JP2001149081A - 脱アセチル化酵素の活性測定方法、並びにこれら酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法 - Google Patents
脱アセチル化酵素の活性測定方法、並びにこれら酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ペプチドのアセチル化レベルを簡便に評価でき
る方法の提供を課題とする。更に、この方法に基づく酵
素活性測定や、酵素阻害剤のスクリーニング方法の提供
を課題とする。 【解決手段】アセチル化レベルの変化が、基質ペプチド
のペプチダーゼ感受性に反映されることを利用し、ペプ
チドのアセチル化レベルを判定する。この方法は、脱ア
セチル化酵素や、アセチル化酵素の活性測定に利用でき
る。更にこれらの酵素活性に影響を与える物質のスクリ
ーニングが可能である。本発明により、脱アセチル化酵
素活性を、簡便に測定できる。
る方法の提供を課題とする。更に、この方法に基づく酵
素活性測定や、酵素阻害剤のスクリーニング方法の提供
を課題とする。 【解決手段】アセチル化レベルの変化が、基質ペプチド
のペプチダーゼ感受性に反映されることを利用し、ペプ
チドのアセチル化レベルを判定する。この方法は、脱ア
セチル化酵素や、アセチル化酵素の活性測定に利用でき
る。更にこれらの酵素活性に影響を与える物質のスクリ
ーニングが可能である。本発明により、脱アセチル化酵
素活性を、簡便に測定できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、簡便にアセチル化
酵素活性、および脱アセチル化酵素活性を測定する方
法、簡便にアセチル化酵素、および脱アセチル化酵素の
阻害剤もしくは促進剤をスクリーニングする方法、並び
にこれら測定およびスクリーニングのためのキットに関
する。
酵素活性、および脱アセチル化酵素活性を測定する方
法、簡便にアセチル化酵素、および脱アセチル化酵素の
阻害剤もしくは促進剤をスクリーニングする方法、並び
にこれら測定およびスクリーニングのためのキットに関
する。
【０００２】
【従来の技術】近年、リン酸化、アセチル化、脂質や糖
鎖修飾に関連する修飾基転移酵素、脱修飾化酵素、ある
いはそれらの基質となる機能性タンパク質は、抗癌剤や
抗菌・抗生物質などの新薬開発の標的として注目されて
いる。中でもヒストン脱アセチル化酵素は新たな抗癌剤
の標的として有力な候補である。今までに酪酸ナトリウ
ム、トリコスタチンA 、トラポキシンなどの薬剤がヒス
トン脱アセチル化酵素の阻害剤であることが報告されて
いる。これらの阻害剤はそもそも抗真菌抗生物質とし
て、または v-sis-トランスフォーム細胞の形態正常化
物質として見いだされた。(Taunton, J. et al., Scien
ce Vol.272, 408-411, 1996; Yoshida, M. et al., J.
Biol. Chem. Vol.265, 17174-17179, 1990)。その後の
研究により、これらの薬剤の標的がヒストン脱アセチル
化酵素であることが判明した。また、次のような強力な
抗腫瘍活性を持つヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が知
られている。 FR901228（藤沢製薬） MS275（三井製薬） しかしながら、これらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤
はCdk阻害タンパク質であるp21CIPの発現を誘導するこ
と以外、制癌作用を発揮する詳細な機構は現在のところ
明らかにされていない。
鎖修飾に関連する修飾基転移酵素、脱修飾化酵素、ある
いはそれらの基質となる機能性タンパク質は、抗癌剤や
抗菌・抗生物質などの新薬開発の標的として注目されて
いる。中でもヒストン脱アセチル化酵素は新たな抗癌剤
の標的として有力な候補である。今までに酪酸ナトリウ
ム、トリコスタチンA 、トラポキシンなどの薬剤がヒス
トン脱アセチル化酵素の阻害剤であることが報告されて
いる。これらの阻害剤はそもそも抗真菌抗生物質とし
て、または v-sis-トランスフォーム細胞の形態正常化
物質として見いだされた。(Taunton, J. et al., Scien
ce Vol.272, 408-411, 1996; Yoshida, M. et al., J.
Biol. Chem. Vol.265, 17174-17179, 1990)。その後の
研究により、これらの薬剤の標的がヒストン脱アセチル
化酵素であることが判明した。また、次のような強力な
抗腫瘍活性を持つヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が知
られている。 FR901228（藤沢製薬） MS275（三井製薬） しかしながら、これらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤
はCdk阻害タンパク質であるp21CIPの発現を誘導するこ
と以外、制癌作用を発揮する詳細な機構は現在のところ
明らかにされていない。
【０００３】ヒストン脱アセチル化酵素は、ヌクレオソ
ーム構造を変化させることにより、様々な遺伝子の発現
を調節する重要な働きをしている(Davie, J. R and Cha
dee,D. N. J. Cell Biochem. (Suppl.) 30-31, 203-21
3, 1998)。またヒストン脱アセチル化酵素は細胞周期の
進行、分化に関与しており、この調節が崩れることがあ
る種の癌と関連していることが報告されている(Kouzari
des, T. Curr. Opin.Genet. Dev. Vol.9, 40-84, 1999;
Fenrick, R. and Hiebert, S. W. J. Cell Biochem.
(Suppl.) 30-31, 194-202, 1998)。一方、トリコスタチ
ンA (TSA) やスベロイラニリド・ハイドロザミック酸
(SAHA) などのヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤が抗
腫瘍効果を有することも公知である。その他にも、ヒス
トン脱アセチル化酵素の阻害剤には次のような作用が報
告されている。 細胞増殖の阻害(Yoshida, M. et al., Bioassays Vol.1
7, 423-430, 1995; Richon, V. M. et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA Vol.93, 5705-5708, 1996; Richon, V.
M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.95 3003
-3007, 1998)、 最終分化の誘導(Yoshida, M., et al., Bioassays Vol.
17, 423-430, 1995; Richon, V. M. et al. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. Vol.93, 5705-5708, 1996)、 マウスモデルにおける腫瘍の増大を抑えること(Cohen,
L. et al. Proc. AACR Vol.39, 108, abstr. 736, 199
8; Desai, D. et al., Proc. AACR Vol.40, 2396,abst
r. 362, 1999)、 急性前骨髄性白血病の治療に効果的であること(Fenric
k, R. and Hiebert, S.W.J. Cell Biochem. (Suppl.) 3
0-31, 194-202, 1998) このようにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は新規抗癌
剤として期待されており、更に抗菌物質しての可能性も
考えられている。今後、さらに同様の作用を有する物質
の探索の一つとしてヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤
のスクリーニングが行われるものと考えられる。
ーム構造を変化させることにより、様々な遺伝子の発現
を調節する重要な働きをしている(Davie, J. R and Cha
dee,D. N. J. Cell Biochem. (Suppl.) 30-31, 203-21
3, 1998)。またヒストン脱アセチル化酵素は細胞周期の
進行、分化に関与しており、この調節が崩れることがあ
る種の癌と関連していることが報告されている(Kouzari
des, T. Curr. Opin.Genet. Dev. Vol.9, 40-84, 1999;
Fenrick, R. and Hiebert, S. W. J. Cell Biochem.
(Suppl.) 30-31, 194-202, 1998)。一方、トリコスタチ
ンA (TSA) やスベロイラニリド・ハイドロザミック酸
(SAHA) などのヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤が抗
腫瘍効果を有することも公知である。その他にも、ヒス
トン脱アセチル化酵素の阻害剤には次のような作用が報
告されている。 細胞増殖の阻害(Yoshida, M. et al., Bioassays Vol.1
7, 423-430, 1995; Richon, V. M. et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA Vol.93, 5705-5708, 1996; Richon, V.
M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.95 3003
-3007, 1998)、 最終分化の誘導(Yoshida, M., et al., Bioassays Vol.
17, 423-430, 1995; Richon, V. M. et al. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. Vol.93, 5705-5708, 1996)、 マウスモデルにおける腫瘍の増大を抑えること(Cohen,
L. et al. Proc. AACR Vol.39, 108, abstr. 736, 199
8; Desai, D. et al., Proc. AACR Vol.40, 2396,abst
r. 362, 1999)、 急性前骨髄性白血病の治療に効果的であること(Fenric
k, R. and Hiebert, S.W.J. Cell Biochem. (Suppl.) 3
0-31, 194-202, 1998) このようにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は新規抗癌
剤として期待されており、更に抗菌物質しての可能性も
考えられている。今後、さらに同様の作用を有する物質
の探索の一つとしてヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤
のスクリーニングが行われるものと考えられる。
【０００４】しかしながら、既存のヒストン脱アセチル
化酵素活性の測定方法は非常に煩雑である。すなわち、
公知の測定方法においてはまず、培養細胞の培地中に、
放射能標識された酢酸を添加し、細胞のヒストンを代謝
的に放射能標識する。この細胞より精製したヒストンに
脱アセチル化酵素を作用させる。反応後、酢酸エチルを
用いて、ヒストンより遊離した放射能標識アセチル基を
抽出して、その放射活性に基づいて酵素活性を測定す
る。(Laherty, C. D. et al Cell Vol.89, 349-356, 19
97; Hassig, C. et al Cell Vol.89, 341-347, 1997)。
化酵素活性の測定方法は非常に煩雑である。すなわち、
公知の測定方法においてはまず、培養細胞の培地中に、
放射能標識された酢酸を添加し、細胞のヒストンを代謝
的に放射能標識する。この細胞より精製したヒストンに
脱アセチル化酵素を作用させる。反応後、酢酸エチルを
用いて、ヒストンより遊離した放射能標識アセチル基を
抽出して、その放射活性に基づいて酵素活性を測定す
る。(Laherty, C. D. et al Cell Vol.89, 349-356, 19
97; Hassig, C. et al Cell Vol.89, 341-347, 1997)。
【０００５】また、放射性物質を用いない脱アセチル化
酵素活性の測定方法も報告されている。この方法では基
質として蛍光物質で標識したアセチル化リジンを用いる
ため、反応精製物を逆相HPLC で分離して測定する必要
がある(Hoffmann, K. et al.,Nucleic Acids Res. Vol.
27, 2057-2058, 1999)。また本発明者は、放射性物質を
用いない方法として、アセチル化したペプチドに特異的
に結合する抗体を利用した、脱アセチル化酵素活性を検
出する方法を特許出願している（特願平10-9171）。こ
の方法を用いてELISAにより脱アセチル化酵素活性を検
出する場合には、B/F分離が必要なことから、処理ステ
ップが多く、連続した活性測定は難しい。以上のよう
に、公知の測定方法は操作が煩雑なため、多くのサンプ
ルの処理や、多様な条件下での実験が困難である。新薬
開発などの大規模なスクリーニングを容易とするために
は、放射性同位体を使わず且つ簡便な系が求められてい
た。
酵素活性の測定方法も報告されている。この方法では基
質として蛍光物質で標識したアセチル化リジンを用いる
ため、反応精製物を逆相HPLC で分離して測定する必要
がある(Hoffmann, K. et al.,Nucleic Acids Res. Vol.
