JP2014508537A - 酵素アッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、蛍光寿命（FLT）の測定に基づいて酵素の活性をアッセイする方法に関係する。特に本発明は、ペプチド基質の構造を修飾する能力を有する酵素、例えばペプチド基質のメチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化または脱イミノ化を触媒する酵素などのアッセイに関する。

Description

［発明の分野］
本発明は、蛍光寿命（FLT）の測定に基づいて酵素の活性をアッセイする方法に関係する。特に本発明は、ペプチド基質の構造を修飾する能力を有する酵素、例えばペプチド基質のメチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化または脱イミノ化を触媒する酵素などのアッセイに関する。

［背景］
他の生物学的分子の構造修飾を触媒する酵素は、創薬の重要なターゲットである。例えばタンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素、特にヒストンタンパク質の構造を修飾する酵素は、神経変性やがんなどのヒト疾患と関連するので、有望な薬物ターゲットである。

ヒストンタンパク質を構成するアミノ酸の翻訳後修飾は、「エピジェネティクス」（これは、基礎をなすDNA配列の変化以外の機序によって引き起こされる表現型（外観）または遺伝子発現の遺伝的変化の研究である）の分野では特に重要である。遺伝物質は、保護、パッケージング、ならびに転写、複製および修復などの過程を調節するための方法を必要とする。真核生物では、これらの役割の大部分が、ゲノムDNAをヌクレオソームにアセンブルするヒストンタンパク質によって行われている。ヌクレオソームはいくつかの関連タンパク質と共にパッケージングされて、クロマチン線維を形成する。各ヌクレオソームは、2コピーの各ヒストン、H2A、H2B、H3およびH4を含有する円柱状のタンパク質コアにほぼ2周巻き付いたDNAからなる。ヒストンタンパク質のN末端テールは、明確な構造を有する球状のドメインが存在するヌクレオソームコアから突き出している。

ヒストンタンパク質は、多種多様な過程の調節を可能にするために、さまざまな翻訳後修飾によって改変される。ヒストン修飾は配列全体にわたって至るところで起こるが、明確な構造を持たないヒストンのN末端（ヒストンテール）は、特に高度に修飾される。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、脱イミノ化、ユビキチン化、リン酸化およびSUMO化が含まれる。アセチル化は、これらのなかで最もよく研究されている修飾である。例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素（HAT）による、ヒストンH3のテールのK14およびK9リジンのアセチル化は、一般に、転写能と相関関係にある。

ヒストンアセチル化は多くの細胞過程を調節し、個々のアセチル化パターンは相異なる帰結をもたらす。例えば、新たに合成されたヒストン上のアセチル化パターンは、ヒストンシャペロンによるそれらのヌクレオソームへのアセンブリにとって重要である。また、クロマチン凝縮およびクロマチンフォールディングの程度は、ヒストンH4のリジン16におけるアセチル化によって調節されうる。最終的に、ヒストンアセチル化は、遺伝子転写にとって極めて重要である。ヒストンのリジンアセチル化は、一般に、より高い転写速度を有するオープンクロマチン構造に関係づけられる。

ヒストンアセチル化は、さまざまなヒストンタンパク質に対する優先度および個々のヒストン上の特定部位に対する優先度が異なるヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびヒストンデアセチラーゼの活性によって調節される（Shahbazian and Grunstein (2007) Annual review of Biochemistry, Vol.76:75-100参照）。

アセチル化に加えて、ヒストン、特にH3およびH4のメチル化も、遺伝子発現、DNA複製および染色体分離などといったクロマチン機能の調節にとって重要である。ヒストンH3のメチル化は、一般にクロマチン凝縮に関連して、転写抑制につながる。

ヒストンはアルギニン残基とリジン残基だけがメチル化される。アルギニンは、モノメチル化またはジメチル化が可能であり、後者は対称的配置または非対称的配置をとる。この過程を触媒する酵素は2タイプに分類されており、I型酵素がN^G-モノメチルアルギニン残基および非対称N^G,N^G-ジメチルアルギニン残基の形成を触媒するのに対して、II型酵素はN^G-モノメチルアルギニン残基および対称N^G,N^’G-ジメチルアルギニン残基の形成を触媒する。アルギニンメチル化と同様に、ε-窒素でのリジンメチル化も、モノ-、ジ-、またはトリ-メチル化型として起こりうる。

ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（PKMT）は、ヒストンH3およびH4のメチル化を担っており、SETドメイン（Supressor of variegation，Enhancer of zeste，Trithorax）と呼ばれる触媒活性部位を利用する。SETドメインは遺伝子活性の調整に関与する130アミノ酸配列である。このドメインはヒストンテールに結合してヒストンのメチル化を引き起こすことが実証されている。ヒストンH3およびH4は、ヒストンリジンデメチラーゼ（PKDM）を使った脱メチル化によっても操作されうる。最近同定されたこの酵素クラスの一ファミリーは、十文字（Jumonji）ドメイン（JmjC）と呼ばれる触媒活性部位を有している。JmjCが複数の補因子を利用してメチル基をヒドロキシル化することによってそれを除去すると、脱メチル化が起こる。JmjCは、モノ-、ジ-、およびトリ-メチル化基質を脱メチル化する能力を有する。

ヒストンメチルトランスフェラーゼ（HMT）とヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）の両方の活性を、悪性疾患からニューロパシーに及ぶさまざまな病理と関連付ける証拠はますます増えつつある。したがって、これらの酵素の阻害剤の同定は、創薬への出発点になりうる。

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）は、基質タンパク質上のアルギニン残基を翻訳後に非標準アミノ酸シトルリンに転化するカルシウム依存性酵素のファミリーである。PADが触媒するシトルリン化は、正のイミン基の喪失を伴って、強塩基性のアルギニン残基を中性アミノ酸に転化する。シトルリン化が引き起こす塩基性電荷の喪失は、基質タンパク質内の電荷分布を乱し、他の分子と相互作用する基質タンパク質の能力を変化させると考えられる。PADクラスの酵素によるヒストンタンパク質H2A、H3およびH4の脱イミノ化は、アルギニンメチル化を拮抗する。特に、PAD4アイソフォームは、ヒストンH2A、H3およびH4上のアルギニン残基のシトルリン化を触媒する能力を有する（Thompson, P.R. and Fast, W., ACS Chem Biol. 2006, 1, 433-441）。したがって、PAD酵素群は、「ヒストンコード」の修飾において果たすべき重要な役割を有し、それによって遺伝子転写に影響を及ぼしうる。

PAD酵素およびシトルリン化されたタンパク質は、関節リウマチ、多発性硬化症、アルツハイマー病を含む複数のヒト疾患とも関連付けられており、さらに最近になって、がんとも関連付けられている（Vossaar, E.R. et al「Citrullination of synovial proteins in mouse models of rheumatoid arthritis」(2003) Arthritis Rheum, Vol.48:2489-2500；Musse, A.A. et al.「Peptidyl arginine deiminase 2 (PAD2) over expression in transgenic mice leads to myelin loss in the central nervous system」(2008) Dis Model Mech. Vol.1:229-240；Ishigami,A. et al.「Abnormal accumulation of citrullinated proteins catalysed by peptidyl arginine deminiase in hippocampal extracts from patients with Alzheimer's disease」(2005) J Neurosci Res. Vol 80:120-128；およびChang X. et al.「Expression of peptidyl arginine deiminase type 4 (PAD4) in various tumours」(2006) Mol Carinog. Vol. 45:183-196）。

したがって、他の生物学的分子の構造を修飾する上述の酵素、特に、上に要約したヒストンタンパク質の修飾を触媒する酵素クラスに関するロバストで高感度なアッセイが必要とされている。特に、上述の酵素に関するロバストで高感度なアッセイであって、ハイスループットスクリーニングフォーマットで容易に応用することができ、酵素阻害剤の効率的なスクリーニングを可能にするものが必要とされている。

ヒストン修飾酵素の活性を調整する化合物を同定するために、放射能に基づくさまざまな酵素アッセイが報告されている。例えば、通常の標識補因子S-アデノシル-L-メチオニン（SAM）からヒストン由来ペプチド基質上のリジンのε-アミノ残基へのメチル基の転移を測定することによって、ヒストンメチルトランスフェラーゼの活性をモニターするためのアッセイが開発されている。しかし、ヒストンメチルトランスフェラーゼはリジンのモノ-、ジ-またはトリ-メチル化をどれでも行いうるので、放射性メチル基の組込みを測定しても、最終反応生成物の性質の情報は得られない。また、放射性アッセイの使用とその後の放射性核種の廃棄に付随する重大な危険もある。

マススペクトロスコピー（MS）も、ヒストンメチルトランスフェラーゼとヒストンアセチルトランスフェラーゼの活性を研究するために使用されている。MSを使用すれば、一定のヒストンメチルトランスフェラーゼによって生成する異なるメチル-リジン型、すなわちモノ-、ジ-、またはトリ-メチル化リジンを、同時に特徴づけることが可能になる。しかし、この技術はハイスループットスクリーニングへの応用には馴染まない。

ヒストンのアセチル化またはメチル化に関する非放射性アッセイが、ヒストンH3由来基質のインビトロ酵素修飾に基づいて開発されている。そのようなアッセイでは、メチル化反応生成物の検出が、標識抗体を使って行われる。そのようなアッセイの例は、PerkinElmer（商標）によって開発されたLanceUltra（商標）アッセイやAlphaLISA（商標）アッセイである。

WO2007/076302には、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性の調整因子に関するハイスループットアッセイが記載されている。そのアッセイは蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づいている。

本発明は、蛍光寿命（FLT）の測定に基づく、酵素の活性、特にペプチド基質の構造を修飾する能力を有する酵素、例えばペプチド基質のメチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化または脱イミノ化を触媒する酵素などの活性に関するアッセイを提供する。

本発明の第1の態様では、試験試料中の修飾酵素の活性をアッセイする方法であって、
（a）試験試料を、蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされたリンカー分子を含む蛍光変調酵素基質であって、基質は修飾酵素の作用によって修飾されて修飾基質を形成し、該修飾基質のリンカー分子は修飾の結果として第2酵素による切断に対して感受性になるかまたは第2酵素による切断から保護され、第2酵素による基質または修飾基質の切断が、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離するようになっている蛍光変調酵素基質と、接触させること；および
（b）修飾基質および/または基質に対する第2酵素の作用の結果としての蛍光成分の蛍光寿命の変化を検出することによって修飾基質の形成を検出すること
を含み、修飾基質の形成が修飾酵素の活性の指標を与える方法が提供される。

特定の実施形態において、本方法は、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、デイミナーゼ、タンパク質デメチラーゼおよびタンパク質デアセチラーゼからなる群より選択される修飾酵素の活性をアッセイするために使用することができる。より具体的には、以下の酵素クラスのそれぞれに関するアッセイが提供される：ヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼ（PKMT）、ヒストン-アルギニン N-メチルトランスフェラーゼ（PRMT）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）、ヒストンデメチラーゼ、特にヒストン-リジンデメチラーゼ（KDM）およびヒストン-アルギニンデメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）ならびにペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）。

本発明の第2の態様では、修飾酵素の阻害剤に関するスクリーニングの方法であって、試験化合物の存在下で本発明の第1の態様による方法を使って該修飾酵素をアッセイすることを含み、試験化合物の存在下における酵素活性の低下によって、その試験化合物が修飾酵素の阻害剤であると同定される方法が提供される。

特定の実施形態において、本方法は、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、デイミナーゼ、タンパク質デメチラーゼおよびタンパク質デアセチラーゼからなる群より選択される修飾酵素の阻害剤をスクリーニングするために使用することができる。より具体的には、以下の酵素クラスの阻害剤に関するスクリーニングの方法が、ここに提供される：ヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼ（PKMT）、ヒストン-アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ（PRMT）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）、ヒストンデメチラーゼ、特にヒストン-リジンデメチラーゼ（KDM）およびヒストン-アルギニンデメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）およびペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）。

