществлении способа вы влени распределени гуанилатциклазы в ткан х последние инкубируют при температуре 30-34С в течение 5055 мин в среде, содержащей 80 мМ трисмадеатного буфера,13-14 мМ глюкозы , 1-2 мМ теофиллина,0,1-0,5 мМ ГТФ и 4 мМ Ва (HQ)I, затем Их обезвоживают , заливают в эпоксидную смолу и провод т электронную микроскопию .

Способ осуществл ют следующим образом .

В ТКАНЯХ

Провод т фиксацию в 1%-ном глютаральдегиде на 0,05 М какодилатном буфере с 4,5%-ной глюкозой 1ч при комнатной температуре,рН фиксатора -.7,4.

Промывают в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой в течение 1 сут. На следукнций день производ т отбраковку материала дл оптимального инку10 бировани материала.

Инкубацию осуществл ют при + 30 + 34°С в течение 50-55 мин (оптимальна продолжительность инкубации).

Дл оптимизации вы влени фермента были испробованы 6 вариантов инкубационной смеси.

В табл. 1 представлены материалы оптимизации температурного режима и врем инкубации.

С помощью табл.2 установлено, что

20 дл определени активности гуанилат -. циклазы в различных органах необхо- , ДИМ определенн1 й вариант.

Инкубационна смесь включает,мМ: трисмалеатный буфер 80

25 глюкоза13

теофиллин1 2

MnCIa0,1-0,5

Ъа(НО)4

30 Кроме предлагаемой иккубационной смеси, примен етс инкубационна смесь, в состав которой помимо указа ных компонентов входит еще MaN -ази натри , который вл етс спёщифичесКИМ активатором гуанилатциклазы. Пос ле удалени азида натри из инкубационной смеси активность гуанилатциклазы возвращаетс к норме. Дл оптимизации вы влени фермента с помощью активатора гуанилатцикл зы азида натри были испробованы так же 6 вариантов инкубационной смеси которые приведены в табл.3. Например, дл оптимального выделени фермента в клетках тонкого кишечника, печени и поджелудочной железы млекопитак цих необходим 1V вариант инкубационной смеси, дл оптимального вы влени фермента в клет ках легких и сердца - ГГ вариант. Теофиллин -ввод т в инкубационную смесь дл ингибации фосфодиэстаразы (ФДЭ что способствует увеличению уровн цГМФ в клетке, необходимого дл активации катализа ферментативной реакции ГТФ или гуанилилмидодифо фат - специфический субстрат вы влени гуанилатциклазы. Ва(НО),- маркер вы влени фермента. После инкубации производ т быструю промывку материала в 0,08 м трисмалеатном буфере. Дриофиксацию в 1% OgO на 0,05 М какодиалатном буфере с глюкозой (,4) провод т в течение 1,01 ,5 ч при 4°С, прокывку - в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой (,4). Дегидратацию осуществл ют в ацетонах возрастающей крепости (30, 50, 70, 96°, 100) и заливают в смесь чпона с аралдитом. Предлагаемый способ .при исследовании кусочков тканн из некоторых органов млекопитающих (тонкого кишечника , сердца, легких, печени, поджелудочной железы) позвол ет определить строгую специфичность локализации гуанилатциклазы, а также установить ее видовую и органную специфичность, вы вление гуанилатциклазы поможет вскрыть механизмы активации фермента как в физиологических, так и в некоторых патологических состо ни х, что вл етс чрезвычайно важным моментом в расшифровке проблем молекул рной биологии. Таблица 1

Фермент не

Фермент не вы вл етс вы вл етс

Слаба

Слаба реакци реакци вы влени вы влени фермента фермента

Слаба

Слаба реакреакци ци вы влени ферменвы влени фермента та

Реакци

Оптимальна неравнореакци мерна вы влени фермента

13

80

1Г

13

80

Г1Г80

13

IV 80

13

80

13

VI 80

8%

80

1Г80

8%

Таблица 2

0,5 ОД

Фермент не вы вл етс

0,3

Оптимальна реакци дл клеток сердца и легких

0,50,5

Слаба реакци во всех органах

0,1

Оптимальна реакци дл клеток тонкого каучука, поджелудочной железы, печени

0,1 0,3

Слаба реакци во всех органах

Фермент не

0,1 0,5 вы вл етс

Таблица 3

0,5

Нет

0,5 0,1

Оптималь0 ,3 на реак- ци дл клетоЛ сердца и легких

ГП 80

0,5 0,5

8%

IV 80

8%

0,1 0,1

8%

0,3 0,3

80

8%

0,5 0,5

Claims

vr 80 Формула изобретени Способ вы влени распределени гуанилатциклазы в ткан х, о т л ичающ-ийс тем, что, с целью вышени точности способа и упрощени его, ткани инкубируют при темпе ратуре 30-34С в течение 50-55 мин в среде, содержащей 80 мМ трисмалеатного буфера, 13-14 мМ клюкозы, 1-2 мМ теофиллина, 0,1-0,5 мМ ГТФ

Продолжение табл. 3.

Слаба реакци во всех органах

Оптимальна реакци дл клеток пищеварительной системы

Слаба реакци во всех органах

Нет и 4 мМ Ba(NOj)i3 затем из обезвоживают , заливают в эпоксидную смолу и провод т электронную микроскопию. Источники информации прин тые во внимание при э кспертизе 1. Schultz G., Hardman J.G, et а 1 I A new enzymattc assay for guanosine 3,5-cyeIic monophosphate and its application to the ductus referens of the rat. Proc. Nat 1 . Acad, Sci. USA. 1973, T. 70, 6, c. 1721-1725.