27, 2057-2058, 1999)。また本発明者は、放射性物質を
用いない方法として、アセチル化したペプチドに特異的
に結合する抗体を利用した、脱アセチル化酵素活性を検
出する方法を特許出願している（特願平10-9171）。こ
の方法を用いてELISAにより脱アセチル化酵素活性を検
出する場合には、B/F分離が必要なことから、処理ステ
ップが多く、連続した活性測定は難しい。以上のよう
に、公知の測定方法は操作が煩雑なため、多くのサンプ
ルの処理や、多様な条件下での実験が困難である。新薬
開発などの大規模なスクリーニングを容易とするために
は、放射性同位体を使わず且つ簡便な系が求められてい
た。
【０００６】近年、完全自動化のもとで医薬品の種子と
なる有機化合物を連続的に合成することを可能にしたコ
ンビナトリアルケミカルライブラリーシステムの開発、
導入に伴い、より高速に化合物からのスクリーニングを
おこなえるシステムが開発されている。このシステムは
天然素材から抽出された有機化合物から構成される既存
のケミカルライブラリーとは全く異なり、理論的には無
限に新規の有機化合物を作り出すことが可能となった。
現在、世界の大手製薬企業はこぞってこの革新的なシス
テムの導入を推し進めている。その結果、膨大な数の候
補化合物が産み出される状況となった。そのため、医薬
品に繋がる有用な物質を今まで以上に高い効率で探索し
なければならず、より簡便な測定方法の需要が高まって
いる。しかし、既存の測定方法は非常に煩雑なものが多
く、大きな経済的負担が必要とされてきた。
なる有機化合物を連続的に合成することを可能にしたコ
ンビナトリアルケミカルライブラリーシステムの開発、
導入に伴い、より高速に化合物からのスクリーニングを
おこなえるシステムが開発されている。このシステムは
天然素材から抽出された有機化合物から構成される既存
のケミカルライブラリーとは全く異なり、理論的には無
限に新規の有機化合物を作り出すことが可能となった。
現在、世界の大手製薬企業はこぞってこの革新的なシス
テムの導入を推し進めている。その結果、膨大な数の候
補化合物が産み出される状況となった。そのため、医薬
品に繋がる有用な物質を今まで以上に高い効率で探索し
なければならず、より簡便な測定方法の需要が高まって
いる。しかし、既存の測定方法は非常に煩雑なものが多
く、大きな経済的負担が必要とされてきた。
【０００７】スクリーニング方法の一例として、バイデ
ィングアッセイシステムが上げられる。このシステム
は、化合物が酵素などのタンパク質とその基質である低
分子や結合タンパク質の会合に与える影響を測定するシ
ステムである。バイディングアッセイシステムは確かに
スクリーニングの速度的問題に対するひとつの方向を示
しはした。しかし、基本的に放射能標識された基質を使
用することやシステム自体の導入に非常に莫大な投資が
必要である。また、原理的に、分子間の会合を指標とし
ているので、酵素反応の阻害活性のレベルを評価するこ
とはできない。更に、しばしば放射性同位体を使用する
ため、放射性廃棄物を伴う。従って、脱アセチル化酵素
の活性を制御する化合物を容易にスクリーニングするこ
とができる方法の提供が求められている。
ィングアッセイシステムが上げられる。このシステム
は、化合物が酵素などのタンパク質とその基質である低
分子や結合タンパク質の会合に与える影響を測定するシ
ステムである。バイディングアッセイシステムは確かに
スクリーニングの速度的問題に対するひとつの方向を示
しはした。しかし、基本的に放射能標識された基質を使
用することやシステム自体の導入に非常に莫大な投資が
必要である。また、原理的に、分子間の会合を指標とし
ているので、酵素反応の阻害活性のレベルを評価するこ
とはできない。更に、しばしば放射性同位体を使用する
ため、放射性廃棄物を伴う。従って、脱アセチル化酵素
の活性を制御する化合物を容易にスクリーニングするこ
とができる方法の提供が求められている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、基質ペプチ
ドのアセチル化レベルを簡便に評価することができる方
法の提供を課題とする。また本発明は、この方法に基づ
いて、脱アセチル化酵素活性、あるいはアセチル化酵素
活性の測定方法を提供することを課題とする。更に本発
明は、これら活性測定方法に基づくスクリーニング方
法、並びにこれら測定方法およびスクリーニング方法の
ためのキットを提供することを課題とする。
ドのアセチル化レベルを簡便に評価することができる方
法の提供を課題とする。また本発明は、この方法に基づ
いて、脱アセチル化酵素活性、あるいはアセチル化酵素
活性の測定方法を提供することを課題とする。更に本発
明は、これら活性測定方法に基づくスクリーニング方
法、並びにこれら測定方法およびスクリーニング方法の
ためのキットを提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、基質ペプ
チドのアセチル化レベルを評価する方法として、ペプチ
ドの酵素感受性を利用できるのではないかと考えた。そ
して上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、あ
る種のペプチダーゼは、基質ペプチドがアセチル化され
ている場合には、この基質ペプチドを切断しないか、も
しくは切断活性が有意に低下することを確認した。本発
明者らはこの現象を、脱アセチル化酵素活性およびアセ
チル化酵素活性の検出に利用できることを見出して本発
明を完成した。
チドのアセチル化レベルを評価する方法として、ペプチ
ドの酵素感受性を利用できるのではないかと考えた。そ
して上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、あ
る種のペプチダーゼは、基質ペプチドがアセチル化され
ている場合には、この基質ペプチドを切断しないか、も
しくは切断活性が有意に低下することを確認した。本発
明者らはこの現象を、脱アセチル化酵素活性およびアセ
チル化酵素活性の検出に利用できることを見出して本発
明を完成した。
【００１０】すなわち本発明は、次のペプチドのアセチ
ル化レベル判定方法に関する。更に本発明は、この方法
に基づくアセチル化酵素、または脱アセチル化酵素活性
の測定方法、並びにこれらの酵素活性に影響を与える化
合物のスクリーニング方法に関する。 〔１〕ペプチドのアセチル化のレベルを判定する方法に
おいて、アセチル化のレベルの変化が、該ペプチドを基
質とするペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検
出されることを特徴とする方法。 〔２〕次の工程を含む脱アセチル化酵素活性、またはア
セチル化酵素活性の測定方法。 (a)基質ペプチドと試料とを、脱アセチル化酵素による
脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペプチド
と試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応に必要
な条件下で接触させる工程、(b)〔１〕に記載の方法に
よって基質ペプチドのアセチル化レベルの変化を判定す
る工程 〔３〕脱アセチル化酵素が、リジン残基のεアミノ基に
導入されたアセチル基に作用するものである〔２〕に記
載の方法。 〔４〕脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル化酵素
である〔３〕に記載の方法。 〔５〕ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼ、エ
ンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、
メタロエンドペプチダーゼ、およびナラタケ(Armillari
a mellea)プロテアーゼからなる群から選択される少な
くとも１種のペプチダーゼである〔１〕に記載の方法。 〔６〕基質ペプチドが、該ペプチドの切断によりシグナ
ルレベルが変化する物質により標識されており、ペプチ
ダーゼによって切断されてシグナルを生成する〔５〕に
記載の方法。 〔７〕基質ペプチドが、色素標識されており、ペプチダ
ーゼによって切断されてシグナルを生成する〔６〕に記
載の方法。 〔８〕色素標識が蛍光物質標識であり、シグナルが蛍光
シグナルである〔７〕に記載の方法。
ル化レベル判定方法に関する。更に本発明は、この方法
に基づくアセチル化酵素、または脱アセチル化酵素活性
の測定方法、並びにこれらの酵素活性に影響を与える化
合物のスクリーニング方法に関する。 〔１〕ペプチドのアセチル化のレベルを判定する方法に
おいて、アセチル化のレベルの変化が、該ペプチドを基
質とするペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検
出されることを特徴とする方法。 〔２〕次の工程を含む脱アセチル化酵素活性、またはア
セチル化酵素活性の測定方法。 (a)基質ペプチドと試料とを、脱アセチル化酵素による
脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペプチド
と試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応に必要
な条件下で接触させる工程、(b)〔１〕に記載の方法に
よって基質ペプチドのアセチル化レベルの変化を判定す
る工程 〔３〕脱アセチル化酵素が、リジン残基のεアミノ基に
導入されたアセチル基に作用するものである〔２〕に記
載の方法。 〔４〕脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル化酵素
である〔３〕に記載の方法。 〔５〕ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼ、エ
ンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、
メタロエンドペプチダーゼ、およびナラタケ(Armillari
a mellea)プロテアーゼからなる群から選択される少な
くとも１種のペプチダーゼである〔１〕に記載の方法。 〔６〕基質ペプチドが、該ペプチドの切断によりシグナ
ルレベルが変化する物質により標識されており、ペプチ
ダーゼによって切断されてシグナルを生成する〔５〕に
記載の方法。 〔７〕基質ペプチドが、色素標識されており、ペプチダ
ーゼによって切断されてシグナルを生成する〔６〕に記
載の方法。 〔８〕色素標識が蛍光物質標識であり、シグナルが蛍光
シグナルである〔７〕に記載の方法。
〔９〕基質ペプチドがアセチル化したリジンを含む
〔５〕に記載の方法。 〔１０〕ペプチダーゼがリジルエンドペプチダーゼであ
る
〔５〕に記載の方法。 〔１０〕ペプチダーゼがリジルエンドペプチダーゼであ
る
〔９〕に記載の方法。 〔１１〕次の要素を含む、アセチル化酵素活性または脱
アセチル化酵素活性の測定用試薬キット。 (a)基質ペプチド (b)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切
断活性が変化するペプチダーゼ 〔１２〕次の工程を含む脱アセチル化酵素活性を阻害も
しくは促進する化合物のスクリーニング方法において、
基質ペプチドのアセチル化レベルの変化が基質ペプチド
のアセチル化に伴うペプチダーゼの切断活性の変化を指
標として検出されることを特徴とする方法。 (a)アセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化
酵素とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必
要な条件下で接触させる工程、(b)基質ペプチドのアセ
チル化レベルの変化を検出する工程、(c)被検化合物の
非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較し
て、基質の脱アセチル化のレベルを低下もしくは上昇さ
せる化合物を選択する工程 〔１３〕次の要素を含む、脱アセチル化酵素活性を阻害
もしくは促進する化合物のスクリーニングのための試薬
キット。 (a)基質ペプチド (b)脱アセチル化酵素 (c)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切
断活性が変化するペプチダーゼ 〔１４〕ペプチドのアセチル化レベルを変化させる酵素
活性測定用のペプチド基質であって、前記酵素によって
アセチル化または脱アセチル化されるアミノ酸残基を含
み、かつこのアミノ酸残基のアセチル化のレベルによっ
てペプチダーゼの感受性が変化することを特徴とするペ
プチド基質。
アセチル化酵素活性の測定用試薬キット。 (a)基質ペプチド (b)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切
断活性が変化するペプチダーゼ 〔１２〕次の工程を含む脱アセチル化酵素活性を阻害も
しくは促進する化合物のスクリーニング方法において、
基質ペプチドのアセチル化レベルの変化が基質ペプチド
のアセチル化に伴うペプチダーゼの切断活性の変化を指
標として検出されることを特徴とする方法。 (a)アセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化
酵素とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必
要な条件下で接触させる工程、(b)基質ペプチドのアセ
チル化レベルの変化を検出する工程、(c)被検化合物の
非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較し
て、基質の脱アセチル化のレベルを低下もしくは上昇さ
せる化合物を選択する工程 〔１３〕次の要素を含む、脱アセチル化酵素活性を阻害
もしくは促進する化合物のスクリーニングのための試薬
キット。 (a)基質ペプチド (b)脱アセチル化酵素 (c)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切
断活性が変化するペプチダーゼ 〔１４〕ペプチドのアセチル化レベルを変化させる酵素
活性測定用のペプチド基質であって、前記酵素によって
アセチル化または脱アセチル化されるアミノ酸残基を含
み、かつこのアミノ酸残基のアセチル化のレベルによっ
てペプチダーゼの感受性が変化することを特徴とするペ
プチド基質。
【００１１】本発明において「ペプチド」とは、2個以
上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を指
し、その鎖長は問わない。従って、本発明において、
「アセチル化酵素」とは、アセチル基(CH3CO-)をある物
質（例えば、アセチルCoA）からペプチドに転移させる
反応を触媒する酵素を指す。「脱アセチル化酵素」と
は、アセチル化されたペプチドからアセチル基を遊離さ
せる酵素を指す。また、本発明において「ペプチダー
ゼ」とは、ペプチドを基質とするペプチド結合加水分解
酵素を指す。一般に「ペプチダーゼ」という場合は、比
較的低分子量ぺプチド基質に作用する酵素を指すことも
あるが、本発明における「ペプチダーゼ」とは、基質ペ
プチドの分子量に関わらず、タンパク質を含むペプチド
群に作用する酵素を意味する。従って、いわゆる「タン
パク質分解酵素」、「プロテアーゼ(protease)」、「プ
ロテイナーゼ(proteinase)」、「ペプチドヒドロラーゼ
(peptidehydrolase)」はいずれも、本発明の「ペプチダ
ーゼ」に含まれる。本発明の「ペプチド切断活性」と
は、基質となるペプチド中のペプチド結合を、加水分解
する活性を意味する。
上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を指