本発明の第3の態様では、蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされたリンカー分子を含む蛍光変調酵素基質であって、基質は修飾酵素の作用によって修飾されて修飾基質を形成し、該修飾基質のリンカー分子は修飾の結果として第2酵素による切断に対して感受性になるかまたは第2酵素による切断から保護され、第2酵素による基質または修飾基質の切断が、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離するようになっている蛍光変調酵素基質が提供される。

本発明の第4の態様では、本発明の第3の態様による蛍光変調酵素基質と、蛍光変調酵素基質または基質に対する修飾酵素の作用によって形成される前記基質の修飾型を切断する能力を有するプロテアーゼであって、基質または修飾基質の切断が、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離することになるプロテアーゼとを含むキットが提供される。

デイミナーゼクラスの酵素をアッセイするための蛍光寿命法の例を模式的に図解した図である。本方法のこの具体例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。 PAD4デイミナーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質を示す図である。 PAD4アッセイ緩衝液におけるペプチド1〜3の蛍光寿命測定を経時的に示す図である。 ペプチド1〜3およびそれらのシトルリン化類似体のトリプシン切断を図解する図である。各ペプチドをさまざまな濃度（凡例に示す）のトリプシンと共にインキュベートし、蛍光寿命を経時的にモニターした：（A）ペプチド1；（B）ペプチド2；（C）ペプチド3。（D）5nMトリプシンと共にインキュベートした後のペプチド1〜3のシトルリン化体の蛍光寿命。シトルリン化類似体は、アルギニンがシトルリンで置き換えられているペプチド配列1〜3を含む。 アッセイ緩衝液中のPAD4ペプチド基質と対応するシトルリン化生成物との1：1混合物のRP-HPLCスペクトル：（A）ペプチド1；（B）ペプチド2；（C）ペプチド3。注：Arg＝アルギニン含有ペプチド；Cit＝シトルリン含有ペプチド。 基質としてペプチド1を含有するPAD4アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル：（A）t＝0分；（B）t＝30分；（C）t＝60分。 基質としてペプチド2を含有するPAD4アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル：（A）t＝0分；（B）t＝30分；（C）t＝60分。 基質としてペプチド3を含有するPAD4アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル：（A）t＝0分；（B）t＝30分；（C）t＝60分。 ペプチド1を基質とするPAD4アッセイのRP-HPLC分析からの主要9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0分、t_R＝14.3分；（B）t＝60分、t_R＝14.6分。 ペプチド3を基質とするPAD4アッセイのRP-HPLC分析からの主要9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0分、t_R＝13.8分；（B）t＝60分、t_R＝13.9分。 トリプシンと共にインキュベートする前と後でのPAD4アッセイ混合物の蛍光寿命の比較。酵素なしの対照（PAD4なし）を比較のために含めた。 ペプチド1を基質とするPAD4アッセイの経時変化。（A）10nMトリプシンを添加する前の蛍光寿命；（B）10nMトリプシンと共に室温で10分間インキュベートした後の蛍光寿命。 タンパク質リジンメチルトランスフェラーゼ（PKMT）およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMT）をアッセイするための蛍光寿命法の例を模式的に図解した図である。本方法のこれらの例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。 G9aメチルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質示す図である。 G9a蛍光寿命ベースプロテアーゼ保護アッセイにおける基質としてのペプチド4〜9の評価。 ペプチド4および9を基質とするG9a蛍光寿命（FLT）プロテアーゼ保護アッセイ。（A）Endo-Lys Cプロテアーゼを添加する前のG9a濃度の関数としてのFLT。（B）Endo-LysCと共に10分間インキュベートした後のG9a濃度の関数としてのFLT。（C）Endo-LysCと共に60分インキュベートした後のG9a濃度の関数としてのFLT。（D）および（E）は（B）および（C）と同じであるが、明瞭に見えるようにX軸を拡大し、プロテアーゼ保護の程度を示すための未切断ペプチド対照を含めた。 基質としてペプチド4を含有するG9aアッセイ混合物から以下の間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル：（A）t＝0分；（B）t＝6時間。 基質としてペプチド9を含有するG9aアッセイ混合物から以下の間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル：（A）t＝0分；（B）t＝6時間。 ペプチド4を基質とするG9aアッセイのRP-HPLC分析からの9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0分、t_R＝21.4分；（B）t＝6時間、t_R＝24.3分。 ペプチド9を基質とするG9aアッセイのRP-HPLC分析からの9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0分、t_R＝19.6分；（B）t＝6時間、t_R＝19.5分。 基質としてのペプチド4とさまざまな濃度のG9aとを用いたアッセイの経時変化。（A）2nM Endo-LysCによる切断前；（B）2nM Endo-LysCによる切断後。 基質としてのペプチド9とさまざまな濃度のG9aとを用いたアッセイの経時変化。（A）2nM Endo-LysCによる切断前；（B）2nM Endo-LysCによる切断後。 ペプチド4および9を基質として行われたFLT G9aプロテアーゼ保護アッセイについてのSAM濃度の関数としての平均寿命。 ペプチド4および9を基質として行われたFLT G9aプロテアーゼ保護アッセイについての阻害剤濃度の関数としての平均寿命。 タンパク質リジンデメチラーゼ（PKDM）およびタンパク質アルギニンデメチラーゼ（PRDM）をアッセイするための蛍光寿命法の例を模式的に図解した図である。本方法のこれらの具体例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。 リジン-36に作用するJHDM1AリジンデメチラーゼをアッセイするためのH3 N末端テール配列に基づく蛍光寿命基質を示す図である。 ヒストンアセチルトランスフェラーゼをアッセイするための蛍光寿命法の例を模式的に図解した図である。本方法のこの具体例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。 リジン-14をアセチル化するHAT酵素をアッセイするための、H3 N末端テール配列に基づく、蛍光変調ペプチド基質の案を示す図である。 ヒストンデアセチラーゼをアッセイするための蛍光寿命法の一例を模式的に図解した図である。本方法のこの具体例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。 FLTプロテアーゼ保護アプローチによってHDACをアッセイするための蛍光変調ペプチド基質の案を示す図である。Xaa＝任意のアミノ酸。 基質としてペプチド1を含有するPAD2アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル：（A）t＝0分；（B）t＝30分；（C）t＝120分。 ペプチド1を基質とするPAD2アッセイのRP-HPLC分析からの主要9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0分、t_R＝14.4分；（B）t＝120分、t_R＝14.7分。 トリプシンと共にインキュベートした後のPAD2アッセイ混合物の蛍光寿命測定。比較のためにペプチドだけの対照を含めた。 ペプチド1を基質とするPAD2アッセイの経時変化。 Endo-LysCと共にインキュベートした後のペプチド10を基質とするJHDM1Aアッセイ混合物の蛍光寿命測定。比較のためにペプチドだけの対照を含めた。 基質としてペプチド12を含有するSet7/9アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトルの重ね合わせ。（a）t＝0時間；（b）t＝2時間；（c）t＝6時間。 ペプチド12を基質とするSet7/9アッセイのRP-HPLC分析からの主要9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0時間、t_R＝18.3分；（B）t＝6時間、t_R＝18.4分。 Endo-LysCと共にインキュベートした後のSet7/9アッセイ混合物の蛍光寿命測定。比較のためにペプチドだけの対照を含めた。 基質としてのペプチド12とさまざまな濃度のSet7/9とを用いたアッセイの経時変化。（A）2nM Endo-LysCによる切断前；（B）2nM Endo-LysCによる切断後。 基質としてのペプチド13とさまざまな濃度のSet7/9とを用いたアッセイの経時変化。（A）2nM Endo-LysCによる切断前；（B）2nM Endo-LysCによる切断後。 ペプチド13を基質として行われたFLT Set7/9プロテアーゼ保護アッセイについてのSAM濃度の関数としての平均寿命。 ペプチド13を基質として行われたFLT Set7/9プロテアーゼ保護アッセイについてのSAH阻害剤濃度の関数としての平均寿命。 ペプチド13を基質として行われたFLT Set7/9プロテアーゼ保護アッセイについてのZ'ファクター。 Set7/9メチルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質を示す図である。 さまざまな濃度のEndo-ArgCによるペプチド15の切断についての、時間に対する平均寿命。 基質としてペプチド15を含有するPRMT5アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトルの重ね合わせ：（a）t＝0時間；（b）t＝3.5時間；（c）t＝17.5時間。 ペプチド15を基質とするPRMT5アッセイのRP-HPLC分析からの主要9AA標識ペプチドピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t＝0時間、t_R＝20.0分；（B）t＝17.5時間、t_R＝20.3分。 Endo-ArgCと共にインキュベートした後のPRMT5アッセイ混合物の蛍光寿命測定。比較のためにペプチドだけの対照を含めた。 基質としてのペプチド15とさまざまな濃度のPRMT5とを用いたアッセイの経時変化。（A）1.25nM Endo-ArgCによる切断前；（B）1.25nM Endo-ArgCによる切断後。 PRMT5メチルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質を示す図である。 ペプチド15を基質として行われたPRMT5 FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのシネフンギン阻害剤濃度の関数としての平均寿命。 Endo-LysCによるペプチド16の切断についての、時間に対する平均寿命。 PCAFアセチルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質を示す図である。 Endo-LysCによるペプチド17の切断についての、時間に対する平均寿命。 基質としてペプチド17を含有するpCAFアッセイ混合物から（A）0分、（B）30分、（C）60分、（D）90分の間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトル。 ペプチド17を基質とするpCAFアッセイのRP-HPLC分析からのピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t_R＝16.1分；（B）t_R＝16.7分。 基質としてのペプチド17とさまざまな濃度のPCAFとを用いたアッセイの経時変化。（A）25nM Endo-LysCによる切断前；（B）25nM Endo-LysCによる切断後。 基質としてペプチド17を用いたPCAF FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのAcCoAに関するK _M（app）の決定。 HDAC1デアセチラーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質を示す図である。 脱アセチル化生成物ペプチド。 さまざまな濃度のトリプシンによるペプチド18（A）およびペプチド19（B）の切断についての、時間に対する平均寿命。 基質としてペプチド18を含有するHDAC1アッセイ混合物から一定間隔で採取した試料のRP-HPLCスペクトルの重ね合わせ。 室温で2時間インキュベートした後のペプチド18によるHDAC1アッセイのRP-HPLC分析からのピークのエレクトロスプレーマススペクトル。（A）t_R＝19.1分；（B）t_R＝21.2分。 基質としてのペプチド18とさまざまな濃度のHDAC1とを用いたアッセイの経時変化。（A）10nMトリプシンによる切断前；（B）10nMトリプシンによる切断後。 基質としてペプチド18を用いたHDAC1 FLTプロテアーゼ保護アッセイについての基質K _Mの決定。 ペプチド18を基質として行われたHDAC1 FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのTSA阻害剤濃度の関数としての平均寿命。 ペプチド18を基質として行われたHDAC1 FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのZ'ファクター。 EZH2メチルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために合成された蛍光変調ペプチド基質を示す図である。 さまざまな濃度のEndo-LysCによるペプチド20の切断についての、時間に対する平均寿命。 基質としてのペプチド20とさまざまな濃度のEZH2複合体とを用いたアッセイの経時変化。 基質としてペプチド20を用いたEZH2 FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのSAMに関するK _M（app）の決定。 ペプチド20を基質として行われたEZH2 FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのSAH阻害剤濃度の関数としての平均寿命。 PAD4 FLTプロテアーゼ保護アッセイにおけるペプチド1に関する基質K _Mの決定。 ペプチド1を基質として行われたPAD4 FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのZ'ファクター。 ペプチド9を基質として行われたG9a FLTプロテアーゼ保護アッセイについてのZ'ファクター。

［発明の詳細な説明］
酵素（本明細書において修飾酵素と呼ぶもの）の活性を、その修飾酵素の基質に取り付けられた蛍光成分の蛍光寿命の変化を検出することに基づいてアッセイするための方法が、ここに提供される。