し、その鎖長は問わない。従って、本発明において、
「アセチル化酵素」とは、アセチル基(CH3CO-)をある物
質（例えば、アセチルCoA）からペプチドに転移させる
反応を触媒する酵素を指す。「脱アセチル化酵素」と
は、アセチル化されたペプチドからアセチル基を遊離さ
せる酵素を指す。また、本発明において「ペプチダー
ゼ」とは、ペプチドを基質とするペプチド結合加水分解
酵素を指す。一般に「ペプチダーゼ」という場合は、比
較的低分子量ぺプチド基質に作用する酵素を指すことも
あるが、本発明における「ペプチダーゼ」とは、基質ペ
プチドの分子量に関わらず、タンパク質を含むペプチド
群に作用する酵素を意味する。従って、いわゆる「タン
パク質分解酵素」、「プロテアーゼ(protease)」、「プ
ロテイナーゼ(proteinase)」、「ペプチドヒドロラーゼ
(peptidehydrolase)」はいずれも、本発明の「ペプチダ
ーゼ」に含まれる。本発明の「ペプチド切断活性」と
は、基質となるペプチド中のペプチド結合を、加水分解
する活性を意味する。
【００１２】また、本明細書において、下記に示す略語
を用いた。 DMSO: Dimethyl Sulfoxide AFC: 7-Amino-4-Trifluoromethyl Coumarin p-NA: para-nitroaniline (Ac)Lys: Nε-Acetyl Lysine（ε-アセチル化リジン） Boc: t-Butyloxycarbonyl residue MCA:α-(4-Methyl-Coumaryl-7-Amide) AMC: 7-Amino-4-Methyl-Coumarin MOAc-Arg-Pro-Gly-Leu-(Ac)Lys-Pro-Lys(Dnp)-NH2 : (M
ethyloxycoumarin-4-ly)acetyl-L-Arginyl-L-Prolyl-L-
Glycyl-L-Leucyl-Nε-Acetyl-L-Lysyl-Prolyl -N ε -
(2,4-Dinitrophenyl)-L-Lysine Amide MOAc-Leu-Pro-(Ac)Lys-Leu-A2pr(Dnp) -Pro-Arg-NH2 :
(Methyloxycoumarin-4-ly) acetyl-L-Leucyl-L-Prolyl-
Nε-Acetyl-L-Lysil-[N3-(2,4-Dinitrophenyl)-L-2,3-D
iaminopropionyl]- L-Prolyl-L-Arginine Amide
を用いた。 DMSO: Dimethyl Sulfoxide AFC: 7-Amino-4-Trifluoromethyl Coumarin p-NA: para-nitroaniline (Ac)Lys: Nε-Acetyl Lysine（ε-アセチル化リジン） Boc: t-Butyloxycarbonyl residue MCA:α-(4-Methyl-Coumaryl-7-Amide) AMC: 7-Amino-4-Methyl-Coumarin MOAc-Arg-Pro-Gly-Leu-(Ac)Lys-Pro-Lys(Dnp)-NH2 : (M
ethyloxycoumarin-4-ly)acetyl-L-Arginyl-L-Prolyl-L-
Glycyl-L-Leucyl-Nε-Acetyl-L-Lysyl-Prolyl -N ε -
(2,4-Dinitrophenyl)-L-Lysine Amide MOAc-Leu-Pro-(Ac)Lys-Leu-A2pr(Dnp) -Pro-Arg-NH2 :
(Methyloxycoumarin-4-ly) acetyl-L-Leucyl-L-Prolyl-
Nε-Acetyl-L-Lysil-[N3-(2,4-Dinitrophenyl)-L-2,3-D
iaminopropionyl]- L-Prolyl-L-Arginine Amide
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は第一に、ペプチドのアセ
チル化のレベルの変化が、該ペプチドを基質とするペプ
チダーゼの切断活性の変化を指標として検出されること
を特徴とする、ペプチドのアセチル化レベルを判定する
方法に関する。また本発明のアセチル化レベルの判定方
法は、あるアセチル化酵素のアセチル化酵素活性、およ
び脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性の測定に利
用することができる。すなわち本発明は、ペプチダーゼ
の切断活性の変化を指標として、アセチル化レベルを判
定する方法を利用した、脱アセチル化酵素活性、および
アセチル化酵素活性の測定方法に関する。本発明の脱ア
セチル化酵素活性、またはアセチル化酵素活性の測定方
法は、（ａ）基質ペプチドと試料とを脱アセチル化酵素
による脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペ
プチドと試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応
に必要な条件下で接触させる工程、（ｂ）基質ペプチド
のアセチル化のレベルを判定する工程、を含む。
チル化のレベルの変化が、該ペプチドを基質とするペプ
チダーゼの切断活性の変化を指標として検出されること
を特徴とする、ペプチドのアセチル化レベルを判定する
方法に関する。また本発明のアセチル化レベルの判定方
法は、あるアセチル化酵素のアセチル化酵素活性、およ
び脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性の測定に利
用することができる。すなわち本発明は、ペプチダーゼ
の切断活性の変化を指標として、アセチル化レベルを判
定する方法を利用した、脱アセチル化酵素活性、および
アセチル化酵素活性の測定方法に関する。本発明の脱ア
セチル化酵素活性、またはアセチル化酵素活性の測定方
法は、（ａ）基質ペプチドと試料とを脱アセチル化酵素
による脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペ
プチドと試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応
に必要な条件下で接触させる工程、（ｂ）基質ペプチド
のアセチル化のレベルを判定する工程、を含む。
【００１４】本発明で使用するペプチダーゼは、基質と
なるペプチドのアセチル化レベルの変化により、ペプチ
ド切断活性が変化するような酵素を使用する。ペプチド
のアセチル化レベルの変化を、ペプチダーゼ感受性の変
化を指標として評価できることは、本発明者らが見出し
た新規な知見である。
なるペプチドのアセチル化レベルの変化により、ペプチ
ド切断活性が変化するような酵素を使用する。ペプチド
のアセチル化レベルの変化を、ペプチダーゼ感受性の変
化を指標として評価できることは、本発明者らが見出し
た新規な知見である。
【００１５】本発明に用いることができるペプチダーゼ
としては例えば、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプ
ロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、および
トリプシン等が挙げられる。これらのペプチダーゼは、
基質ペプチド中のリジン残基のεアミノ基がアセチル化
されている場合には、この基質ペプチドを切断しないか
もしくは切断活性が有意に低下する。中でもリシルエン
ドペプチダーゼは、安定性に優れる酵素であることから
本発明における望ましいペプチダーゼの一つである。リ
シルエンドペプチダーゼは、リジン残基のC末端側を切
断するペプチダーゼで、その切断活性はリジン残基のア
セチル化によって有意に低下する。
としては例えば、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプ
ロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、および
トリプシン等が挙げられる。これらのペプチダーゼは、
基質ペプチド中のリジン残基のεアミノ基がアセチル化
されている場合には、この基質ペプチドを切断しないか
もしくは切断活性が有意に低下する。中でもリシルエン
ドペプチダーゼは、安定性に優れる酵素であることから
本発明における望ましいペプチダーゼの一つである。リ
シルエンドペプチダーゼは、リジン残基のC末端側を切
断するペプチダーゼで、その切断活性はリジン残基のア
セチル化によって有意に低下する。
【００１６】前記ペプチダーゼの切断活性の変化を検出
する手段としては、基質ペプチドが、該ペプチドの切断
によりシグナルレベルが変化する物質により標識されて
おり、ペプチダーゼによって切断されて発生するシグナ
ルの変化を測定する方法が挙げられる。具体的には、例
えばペプチドと結合した状態と結合していない状態とで
蛍光波長が異なるような蛍光物質により基質ペプチドを
標識し、蛍光強度測定機を用いて、蛍光強度の変化を測
定することができる。この他に、基質ペプチドの切断を
検出する方法として、高速液体クロマトグラフィー(HPL
C)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、あるいは質量分析
計で得られるマススペクトラム等を用いた検出系を挙げ
ることができる。
する手段としては、基質ペプチドが、該ペプチドの切断
によりシグナルレベルが変化する物質により標識されて
おり、ペプチダーゼによって切断されて発生するシグナ
ルの変化を測定する方法が挙げられる。具体的には、例
えばペプチドと結合した状態と結合していない状態とで
蛍光波長が異なるような蛍光物質により基質ペプチドを
標識し、蛍光強度測定機を用いて、蛍光強度の変化を測
定することができる。この他に、基質ペプチドの切断を
検出する方法として、高速液体クロマトグラフィー(HPL
C)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、あるいは質量分析
計で得られるマススペクトラム等を用いた検出系を挙げ
ることができる。
【００１７】本発明の測定方法によって、脱アセチル化
酵素を測定する場合には、基質ペプチドとして予めアセ
チル化されたアミノ酸を含むペプチドを用いる。例え
ば、ヒストン脱アセチル化酵素は、リジン残基がアセチ
ル化したペプチドからアセチル基を遊離させる反応を触
媒する酵素であることが知られている。従って、脱アセ
チル化酵素としてヒストン脱アセチル化酵素を測定対象
とする場合には、εアミノ基がアセチル化されたリジン
残基を有するペプチドを用いる。本発明で使用する基質
ペプチドは、ペプチダーゼが切断するためのペプチド結
合を有し、その切断活性が基質ペプチドのアセチル化レ
ベルを反映しうるものであれば、その構造は限定されな
い。該基質ペプチドは、天然のもの、遺伝子組換え技術
を利用して調製されたもの、合成ペプチドのいずれであ
ってもよい。ペプチドの精製を容易にするなどの目的
で、他のペプチド（例えば、グルタチオン-S-トランス
フェラーゼ）と融合されていてもよい。更に、脱アセチ
ル化酵素（またはアセチル化酵素）と、ペプチダーゼの
基質として機能するものであれば、アミノ酸以外の構造
を含むこともできる。
酵素を測定する場合には、基質ペプチドとして予めアセ
チル化されたアミノ酸を含むペプチドを用いる。例え
ば、ヒストン脱アセチル化酵素は、リジン残基がアセチ
ル化したペプチドからアセチル基を遊離させる反応を触
媒する酵素であることが知られている。従って、脱アセ
チル化酵素としてヒストン脱アセチル化酵素を測定対象
とする場合には、εアミノ基がアセチル化されたリジン
残基を有するペプチドを用いる。本発明で使用する基質
ペプチドは、ペプチダーゼが切断するためのペプチド結
合を有し、その切断活性が基質ペプチドのアセチル化レ
ベルを反映しうるものであれば、その構造は限定されな
い。該基質ペプチドは、天然のもの、遺伝子組換え技術
を利用して調製されたもの、合成ペプチドのいずれであ
ってもよい。ペプチドの精製を容易にするなどの目的
で、他のペプチド（例えば、グルタチオン-S-トランス
フェラーゼ）と融合されていてもよい。更に、脱アセチ
ル化酵素（またはアセチル化酵素）と、ペプチダーゼの
基質として機能するものであれば、アミノ酸以外の構造
を含むこともできる。
【００１８】本発明の基質ペプチドは、通常この分野に
おいて用いられる方法に従って合成することができる。
通常ペプチド合成は、目的とするアミノ酸配列の、カル
ボキシル末端側から、１アミノ酸ずつ結合さることによ
って行われる。あるいは、このようにして合成されたい
くつかのペプチド断片同士を結合させることもできる。
本発明における基質ペプチドは、脱アセチル化酵素の測
定やスクリーニングを行う場合には、予めアセチル化し
ておかなければならない。アミノ酸のアセチル化の方法
として、αアミノ基と側鎖のアミノ基を保護基でブロッ
クしてあるアミノ酸を、酢酸無水物やN-ヒドロキシスク
シンイミドアセテート等を用いてアセチル化する方法が
挙げられる。そしてこれらのアセチル化したアミノ酸を
用い、固相法によってアセチル化リジンを含むペプチド
を合成することができる。一般に、アセチル化ペプチド
は、ペプチド合成機を用いて、Fmoc法により合成するこ
とができる。たとえば商業的にペプチド合成サービスを
提供しているメーカーでは、任意のアミノ酸配列につい
て、任意の位置でアセチル化したペプチドの合成を行っ
ている。
おいて用いられる方法に従って合成することができる。
通常ペプチド合成は、目的とするアミノ酸配列の、カル
ボキシル末端側から、１アミノ酸ずつ結合さることによ
って行われる。あるいは、このようにして合成されたい
くつかのペプチド断片同士を結合させることもできる。
本発明における基質ペプチドは、脱アセチル化酵素の測
定やスクリーニングを行う場合には、予めアセチル化し
ておかなければならない。アミノ酸のアセチル化の方法
として、αアミノ基と側鎖のアミノ基を保護基でブロッ
クしてあるアミノ酸を、酢酸無水物やN-ヒドロキシスク
シンイミドアセテート等を用いてアセチル化する方法が
挙げられる。そしてこれらのアセチル化したアミノ酸を
用い、固相法によってアセチル化リジンを含むペプチド
を合成することができる。一般に、アセチル化ペプチド
は、ペプチド合成機を用いて、Fmoc法により合成するこ
とができる。たとえば商業的にペプチド合成サービスを
提供しているメーカーでは、任意のアミノ酸配列につい
て、任意の位置でアセチル化したペプチドの合成を行っ
ている。
【００１９】脱アセチル化酵素の基質となるペプチドと
しては、蛍光物質で標識された以下のペプチドを例示す
ることができる。 Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCA Boc-Glu-Lys-(Ac)Lys-MCA BocはValおよびGluのNα位のアミノ基の保護基である。
MCAは蛍光物質であり、隣接するリジン残基のεアミノ
基がアセチル化されている。これらのペプチドはリジン
残基のカルボキシル末端側で切断が起こると、AMCを遊
離する。遊離したAMCの蛍光波長は、ペプチジル-MCAと
は異なるので、AMCによる蛍光強度の変化を指標とし
て、基質の切断量を測定することができる。具体的に
は、まず、アセチル化された基質ペプチドを被検脱アセ
チル化酵素と反応させる。その結果、リジン残基からア
セチル基が除去されると、上記のペプチダーゼにより、
基質が切断される。この切断量を上記の方法により測定
することにより、脱アセチル化酵素活性を測定すること
ができる。つまり、第一の反応として、リジン残基の脱
アセチル化、それに引き続く第二の反応として、タンパ
ク質分解反応（ペプチド結合の解裂反応）を行うことに
より、第一の反応のリジン残基の脱アセチル化量を第二
の反応のタンパク質分解量に変換することが可能となる
（化１）。
しては、蛍光物質で標識された以下のペプチドを例示す
ることができる。 Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCA Boc-Glu-Lys-(Ac)Lys-MCA BocはValおよびGluのNα位のアミノ基の保護基である。
MCAは蛍光物質であり、隣接するリジン残基のεアミノ
基がアセチル化されている。これらのペプチドはリジン
残基のカルボキシル末端側で切断が起こると、AMCを遊
離する。遊離したAMCの蛍光波長は、ペプチジル-MCAと
は異なるので、AMCによる蛍光強度の変化を指標とし
て、基質の切断量を測定することができる。具体的に
は、まず、アセチル化された基質ペプチドを被検脱アセ
チル化酵素と反応させる。その結果、リジン残基からア
セチル基が除去されると、上記のペプチダーゼにより、
基質が切断される。この切断量を上記の方法により測定
することにより、脱アセチル化酵素活性を測定すること
ができる。つまり、第一の反応として、リジン残基の脱
アセチル化、それに引き続く第二の反応として、タンパ
ク質分解反応（ペプチド結合の解裂反応）を行うことに
より、第一の反応のリジン残基の脱アセチル化量を第二
の反応のタンパク質分解量に変換することが可能となる
（化１）。
【００２０】
【化１】 （式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
【００２１】前記基質ペプチドBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MC
Aを使用した、ヒストン脱アセチル化酵素活性の測定手
順を、以下に示す。まず、基質ペプチドを反応バッファ
ーに添加し、蛍光測定用マイクロプレートに分注し、保
温する。次に、各ウェルにヒストン脱アセチル化酵素液
を添加し、一定時間、通常60分間、脱アセチル化反応さ
せる。ペプチダーゼ液、およびペプチダーゼ反応バッフ
ァーを各ウェルに添加し、マイクロプレート用蛍光リー
ダーで一定時間、通常150秒間、毎の蛍光強度を測定す
る。
Aを使用した、ヒストン脱アセチル化酵素活性の測定手
順を、以下に示す。まず、基質ペプチドを反応バッファ
ーに添加し、蛍光測定用マイクロプレートに分注し、保
温する。次に、各ウェルにヒストン脱アセチル化酵素液
を添加し、一定時間、通常60分間、脱アセチル化反応さ
せる。ペプチダーゼ液、およびペプチダーゼ反応バッフ
ァーを各ウェルに添加し、マイクロプレート用蛍光リー
ダーで一定時間、通常150秒間、毎の蛍光強度を測定す
る。
【００２２】蛍光物質標識ペプチドの例として、X-X-(A
c)Lys-MCAを例示したが、蛍光物質としては、基質とな
るペプチジル-蛍光物質と反応生成物である蛍光物質の
蛍光波長が異なれば、その他の蛍光物質、例えばAFC等
でもよい。また、予め蛍光物質の他に、基質ペプチドに
消光物質を結合させておき、基質ペプチドの切断によっ
て、蛍光を生じさせることも可能である（化２）。
c)Lys-MCAを例示したが、蛍光物質としては、基質とな
るペプチジル-蛍光物質と反応生成物である蛍光物質の
蛍光波長が異なれば、その他の蛍光物質、例えばAFC等
でもよい。また、予め蛍光物質の他に、基質ペプチドに
消光物質を結合させておき、基質ペプチドの切断によっ
て、蛍光を生じさせることも可能である（化２）。
【００２３】
【化２】 （式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
【００２４】この場合の蛍光物質としては、蛍光性を有
しかつ分子内の消光基によりその蛍光が消光される性質
を有するものであれば良い。具体例としては、MOAc、Nm
a (N-メチルアントラニル酸；N-methylanthranilic aci
d)等を挙げることができる。また、消光基としては、同
一ペプチドに存在する蛍光基による蛍光を消光する性質
があればよく、具体例としては、Dnp等を挙げられる。
この場合の基質としては、以下のペプチドを例示するこ
とができる。 MOAc-Arg-Pro-Gly-Leu-(Ac)Lys-Pro-Lys(Dnp)-NH2（配
列番号：１） MOAc-Leu-Pro-(Ac)Lys-Leu-A2pr(Dnp)-Pro-Arg-NH2（配
列番号：２） MOAcは蛍光物質、Dnpは消光物質であり、これらの間に
あるリジン残基がアセチル化されている。これらの基質
は、消光物質を含んでいるために、そのままでは蛍光強
度が低下しているが、ペプチダーゼによりリジン残基の
アミノ末端側で切断が起こると、蛍光強度が増加し、基
質ペプチドの切断量を測定することができる。
しかつ分子内の消光基によりその蛍光が消光される性質
を有するものであれば良い。具体例としては、MOAc、Nm
a (N-メチルアントラニル酸；N-methylanthranilic aci
d)等を挙げることができる。また、消光基としては、同
一ペプチドに存在する蛍光基による蛍光を消光する性質
があればよく、具体例としては、Dnp等を挙げられる。
この場合の基質としては、以下のペプチドを例示するこ
とができる。 MOAc-Arg-Pro-Gly-Leu-(Ac)Lys-Pro-Lys(Dnp)-NH2（配
列番号：１） MOAc-Leu-Pro-(Ac)Lys-Leu-A2pr(Dnp)-Pro-Arg-NH2（配
列番号：２） MOAcは蛍光物質、Dnpは消光物質であり、これらの間に
あるリジン残基がアセチル化されている。これらの基質
は、消光物質を含んでいるために、そのままでは蛍光強
度が低下しているが、ペプチダーゼによりリジン残基の
アミノ末端側で切断が起こると、蛍光強度が増加し、基
質ペプチドの切断量を測定することができる。
【００２５】さらには、基質ペプチドが切断されると吸
収特性が変わるような色素で標識することもできる。吸
収特性の変化は分光光度計によって検出することができ
る（化３）。この場合の基質ペプチドの例として、p-NA
色素で標識したペプチドX-X-(Ac)Lys-pNA等を挙げるこ
とができる。
収特性が変わるような色素で標識することもできる。吸
収特性の変化は分光光度計によって検出することができ
る（化３）。この場合の基質ペプチドの例として、p-NA
色素で標識したペプチドX-X-(Ac)Lys-pNA等を挙げるこ
とができる。
【００２６】
【化３】 （式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
【００２７】前記のペプチダーゼは、リジンのカルボキ
シル末端側で切断するものであるが、リジンのアミノ末
端側で切断するペプチダーゼを用いることもできる。こ
のようなペプチダーゼの例として、メタロエンドペプチ
ダーゼ、Armillaria melleaプロテアーゼ等が挙げられ
る。この場合に用いる基質ペプチドは、前記消光蛍光法
に用いられる蛍光物質標識基質ペプチドを用いる必要が
ある（化４）。
シル末端側で切断するものであるが、リジンのアミノ末
端側で切断するペプチダーゼを用いることもできる。こ
のようなペプチダーゼの例として、メタロエンドペプチ
ダーゼ、Armillaria melleaプロテアーゼ等が挙げられ
る。この場合に用いる基質ペプチドは、前記消光蛍光法
に用いられる蛍光物質標識基質ペプチドを用いる必要が
ある（化４）。
【００２８】
【化４】 （式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
【００２９】上記の蛍光物質、消光物質、および色素に
より、ペプチドを標識する方法は公知であり、通常用い
られる方法に従って行うことができる。
より、ペプチドを標識する方法は公知であり、通常用い
られる方法に従って行うことができる。
【００３０】本発明により、脱アセチル化活性の測定が
可能な脱アセチル化酵素の例としては、前記ヒストン脱
アセチル化酵素が挙げられる。
可能な脱アセチル化酵素の例としては、前記ヒストン脱
アセチル化酵素が挙げられる。
【００３１】アセチル化酵素活性の測定の場合も、上記
の脱アセチル化酵素活性の測定方法と同様にして測定す
ることができる。この場合は、基質としてリジン残基が
アセチル化していないペプチドを使用する。アセチル化
酵素と反応させた後、基質ペプチドに対するペプチダー
ゼの切断活性を測定する。リジンがアセチル化したペプ
チドは、ペプチダーゼの切断を受けないので、ペプチダ
ーゼの切断活性の変化から、アセチル化酵素の活性を測
定することが可能である。すなわち、脱アセチル化酵素
活性と、アセチル化酵素活性とは、基質ペプチドのアセ
チル化の有無のみが相違する。
の脱アセチル化酵素活性の測定方法と同様にして測定す
ることができる。この場合は、基質としてリジン残基が
アセチル化していないペプチドを使用する。アセチル化
酵素と反応させた後、基質ペプチドに対するペプチダー
ゼの切断活性を測定する。リジンがアセチル化したペプ
チドは、ペプチダーゼの切断を受けないので、ペプチダ
ーゼの切断活性の変化から、アセチル化酵素の活性を測
定することが可能である。すなわち、脱アセチル化酵素
活性と、アセチル化酵素活性とは、基質ペプチドのアセ
チル化の有無のみが相違する。
【００３２】本発明により、アセチル化酵素活性の測定
が可能なアセチル化酵素の例としては、GCN5、CBP/p30
0、Tip60、SRC1、AIB1、およびATCR等が挙げられる。
が可能なアセチル化酵素の例としては、GCN5、CBP/p30
0、Tip60、SRC1、AIB1、およびATCR等が挙げられる。
【００３３】本発明に使用する基質ペプチドは、予想さ
れる酵素活性に対して不足することが無いように過剰量
で用いるのが望ましい。具体的には、細胞核抽出液のよ
うな、一般的な生体試料について脱アセチル化酵素活性
を測定する場合には、反応時の濃度として通常1〜200μ
M、好ましくは20〜50μMを用いる。一方ペプチダーゼの
濃度は、主として基質ペプチドの使用量に応じて決定す
ることができる。通常は、予想される基質ペプチドの生
成量に応じて、与えられた条件下で基質ペプチドを十分
に切断することができるペプチダーゼの使用量を設定す
る。たとえば、用いる基質ペプチドの全てが脱アセチル
化によって切断可能となった場合にも、測定条件の基で
十分に切断することができるだけのペプチダーゼ活性を
存在させることが望ましい。具体的には、リシルエンド
ペプチダーゼを用い、基質ペプチドの濃度が20〜50μM
程度である場合、ペプチダーゼの使用量としては、通常
1x 10-6 AU 〜1 x 10-4 AU 、好ましくは2.5 x 10-5 AU
〜7.5 x 10-5 AUを例示することができる。脱アセチル
化酵素またはアセチル化酵素反応のためのpHは、測定対
象である酵素の至適pHを考慮して決定することができ
る。例えばヒストン脱アセチル化酵素の活性測定を目的
とするときには、通常pH6.0〜8.5、好ましくはpH6.8〜
7.8である。反応バッファーは、前記pHを与える緩衝剤
の中から選択することができる。例えばTris-HCl, Hepe
s-KOH等を、本発明の測定方法に利用することができ
る。より具体的には、25 mM Tris HCl, pH 7.5を例示す
ることができる。反応液中には、酵素活性の発現に必要
な塩類や活性保護剤を添加しておくことが望ましい。た
とえばヒストン脱アセチル化酵素では、2 mMのmercapto
ethanol添加が望ましい。
れる酵素活性に対して不足することが無いように過剰量
で用いるのが望ましい。具体的には、細胞核抽出液のよ
うな、一般的な生体試料について脱アセチル化酵素活性
を測定する場合には、反応時の濃度として通常1〜200μ
M、好ましくは20〜50μMを用いる。一方ペプチダーゼの
濃度は、主として基質ペプチドの使用量に応じて決定す
ることができる。通常は、予想される基質ペプチドの生
成量に応じて、与えられた条件下で基質ペプチドを十分
に切断することができるペプチダーゼの使用量を設定す
る。たとえば、用いる基質ペプチドの全てが脱アセチル
化によって切断可能となった場合にも、測定条件の基で
十分に切断することができるだけのペプチダーゼ活性を
存在させることが望ましい。具体的には、リシルエンド
ペプチダーゼを用い、基質ペプチドの濃度が20〜50μM
程度である場合、ペプチダーゼの使用量としては、通常
1x 10-6 AU 〜1 x 10-4 AU 、好ましくは2.5 x 10-5 AU
〜7.5 x 10-5 AUを例示することができる。脱アセチル
化酵素またはアセチル化酵素反応のためのpHは、測定対
象である酵素の至適pHを考慮して決定することができ
る。例えばヒストン脱アセチル化酵素の活性測定を目的
とするときには、通常pH6.0〜8.5、好ましくはpH6.8〜
7.8である。反応バッファーは、前記pHを与える緩衝剤
の中から選択することができる。例えばTris-HCl, Hepe
s-KOH等を、本発明の測定方法に利用することができ
る。より具体的には、25 mM Tris HCl, pH 7.5を例示す
ることができる。反応液中には、酵素活性の発現に必要
な塩類や活性保護剤を添加しておくことが望ましい。た
とえばヒストン脱アセチル化酵素では、2 mMのmercapto
ethanol添加が望ましい。
【００３４】これらのアセチル化酵素活性および脱アセ
チル化酵素活性の測定方法は、それぞれアセチル化酵素
および脱アセチル化酵素の阻害剤もしくは促進剤のスク
リーニングに利用することができる。従って、本発明
は、また、アセチル化酵素の活性を阻害もしくは促進す
る化合物のスクリーニングする方法、および脱アセチル
化酵素を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング
方法に関する。
チル化酵素活性の測定方法は、それぞれアセチル化酵素
および脱アセチル化酵素の阻害剤もしくは促進剤のスク
リーニングに利用することができる。従って、本発明
は、また、アセチル化酵素の活性を阻害もしくは促進す
る化合物のスクリーニングする方法、および脱アセチル
化酵素を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング
方法に関する。
【００３５】本発明の脱アセチル化酵素の活性を阻害も
しくは促進する化合物のスクリーニング方法は、（ａ）
アセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化酵素
とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必要な
条件下で接触させる工程、（ｂ）基質ペプチドのアセチ
ル化のレベルの変化を検出する工程、（ｃ）被検化合物
の非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較
して、基質の脱アセチル化レベルを低下もしくは上昇さ
せる化合物を選択する工程、を含む。このスクリーニン
グ方法において用いられる被検化合物としては、例え
ば、ペプチド、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞
抽出物、細胞培養上清などが用いられるが、これらに制
限されない。被検化合物は、酵素反応に先立って脱アセ
チル化酵素に加えることもできるし、酵素反応の開始時
に加えることもできる。
しくは促進する化合物のスクリーニング方法は、（ａ）
アセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化酵素
とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必要な
条件下で接触させる工程、（ｂ）基質ペプチドのアセチ