本発明では、まず、修飾酵素を含有することがわかっているか修飾酵素を含有すると疑われる試験試料を、修飾酵素の作用によって修飾されて修飾基質を形成する基質と接触させる。基質と、基質に対する修飾酵素の作用によって形成される修飾基質は、構造が異なっていて、基質と修飾基質の両方ではなくどちらか一方が、第2酵素の作用によって、蛍光成分と寿命調整因子成分との間に位置する切断部位において切断されうるのに対し、他方は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間のどの場所においても、第2酵素による切断から保護されるようになっている。したがって、基質に対する修飾酵素の作用による修飾基質の形成は、修飾基質および/またはそれが形成される元となった基質に対する第2酵素の作用をアッセイすることによって決定することができる。

本明細書において使用する用語「試験試料」は、単に、修飾酵素の活性について試験されるべき任意の試料を指す。これは例えば、適切な液体媒質、例えば酵素緩衝液中の、純粋なまたは半純粋な酵素の試料であってもよいし、酵素の活性について試験されるべき生物学的試料、例えば患者材料の臨床試料を指してもよい。

基質、およびその基質に対する修飾酵素の作用によって形成される修飾基質は、蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされている。蛍光成分の取り付け部位と蛍光寿命調整因子成分の取り付け部位との間の切断部位における第2酵素による基質または修飾基質の切断は、調整因子成分が蛍光成分の蛍光寿命をもはや調整しないような形で、基質を、蛍光成分を含有する第1部分と蛍光寿命調整因子成分を含有する第2部分とを含む少なくとも２つのパーツに、分離することになる。したがって、アッセイの最終読出しは、蛍光成分の蛍光寿命の測定に基づき、修飾基質（または基質）に対する第2酵素の作用の指標を与え、次にそれが、基質に対する修飾酵素の作用による修飾基質の形成の指標を与える。

「修飾酵素」という用語は、基質を修飾して修飾基質（この修飾基質は、構造が異なっていて、基質と修飾基質の両方ではなくどちらか一方が、第2酵素の作用によって、蛍光成分と寿命調整因子成分との間に位置する切断部位において切断されうるのに対し、他方は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間のどの場所においても、第2酵素による切断から保護されるようになっている）を形成する能力を有する任意の酵素を指す。修飾酵素は典型的には、ペプチドまたはタンパク質の構造を修飾する能力を有する酵素、例えばタンパク質またはペプチドの翻訳後修飾を触媒する酵素である。本明細書で詳述する特定の実施形態において、修飾酵素は、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、デイミナーゼ、タンパク質デメチラーゼおよびタンパク質デアセチラーゼからなる群より選択されうる。より具体的には、本明細書に一般論として記載するアッセイ方法論は、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素の活性をアッセイするために使用することができ、そのような酵素はエピジェネティクスの分野における重要なターゲットである。それゆえに、具体的実施形態において、修飾酵素は、以下の酵素クラスの一つに属しうる：ヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼ（PKMT）、ヒストン-アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ（PRMT）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）、ヒストンデメチラーゼ、特にヒストン-リジンデメチラーゼ（KDM）およびヒストン-アルギニンデメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）ならびにペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）。

基質は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との両方にコンジュゲートされたリンカー分子を含む。蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分は、蛍光寿命調整因子成分が蛍光成分の蛍光寿命を調整することができるように構成されている。それゆえに、基質は、「蛍光変調基質」または「蛍光変調酵素基質」と呼ぶことができ、これらの用語は区別なく使用される。

本明細書において使用する用語「蛍光成分」は、蛍光変調酵素基質にコンジュゲートされた蛍光ラベルを指す。

本明細書に記載するアッセイでは、蛍光成分の蛍光寿命の変化に基づく読出しを使用するので、アッセイのダイナミックレンジを増加させるために、（寿命調整が一切ない状態で）長い（典型的には10nsを超える、好ましくは10ns〜25nsの範囲内にある）蛍光寿命を示す蛍光成分を選択することが有利であるだろう。これに関連して「蛍光寿命」とは、発蛍光団が励起状態から基底状態へと減衰するのに要する平均時間と定義される。ただし、より短い蛍光寿命を示す蛍光成分の使用も、明らかに本発明の範囲に包含される。

好ましい蛍光成分には、WO2007/049057（引用により本明細書に組み込まれる）に記載の9-アミノアクリジンおよびその誘導体、アクリドン誘導体およびキナクリドン誘導体、例えばアクリドン化合物およびキナクリドン化合物、ならびに参考文献US7,727,739B2、WO02/099432およびWO03/089663（引用により本明細書に組み込まれる）に記載の他の蛍光成分、アクリジン成分およびアクリジニウム成分、AssayMetrics Limitedから入手することができるPuretime（商標）シリーズの色素、引用により本明細書に組み込まれるWO02/081509に記載のオキサジン誘導体（例えばMR121、JA242、JA243）およびローダミン誘導体（例えばJA165、JA167、JA169）などがあるが、これらに限るわけではない。（WO02/056670に記載の）他の例には、Cy5、Cy5.5およびCy7（Amersham）；IRD41およびIRD700（Licor）；NIR-1およびIC5-OSu（同仁化学）；Alexa fluor 660およびAlexa fluor 680（Molecular Probes）；LaJolla Blue（Diatron）；FAR-Blue、FAR-Green OneおよびFAR-Green Two（Innosense）；ADS 790-NSおよびADS 821-NS（American Dye Source）；インドシアニングリーン（ICG）およびその類似体（米国特許第5,968,479）；インドトリカルボシアニン（ITC、WO98/47538）；蛍光量子ドット（硫化亜鉛キャップセレン化カドミウムナノ結晶-QuantumDot Corp.）およびキレートランタノイド化合物（蛍光ランタノイド金属にはユーロピウムおよびテルビウムが含まれる）などがあるが、これらに限るわけではない。このリストは限定ではなく例示を意図したものである。

本明細書において使用する用語「蛍光寿命調整因子」は、蛍光変調酵素基質中に蛍光成分と蛍光寿命調整因子の両方が存在する場合に、蛍光成分の蛍光寿命を変化させる能力を有する化合物、コンジュゲートまたは成分を意味する。そのような蛍光調整の機序は、エネルギー移動、電子移動もしくは分子相互作用、またはそれらの組み合わせでありうるが、これらに限るわけではない。好ましい蛍光寿命調整因子には、インドリル成分およびその誘導体、例えばアミノ酸トリプトファンの側鎖中に存在するインドリル成分、フェノール成分およびその誘導体、例えばアミノ酸チロシンの側鎖中に存在するフェノール成分、イミダゾール成分およびその誘導体、例えばアミノ酸ヒスチジンの側鎖中に存在するイミダゾール成分、ベンジル成分およびその誘導体、例えばアミノ酸フェニルアラニンのベンジル側鎖、フェノキシ成分、ナフチル成分およびその誘導体、ナフチルアラニン成分、カルバゾール成分およびフェノチアジン成分などがあるが、これらに限るわけではない。このリストは限定ではなく例示を意図したものである。

蛍光成分および蛍光寿命調整成分は、蛍光寿命調整因子が存在しない場合と比較して、蛍光寿命調整因子の存在下では、蛍光成分の蛍光寿命が減少するように選択される。好ましくは、蛍光寿命調整因子が存在しない場合と比較して、蛍光寿命調整因子の存在下では、蛍光成分の蛍光寿命が変化し、より好ましくは、少なくとも0.1ns、少なくとも0.5ns、より好ましくは少なくとも2ns、さらに好ましくは少なくとも5ns、または少なくとも10ns減少する。調整効果は、蛍光変調酵素基質内での蛍光成分と調整因子との近接性および空間的配向に依存する。蛍光寿命調整因子の吸収スペクトルにとって、蛍光成分の放出スペクトルとオーバラップすることは、明示的要件ではない。これとは対称的に、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）過程は、ドナー成分とアクセプター成分の間の近接を必要とするだけでなく、アクセプター成分の吸収スペクトルとドナー成分の放出スペクトルとの間のスペクトルオーバーラップも必要とする。

有意な調整効果（例えば蛍光成分の蛍光寿命の5ns以上の変化）は、酵素アッセイのダイナミックレンジの重要な決定因子である。この点において、調整の度合、すなわち、調整因子が存在する場合の蛍光成分の蛍光寿命の変化の大きさは、蛍光成分の蛍光寿命の絶対的長さより重要でありうる。したがって、もしも、調整因子成分が調整の結果として蛍光成分の蛍光寿命を有意に短縮する（例えば少なくとも2nsの差）ことになるように、蛍光成分/調整因子の組み合わせが選択されるのであれば、蛍光成分の蛍光寿命の絶対的長さは、決定的な問題ではないだろう。それゆえに、両者をリンカーにコンジュゲートした時に、選択した調整因子がこの蛍光寿命の有意な減少（例えば2ns以上）を引き起こすのであれば、調整の非存在下で比較的「短い」蛍光寿命を示す蛍光成分（例えば10ns未満、または5ns未満）でもなお、蛍光変調基質に利用しうる。

しかし、蛍光化合物ライブラリー、自己蛍光または内部フィルター効果から生じる蛍光アッセイにおけるバックグラウンド干渉は、通常、5ns以下の領域にある短い寿命を有するので、長い蛍光寿命（＞10ns）を有する発蛍光団の使用には利点があるだろう。事実、蛍光成分の寿命に基づいて、そのようなバックグラウンドおよび化合物干渉と区別できることは、この分野では、蛍光強度に基づく方法、例えば限定するわけではないがFRETや蛍光偏光などとの比較で、この技法の重要な利点であると考えられる。長い蛍光寿命を有する発蛍光団は、区別が可能でないことも多い短い蛍光寿命を有する発蛍光団とは対照的に、このバックグラウンド蛍光および化合物干渉との区別を容易にする。

蛍光変調基質中に含めるための蛍光成分と蛍光寿命調整成分との適切な組み合わせは、蛍光寿命調整因子の存在下では蛍光成分の蛍光寿命が減少するように選択される。適当な組み合わせを選択するにあたって、蛍光寿命調整因子の吸収スペクトルにとって、蛍光成分の放出スペクトルとオーバラップすることが、明示的要件ではないことを強調しておく。蛍光変調基質は、それがある特定酵素アッセイにとって適当であれば、2つ以上の蛍光成分および/または2つ以上の蛍光寿命調整因子成分を含んでもよい。

蛍光変調酵素基質中に含めるための蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との好ましい組み合わせには、蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）とインドリル成分（特にトリプトファン残基のインドリル側鎖）である調整因子成分、蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）とナフチルアラニンまたはその誘導体である調整因子成分、蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）とカルバゾール成分またはその誘導体である調整因子成分、および蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と調整因子成分フェノチアジンまたはその誘導体などがあるが、これらに限るわけではない。他の適切な組み合わせには、アクリドンまたはその誘導体である蛍光成分と、インドリル成分（特にトリプトファン残基のインドリル側鎖）である調整因子成分や、キナクリドンまたはその誘導体である蛍光成分と、インドリル成分（特にトリプトファン残基のインドリル側鎖）である調整因子成分などがある。アクリドン系発蛍光団の蛍光寿命は、トリプトファン残基のインドリル側鎖によって調整されることが示されている（WO03/089663；Hassiepien, U et al. Screening. Vol.4, 2009, 11；Doering, K. et al. J Biomol. Screen., 2009, 14, 1）。列挙した組合せはどれでも、本明細書に記載する任意の蛍光変調酵素基質（構造に基づいて以下に定義する具体的基質を含む）に含めることができる。疑義が生じないように述べると、上記のセクションで述べた蛍光成分/調整因子成分の組合せは、以下に使用する構造の定義における成分FlおよびMに対応することができる。

蛍光変調酵素基質のリンカー分子構成要素は、蛍光成分の蛍光寿命の効果的な調整が達成されるように、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分とを適当なコンフィギュレーションに配置するのに役立つ。リンカー分子は、修飾基質を形成するための修飾酵素による蛍光変調酵素基質の修飾部位でもある。

好ましい実施形態では、基質のリンカー分子構成要素が、修飾酵素の作用によって修飾されて修飾ペプチドを形成することができるペプチドリンカーである。基質のリンカー分子構成要素がペプチドリンカーである実施形態では、修飾酵素の作用に起因する修飾型を「修飾ペプチドリンカー」と呼ぶことができる。ペプチドリンカーは、修飾酵素の作用によって修飾される少なくとも一つのアミノ酸残基を含みうる。以下に詳述するように、修飾酵素によって触媒されうるペプチド修飾のタイプには、メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化および脱イミノ化などがあるが、これらに限るわけではない。

修飾酵素の作用によって修飾されるペプチドリンカー内のアミノ酸残基は、一般的には、第2酵素（これは典型的にはプロテアーゼである）の認識部位を形成するアミノ酸配列コンテクスト中に存在する。第2酵素の認識部位は、ペプチドリンカーへの蛍光成分の取り付け部位とペプチドリンカーへの蛍光寿命調整因子成分の取り付け部位との間において切断が起こって、（基質または修飾基質のどちらか一方の）切断部位におけるペプチドリンカーの切断が、蛍光変調酵素基質（または修飾基質）を、蛍光成分を含む第1部分と、蛍光寿命調整因子成分を含む第2部分とに分離することになるように配置される。この分離の結果として、蛍光寿命調整因子成分は蛍光成分の蛍光寿命をもはや調整せず、したがって蛍光成分の蛍光寿命が増加することが観察されうる。

ペプチドリンカーを含む蛍光変調酵素基質は、典型的には、以下の一般構造に従うであろう：
Fl-X_n1-N-X_n2-M、またはFlとMの配向が逆になっている構造M-X_n1-N-X_n2-Fl
［式中、X_n1は1つ以上のアミノ酸の第1配列を表し、FlはX_n1（またはFlとMの配向が逆の場合はX_n2）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、Nは修飾酵素の作用によって修飾されるアミノ酸残基を表し、X_n2は1つ以上のアミノ酸の第2配列を表し、MはX_n2（またはFlとMの配向が逆の場合はX_n1）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］。修飾酵素による処理後に、基質は、一般構造：
Fl-X_n1-N_mod-X_n2-M、またはM-X_n1-N_mod-X_n2-Fl
［式中、N_modは残基Nの修飾誘導体を表す］
によって表される修飾基質に転化される。

蛍光成分FlはX_n1「にコンジュゲート」され、一方、蛍光寿命調整因子成分MはX_n2「にコンジュゲート」されるか、残基Nに対するFlとMの位置が逆の場合は、その逆である。必須の要件は、基質を切断するとFlとMとが分離されることである。したがって、「にコンジュゲート」という用語は、Flは、X_n1と表されるアミノ酸配列の任意の部分内で、基質のペプチドリンカーに接合することができ、かつMは、X_n2と表されるアミノ酸配列の任意の部分内で、基質のペプチドリンカーに接合することができ、またはその逆であることを意味している。FlとMがペプチドリンカーのC末端残基とN末端残基に接合されている実施形態も包含されるが、基質の構造を、そのような構造に限定するつもりはない。FlとMは、X_n1内または X_n2内の内部アミノ酸残基に接合することもできる。蛍光寿命調整因子Mは、X_n2（または位置が逆の場合はX_n1）中のアミノ酸残基の側鎖によって提供されてもよく、それはペプチドリンカーの内部残基であってもよいし、C末端残基またはN末端残基であってもよい。例えばMは、X_n1またはX_n2に組み込まれているトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはフェニルアラニン残基のインドリル側鎖、フェノール側鎖、イミダゾール側鎖およびベンジル側鎖によって提供されてもよい。FlおよびMの位置決めのこの定義/解釈は、以下に詳述する基質の具体的実施形態の全てに適用されるものとする。

X_n1およびX_n2は、最終構造X_n1-N-X_n2が修飾酵素による残基Nの修飾にとって適当な配列コンテクストを与えるように選択される。修飾酵素の活性が高度に配列依存的である場合、X_n1-N-X_n2のアミノ酸配列は全体として、その修飾酵素の天然基質の一部のアミノ酸配列を模倣することが適当であるだろう。例えば修飾酵素の天然基質がヒストンタンパク質である場合、X_n1-N-X_n2は、修飾酵素の作用によって修飾されるアミノ酸残基を取り囲むヒストンタンパク質の短いペプチドフラグメントの配列を模倣しうる。

配列X_n1-N-X_n2または修飾型X_n1-N_mod-X_n2の両方ではなく一方だけが、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における第2酵素による切断にとっての基質を形成することも重要である。ペプチドリンカーの使用に基づく実施形態では、第2酵素が一般にプロテアーゼであるだろう。当技術分野では、さまざまな基質特異性を有する広範囲にわたるプロテアーゼ酵素を入手することができる。したがって、修飾酵素によって触媒される修飾の性質に合致するように、プロテアーゼを選択することができる。アッセイの正しい作用にとって、第2酵素によって切断されない形態から第2酵素によって切断される形態への転化（またはその逆）が、もっぱら修飾酵素の活性だけに依存することは、極めて重要である。それゆえに、リンカーの切断によるFlとMの分離が残基Nの修飾に決定的に依存することを保証するために、リンカーが、残基Nにおける修飾には依存しないような形で蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における第2酵素によるリンカーの切断を許す部位を一切含有しないことを保証することが不可欠である。第2酵素が基質または修飾基質中のどこか他の場所にある第2切断部位を切断するかもしれないこと、そしてその場合に、その第2部位における基質切断が基質の修飾に依存しないことは、可能性として排除されない。基質修飾に依存しない第2部位における切断は、この第2部位における切断が蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分の分離をもたらさないことを条件として、許容することができる。例えば図2に示す基質は、蛍光寿命調整因子成分（トリプトファンのインドリル側鎖）を与えるトリプトファン残基とペプチドのC末端との間に位置するリジン残基におけるトリプシン切断に対して感受性でありうる。

X_n1-N-X_n2によって表されるアミノ酸残基は、全体として、基質のペプチドリンカー構成要素を構成する。ペプチドリンカーは、主として、従来のペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基から形成されうる。アミノ酸残基そのものは、天然アミノ酸残基でも、非天然アミノ酸残基でも、またはそれらの混合物でもよい。Nによって表されるアミノ酸残基が修飾酵素の作用によって修飾されうることが要件であることは明らかだが、他のアミノ酸残基の修飾も、基質が依然として残基Nにおける修飾を受けうるのであれば、許容される。1つ以上の非ペプチド結合を含むことも、基質または修飾基質のどちらかにおけるペプチドリンカーが第2酵素（例えばプロテアーゼ）によって依然として切断されうるのであれば、許容されうる。

成分Mによる成分Flの蛍光寿命の効果的な調整が達成されるように、蛍光変調酵素基質の全体的構造内で、蛍光成分Flと蛍光寿命調整因子成分Mとが、適当な空間的コンフィギュレーションに維持されていることも、重要な要件である。典型的には、FlとMはどちらも、直接的な共有結合によってペプチドリンカー（X_n1-N-X_n2）に取り付けられる。蛍光成分をペプチドに直接的に共有結合するのに適した方法は、引用により本明細書に組み込まれるWO2007/049057に記載されている。蛍光成分をタンパク質およびペプチドに取り付ける他の方法は、引用により本明細書に組み込まれるG.T. Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press（1996）に記載されている。

蛍光寿命調整因子Mが、X_n1またはX_n2に組み込まれているトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはフェニルアラニン残基のインドリル、フェノール、イミダゾールおよびベンジル側鎖によって提供される実施形態において、調整因子Mとして作用する側鎖を与えるアミノ酸残基は、それ自体が、X_n2（またはFLとMの位置が逆の実施形態においてはX_n1）によって表されるアミノ酸配列の一部を形成しうる。それゆえに、蛍光寿命調整因子Mとして作用するアミノ酸残基は、共有結合性のペプチド結合によってペプチドリンカーの残りの部分に接合されうる。

X_n1-N-X_n2によって表されるペプチドリンカーのアミノ酸配列は、ある範囲のさまざまな目的の修飾酵素に適合させることができ、それでもなお、FLT検出に基づくアッセイの一般原理は全てのアッセイに共通したままであるという点は、本明細書に記載するアッセイプラットフォームの特別な利点である。

蛍光寿命と蛍光強度の測定には従来の検出方法を使用しうる。これらの方法には、検出デバイスとして光電子増倍管を用いる計器が含まれる。これらの方法を使用することで、例えば
i）時間相関単一光子計数法に基づく方法（J R Lakowicz編「Principles of Fluorescence Spectroscopy」（Chapter 4）第2版，1999，Kluwer/Academic Press参照）；
ii）周波数領域/位相変調に基づく方法（J R Lakowicz編「Principles of Fluorescence Spectroscopy」（Chapter 5）第2版，1999，Kluwer/Academic Press参照）；および
iii）時間ゲーティングに基づく方法（Sanders et al., (1995) Analytical Biochemistry, 227 (2), 302-308参照）
など、いくつかのアプローチが可能である。

蛍光寿命を測定するのに適したデバイスは、時間相関単一光子計数法を使用するEdinburgh Instruments FLS920蛍光光度計およびEdinburgh Instruments NanoTaurus（商標）蛍光寿命プレートリーダー（Edinburgh Instruments、英国）や、時間ゲーティングを利用するIOM Nanoscanである。

蛍光強度/蛍光寿命の測定は、マルチウェルプレートのウェルの全てを撮像するために走査型撮像装置またはエリア型撮像装置などの電荷結合素子（CCD）撮像装置を使って行うことができる。

本アッセイ方法の読出しは、蛍光成分の蛍光寿命の変化によって報告される。一定の実施形態において、本アッセイは、存在する全ての蛍光種（すなわち、蛍光変調基質、および基質に対する修飾酵素の作用によって形成された修飾基質、ならびに蛍光変調基質または修飾基質のどちらか一方が第2酵素（例えばプロテアーゼ）の作用によって切断された時に生成する蛍光生成物）の蛍光寿命の組み合わせである平均蛍光寿命の測定に基づきうる。

修飾基質（蛍光変調基質に対する修飾酵素の作用によって形成されるもの）内での蛍光成分の蛍光寿命が、それが由来する蛍光変調基質内での蛍光成分の蛍光寿命と実質的に同じ長さであることは、理解されるであろう。というのも、修飾酵素によって触媒される修飾（例えばメチル化、アセチル化、脱メチル化、脱アセチル化、脱イミノ化）は、一般的には、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分の配向を、したがって蛍光寿命調整の度合を、有意に変化させないからである。蛍光成分の蛍光寿命は、蛍光変調基質と修飾基質のどちらにおいても調整される。蛍光寿命の変化は、蛍光変調基質または修飾基質の切断が起こって、蛍光成分にコンジュゲートされている基質の一部が、蛍光寿命調整因子にコンジュゲートされている基質の一部から分離され、それが調整を消滅させた場合にのみ、検出可能である。蛍光成分にコンジュゲートされている基質の切断部分は、蛍光変調基質より長い蛍光寿命を示す。

それゆえに、平均蛍光寿命測定は、調整ゆえに「短縮された」蛍光寿命を示す蛍光種（蛍光変調基質＋修飾基質）と、より長い（調整されていない）蛍光寿命を示す蛍光種（蛍光成分にコンジュゲートされている切断された基質部分）との相対的比率に応じて変動する。第2酵素で処理した後の「短」寿命蛍光種と「長」寿命蛍光種の相対的比率は、第2酵素を加えた時点で存在する「切断可能な」蛍光変調基質（または修飾基質）の量と、直接関係する。したがってそれは修飾酵素の活性とも直接関係する。蛍光寿命測定に言及する際の「長い」または「短い」という用語は、相対的な用語であって、調整されていない時と、蛍光寿命調整因子の存在によって調整されている時の、同じ蛍光成分の蛍光寿命に言及しており、特定の絶対値を含意するわけではない。