ル化のレベルの変化を検出する工程、（ｃ）被検化合物
の非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較
して、基質の脱アセチル化レベルを低下もしくは上昇さ
せる化合物を選択する工程、を含む。このスクリーニン
グ方法において用いられる被検化合物としては、例え
ば、ペプチド、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞
抽出物、細胞培養上清などが用いられるが、これらに制
限されない。被検化合物は、酵素反応に先立って脱アセ
チル化酵素に加えることもできるし、酵素反応の開始時
に加えることもできる。
【００３６】本発明のスクリーニング方法は、基質ペプ
チドの脱アセチル化（またはアセチル化）が可能な十分
量の脱アセチル化酵素（またはアセチル化酵素）用い、
必要な酵素反応に適した条件下でインキュベートするこ
とによって行われる。具体的には、たとえばヒストン脱
アセチル化酵素10〜30 Uに対して、基質ペプチド20〜50
μMを用い、リシルエンドペプチダーゼを2.5 x 10-5 AU
〜7.5 x 10-5 AU加える。これらの酵素反応に必要な条
件は、先に述べた酵素活性の測定のための条件を応用す
ることができる。なお、本明細書においてヒストン脱ア
セチル化酵素の1 Uとは、ヒト培養細胞株MCF7細胞1000
個から得られる粗ヒストン脱アセチル化酵素の量と定義
する。
チドの脱アセチル化（またはアセチル化）が可能な十分
量の脱アセチル化酵素（またはアセチル化酵素）用い、
必要な酵素反応に適した条件下でインキュベートするこ
とによって行われる。具体的には、たとえばヒストン脱
アセチル化酵素10〜30 Uに対して、基質ペプチド20〜50
μMを用い、リシルエンドペプチダーゼを2.5 x 10-5 AU
〜7.5 x 10-5 AU加える。これらの酵素反応に必要な条
件は、先に述べた酵素活性の測定のための条件を応用す
ることができる。なお、本明細書においてヒストン脱ア
セチル化酵素の1 Uとは、ヒト培養細胞株MCF7細胞1000
個から得られる粗ヒストン脱アセチル化酵素の量と定義
する。
【００３７】基質ペプチドと脱アセチル化酵素との接
触、および基質ぺプチドのアセチル化レベルの変化を検
出する工程は、上記の脱アセチル化酵素活性の測定方法
と同様にして行うことができる。その結果、被検化合物
の非存在下で基質ペプチドのアセチル化のレベルを検出
した場合（対照）と比較して、アセチル化のレベルが低
下すれば、スクリーニングに用いた被検化合物は、脱ア
セチル化酵素活性を促進すると判定される。逆に、基質
ペプチドのアセチル化のレベルが増加すれば、スクリー
ニングに用いた被検化合物は、脱アセチル化酵素活性を
阻害すると判定される。なお、被検化合物として、動植
物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などを用いた場合
には、これらを分画し、各分画についてそれぞれ検出を
行うことにより、脱アセチル化酵素の活性を促進もしく
は阻害する単一の化合物を最終的に特定することが可能
である。分画は各種クロマトグラフィー等を利用して行
われる。
触、および基質ぺプチドのアセチル化レベルの変化を検
出する工程は、上記の脱アセチル化酵素活性の測定方法
と同様にして行うことができる。その結果、被検化合物
の非存在下で基質ペプチドのアセチル化のレベルを検出
した場合（対照）と比較して、アセチル化のレベルが低
下すれば、スクリーニングに用いた被検化合物は、脱ア
セチル化酵素活性を促進すると判定される。逆に、基質
ペプチドのアセチル化のレベルが増加すれば、スクリー
ニングに用いた被検化合物は、脱アセチル化酵素活性を
阻害すると判定される。なお、被検化合物として、動植
物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などを用いた場合
には、これらを分画し、各分画についてそれぞれ検出を
行うことにより、脱アセチル化酵素の活性を促進もしく
は阻害する単一の化合物を最終的に特定することが可能
である。分画は各種クロマトグラフィー等を利用して行
われる。
【００３８】また、本発明は、上記の脱アセチル化酵素
活性の測定、ならびに脱アセチル化酵素活性を阻害、も
しくは促進する化合物のスクリーニングのためのキット
に関する。あるいは本発明は、アセチル化酵素活性の測
定、ならびにアセチル化酵素活性を阻害、もしくは促進
する化合物のスクリーニングのためのキットに関する。
本発明のキットは、（ａ）基質ペプチド、（ｂ）脱アセ
チル化酵素（またはアセチル化酵素）、および（ｃ）基
質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切断活性
が変化するペプチダーゼ、を含む。本発明のキットは、
更に被検化合物を含むこともできる。基質ペプチドは、
脱アセチル化酵素の活性測定を目的とする場合には予め
アセチル化したものを用いる。逆にアセチル化酵素の活
性測定を目的とするなら、アセチル化されていないペプ
チドを基質とする。基質ペプチドは先に述べたように標
識されていてもよい。酵素標品や基質ペプチドには、タ
ンパク質の安定化のための他の成分を配合することがで
きる。例えば、1%程度のBSA、および終濃度0.2〜10%、
好ましくは1%のシュークロース(sucrose)、フルクトー
ス(fructose)などのポリオール類を標品中に添加し、凍
結乾燥後のタンパク質変性防止剤として用いることが好
ましい。
活性の測定、ならびに脱アセチル化酵素活性を阻害、も
しくは促進する化合物のスクリーニングのためのキット
に関する。あるいは本発明は、アセチル化酵素活性の測
定、ならびにアセチル化酵素活性を阻害、もしくは促進
する化合物のスクリーニングのためのキットに関する。
本発明のキットは、（ａ）基質ペプチド、（ｂ）脱アセ
チル化酵素（またはアセチル化酵素）、および（ｃ）基
質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切断活性
が変化するペプチダーゼ、を含む。本発明のキットは、
更に被検化合物を含むこともできる。基質ペプチドは、
脱アセチル化酵素の活性測定を目的とする場合には予め
アセチル化したものを用いる。逆にアセチル化酵素の活
性測定を目的とするなら、アセチル化されていないペプ
チドを基質とする。基質ペプチドは先に述べたように標
識されていてもよい。酵素標品や基質ペプチドには、タ
ンパク質の安定化のための他の成分を配合することがで
きる。例えば、1%程度のBSA、および終濃度0.2〜10%、
好ましくは1%のシュークロース(sucrose)、フルクトー
ス(fructose)などのポリオール類を標品中に添加し、凍
結乾燥後のタンパク質変性防止剤として用いることが好
ましい。
【００３９】本発明によるキットの各構成要素は、溶液
状態、乾燥状態のいずれの形態でも提供可能である。ま
た、脱アセチル化酵素活性測定を阻害しないものであれ
ば、上記のもの以外に、通常この分野で使用される界面
活性剤、防腐剤、あるいは緩衝剤等を加えることができ
る。以下、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発
明は以下の実施例に制限されるものではない。
状態、乾燥状態のいずれの形態でも提供可能である。ま
た、脱アセチル化酵素活性測定を阻害しないものであれ
ば、上記のもの以外に、通常この分野で使用される界面
活性剤、防腐剤、あるいは緩衝剤等を加えることができ
る。以下、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発
明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００４０】
【実施例】［実施例１］遺伝子組換えによるリコンビナ
ント・ヒストン脱アセチル化酵素の作製と精製 （１） RT-PCR によるヒストン脱アセチル化酵素遺伝子
の単離 現在までに HDAC1/RPD3 (Taunton, J. et al., Science
Vol.272, 408-411, 1996; Rundlett, S. E. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.93, 14503-14508)、H
DAC2/YY-1BP(Yang, W. M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. Vol.93, 12845-12850; Lusser, A. et al.,
Science Vol.277, 88-91, 1997)、HDAC3(Yang, W. M. e
t al., J. Biol. Chem. Vol.272, 28001-28007)の３つ
の遺伝子がヒストン脱アセチル化酵素の遺伝子として報
告されている。これらヒストン脱アセチル化酵素遺伝子
のうち、HDAC1/RPD3 (Genbank Accession#: U50079)、
およびHDAC3 (Genbank Accession#: U66914)を RT-PCR
法を用いて増幅、単離した。以下の塩基配列からなるプ
ライマーを PCR に用いた。
ント・ヒストン脱アセチル化酵素の作製と精製 （１） RT-PCR によるヒストン脱アセチル化酵素遺伝子
の単離 現在までに HDAC1/RPD3 (Taunton, J. et al., Science
Vol.272, 408-411, 1996; Rundlett, S. E. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.93, 14503-14508)、H
DAC2/YY-1BP(Yang, W. M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. Vol.93, 12845-12850; Lusser, A. et al.,
Science Vol.277, 88-91, 1997)、HDAC3(Yang, W. M. e
t al., J. Biol. Chem. Vol.272, 28001-28007)の３つ
の遺伝子がヒストン脱アセチル化酵素の遺伝子として報
告されている。これらヒストン脱アセチル化酵素遺伝子
のうち、HDAC1/RPD3 (Genbank Accession#: U50079)、
およびHDAC3 (Genbank Accession#: U66914)を RT-PCR
法を用いて増幅、単離した。以下の塩基配列からなるプ
ライマーを PCR に用いた。
【００４１】(a) プライマー ＜HDAC1/RPD3 増幅用プライマー＞ フォワードプライマー (HD1F) ；5'-CGCGGATCCATGGCGCA
GACGCAGGGCACC-3' （配列番号：３） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (GGA
TCC) は制限酵素 Bam HI サイト。） リバースプライマー (HD1R) ；5'-CGCCTCGAGGGCCAACTTG
ACCTCCTCCTT-3' （配列番号：４） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (CTC
GAG) は制限酵素 Xho I サイト。） このプライマーセットを用いることによって、HDAC1/RP
D3 の1番目から 482 番目（全長）をコードしている DN
A を増幅した。 ＜HDAC3 増幅用プライマー＞ フォワードプライマー(HD3F) ；5'-CGCGGATCCATGGCCAAG
ACCGTGGCGTAT-3' （配列番号：５） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (GGA
TCC) は制限酵素 Bam HI サイト。）リバースプライマ
ー(HD3R) ；5'-CGCCTCGAGAATCTCCACATCGCTTTCCTT-3' （配列番号：６） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から9 番目 (CTCG
AG) は制限酵素 Xho I サイト。） この 2 つのプライマーセットを用いることによって HD
AC3 のアミノ酸 1 番目から 428 番目（全長）をコード
している DNA を増幅した。
GACGCAGGGCACC-3' （配列番号：３） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (GGA
TCC) は制限酵素 Bam HI サイト。） リバースプライマー (HD1R) ；5'-CGCCTCGAGGGCCAACTTG
ACCTCCTCCTT-3' （配列番号：４） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (CTC
GAG) は制限酵素 Xho I サイト。） このプライマーセットを用いることによって、HDAC1/RP
D3 の1番目から 482 番目（全長）をコードしている DN
A を増幅した。 ＜HDAC3 増幅用プライマー＞ フォワードプライマー(HD3F) ；5'-CGCGGATCCATGGCCAAG
ACCGTGGCGTAT-3' （配列番号：５） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (GGA
TCC) は制限酵素 Bam HI サイト。）リバースプライマ
ー(HD3R) ；5'-CGCCTCGAGAATCTCCACATCGCTTTCCTT-3' （配列番号：６） （ 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑にお
こなわせるためのもの。5' 側 4 番目から9 番目 (CTCG
AG) は制限酵素 Xho I サイト。） この 2 つのプライマーセットを用いることによって HD
AC3 のアミノ酸 1 番目から 428 番目（全長）をコード
している DNA を増幅した。
【００４２】(b) RT-PCRの条件 ヒストン脱アセチル化酵素遺伝子を PCR 法で増幅する
際のテンプレートとして、ヒト子宮頚ガン由来 HeLa 細
胞の cDNA を用いた。まず、cDNA を作製するため、HeL
a 細胞よりフェノール-チオシアン酸グアニジン法（ニ
ッポンジーン、ISOGEN）を用いて 全RNA を抽出、精製
した。抽出した 全RNAをもとにランダムプライマーを用
いて cDNA を合成した（逆転写反応）。このcDNAをテン
プレートとして以下の条件でPCRを行なった。1）92 ℃
3 分間を1サイクル、2）92℃ 1分間（変性）、Ｘ℃
1分間（アニーリング）、72℃ 1分間（伸長反応）を
35サイクル、3）72℃ 10 分を1サイクル。アニーリン
グの温度（Ｘ℃）は以下のように、各遺伝子のプライマ
ーセットで異なった設定値を用いた。プライマーセット
：アニーリング温度はHD1F-HD1R ：64 ℃、HD3F-HD3R
：64 ℃とした。また、これら PCR用の熱耐性 DNA ポ
リメラーゼとしてPfu-Turbo ポリメラーゼ (StrataGene
社製)を用いた。
際のテンプレートとして、ヒト子宮頚ガン由来 HeLa 細
胞の cDNA を用いた。まず、cDNA を作製するため、HeL
a 細胞よりフェノール-チオシアン酸グアニジン法（ニ
ッポンジーン、ISOGEN）を用いて 全RNA を抽出、精製
した。抽出した 全RNAをもとにランダムプライマーを用
いて cDNA を合成した（逆転写反応）。このcDNAをテン
プレートとして以下の条件でPCRを行なった。1）92 ℃
3 分間を1サイクル、2）92℃ 1分間（変性）、Ｘ℃