経時変化アッセイでは、修飾基質が、無修飾基質と比較して、第2酵素（例えばプロテアーゼ）による切断に対して感受性になるか、それとも第2酵素による切断から保護されるかに応じて、平均蛍光寿命は、100％無修飾基質に関するt＝0測定値との比較で経時的に増加または減少することが観察されうる。終点アッセイでは、修飾基質が、無修飾基質と比較して、第2酵素（例えばプロテアーゼ）による切断に対して感受性になるか、それとも第2酵素による切断から保護されるかに応じて、終点における平均寿命測定が、100％無修飾基質に対応するベースライン測定値よりも高くまたは低くなりうる。

平均寿命の測定に代わる選択肢として、アッセイは、特定構成要素の特徴的蛍光寿命の測定に基づくこともできる。例えば「長」蛍光寿命構成要素の存在量だけを測定するものとすることができる。長い蛍光寿命は、蛍光成分が蛍光寿命調整因子から分離されている切断生成物の特徴であるから、この測定は、濃度単位での切断基質の存在量に、直接関係しうる。経時変化アッセイでは、修飾基質が、第2酵素（例えばプロテアーゼ）による切断に対して感受性になるか、それとも第2酵素による切断から保護されるかに応じて、存在する長寿命特性構成要素（すなわち蛍光成分にコンジュゲートされている切断生成物）の絶対量は、100％無修飾基質に関するt＝0測定値との比較で、経時的に増加または減少することが観察されうる。終点アッセイでは、修飾基質が、無修飾基質と比較して、第2酵素（例えばプロテアーゼ）による切断に対して感受性になるか、それとも第2酵素による切断から保護されるかに応じて、存在する長寿命特性構成要素（すなわち蛍光成分にコンジュゲートされている切断生成物）の絶対量は、100％無修飾基質に対応するベースライン測定値よりも高くまたは低くなりうる。

蛍光寿命測定には、もっぱら蛍光強度の定量のみに基づく従来の蛍光技法と比較して、著しい利点がある。蛍光寿命は、同じスペクトル分解強度シグナルから決定されるが、さらに時間的領域でも分解される。この固有の蛍光特性は、プローブ濃度および体積に依存せず、自己蛍光、光散乱および内部フィルター効果ならびに光退色に左右されない。結果として、この方法の本質的性質は、より良い感度を有する、よりロバストなアッセイにつながるはずであり、蛍光化合物ライブラリーからのバックグラウンド干渉を最小限に抑えることを可能にして、薬物スクリーニングへの応用時には、より少ない偽陽性につながるはずである。

以下に本アッセイの非限定的な実施形態をさらに詳しく説明する。

（A）プロテアーゼ保護に基づくアッセイ
アッセイの実施形態の1つ目のグループは、蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされたペプチドリンカー分子を含む基質の使用に基づき、ここでは、ペプチドが修飾酵素の作用によって修飾されて修飾ペプチドを形成し、基質中のペプチドは第2酵素（すなわちプロテアーゼ）によって切断される能力を有し、かつ修飾酵素によるペプチドの修飾は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分の間における第2酵素（例えばプロテアーゼ）による切断から修飾ペプチドを保護する。そのような実施形態では、基質は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における第2酵素（プロテアーゼ）による切断に対して感受性であって、基質の切断は蛍光成分の蛍光寿命の増加をもたらすが、基質に対する修飾酵素の作用によって形成される修飾基質は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において、第2酵素（プロテアーゼ）によって切断されない。したがって、（基質に対する修飾酵素の作用による）修飾ペプチドの形成は、無修飾ペプチドとの比較でプロテアーゼ処理後の蛍光成分の蛍光寿命の時間依存的減少によって示される。

このアッセイの非限定的な実施形態は以下のとおりである。

（1）メチルトランスフェラーゼアッセイ
ある実施形態では、メチルトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイするために、本明細書に記載するアッセイ方法を適合させることができる。

メチルトランスフェラーゼアッセイのための基質はペプチドリンカーを含み、一般構造：
Fl-X1-N1-X2-M （I）
［式中、X1はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX1にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N1はメチルトランスフェラーゼの作用によってメチル化されるアミノ酸残基を表し、X2はアミノ酸の第2配列を表し、MはX2にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有しうる。メチルトランスフェラーゼによる処理後に、基質は、一般構造：
Fl-X1-N1(Me)-X2-M （II）
［式中、N(Me)は残基N上のメチル化を表す］
によって表される修飾（メチル化）基質に転化される。

FlとMとが実際にはどちらの配向で存在してもよいことは理解されるであろう。残基N1は、典型的には、リジン（リジンメチルトランスフェラーゼに関するアッセイの場合）またはアルギニン（アルギニンメチルトランスフェラーゼに関するアッセイの場合）である。

アミノ酸配列X1およびX2は、どちらも、残基N1をメチル化にとって適当な配列コンテクストに置くこと、（非メチル化構造（I）において）プロテアーゼによる切断のための認識部位を提供すること、そしてまた、Flの蛍光寿命の効果的な調整が達成されるように蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）の最適な配向を与えることを目的として選択される。X1およびX2の配列は、アッセイされるメチルトランスフェラーゼ酵素の天然基質の配列に基づきうる。

蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）とは蛍光寿命の効果的な調整のために適当な間隔で配置される必要があるものの、蛍光成分（Fl）または蛍光寿命調整因子（M）がペプチドリンカーの端（N末端またはC末端）に存在することが必須でないことは理解されるであろう。したがって、FlはX1内のアミノ酸残基に取り付けることができるし、MはX2内のアミノ酸残基に取り付けることができ、その逆も同じである。蛍光寿命調整因子Mが、それ自体、アミノ酸残基、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニンもしくはヒスチジンまたはその誘導体の側鎖によって提供される場合、調整因子Mとして作用するアミノ酸残基は、それ自体が、X2によって表されるアミノ酸配列の一部を形成しうる。アミノ酸配列X1およびX2は、天然または非天然アミノ酸残基、ならびに非ペプチド結合などの他の修飾を含有しうる。

アルギニンのメチル化に基づくアッセイの場合、Nによって表されるアルギニン残基は、問題のアルギニンメチルトランスフェラーゼ酵素の活性に依存して、モノメチル化またはジメチル化が可能であり、後者は対称的配置または非対称的配置をとる。メチル化の正確な度合と、ジメチル化型のコンフィギュレーションは、アッセイの遂行にとって本質的ではないので、アルギニンメチル化の場合、残基N(Me)は、モノ-、ジ-メチル化型のいずれをも表しうる。

リジンのメチル化に基づくアッセイの場合、Nによって表されるリジン残基は、問題のリジンメチルトランスフェラーゼ酵素の活性に依存して、モノ-、ジ-またはトリ-メチル化のいずれかが可能である。メチル化の正確な度合と、ジ-メチル化型またはトリ-メチル化型のコンフィギュレーションは、アッセイの遂行にとって本質的ではないので、リジンメチル化の場合、残基N(Me)は、モノ-、ジ-またはトリ-メチル化型のいずれをも表しうる。

構造（I）の基質において、蛍光成分Fl（これは好ましくは9-アミノアクリジン（9AA）であるが、他の任意の適切な蛍光成分であってもよい）の蛍光寿命は、基質中の蛍光寿命調整因子M（Mは好ましくはトリプトファンであるが、蛍光寿命の他の任意の既知の調整因子であってもよい）の存在によって調整されている。残基N1（例えばリジンまたはアルギニン）の隣りを切断するプロテアーゼで構造（I）の基質を処理すると、タンパク質加水分解が誘発され、調整因子Mによる蛍光寿命の調整は取り除かれることになる。適当なメチルトランスフェラーゼ酵素による残基N1（例えばリジンまたはアルギニン）のメチル化後は、構造（II）の修飾ペプチドをプロテアーゼで処理しても、残基N1後での切断は誘発されず、蛍光成分（Fl）の寿命は調整されたままである。例えば経時変化アッセイがそうであるように、基質（I）から修飾基質（II）への連続的な転化が起こっている場合には、蛍光成分（Fl）の蛍光寿命は、時間（およびメチルトランスフェラーゼ酵素の濃度）の関数として減少することになる。100％無修飾基質（I）に関するベースライン測定値と比較した蛍光寿命のシフト（減少）は、基質（I）から修飾基質（II）への転化がある程度起こったことを示す。したがって、このシフトの大きさを使って、メチルトランスフェラーゼの作用による基質（I）から修飾基質（II）への転化を評価することができる。

したがって、タンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、
（a）試験試料を、一般式（I）の蛍光変調酵素基質
Fl-X1-N1-X2-M （I）
［式中、X1はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX1にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N1はメチルトランスフェラーゼの作用によってメチル化されるアミノ酸残基を表し、X2はアミノ酸の第2配列を表し、MはX2にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
と、タンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の作用による蛍光変調酵素基質から一般式（II）の修飾基質
Fl-X1-N1(Me)-X2-M （II）
［式中、N(Me)は残基N上のメチル化を表す］
への酵素的転化を許す条件下で接触させること；
（b）ステップ（a）の生成物を、一般式（I）の蛍光変調酵素基質を残基N1の隣りで切断する能力は有するが一般式（II）の修飾基質をFlとMの間で切断する能力は有さないプロテアーゼ酵素と、接触させること；および
（c）蛍光成分Flの蛍光寿命の変化を検出し、それによってタンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイすること、
を含む方法が、ここに提供される。

この方法は、ステップ（a）において、阻害剤活性について試験しようとする候補化合物を加えることにより、タンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤のスクリーニングに、すぐに応用することができる。

1つ以上のメチル基をペプチド/タンパク質基質中のリジンまたはアルギニン残基に転移するタンパク質メチルトランスフェラーゼ（PMT）を、蛍光寿命プロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする方法の具体例を、添付の図13に模式的に示す。この例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。ただし、これらの具体的蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分は一例として示されているに過ぎず、それらを本明細書に記載するような代替的な蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分で置き換えうることは理解されるであろう。

上述の一般的方法論は、リジン上をメチル化するメチルトランスフェラーゼ（PKMTと総称される）とアルギニン上をメチル化するメチルトランスフェラーゼ（PRMTと総称される）の両方を含めて、任意の目的のメチルトランスフェラーゼ酵素での使用に適合させることができる。特定の実施形態では、本アッセイを使って、ヒストンタンパク質をリジン上またはアルギニン上でメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼの活性を決定することができる。本方法は、酵素クラスEC2.1.1.43に属する全てのヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼを含む、任意のヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼに応用しうる。この方法を使ってアッセイしうる具体的PKMT酵素には、例えばG9a、Set7/9、GLPおよびEZH2などがある。

タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMT）は、S-アデノシル-L-メチオニン（SAM）からアルギニン残基のグアニジノ窒素へのメチル基の転移を触媒する。PRMTは、それが対称ジメチル化を触媒するか非対称ジメチル化を触媒するかに基づいて、2タイプに分類することができる。H3特異的アルギニンメチルトランスフェラーゼCARM1/PRMT4は、1型タンパク質N-メチルトランスフェラーゼファミリーに属する。適切なPRMT酵素には、例えばPRMT1、PRMT3、およびPRMT5も含まれる。本アッセイ方法は、酵素クラスEC2.1.1.125に属する任意のヒストン-アルギニンN-メチルトランスフェラーゼを含むヒストン-アルギニンN-メチルトランスフェラーゼの活性を決定するために使用することができる。

蛍光成分としての9-アミノアクリジン（9AA）の使用と、蛍光寿命調整因子成分としてのトリプトファン（W）の使用とに基づく、代表的PKMT酵素G9aと共に使用するための基質の例には、次に挙げるものが含まれる。
ペプチド4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂
ペプチド7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂

K⁹は、PKMT酵素G9aの作用によるメチル化の部位であるリジン残基を表し、G9aの天然基質を形成するヒストンH3内でリジンメチル化が起こる配列コンテクストを模倣している。

蛍光成分としての9-アミノアクリジン（9AA）の使用と、蛍光寿命調整因子成分としてのトリプトファン（W）の使用とに基づく、代表的PKMT酵素Set7/9と共に使用するための基質の例には、次に挙げるものが含まれる。
ペプチド12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
ペプチド13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

K⁴は、PKMT酵素Set7/9の作用によるメチル化の部位であるリジン残基を表し、Set7/9の天然基質を形成するヒストンH3内でリジンメチル化が起こる配列コンテクストを模倣している。

蛍光成分としての9-アミノアクリジン（9AA）の使用と、蛍光寿命調整因子成分としてのトリプトファン（W）の使用とに基づく、代表的PRMT酵素PRMT5と共に使用するための基質の例には、次に挙げるものが含まれる。
ペプチド14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
ペプチド15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

R³は、PRMT酵素PRMT5の作用によるメチル化の部位であるアルギニン残基を表し、PRMT5の天然基質を形成するヒストンH4内でアルギニンメチル化が起こる配列コンテクストを模倣している。ペプチド15は、N末端がアセチル化（Ac）されている。

蛍光成分としての9-アミノアクリジン（9AA）の使用と、蛍光寿命調整因子成分としてのトリプトファン（W）の使用とに基づく、代表的PKMT酵素EZH2と共に使用するための基質の例には、次に挙げるものが含まれる。
ペプチド20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂

K²⁷は、PKMT酵素EZH2の作用によるメチル化の部位であるリジン残基を表し、EZH2の天然基質を形成するヒストンH3内でリジンメチル化が起こる配列コンテクストを模倣している。

他のPKMTおよびPRMT酵素をアッセイする際に使用するのに適したペプチド基質は、下記の実施例に例示する一般原理に従って調製することができる。

上に概説した一般的アプローチにおいて使用するのに適したプロテアーゼには、リジン後を切断するEndo-LysC（リジンのメチル化に基づくアッセイ用）およびアルギニン後を切断するEndo-ArgC（アルギニンのメチル化に基づくアッセイ用）などがあるが、これらに限るわけではない。

（2）アセチルトランスフェラーゼアッセイ
ある実施形態では、アセチルトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイするために、本明細書に記載するアッセイ方法を適合させることができる。

このアッセイのための基質はペプチドリンカーを含み、一般構造（III）：
Fl-X3-N2-X4-M （III）
［式中、X3はアミノ酸の第1配列を表し、Flは、X3にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N2はアセチルトランスフェラーゼの作用によってアセチル化されるアミノ酸残基を表し、X4はアミノ酸の第2配列を表し、MはX4にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する。アセチルトランスフェラーゼによる処理後に、基質は、一般構造：
Fl-X3-N2(Ac)-X4-M （IV）
［式中、N2(Ac)は残基N2上でのアセチル化を表す］
によって表される修飾（アセチル化）基質に転化される。

FlとMとが実際にはどちらの配向で存在してもよいことは理解されるであろう。残基N2は、典型的には、リジン（リジンアセチラーゼに関するアッセイの場合）である。

アミノ酸配列X3およびX4は、どちらも、残基N2を、アセチル化と（非アセチル化構造（III）における）プロテアーゼによる切断とにとって適当な配列コンテクストに置くこと、そしてまた、Flの蛍光寿命の効果的な調整が達成されるように蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）の最適な配向を与えることを目的として選択される。X3およびX4の配列は、アッセイされるアセチルトランスフェラーゼ酵素の天然基質の配列に基づきうる。蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）とは蛍光寿命の効果的な調整のために適当な間隔で配置される必要があるものの、蛍光成分（Fl）または蛍光寿命調整因子（M）がペプチドリンカーの端（N末端またはC末端）に存在することが必須でないことは理解されるであろう。したがって、FlはX3内のアミノ酸残基に取り付けることができるし、MはX4内のアミノ酸残基に取り付けることができ、その逆も同じである。蛍光寿命調整因子Mが、それ自体、アミノ酸残基、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニンもしくはヒスチジンまたはその誘導体の側鎖によって提供される場合、調整因子Mとして作用するアミノ酸残基は、それ自体が、X4によって表されるアミノ酸配列の一部を形成しうる。アミノ酸配列X3およびX4は、天然または非天然アミノ酸残基、ならびに非ペプチド結合などの他の修飾を含有しうる。

構造（III）の基質において、蛍光成分Fl（これは好ましくは9-アミノアクリジン（9AA）であるが、他の任意の適切な蛍光成分であってもよい）の蛍光寿命は、基質中の蛍光寿命調整因子M（Mは好ましくはトリプトファンであるが、蛍光寿命の他の任意の既知の調整因子であってもよい）の存在によって調整されている。残基N2（例えばリジン）後を切断するプロテアーゼで構造（III）の基質を処理すると、タンパク質加水分解が誘発され、調整因子Mによる蛍光寿命の調整は取り除かれることになる。適当なアセチルトランスフェラーゼ酵素による残基N2（例えばリジン）上のアセチル化後は、構造（IV）の修飾ペプチドをプロテアーゼで処理しても、残基N2後での切断は誘発されず、蛍光成分（Fl）の寿命は調整されたままである。例えば経時変化アッセイがそうであるように、基質（III）から修飾基質（IV）への連続的な転化が起こっている場合には、蛍光成分（Fl）の蛍光寿命は、時間（およびアセチルトランスフェラーゼ酵素の濃度）の関数として減少することになる。100％無修飾基質（III）に関するベースライン測定値と比較した蛍光寿命のシフト（減少）は、基質（III）から修飾基質（IV）への転化がある程度起こったことを示す。したがって、このシフトの大きさを使って、アセチルトランスフェラーゼの作用による基質（III）から修飾基質（IV）への転化を評価することができる。

したがって、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、
（a）試験試料を、一般式（III）の蛍光変調酵素基質
Fl-X3-N2-X4-M （III）
［式中、X3はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX3にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N2はアセチルトランスフェラーゼの作用によってアセチル化されるアミノ酸残基を表し、X4はアミノ酸の第2配列を表し、MはX4にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
と、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ酵素の作用による蛍光変調酵素基質から一般式（IV）の修飾基質
Fl-X3-N2(Me)-X4-M （IV）
［式中、N2(Ac)は残基N2上のアセチル化を表す］
への酵素的転化を許す条件下で接触させること；
（b）ステップ（a）の生成物を、一般式（III）の蛍光変調酵素基質を残基N2の隣りで切断する能力は有するが一般式（IV）の修飾基質をFlとMの間で切断する能力は有さないプロテアーゼ酵素と、接触させること；および
（c）蛍光成分Flの蛍光寿命の変化を検出し、それによってタンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイすること、
を含む方法が、ここに提供される。

この方法は、ステップ（a）において、阻害剤活性について試験しようとする候補化合物を加えることにより、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤のスクリーニングに、すぐに応用することができる。

ペプチド/タンパク質基質中のリジン残基をアセチル化するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）を、FLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする方法の具体例を、添付の図27に示す。この例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。ただし、これらの具体的蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分は一例として示されているに過ぎず、それらを本明細書に記載するような代替的な蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分で置き換えうることは理解されるであろう。

上述の一般的方法論は、任意の目的のアセチルトランスフェラーゼ酵素、例えば限定するわけではないが、任意の既知のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）酵素、例えば酵素クラスEC2.3.1.48に属する任意のヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性を決定するために応用することができる。特に、本アッセイ方法は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼGcn5、PCAF、Hat1およびp300に応用することができるが、これらは非限定的な例である。

特定のHATにとってのアセチル化の部位であるリジン残基に隣接して発蛍光団（Fl）と調整因子成分（M）とが組み込まれているヒストンN末端配列に基づくペプチド基質は、このクラスの酵素に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイの基礎を成すであろう。そのような基質の例を以下に示すと共に、図28および図53にも示す。これらは、蛍光成分としての9-アミノアクリジン（9AA）および蛍光寿命調整因子成分としてのトリプトファン（W）の使用と、PCAFなどのHATによるアセチル化の部位であるK¹⁴を有するヒストンH3配列に基づいている。
ペプチド16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂
ペプチド17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂

他のアセチルトランスフェラーゼ酵素をアッセイする際に使用するのに適したペプチド基質は、下記の実施例に例示する一般原理に従って調製することができる。

上に概説した一般的アプローチにおいて使用するのに適したプロテアーゼには、リジン後を切断するEndo-LysC（リジンのアセチル化に基づくアッセイ用）があるが、これに限るわけではない。

（3） デイミナーゼアッセイ
ある実施形態では、デイミナーゼ酵素の活性をアッセイするために、本明細書に記載するアッセイ方法を適合させることができる。

このアッセイのための基質はペプチドリンカーを含み、一般構造：
Fl-X5-R-X6-M （V）
［式中、X5はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX5にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、Rはデイミナーゼの作用によってシトルリンに転化されるアルギニン残基を表し、X6はアミノ酸の第2配列を表し、MはX6にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する。デイミナーゼによる処理後に、基質は、一般構造：
Fl-X5-R(Cit)-X6-M （VI）
［式中、R(Cit)は脱イミノ化による残基Rからシトルリンへの転化を表す］
によって表される修飾（脱イミノ化）基質に転化される。

FlとMとが実際にはどちらの配向で存在してもよいことは理解されるであろう。アミノ酸配列X5およびX6は、どちらも、残基Rを、シトルリンへの脱イミノ化と（構造（V）における）プロテアーゼによる分解とにとって適当な配列コンテクストに置くこと、そしてまた、効果的な調整が達成されるように蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）の最適な配向を与えることを目的として選択される。X5およびX6の配列は、アッセイされるデイミナーゼ酵素の天然基質の配列に基づきうる。蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）とは蛍光寿命の効果的な調整のために適当な間隔で配置される必要があるものの、蛍光成分（Fl）または蛍光寿命調整因子（M）がペプチドリンカーの端（N末端またはC末端）に存在することが必須でないことは理解されるであろう。したがって、FlはX5内のアミノ酸残基に取り付けることができるし、MはX6内のアミノ酸残基に取り付けることができ、その逆も同じである。蛍光寿命調整因子Mが、それ自体、アミノ酸残基、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニンもしくはヒスチジンまたはその誘導体の側鎖によって提供される場合、調整因子Mとして作用するアミノ酸残基は、それ自体が、X6によって表されるアミノ酸配列の一部を形成しうる。アミノ酸配列X5およびX6は、天然または非天然アミノ酸残基、ならびに非ペプチド結合などの他の修飾を含有しうる。

構造（V）の基質において、蛍光成分Fl（これは好ましくは9-アミノアクリジン（9AA）であるが、他の任意の適切な蛍光成分であってもよい）の蛍光寿命は、基質中の蛍光寿命調整因子M（Mは好ましくはトリプトファンであるが、蛍光寿命の他の任意の既知の調整因子であってもよい）の存在によって調整されている。残基R後を切断するプロテアーゼで構造（V）の基質を処理すると、タンパク質加水分解が誘発され、調整因子Mによる蛍光寿命の調整は取り除かれることになる。適当なデイミナーゼ酵素による残基Rからシトルリンへの転化後は、構造（VI）の修飾ペプチドをプロテアーゼで処理しても、残基R後での切断は誘発されず、蛍光成分（Fl）の寿命は調整されたままである。例えば経時変化アッセイがそうであるように、基質（V）から修飾基質（VI）への連続的な転化が起こっている場合には、蛍光成分（Fl）の蛍光寿命は、時間（およびデイミナーゼ酵素の濃度）の関数として減少することになる。100％無修飾基質（V）に関するベースライン測定値と比較した蛍光寿命のシフト（減少）は、基質（V）から修飾基質（VI）への転化がある程度起こったことを示す。したがって、このシフトの大きさを使って、デイミナーゼの作用による基質（V）から修飾基質（VI）への転化を評価することができる。