1分間（アニーリング）、72℃ 1分間（伸長反応）を
35サイクル、3）72℃ 10 分を1サイクル。アニーリン
グの温度（Ｘ℃）は以下のように、各遺伝子のプライマ
ーセットで異なった設定値を用いた。プライマーセット
：アニーリング温度はHD1F-HD1R ：64 ℃、HD3F-HD3R
：64 ℃とした。また、これら PCR用の熱耐性 DNA ポ
リメラーゼとしてPfu-Turbo ポリメラーゼ (StrataGene
社製)を用いた。
【００４３】(c)PCR 産物の発現ベクターへのサブクロ
ーニングと塩基配列の確認 PCR によって増幅した各 DNA バンド（PCR 産物）を1 %
のアガロースゲル電気泳動によって確認した。バンド
の確認後、各 PCR 産物は制限酵素 Bam HI とXho I に
よって処理した。この処理によって、PCR の各プライマ
ーの 5' 末端側に導入しておいた制限酵素サイトが切ら
れて、PCR 産物の両末端は粘着末端(cohesive end) と
なる。制限酵素処理した各 PCR 産物はアガロースゲル
電気泳動によって分離した。アガロースゲルで分離した
PCR 産物のバンドをゲルごと切り出し、glass milk (B
io-101)を用いてアガロースから分離精製した。アガロ
ースゲルから分離精製した PCR 産物を、発現ベクター
pCMV-8XHis およびpCMV-Flagのクローニングサイトにサ
ブクローニングした。pCMV-8Xhis、およびpCMV-Flag
は、pcDNA3 (Invitrogen社)の制限サイトXhoI/XbaIにそ
れぞれ下記の8XHisおよびFlagをコードするアダプター
オリゴヌクレオチドを挿入して作製したベクターであ
る。 pCMV-8Xhis： C-8XHis upper: 5'-TCGAGCTAGCACATCACCACCATCACCATCAT
CACTAAG-3' （配列番号：７） C-8XHis lower: 5'-CTAGCTTAGTGATGATGGTGATGGTGGTGATG
TGCTAGC-3' （配列番号：８） pCMV-Flag: C-Flag upper: 5'-TCGAGGGGGACTATAAGGACGATGATGATGATA
AATAAT-3' （配列番号：９） C-Flag lower: 5'-CTAGATTATTTATCATCATCATCGTCCTTATAG
TCCCCC-3' （配列番号：１０）
ーニングと塩基配列の確認 PCR によって増幅した各 DNA バンド（PCR 産物）を1 %
のアガロースゲル電気泳動によって確認した。バンド
の確認後、各 PCR 産物は制限酵素 Bam HI とXho I に
よって処理した。この処理によって、PCR の各プライマ
ーの 5' 末端側に導入しておいた制限酵素サイトが切ら
れて、PCR 産物の両末端は粘着末端(cohesive end) と
なる。制限酵素処理した各 PCR 産物はアガロースゲル
電気泳動によって分離した。アガロースゲルで分離した
PCR 産物のバンドをゲルごと切り出し、glass milk (B
io-101)を用いてアガロースから分離精製した。アガロ
ースゲルから分離精製した PCR 産物を、発現ベクター
pCMV-8XHis およびpCMV-Flagのクローニングサイトにサ
ブクローニングした。pCMV-8Xhis、およびpCMV-Flag
は、pcDNA3 (Invitrogen社)の制限サイトXhoI/XbaIにそ
れぞれ下記の8XHisおよびFlagをコードするアダプター
オリゴヌクレオチドを挿入して作製したベクターであ
る。 pCMV-8Xhis： C-8XHis upper: 5'-TCGAGCTAGCACATCACCACCATCACCATCAT
CACTAAG-3' （配列番号：７） C-8XHis lower: 5'-CTAGCTTAGTGATGATGGTGATGGTGGTGATG
TGCTAGC-3' （配列番号：８） pCMV-Flag: C-Flag upper: 5'-TCGAGGGGGACTATAAGGACGATGATGATGATA
AATAAT-3' （配列番号：９） C-Flag lower: 5'-CTAGATTATTTATCATCATCATCGTCCTTATAG
TCCCCC-3' （配列番号：１０）
【００４４】発現ベクターは前もって PCR 産物の両末
端と同じ制限酵素 Bam HI と Xho Iによって処理した
後、アガロースゲルで分離精製しておいた。 PCR 産物
と発現ベクターをほぼ等モルになるように混和し、T4
リガーゼを用いてライゲーションは 16 ℃、1 時間行な
った。ライゲーション後、各サンプルを塩化ルビジウム
法によってコンピテント化された大腸菌 DH5αに導入し
た。 これをセレクション用の抗生物質であるアンピシ
リンを 50 μg/ml で含む LB プレートにスプレッドし
た。それらのプレートは 37 ℃、一昼夜培養した。プレ
ートから複数のコロニーを拾い、LB-アンピシリン培地
で一晩培養した。培養した大腸菌から、アルカリ法を用
いてプラスミド（発現ベクター）を精製した。それらプ
ラスミドを制限酵素 Bam HI と Xho I で処理し、アガ
ロースゲル電気泳動によりインサート(PCR 産物)が入っ
ていることを確認した。また、それらプラスミドのイン
サートの塩基配列をオートシークエンサーを用いて決定
し、報告されている塩基配列と同一であること確認し
た。
端と同じ制限酵素 Bam HI と Xho Iによって処理した
後、アガロースゲルで分離精製しておいた。 PCR 産物
と発現ベクターをほぼ等モルになるように混和し、T4
リガーゼを用いてライゲーションは 16 ℃、1 時間行な
った。ライゲーション後、各サンプルを塩化ルビジウム
法によってコンピテント化された大腸菌 DH5αに導入し
た。 これをセレクション用の抗生物質であるアンピシ
リンを 50 μg/ml で含む LB プレートにスプレッドし
た。それらのプレートは 37 ℃、一昼夜培養した。プレ
ートから複数のコロニーを拾い、LB-アンピシリン培地
で一晩培養した。培養した大腸菌から、アルカリ法を用
いてプラスミド（発現ベクター）を精製した。それらプ
ラスミドを制限酵素 Bam HI と Xho I で処理し、アガ
ロースゲル電気泳動によりインサート(PCR 産物)が入っ
ていることを確認した。また、それらプラスミドのイン
サートの塩基配列をオートシークエンサーを用いて決定
し、報告されている塩基配列と同一であること確認し
た。
【００４５】（２） リコンビナント・ヒストン脱アセ
チル化酵素産生細胞株の単離 （１）で構築した発現ベクターpCMV-8XHis-HDAC1, pCMV
-Flag-HDAC1, pCMV-8XHis-HDAC3, pCMV-Flag-HDAC3のそ
れぞれ2.5μgをCHO細胞にリポフェクション法によりト
ランスフェクトした後、500 μg/mlジェネティシンを添
加した培地中で約２週間培養をつづけ、ネオマイシン耐
性クローンを選別した。各々独立した12クローンを分離
し、24 ウェルプレート で培養し、遺伝子が導入され、
ヒストン脱アセチル化酵素を発現しているクローンを抗
His-Tag抗体および抗Flag抗体とそれぞれのヒストン脱
アセチル化酵素に対する抗体を用いたウェスターンブロ
ット法により同定した。
チル化酵素産生細胞株の単離 （１）で構築した発現ベクターpCMV-8XHis-HDAC1, pCMV
-Flag-HDAC1, pCMV-8XHis-HDAC3, pCMV-Flag-HDAC3のそ
れぞれ2.5μgをCHO細胞にリポフェクション法によりト
ランスフェクトした後、500 μg/mlジェネティシンを添
加した培地中で約２週間培養をつづけ、ネオマイシン耐
性クローンを選別した。各々独立した12クローンを分離
し、24 ウェルプレート で培養し、遺伝子が導入され、
ヒストン脱アセチル化酵素を発現しているクローンを抗
His-Tag抗体および抗Flag抗体とそれぞれのヒストン脱
アセチル化酵素に対する抗体を用いたウェスターンブロ
ット法により同定した。
【００４６】（３） リコンビナント・ヒストン脱アセ
チル化酵素の精製 (a) pCMV-8XHis-HDAC pCMV-8XHis ベクターでは連続した８つのヒスチジン（8
His-Tag）がリコンビナントタンパク質のカルボキシ末
端に付加される。この 8His-Tag がニッケルと錯体を形
成することを利用して、リコンビナントタンパク質の精
製をおこなった。1 x 109個のリコンビナント・ヒスト
ン脱アセチル化酵素産生細胞をHypotonicbuffer によく
懸濁し、氷中で３０分間放置した後、低速遠心により核
分画を得た。この核分画をHypotonic bufferで２回洗浄
後、抽出バッファーを加え、超音波処理を行った。これ
を高速遠心し、その上清よりリコンビナントタンパク質
を含む核可溶性分画を採取した。この核可溶性分画を N
i-NTA-アガロースカラム（キアゲン社）に展開し、8His
-Tag を介して組換えタンパク質をカラムに吸着させ
た。カラムを 抽出バッファーで十分に洗浄した後、更
に洗浄バッファーで洗浄した。リコンビナントタンパク
質は溶出バッファーを用いて溶出した。この操作は、イ
ミダゾールの濃度を 50 mM, 100 mM, 200 mM, 1 M と濃
度を徐々に上げながら行った。リコンビナント・ヒスト
ン脱アセチル化酵素を含む画分をプールして、十分量の
HDAC バッファーに一昼夜透析後、-80℃に保存した。各
バッファーの組成は以下の通りである。 ・Hypotonic buffer： 10 mM Hepes KOH pH7.5 10 mM KCl 10 mM MgCl2 0.1% NP-40 ・抽出バッファー： 20 mM Tris-HCl pH 7.9 5 mM イミダゾール 0.5 M NaCl ・洗浄バッファー： 10 mM イミダゾール 0.5 M NaCl 20 mM Tris-HCl pH7.9 ・溶出バッファー： 50 mM から1 Mイミダゾール 0.5 M NaCl 20 mM Tris-HCl pH7.9 ・HDACバッファー： 20 mM Hepes KOH pH 7.5 150 mM NaCl 1 mM EDTA 50 % グリセロール
チル化酵素の精製 (a) pCMV-8XHis-HDAC pCMV-8XHis ベクターでは連続した８つのヒスチジン（8
His-Tag）がリコンビナントタンパク質のカルボキシ末
端に付加される。この 8His-Tag がニッケルと錯体を形
成することを利用して、リコンビナントタンパク質の精
製をおこなった。1 x 109個のリコンビナント・ヒスト
ン脱アセチル化酵素産生細胞をHypotonicbuffer によく
懸濁し、氷中で３０分間放置した後、低速遠心により核
分画を得た。この核分画をHypotonic bufferで２回洗浄
後、抽出バッファーを加え、超音波処理を行った。これ
を高速遠心し、その上清よりリコンビナントタンパク質
を含む核可溶性分画を採取した。この核可溶性分画を N
i-NTA-アガロースカラム（キアゲン社）に展開し、8His
-Tag を介して組換えタンパク質をカラムに吸着させ
た。カラムを 抽出バッファーで十分に洗浄した後、更
に洗浄バッファーで洗浄した。リコンビナントタンパク
質は溶出バッファーを用いて溶出した。この操作は、イ
ミダゾールの濃度を 50 mM, 100 mM, 200 mM, 1 M と濃
度を徐々に上げながら行った。リコンビナント・ヒスト
ン脱アセチル化酵素を含む画分をプールして、十分量の
HDAC バッファーに一昼夜透析後、-80℃に保存した。各
バッファーの組成は以下の通りである。 ・Hypotonic buffer： 10 mM Hepes KOH pH7.5 10 mM KCl 10 mM MgCl2 0.1% NP-40 ・抽出バッファー： 20 mM Tris-HCl pH 7.9 5 mM イミダゾール 0.5 M NaCl ・洗浄バッファー： 10 mM イミダゾール 0.5 M NaCl 20 mM Tris-HCl pH7.9 ・溶出バッファー： 50 mM から1 Mイミダゾール 0.5 M NaCl 20 mM Tris-HCl pH7.9 ・HDACバッファー： 20 mM Hepes KOH pH 7.5 150 mM NaCl 1 mM EDTA 50 % グリセロール
【００４７】(b) pCMV-Flag-HDAC pCMV-Flag-HDAC ベクターではエピトープタグであるFla
g-Tagがリコンビナントタンパク質のカルボキシ末端に
付加される。このFlag-Tagに抗Flag-Tag抗体が結合する
ことを利用した抗Flag-Tag(M2)抗体カラム法を用いてリ
コンビナントタンパク質の精製を行った。上記と同様の
方法で核可溶性分画を採取し、冷えた蒸留水で３倍希釈
した。これを抗Flag-Tag(M2)抗体カラム (Sigma 社製)
に展開し、Flag-Tag を介して組換えタンパク質をカラ
ムに吸着させた。カラムを洗浄バッファーで洗浄後、25
0 μg/ ml のFlag ペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp--Asp-Asp
-Asp-Lys)を含む溶出バッファーで溶出した。リコンビ
ナント・ヒストン脱アセチル化酵素を含む画分をプール
して、十分量のHDACバッファーに一昼夜透析後、-80℃
に保存した。各バッファーの組成は以下の通りである。 ・洗浄バッファー： 20 mM Tris-HCl pH7.5 250 mM NaCl 0.05 % Triton X-100 ・溶出バッファー： 20 mM Tris-HCl pH7.5 150 mM NaCl 10 % グリセロール 1 mM EDTA
g-Tagがリコンビナントタンパク質のカルボキシ末端に
付加される。このFlag-Tagに抗Flag-Tag抗体が結合する
ことを利用した抗Flag-Tag(M2)抗体カラム法を用いてリ
コンビナントタンパク質の精製を行った。上記と同様の
方法で核可溶性分画を採取し、冷えた蒸留水で３倍希釈
した。これを抗Flag-Tag(M2)抗体カラム (Sigma 社製)
に展開し、Flag-Tag を介して組換えタンパク質をカラ
ムに吸着させた。カラムを洗浄バッファーで洗浄後、25
0 μg/ ml のFlag ペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp--Asp-Asp
-Asp-Lys)を含む溶出バッファーで溶出した。リコンビ
ナント・ヒストン脱アセチル化酵素を含む画分をプール
して、十分量のHDACバッファーに一昼夜透析後、-80℃
に保存した。各バッファーの組成は以下の通りである。 ・洗浄バッファー： 20 mM Tris-HCl pH7.5 250 mM NaCl 0.05 % Triton X-100 ・溶出バッファー： 20 mM Tris-HCl pH7.5 150 mM NaCl 10 % グリセロール 1 mM EDTA
【００４８】［実施例２］ヒト培養細胞株からのヒスト
ン脱アセチル化酵素の粗精製 MCF7 細胞をPBSで洗浄後、遠心し、沈殿した細胞を4ml
のLysis bufferに、懸濁した。氷中で15分間静置した
後、07ローター用の細い遠心管でsucrose cushion buff
er 15mlに、ライセート(Lysate)を重層した。その際、L
ysis buffer 1mlで共洗いし、計5mlを得た。次に、1300
g、20分間遠心し、沈殿した細胞を1.5mlのLysis buffer
で回収し、洗浄後、Low-salt buffer 700μlに懸濁し30
秒超音波処理し、氷中に30分間静置した。100,000 gで4
0分間遠心し、上清をとり、粗ヒストン脱アセチル化酵
素を回収した。粗ヒストン脱アセチル化酵素プールを1.
5mlチューブを用いて、50% グリセロール, 150mM NaCl,
20mM Tris pH7.5に対して、一晩透析した。この際透析
液は3回交換した。以上の手順で粗精製したヒストン脱
アセチル化酵素を、脱アセチル化酵素活性の測定に使用
した。各バッファーの組成は以下の通りである。 ・sucrose cushion buffer： 30% sucrose 10mM Tris (pH7.5) 10mM NaCl 3mM MgCl2 ・Lysis buffer： 10mM Tris (pH7.5) 10mM NaCl 15mM MgCl2 0.1mM EGTA 250mM sucrose 0.45% NP-40 0.1mM PMSF ・Low-salt buffer： 50mM Hepes (pH7.5)
ン脱アセチル化酵素の粗精製 MCF7 細胞をPBSで洗浄後、遠心し、沈殿した細胞を4ml
のLysis bufferに、懸濁した。氷中で15分間静置した
後、07ローター用の細い遠心管でsucrose cushion buff
er 15mlに、ライセート(Lysate)を重層した。その際、L
ysis buffer 1mlで共洗いし、計5mlを得た。次に、1300
g、20分間遠心し、沈殿した細胞を1.5mlのLysis buffer
で回収し、洗浄後、Low-salt buffer 700μlに懸濁し30
秒超音波処理し、氷中に30分間静置した。100,000 gで4
0分間遠心し、上清をとり、粗ヒストン脱アセチル化酵
素を回収した。粗ヒストン脱アセチル化酵素プールを1.
5mlチューブを用いて、50% グリセロール, 150mM NaCl,
20mM Tris pH7.5に対して、一晩透析した。この際透析
液は3回交換した。以上の手順で粗精製したヒストン脱
アセチル化酵素を、脱アセチル化酵素活性の測定に使用
した。各バッファーの組成は以下の通りである。 ・sucrose cushion buffer： 30% sucrose 10mM Tris (pH7.5) 10mM NaCl 3mM MgCl2 ・Lysis buffer： 10mM Tris (pH7.5) 10mM NaCl 15mM MgCl2 0.1mM EGTA 250mM sucrose 0.45% NP-40 0.1mM PMSF ・Low-salt buffer： 50mM Hepes (pH7.5)
【００４９】［実施例３］脱アセチル化酵素の活性の測
定 （１） 基質ペプチド Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCA 蛍光物質であるAMC（7-アミノ-4-メチル-クマリン）の
アミノ基に、ε-アミノ基がアセチル化されたリジンを
含むペプチドのカルボキシル基を縮合して、基質ペプチ
ドを作製した。該ペプチドは、ペプチド研究所に依頼し
て作製した。
定 （１） 基質ペプチド Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCA 蛍光物質であるAMC（7-アミノ-4-メチル-クマリン）の
アミノ基に、ε-アミノ基がアセチル化されたリジンを
含むペプチドのカルボキシル基を縮合して、基質ペプチ
ドを作製した。該ペプチドは、ペプチド研究所に依頼し
て作製した。
【００５０】（２） 測定手順 1アッセイ当たり、基質ペプチドであるBoc-Val-Leu-(A
c)Lys-MCAの10 mM DMSO溶液1 μlを、64 μl のHDAC反
応バッファー (25 mM Tris HCl, pH 7.5) に添加し、蛍
光測定用マイクロプレートに分注し、30℃に保温した。
次いで各ウェルにヒストン脱アセチル化酵素液 10μlを
添加し、30℃で60分間、脱アセチル化反応させた。反応
後、25 mM Tris HCl, pH 7.5を用いて至適濃度に希釈し
たペプチダーゼ液5μlと、5Xプロテアーゼ反応バッファ
ー20μlを各ウェルに添加し、マイクロプレート用蛍光
リーダーで150秒毎の蛍光強度を測定した。蛍光強度
は、Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンター（ame
rshampharmacia biotech 社製） で測定した。反応バッ
ファーの組成は以下の通りである。 ・5Xプロテアーゼ反応バッファー： 500 mM Tris HCl, pH 9.6 50 mM βmercaptoethanol
c)Lys-MCAの10 mM DMSO溶液1 μlを、64 μl のHDAC反
応バッファー (25 mM Tris HCl, pH 7.5) に添加し、蛍
光測定用マイクロプレートに分注し、30℃に保温した。
次いで各ウェルにヒストン脱アセチル化酵素液 10μlを
添加し、30℃で60分間、脱アセチル化反応させた。反応
後、25 mM Tris HCl, pH 7.5を用いて至適濃度に希釈し
たペプチダーゼ液5μlと、5Xプロテアーゼ反応バッファ
ー20μlを各ウェルに添加し、マイクロプレート用蛍光
リーダーで150秒毎の蛍光強度を測定した。蛍光強度
は、Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンター（ame
rshampharmacia biotech 社製） で測定した。反応バッ
ファーの組成は以下の通りである。 ・5Xプロテアーゼ反応バッファー： 500 mM Tris HCl, pH 9.6 50 mM βmercaptoethanol
【００５１】（３） 測定結果 この測定方法を用いて、ヒト培養細胞株から粗精製した
ヒストン脱アセチル化酵素画分およびリコンビナント・
ヒストン脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性を測
定した結果を図１〜５に示した。
ヒストン脱アセチル化酵素画分およびリコンビナント・
ヒストン脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性を測
定した結果を図１〜５に示した。
【００５２】図１、２は蛍光標識基質ペプチドであるBo
c-Val-Leu-Lys-MCA と、そのリジン残基がアセチル化さ
れたBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAに対するリシルエンドペ
プチダーゼとプラスミンの切断活性の比較を示す。5 x
10-6 AU のリシルエンドペプチダーゼと0.001Uのプラス
ミンを、Boc-Val-Leu-Lys-MCAおよびBoc-Val-Leu-(Ac)L
ys-MCAに添加後、約150秒毎の蛍光強度を示した。リシ
ルエンドペプチダーゼとプラスミン共に、明らかにBoc-
Val-Leu-Lys-MCAは切断するが、そのリジン残基がアセ
チル化されたBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAは切断しないこ
とが示された。
c-Val-Leu-Lys-MCA と、そのリジン残基がアセチル化さ
れたBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAに対するリシルエンドペ
プチダーゼとプラスミンの切断活性の比較を示す。5 x
10-6 AU のリシルエンドペプチダーゼと0.001Uのプラス
ミンを、Boc-Val-Leu-Lys-MCAおよびBoc-Val-Leu-(Ac)L
ys-MCAに添加後、約150秒毎の蛍光強度を示した。リシ
ルエンドペプチダーゼとプラスミン共に、明らかにBoc-
Val-Leu-Lys-MCAは切断するが、そのリジン残基がアセ
チル化されたBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAは切断しないこ
とが示された。
【００５３】図３は、脱アセチル化反応のタイムコース
を示す。Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAの脱アセチル化反応
を行なわせ、次に 5 x 10-6 AU のリシルエンドペプチ
ダーゼを添加後、タンパク質分解反応がプラトーとなっ
た約20分後の蛍光強度を示した。脱アセチル化反応の時
間に応じて、蛍光強度が上昇していることが示された。
を示す。Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAの脱アセチル化反応
を行なわせ、次に 5 x 10-6 AU のリシルエンドペプチ
ダーゼを添加後、タンパク質分解反応がプラトーとなっ
た約20分後の蛍光強度を示した。脱アセチル化反応の時
間に応じて、蛍光強度が上昇していることが示された。
【００５４】図４は、脱アセチル化反応における酵素の
用量依存性を示す。リコンビナント・ヒストン脱アセチ
ル化酵素および粗精製ヒストン脱アセチル化酵素液の原
液を倍々希釈して、脱アセチル化反応を行なわせ、次に
5 x 10-6 AU のリシルエンドペプチダーゼを添加後、
タンパク質分解反応がプラトーとなった約20分後の蛍光
強度を示した。ヒストン脱アセチル化酵素量応じて、蛍
光強度が上昇していることが示された。
用量依存性を示す。リコンビナント・ヒストン脱アセチ
ル化酵素および粗精製ヒストン脱アセチル化酵素液の原
液を倍々希釈して、脱アセチル化反応を行なわせ、次に
5 x 10-6 AU のリシルエンドペプチダーゼを添加後、
タンパク質分解反応がプラトーとなった約20分後の蛍光
強度を示した。ヒストン脱アセチル化酵素量応じて、蛍
光強度が上昇していることが示された。
【００５５】図５は、既知のヒストン脱アセチル化酵素
阻害剤トリコスタチンAの効果を示す。図に示した濃度
のトリコスタチンAを脱アセチル化反応中に添加して、
本測定への影響をみた。約200 nMのトリコスタチンAに
より、ぼぼ完全に反応は阻害された。このことから、本
測定方法は確実にヒストン脱アセチル化酵素の活性を測
定できると言える。
阻害剤トリコスタチンAの効果を示す。図に示した濃度
のトリコスタチンAを脱アセチル化反応中に添加して、
本測定への影響をみた。約200 nMのトリコスタチンAに
より、ぼぼ完全に反応は阻害された。このことから、本
測定方法は確実にヒストン脱アセチル化酵素の活性を測
定できると言える。
【００５６】
【発明の効果】本発明により、ペプチドのアセチル化レ
ベルの判定方法、脱アセチル化酵素活性測定方法、およ
び脱アセチル化酵素の阻害剤もしくは促進剤をスクリー
ニングする方法が提供された。本発明は、基本原理とし
て、脱アセチル化反応をそれに引き続くペプチダーゼの
活性に変換してしている。本原理は、脱アセチル化酵素
のみならずアセチル化酵素にも応用することができる。
一般的なペプチダーゼの活性測定方法自体は非常に簡便
であり、経済的にも安価に行うことができる。また、こ
の方法を用いると、同一容器内での反応であることから
連続した活性測定が可能となり、脱アセチル化酵素の活
性測定や、阻害剤等のスクリーニング効率の飛躍的な向
上につながる。このことにより、新薬開発に大きく貢献
できるものと期待できる。
ベルの判定方法、脱アセチル化酵素活性測定方法、およ
び脱アセチル化酵素の阻害剤もしくは促進剤をスクリー
ニングする方法が提供された。本発明は、基本原理とし
て、脱アセチル化反応をそれに引き続くペプチダーゼの
活性に変換してしている。本原理は、脱アセチル化酵素
のみならずアセチル化酵素にも応用することができる。
一般的なペプチダーゼの活性測定方法自体は非常に簡便
であり、経済的にも安価に行うことができる。また、こ
の方法を用いると、同一容器内での反応であることから
連続した活性測定が可能となり、脱アセチル化酵素の活
性測定や、阻害剤等のスクリーニング効率の飛躍的な向
上につながる。このことにより、新薬開発に大きく貢献
できるものと期待できる。
【００５７】特に脱アセチル化酵素を阻害する物質は、
細胞周期の停止、細胞分化の誘導を起こすことが明らか
なっており(Taunton, J. et al., Science Vol.272, 40
8-411, 1996; Yoshida, M. et al., J. Biol. Chem. Vo
l.265, 17174-17179, 1990;Kijima, M. et al., J. Bio
l. Chem. Vol.268, 22429-22435, 1993; Chen, W. Y. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 94, 5798-5
803, 1997; Medina,V. et al., Cancer Res. Vol.57, 3
697-3707, 1997)、抗癌剤や抗菌物質としての作用が期
待できることから、今後重要性を増すものと考えられ
る。従って、簡便なスクリーニング方法を実現する本発
明の意義は大きい。
細胞周期の停止、細胞分化の誘導を起こすことが明らか
なっており(Taunton, J. et al., Science Vol.272, 40
8-411, 1996; Yoshida, M. et al., J. Biol. Chem. Vo
l.265, 17174-17179, 1990;Kijima, M. et al., J. Bio
l. Chem. Vol.268, 22429-22435, 1993; Chen, W. Y. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 94, 5798-5
803, 1997; Medina,V. et al., Cancer Res. Vol.57, 3
697-3707, 1997)、抗癌剤や抗菌物質としての作用が期
待できることから、今後重要性を増すものと考えられ
る。従って、簡便なスクリーニング方法を実現する本発
明の意義は大きい。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Cyclex Co., Ltd. <120> Method for determining of deacetylation enzyme activity, and scree ning of inhibitor or accelerator of same. <130> M3-109 <140> <141> <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (7) <223> A quencher binds to 7th amino acid. <220> <221> BINDING <222> (1) <223> A fluorescence group binds to 1st amino acid. <400> 1 Arg Pro Gly Leu Lys Pro Lys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa represents N3-(2,4-Dinitrophenyl)-L-2,3-Diaminopropionic acid. <220> <221> BINDING <222> (1) <223> A fluorescence group binds to 1st amino acid. <400> 2 Leu Pro Lys Leu Xaa Pro Arg 1 5 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 cgcggatcca tggcgcagac gcagggcacc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 cgcctcgagg gccaacttga cctcctcctt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 cgcggatcca tggccaagac cgtggcgtat 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 cgcctcgaga atctccacat cgctttcctt 30 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Sequence <400> 7 tcgagctagc acatcaccac catcaccatc atcactaag 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Sequence <400> 8 ctagcttagt gatgatggtg atggtggtga tgtgctagc 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Sequence <400> 9 tcgaggggga ctataaggac gatgatgatg ataaataat 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Sequence <400> 10 ctagattatt tatcatcatc atcgtcctta tagtccccc 39
【図１】アセチル化、または非アセチル化ペプチドを基
質としたリジルエンドペプチダーゼのペプチド切断活性
の比較を示す図。
質としたリジルエンドペプチダーゼのペプチド切断活性
の比較を示す図。
【図２】アセチル化、または非アセチル化ペプチドを基
質としたプラスミンのペプチド切断活性の比較を示す
図。
質としたプラスミンのペプチド切断活性の比較を示す
図。
【図３】脱アセチル化反応のタイムコースを示す図。
【図４】脱アセチル化反応における酵素の用量依存性を
示す図。
示す図。
【図５】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチ
ンAの効果を示す図。
ンAの効果を示す図。
フロントページの続き (72)発明者 和田 恵美 長野県伊那市大字手良沢岡字大原1063− 103 株式会社サイクレックス内 (72)発明者 立澤 あゆみ 長野県伊那市大字手良沢岡字大原1063− 103 株式会社サイクレックス内 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 BB10 BB16 BB18 BB51 DA80 FB01 FB12 GC15 4B024 AA11 BA11 CA04 DA03 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ79 QR12 QS03 QS28 QS36 QX01
Claims (14)
- 【請求項１】ペプチドのアセチル化のレベルを判定する
方法において、アセチル化のレベルの変化が、該ペプチ
ドを基質とするペプチダーゼの切断活性の変化を指標と
して検出されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】次の工程を含む脱アセチル化酵素活性、ま
たはアセチル化酵素活性の測定方法。 (a)基質ペプチドと試料とを、脱アセチル化酵素による
脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペプチド
と試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応に必要
な条件下で接触させる工程、(b)請求項１に記載の方法
によって基質ペプチドのアセチル化レベルの変化を判定
する工程 - 【請求項３】脱アセチル化酵素が、リジン残基のεアミ
ノ基に導入されたアセチル基に作用するものである請求
項２に記載の方法。 - 【請求項４】脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル
化酵素である請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダー
ゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパ
イン、メタロエンドペプチダーゼ、およびナラタケ(Arm
illaria mellea)プロテアーゼからなる群から選択され
る少なくとも１種のペプチダーゼである請求項１に記載
の方法。 - 【請求項６】基質ペプチドが、該ペプチドの切断により
シグナルレベルが変化する物質により標識されており、
ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成する請
求項５に記載の方法。 - 【請求項７】基質ペプチドが、色素標識されており、ペ
プチダーゼによって切断されてシグナルを生成する請求
項６に記載の方法。 - 【請求項８】色素標識が蛍光物質標識であり、シグナル
が蛍光シグナルである請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】基質ペプチドがアセチル化したリジンを含
む請求項５に記載の方法。 - 【請求項１０】ペプチダーゼがリジルエンドペプチダー
ゼである請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】次の要素を含む、アセチル化酵素活性ま
たは脱アセチル化酵素活性の測定用試薬キット。 (a)基質ペプチド (b)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切
断活性が変化するペプチダーゼ - 【請求項１２】次の工程を含む脱アセチル化酵素活性を
阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法にお
いて、基質ペプチドのアセチル化レベルの変化が基質ペ
プチドのアセチル化に伴うペプチダーゼの切断活性の変
化を指標として検出されることを特徴とする方法。 (a)アセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化