したがって、デイミナーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、
（a）試験試料を、一般式（V）の蛍光変調酵素基質
Fl-X5-R-X6-M （V）
［式中、X5はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX5にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、Rはデイミナーゼの作用によってシトルリンに転化されるアルギニン残基を表し、X6はアミノ酸の第2配列を表し、MはX6にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
と、蛍光変調酵素基質から、デイミナーゼ酵素の作用によって形成される一般式（VI）の修飾基質
Fl-X5-R(Cit)-X6-M （VI）
［式中、R(Cit)はシトルリンを表す］
への酵素的転化を許す条件下で接触させること；
（b）ステップ（a）の生成物を、一般式（V）の蛍光変調酵素基質を残基Rの隣りで切断する能力は有するが一般式（VI）の修飾基質をFlとMの間で切断する能力は有さないプロテアーゼ酵素と、接触させること；および
（c）蛍光成分Flの蛍光寿命の変化を検出し、それによってデイミナーゼ酵素の活性をアッセイすること
を含む方法が、ここに提供される。

この方法は、ステップ（a）において、阻害剤活性について試験しようとする候補化合物を加えることにより、デイミナーゼ酵素の阻害剤のスクリーニングに、すぐに応用することができる。

デイミナーゼクラスの酵素、具体的にはペプチド/タンパク質基質中のアルギニン残基をシトルリンに転化するペプチジルアルギニンデイミナーゼを、FLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする方法の具体例を、図1に模式的に示す。この例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。ただし、これらの具体的蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分は一例として示されているに過ぎず、それらを本明細書に記載するような代替的な蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分で置き換えうることは理解されるであろう。

上述の一般的方法論は、任意の目的のデイミナーゼ酵素、例えば限定するわけではないが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）酵素、例えばPAD1、PAD2、PAD3、PAD4およびPAD6での使用に適合させることができる。特に本方法は、酵素クラスEC3.5.1.15に属する任意のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）に応用することができる。PAD酵素は、代替的にタンパク質-アルギニンデイミナーゼと呼ぶこともできる。

蛍光成分としての9-アミノアクリジン（9AA）の使用と、蛍光寿命調整因子成分としてのトリプトファン（W）の使用とに基づく、PAD2またはPAD4の活性をアッセイする際に使用するのに適した基質の例を次に示す。
ペプチド1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂
ペプチド3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂

他のデイミナーゼ酵素、具体的には他のペプチジルアルギニンデイミナーゼをアッセイする際に使用するのに適したペプチド基質は、上に概説し下記の実施例に例示する一般原理に従って調製することができる。

上に概説した一般的アプローチにおいて使用するのに適したプロテアーゼには、トリプシンおよびアルギニン後を切断するEndo-ArgCがあるが、これらに限るわけではない。

（B）修飾によるプロテアーゼ保護の除去に基づくアッセイ
アッセイの実施形態の２つ目のグループは、蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされたペプチドリンカー分子を含む基質の使用に基づき、ここでは、ペプチドが修飾酵素の作用によって修飾されて修飾ペプチドを形成し、基質中のペプチドは、第2酵素（すなわちプロテアーゼ）によって蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断される能力を有さず、かつ修飾酵素によるペプチドの修飾は、ペプチドを、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において第2酵素（すなわちプロテアーゼ）によって切断される修飾ペプチドに転化する。そのような実施形態では、基質は、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における第2酵素（プロテアーゼ）による切断に対して感受性ではないが、基質に対する修飾酵素の作用によって形成される修飾基質は、第2酵素（プロテアーゼ）により、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断されて、蛍光成分の蛍光寿命の増加をもたらす。したがって、（基質に対する修飾酵素の作用による）修飾ペプチドの形成は、無修飾ペプチドと比較した、プロテアーゼ処理後の蛍光成分の蛍光寿命の時間依存的増加によって示される。

このアッセイの非限定的実施形態は以下のとおりである。

（4）デメチラーゼアッセイ
ある実施形態では、デメチラーゼ酵素の活性をアッセイするために、本明細書に記載するアッセイ方法を適合させることができる。

このアッセイのための基質はペプチドリンカーを含み、一般構造（VII）：
Fl-X7-N3(Me)-X8-M （VII）
［式中、X7はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX7にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N3(Me)はデメチラーゼの作用によって脱メチル化されるメチル化されたアミノ酸残基（例えばメチル化リジンまたはメチル化アルギニン）を表し、X8はアミノ酸の第2配列を表し、MはX8にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する。デメチラーゼによる処理後に、基質は、一般構造：
Fl-X7-N3-X8-M （VIII）
［式中、N3は、脱メチル化されたアミノ酸、例えばリジンまたはアルギニンを表す］
によって表される修飾（脱メチル化）基質に転化される。

FlとMとが実際にはどちらの配向で存在してもよいことは理解されるであろう。アミノ酸配列X7およびX8は、どちらも、残基N3(Me)を、脱メチル化と（構造（VIII）の修飾基質における）プロテアーゼによる切断とにとって適当な配列コンテクストに置くこと、そしてまた、効果的な調整が達成されるように蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）の最適な配向を与えることを目的として選択される。X7およびX8の配列は、アッセイされるデメチラーゼ酵素の天然基質の配列に基づきうる。蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）とは蛍光寿命の効果的な調整のために適当な間隔で配置される必要があるものの、蛍光成分（Fl）または蛍光寿命調整因子（M）がペプチドリンカーの端（N末端またはC末端）に存在することが必須でないことは理解されるであろう。したがって、FlはX7内のアミノ酸残基に取り付けることができるし、MはX8内のアミノ酸残基に取り付けることができ、その逆も同じである。蛍光寿命調整因子Mが、それ自体、アミノ酸残基、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニンもしくはヒスチジンまたはその誘導体の側鎖によって提供される場合、調整因子Mとして作用するアミノ酸残基は、それ自体が、X8によって表されるアミノ酸配列の一部を形成しうる。アミノ酸配列X7およびX8は、天然または非天然アミノ酸残基、ならびに非ペプチド結合などの他の修飾を含有しうる。

アルギニンの脱メチル化に基づくアッセイの場合、N(Me)によって表されるアルギニン残基は、アッセイ対象である活性を有するデメチラーゼ酵素の基質特異性に依存して、モノメチル化体またはジメチル化体であることができ、後者は対称的配置または非対称的配置をとる。メチル化の正確な度合と、ジメチル化型のコンフィギュレーションは、アッセイされるデメチラーゼ酵素が、基質をプロテアーゼによって切断されうる完全脱メチル化型まで脱メチル化することができるのであれば、アッセイの遂行にとって本質的ではない。したがって残基N(Me)は、アルギニンメチル化の場合は、そのアッセイとの関連において適宜、モノ-メチル化型またはジ-メチル化型のいずれをも表しうる。

リジンの脱メチル化に基づくアッセイの場合、N(Me)によって表されるリジン残基は、アッセイ対象である活性を有するリジンデメチラーゼ酵素の基質特異性に依存して、モノ-、ジ-またはトリ-メチル化体であることができる。出発基質のメチル化の正確な度合と、ジ-メチル化型のコンフィギュレーションは、アッセイされるリジンデメチラーゼ酵素が、基質をプロテアーゼによって切断されうる完全脱メチル化型まで脱メチル化することができるのであれば、アッセイの遂行にとって本質的ではない。したがって残基N(Me)は、リジンメチル化の場合は、そのアッセイとの関連において適宜、モノ-、ジ-またはトリ-メチル化型のいずれをも表しうる。

構造（VII）の基質において、蛍光成分Fl（これは好ましくは9-アミノアクリジン（9AA）であるが、他の任意の適切な蛍光成分であってもよい）の蛍光寿命は、基質中の蛍光寿命調整因子M（Mは好ましくはトリプトファンであるが、蛍光寿命の他の任意の既知の調整因子であってもよい）の存在によって調整されている。デメチラーゼ酵素が一切存在しない場合は、残基N3（例えばリジンまたはアルギニン）後を切断するプロテアーゼで構造（VII）の基質を処理しても、FlとMの間での構造（VII）のタンパク質加水分解は誘発されない。というのも、構造（VII）の基質はメチル化型のN3を含有しており、それゆえに、タンパク質加水分解に対して耐性だからである。それゆえに蛍光寿命調整因子M（例えばトリプトファン）による蛍光成分Fl（例えば9AA）の蛍光寿命調整は存続する。デメチラーゼの存在下では、残基N3(Me)が脱メチル化されて、構造（VIII）の修飾基質中の残基N3を形成する。構造（VIII）の修飾基質をプロテアーゼで処理すると、残基N3（例えばリジンまたはアルギニン）後での切断が誘発され、発蛍光団（例えば9AA）の蛍光寿命がもはや調整されなくなる。例えば経時変化アッセイがそうであるように、基質（VII）から修飾基質（VIII）への連続的な転化が起こっている場合には、より多くの修飾基質が形成され、プロテアーゼの作用によって切断されるので、蛍光成分（Fl）の蛍光寿命が、時間（およびデメチラーゼ酵素の濃度）の関数として増加することになる。100％無修飾基質（VII）に関するベースライン測定値と比較した蛍光寿命のシフト（増加）は、基質（VII）から修飾基質（VIII）への転化がある程度起こったことを示す。したがって、このシフトの大きさを使って、デメチラーゼの作用による基質（VII）から修飾基質（VIII）への転化を評価することができる。

したがって、タンパク質デメチラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、
（a）試験試料を、一般式（VII）の蛍光変調酵素基質
Fl-X7-N3(Me)-X8-M （VII）
［式中、X7はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX7にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N3(Me)はデメチラーゼの作用によって脱メチル化されるメチル化アミノ酸残基（例えばメチル化リジンまたはメチル化アルギニン）を表し、X8はアミノ酸の第2配列を表し、MはX8にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
と、デメチラーゼ酵素の作用による蛍光変調酵素基質から一般式（VIII）の修飾基質
Fl-X7-N3-X8-M （VIII）
［式中、N3は、脱メチル化されたアミノ酸を表す］
への酵素的転化を許す条件下で接触させること；
（b）ステップ（a）の生成物を、一般式（VIII）の修飾基質を残基N3の隣りで切断する能力を有するが一般式（VII）の蛍光変調酵素基質をFlとMの間で切断する能力は有さないプロテアーゼ酵素と接触させること；および
（c）蛍光成分Flの蛍光寿命の変化を検出し、それによってデメチラーゼ酵素の活性をアッセイすること
を含む方法が、ここに提供される。

この方法は、ステップ（a）において、阻害剤活性について試験しようとする候補化合物を加えることにより、デメチラーゼ酵素の阻害剤のスクリーニングに、すぐに応用することができる。

ペプチド/タンパク質基質中のリジンまたはアルギニン残基から1つ以上のメチル基を除去するタンパク質デメチラーゼ（PDM）を、FLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする方法の具体例を、図25に模式的に示す。この例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。ただし、これらの具体的蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分は一例として示されているに過ぎず、それらを本明細書に記載するような代替的な蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分で置き換えうることは理解されるであろう。

上述の一般的方法論は、任意の目的のデメチラーゼ酵素での使用に適合させることができる。特に好ましいのは、リジン上がメチル化されているペプチド基質を脱メチル化するPKDM酵素である。特に、本アッセイ方法は、ヒストン-リジンデメチラーゼに応用することができる。ヒストン-リジンデメチラーゼは基質特異性に従って分類することができる。ヒストンタンパク質H3中のリジン残基を脱メチル化するヒストン-リジンデメチラーゼは、リジン4（[ヒストン-H3]-リジン-4デメチラーゼという；EC1.14.11.B2）、リジン9（[ヒストン-H3]-リジン-9デメチラーゼという；EC1.14.11.B1）、リジン36（[ヒストン-H3]-リジン-36デメチラーゼという；EC1.14.11.27）またはリジン27（[ヒストン-H3]-リジン-27デメチラーゼという）を脱メチル化しうる。ヒストンタンパク質H4中のリジン残基を脱メチル化するヒストン-リジンデメチラーゼは、リジン20を脱メチル化しうる。上述のアッセイ方法は、ヒストン-リジンデメチラーゼのこれらのクラスに属する酵素、例えば限定するわけではないがLSD1、JHDM1A、JMJD1A、JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C、JMJD3(KDM6)、FBXL(KDM2)およびKDM5などに応用することができる。