酵素とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必
要な条件下で接触させる工程、(b)基質ペプチドのアセ
チル化レベルの変化を検出する工程、(c)被検化合物の
非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較し
て、基質の脱アセチル化のレベルを低下もしくは上昇さ
せる化合物を選択する工程 - 【請求項１３】次の要素を含む、脱アセチル化酵素活性
を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニングのため
の試薬キット。 (a)基質ペプチド (b)脱アセチル化酵素 (c)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切
断活性が変化するペプチダーゼ - 【請求項１４】ペプチドのアセチル化レベルを変化させ
る酵素活性測定用のペプチド基質であって、前記酵素に
よってアセチル化または脱アセチル化されるアミノ酸残
基を含み、かつこのアミノ酸残基のアセチル化のレベル
によってペプチダーゼの感受性が変化することを特徴と
するペプチド基質。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008289437A (ja) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | Sony Corp | レーザーを用いた酵素活性測定方法及び酵素活性測定装置 |
| WO2011132392A1 (ja) * | 2010-04-19 | 2011-10-27 | 国立大学法人九州工業大学 | ヒストンメチル化酵素活性の測定方法 |
| JP2014508537A (ja) * | 2011-03-25 | 2014-04-10 | アルマック・サイエンシーズ・（スコットランド）・リミテッド | 酵素アッセイ |
| JP2014221907A (ja) * | 2003-03-31 | 2014-11-27 | メディカル リサーチ カウンシル | マイクロカプセルを用いたコンビナトリアルライブラリの合成および試験の方法 |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6822267B1 (en) * | 1997-08-20 | 2004-11-23 | Advantest Corporation | Signal transmission circuit, CMOS semiconductor device, and circuit board |
| JP2001149081A (ja) * | 1999-11-29 | 2001-06-05 | Cyclex Co Ltd | 脱アセチル化酵素の活性測定方法、並びにこれら酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法 |
| US8642284B1 (en) | 1999-12-15 | 2014-02-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein |
| US7452664B2 (en) * | 1999-12-15 | 2008-11-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation |
| US7572575B2 (en) | 2000-12-13 | 2009-08-11 | Massachusetts Institute Of Technology | SIR2 activity |
| US20060058553A1 (en) * | 2002-02-07 | 2006-03-16 | Axys Pharmaceuticals, Inc. | Novel bicyclic hydroxamates as inhibitors of histone deacetylase |
| CA2484013C (en) * | 2002-05-23 | 2011-09-20 | The Regents Of The University Of California | Methods of modulating mitochondrial nad-dependent deacetylase |
| EP1403639A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-03-31 | G2M Cancer Drugs AG | Antibody tools for the diagnostic use in the medical therapy with inhibitors of histone deacetylases |
| US7250514B1 (en) | 2002-10-21 | 2007-07-31 | Takeda San Diego, Inc. | Histone deacetylase inhibitors |
| KR20050122210A (ko) * | 2003-03-17 | 2005-12-28 | 다케다 샌디에고, 인코포레이티드 | 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 |
| WO2005002527A2 (en) * | 2003-07-03 | 2005-01-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Sirt1 modulation of adipogenesis and adipose function |
| US20050159470A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-07-21 | Syrrx, Inc. | Histone deacetylase inhibitors |
| WO2005066151A2 (en) * | 2003-12-19 | 2005-07-21 | Takeda San Diego, Inc. | Histone deacetylase inhibitors |
| EP1709206B1 (en) * | 2003-12-23 | 2012-08-29 | The Regents of The University of California | Compositions and methods for modulating sirtuin activity |
| EP1557474A1 (en) * | 2004-01-21 | 2005-07-27 | Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO | Method for determination of protein modifying or demodifying activity and suitable materials therefor |
| GB0403041D0 (en) * | 2004-02-11 | 2004-03-17 | Milner Anne J | Induction of apoptosis |
| US7642275B2 (en) * | 2004-12-16 | 2010-01-05 | Takeda San Diego, Inc. | Histone deacetylase inhibitors |
| ATE544071T1 (de) * | 2005-03-03 | 2012-02-15 | Sirtris Pharmaceuticals Inc | Fluoreszenzpolarisationstests für die acetyltransferase-deacetylase-aktivität |
| US20070099830A1 (en) | 2005-04-21 | 2007-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Sirt4 activities |
| EP1896436A2 (en) * | 2005-05-11 | 2008-03-12 | Takeda San Diego, Inc. | Histone deacetylase inhibitors |
| CN101263121A (zh) | 2005-07-14 | 2008-09-10 | 塔克达圣地亚哥公司 | 组蛋白脱乙酰基酶抑制剂 |
| GB0518237D0 (en) * | 2005-09-07 | 2005-10-19 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Therapeutic compounds |
| US20070248590A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-10-25 | Sirtris Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof |
| WO2007064902A2 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Sirtris Pharmaceuticals, Inc. | Mass spectrometry assays for acetyltransferase/deacetylase activity |
| EP1976835A2 (en) * | 2006-01-13 | 2008-10-08 | Takeda San Diego, Inc. | Histone deacetylase inhibitors |
| CN101008009B (zh) * | 2006-01-24 | 2010-04-07 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 用于快速筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂的细胞模型 |
| DE602007013213D1 (de) * | 2006-06-06 | 2011-04-28 | Massachusetts Inst Technology | Cholesterinregulierender komplex aus sirt1 und lxr und seine verwendung |
| US8518635B2 (en) | 2006-06-12 | 2013-08-27 | The J. David Gladstone Institutes | Regulation of protein activity by reversible acetylation |
| US20100160262A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-06-24 | Melanie Ott | Compositions and methods for modulating sirtuin activity |
| JP2013509441A (ja) | 2009-10-30 | 2013-03-14 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 記憶／認知および不安障害の処置のためのｃｉ−９９４およびジナリンの使用 |
| WO2012033993A2 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Promega Corporation | Methods for assaying enzyme activities |
| US9637773B2 (en) | 2011-01-13 | 2017-05-02 | Enzo Life Sciences, Inc. | Compounds and methods for detection of enzymes that remove formyl, succinyl, methyl succinyl or myristoyl groups from ε-amino lysine moieties |
| EP3305918B1 (en) | 2012-03-05 | 2020-06-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods for epigenetic sequencing |
| CA2875715C (en) * | 2012-06-05 | 2023-03-21 | Mcmaster University | Screening method and systems utilizing mass spectral fragmentation patterns |
| ES2693349T3 (es) | 2012-06-06 | 2018-12-11 | The Trustees Of Princeton University | Aplicación de códigos de barras de ADN de bancos de matrices de cromatinas y mononucleosomas diseñadores para la creación de perfiles de lectores, escritores, borradores y moduladores de cromatina de los mismos |
| US20150298091A1 (en) | 2014-04-21 | 2015-10-22 | President And Fellows Of Harvard College | Systems and methods for barcoding nucleic acids |
| US11746367B2 (en) | 2015-04-17 | 2023-09-05 | President And Fellows Of Harvard College | Barcoding systems and methods for gene sequencing and other applications |
| CN105294475A (zh) * | 2015-11-14 | 2016-02-03 | 复旦大学 | 广谱的去乙酰化酶抑制剂乙酰化赖氨酸及其应用 |
| CN110082327A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-08-02 | 阜阳师范学院 | 一种卵母细胞h3k27乙酰化指数分析方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0755942B2 (ja) * | 1985-07-29 | 1995-06-14 | 味の素株式会社 | 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法 |
| JPH05137599A (ja) | 1991-11-22 | 1993-06-01 | Takara Shuzo Co Ltd | 蛍光基質 |
| US5811252A (en) | 1994-07-07 | 1998-09-22 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Modified proenzymes as substrates for proteolytic enzymes |
| EP0691409B1 (en) * | 1994-07-07 | 2002-10-23 | Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO | Modified proenzymes as substrates for proteolytic enzymes |
| JP3207120B2 (ja) | 1996-07-24 | 2001-09-10 | 株式会社分子バイオホトニクス研究所 | 酵素活性測定方法 |
| JPH10313896A (ja) | 1997-05-15 | 1998-12-02 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | マトリックスメタロプロテアーゼに対する発色団又は蛍光団を有する新規な活性測定用合成基質 |
| EP1050581A4 (en) * | 1998-01-20 | 2005-10-19 | Med & Biological Lab Co Ltd | METHOD FOR DETECTING ACETYL TRANSFERASE AND DEACETYLASE ACTIVITIES AND METHOD FOR DETERMINING THE INHIBITORS OR ACCELERATORS OF THESE ENZYMES |
| US6884597B1 (en) * | 1998-01-20 | 2005-04-26 | Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd. | Method for detecting acetyltransferase and deacetylase activities and method for screening inhibitors or enhancers of these enzymes |
| JPH11318495A (ja) * | 1998-05-11 | 1999-11-24 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | 抗アセチル化リジン抗体およびその利用 |
| AU6794700A (en) * | 1999-08-20 | 2001-03-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to hdac 4 and 5 regulation of cardiac gene expression |
| JP2001149081A (ja) * | 1999-11-29 | 2001-06-05 | Cyclex Co Ltd | 脱アセチル化酵素の活性測定方法、並びにこれら酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法 |
| CA2408385A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-24 | Methylgene, Inc. | Inhibition of specific histone deacetylase isoforms |
| US6706686B2 (en) * | 2001-09-27 | 2004-03-16 | The Regents Of The University Of Colorado | Inhibition of histone deacetylase as a treatment for cardiac hypertrophy |
-
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- 1999-11-29 JP JP33856599A patent/JP2001149081A/ja active Pending
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-
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- 2005-10-31 US US11/263,685 patent/US7256013B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014221907A (ja) * | 2003-03-31 | 2014-11-27 | メディカル リサーチ カウンシル | マイクロカプセルを用いたコンビナトリアルライブラリの合成および試験の方法 |
| JP2008289437A (ja) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | Sony Corp | レーザーを用いた酵素活性測定方法及び酵素活性測定装置 |
| WO2011132392A1 (ja) * | 2010-04-19 | 2011-10-27 | 国立大学法人九州工業大学 | ヒストンメチル化酵素活性の測定方法 |
| JP2011239775A (ja) * | 2010-04-19 | 2011-12-01 | Kyushu Institute Of Technology | ヒストンメチル化酵素活性の測定方法 |
| US9012166B2 (en) | 2010-04-19 | 2015-04-21 | Kyushu Institute Of Technology | Method for assaying histone methylation enzyme activity |
| JP2014508537A (ja) * | 2011-03-25 | 2014-04-10 | アルマック・サイエンシーズ・（スコットランド）・リミテッド | 酵素アッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| CA2392711A1 (en) | 2001-06-07 |
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| A521 | Written amendment |
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