本アッセイは、アルギニンがメチル化されているペプチド基質を脱メチル化するアルギニンデメチラーゼ酵素（PRDM酵素）、例えばJMJD6に応用することもできる。

代表的PKDM酵素JHDM1AのFLTアッセイに適した基質を以下に示す。JHDM1Aは、ヒストンH3のリジン36を優先的に脱メチル化して、それをジ-またはモノ-メチル化状態から本来の非メチル化残基へと転化する。したがって基質は適当な配列コンテクストにある残基リジン-36に基づく。
ペプチド10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂
この基質例では、蛍光成分の蛍光寿命9AA（または他の適切な蛍光成分）が、C末端近くに組み込まれたトリプトファン残基（または他の適切な蛍光寿命調整因子）の存在によって調整されている。JHDM1Aによるリジン-36の脱メチル化は、この残基におけるプロテアーゼ誘発性切断を可能にし、それによって調整を取り除き、9AAの蛍光寿命の増加をもたらす。これに対して、JHDM1A阻害剤の存在はリジン脱メチル化を防止し、それによって、リジン-36におけるプロテアーゼ誘発性切断に対して耐性なペプチドを残すであろう。したがって9AAの蛍光寿命は調整されたままであり、調整の程度を脱メチル化の度合に相関させることができるであろう。このアッセイにおける使用に適したプロテアーゼは、メチル化リジン（リジン-37はこの残基における非特異的切断を防ぐためにモノメチル誘導体として保護されている）を切断しないEndo-LysCであるだろう。

代表的PKDM酵素JHDM1AのFLTアッセイに適したもう一つの基質を以下に示す。
ペプチド11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂
この基質例では、蛍光成分の蛍光寿命9AA（または他の適切な蛍光成分）が、C末端近くに組み込まれたトリプトファン残基（または他の適切な蛍光寿命調整因子）の存在によって調整されている。JHDM1Aによるリジン-36の脱メチル化は、この残基におけるプロテアーゼ誘発性切断を可能にし、それによって調整を取り除き、9AAの蛍光寿命の増加をもたらす。これに対して、JHDM1A阻害剤の存在はリジン脱メチル化を防止し、それによって、リジン-36におけるプロテアーゼ誘発性切断に対して耐性なペプチドを残すであろう。したがって9AAの蛍光寿命は調整されたままであり、調整の程度を脱メチル化の度合に相関させることができるであろう。このアッセイにおける使用に適したプロテアーゼは、隣接するC末端側の残基がプロリンである場合はリジンを切断しないと報告されているか（例えばKeil, B.「Specificity of Proteolyis」）または切断活性が著しく損なわれていて（Rodriguez, J. et al, J. Prot. Research, 2008, 7, 300-305）、リジン-37における非特異的切断が防止されるか、取るに足らないレベルにまで減少することが保証されるトリプシンであるだろう。

他のデメチラーゼ酵素をアッセイする際に使用するのに適したペプチド基質は、上に概説した一般原理に従って調製することができる。

（5）デアセチラーゼアッセイ
ある実施形態では、デアセチラーゼ酵素の活性をアッセイするために、本明細書に記載するアッセイ方法を適合させることができる。

このアッセイのための基質はペプチドリンカーを含み、一般構造：
Fl-X9-N4(Ac)-X10-M （IX）
［式中、X9はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX9にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N4(Ac)は、デアセチラーゼの作用によって脱アセチル化されるアセチル化アミノ酸残基（例えばアセチル化リジン）を表し、X10はアミノ酸の第2配列を表し、MはX10にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する。デアセチラーゼによる処理後に、基質は、一般構造：
Fl-X9-N4-X10-M （X）
［式中、N4は脱アセチル化されたアミノ酸、例えばリジンを表す］
によって表される修飾（脱アセチル化）基質に転化される。

FlとMとが実際にはどちらの配向で存在してもよいことは理解されるであろう。アミノ酸配列X9およびX10は、どちらも、残基N4(Ac)を、脱アセチル化と（構造（X）の修飾基質中における）プロテアーゼによる切断とにとって適当な配列コンテクストに置くこと、そしてまた、効果的な調整が達成されるように蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）の最適な配向を与えることとを目的として選択される。X9およびX10の配列は、アッセイされるデアセチラーゼ酵素の天然基質の配列に基づきうる。蛍光成分（Fl）と蛍光寿命調整因子（M）とは蛍光寿命の効果的な調整のために適当な間隔で配置される必要があるものの、蛍光成分（Fl）または蛍光寿命調整因子（M）がペプチドリンカーの端（N末端またはC末端）に存在することが必須でないことは理解されるであろう。したがって、FlはX9内のアミノ酸残基に取り付けることができるし、MはX10内のアミノ酸残基に取り付けることができ、その逆も同じである。蛍光寿命調整因子Mが、それ自体、アミノ酸残基、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニンもしくはヒスチジンまたはその誘導体の側鎖によって提供される場合、調整因子Mとして作用するアミノ酸残基は、それ自体が、X10によって表されるアミノ酸配列の一部を形成しうる。アミノ酸配列X9およびX10は、天然または非天然アミノ酸残基、ならびに非ペプチド結合などの他の修飾を含有しうる。

構造（IX）の基質において、蛍光成分Fl（これは好ましくは9-アミノアクリジン（9AA）であるが、他の任意の適切な蛍光成分であってもよい）の蛍光寿命は、基質中の蛍光寿命調整因子M（Mは好ましくはトリプトファンであるが、蛍光寿命の他の任意の既知の調整因子であってもよい）の存在によって調整されている。デアセチラーゼ酵素が一切存在しない場合は、残基N4（例えばリジン）後を切断するプロテアーゼで構造（IX）の基質を処理しても、FlとMの間で構造（IX）のタンパク質加水分解は誘導されないであろう。というのも、構造（IX）の基質はアセチル化型のN4を含有しており、したがってタンパク質加水分解から保護されているからである。それゆえに、蛍光寿命調整因子M（例えばトリプトファン）による蛍光成分Fl（例えば9AA）の蛍光寿命調整は損なわれずに存続する。デアセチラーゼの存在下では、残基N4(Ac)が脱アセチル化されて、構造（X）の修飾基質中の残基N4を形成する。プロテアーゼで構造（X）の修飾基質を処理すると、残基N4（例えばリジン）後での切断が誘発され、発蛍光団（例えば9AA）の蛍光寿命はもはや調整されなくなる。

例えば経時変化アッセイがそうであるように、基質（IX）から修飾基質（X）への連続的な転化が起こっている場合には、より多くの修飾基質が形成され、プロテアーゼの作用によって切断されるので、蛍光成分（Fl）の蛍光寿命が、時間（およびデアセチラーゼ酵素の濃度）の関数として増加することになる。100％無修飾基質（IX）に関するベースライン測定値と比較した蛍光寿命のシフト（増加）は、基質（IX）から修飾基質（X）への転化がある程度起こったことを示す。したがって、このシフトの大きさを使って、デアセチラーゼの作用による基質（IX）から修飾基質（X）への転化を評価することができる。

したがって、タンパク質デアセチラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、
（a）試験試料を、一般式（IX）の蛍光変調酵素基質
Fl-X9-N4(Ac)-X10-M （IX）
［式中、X9はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX9にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N4(Ac)はデアセチラーゼの作用によって脱アセチル化されるアセチル化アミノ酸残基（例えばアセチル化リジン）を表し、X10はアミノ酸の第2配列を表し、MはX10にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
と、デアセチラーゼ酵素の作用による蛍光変調酵素基質から一般式（X）の修飾基質
Fl-X9-N4-X10-M （X）
［式中、N4は脱アセチル化されたアミノ酸を表す］
への酵素的転化を許す条件下で接触させること；
（b）ステップ（a）の生成物を、一般式（X）の修飾基質を残基N4の隣りで切断する能力を有するが、一般式（IX）の蛍光変調酵素基質をFlとMの間で切断する能力は有さないプロテアーゼ酵素と接触させること；および
（c）蛍光成分Flの蛍光寿命の変化を検出し、それによってデアセチラーゼ酵素の活性をアッセイすること
を含む方法が、ここに提供される。

この方法は、ステップ（a）において、阻害剤活性について試験しようとする候補化合物を加えることにより、デアセチラーゼ酵素の阻害剤のスクリーニングに、すぐに応用することができる。

ペプチド/タンパク質基質中のリジン残基から1つ以上のアセチル基を除去するタンパク質デアセチラーゼ、例えばヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を、FLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする方法の具体例を、図29に模式的に示す。この例は、蛍光成分としての9-アミノアクリジンの使用と、蛍光寿命調整因子としてのトリプトファン残基のインドリル側鎖の使用とに基づいている。ただし、これらの具体的蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分は一例として示されているに過ぎず、それらを本明細書に記載するような代替的な蛍光成分および蛍光寿命調整因子成分で置き換えうることは理解されるであろう。

上述の一般的方法論は、任意の目的のデアセチラーゼ酵素での使用に適合させることができる。特に好ましいのは、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）酵素、例えば限定するわけではないが、HDAC1〜11およびSIRT1〜5である。特に、上述のアッセイ方法は、酵素クラスEC3.5.1.98内の任意のヒストンデアセチラーゼ、例えば3つのサブクラスHDAC1、HDAC2およびHDAC3の一つに属する酵素に応用することができる。

HDAC基質の例を以下に図解する：
Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
［Xaa＝任意のアミノ酸］。

HDAC1基質の例を以下に図解する：
ペプチド18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂

これらの基質では、蛍光成分（9AAまたは他の適切な蛍光成分）が、脱アセチル化されるリジンに隣接してC末端に組み込まれており、トリプトファン（または他の適切な蛍光寿命調整因子）が前述のリジンのN末端側に置かれている。HDAC1が触媒する脱アセチル化後のプロテアーゼ誘発性切断は、9AAがトリプトファン残基から分離されるので、蛍光寿命の増加につながる。したがって、蛍光寿命の増加は、HDAC活性の程度と直接的に相関させることができる。もちろん、問題のHDACの配列特異性に応じて、他の同様に意図された基質を設計することもできる。

アッセイの実際的応用
本明細書に記載するアッセイ方法は、全て、ハイスループットスクリーニングアッセイフォーマットで実施することができ、これは、修飾酵素の阻害剤をスクリーニングし同定するためのアッセイの有用性を高める。

本明細書に記載するアッセイをスクリーニングにおいて使用する場合、上述のアッセイは、阻害剤活性について試験しようとする化合物の存在下で実施される。そのようなハイスループットスクリーニングアッセイの一般的フォーマットは当業者にはよく知られているであろう。典型的には、適切なアッセイ対照（例えば阻害剤なし、修飾酵素なし、高濃度の既知阻害剤）と並行して、化合物が試験されるであろう。化合物はいくつかの異なる濃度で並行して試験することができる。アッセイの蛍光寿命読出しの変化によって示される試験化合物の存在下での修飾酵素活性の低下により、その試験化合物は、修飾酵素の阻害剤であると同定される。

本発明のアッセイは、典型的には、マルチウェルプレートのウェルにおいて、例えば24、96、384またはそれ以上のウェル密度（例えば864または1536ウェル）を有するマイクロタイタープレートのウェルにおいて実施しうる。

酵素阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイでは、典型的には、高純度型の修飾酵素、例えば組換え酵素を利用する。修飾酵素および対応する蛍光変調基質は、修飾酵素の活性を支える適切な酵素反応緩衝液に入れて、マルチウェルプレートのウェルに、試験化合物（潜在的酵素阻害剤）と一緒に加えられる。典型的には、化合物は、被験酵素の速度論的性質を考慮して、段階希釈により、適当な濃度範囲で試験される（例えば10nM〜10μM）。ウェルに加えられる修飾酵素の量と基質の量は一定に保たれる（酵素を含有しない対照ウェルを除く）。酵素の既知阻害剤を高濃度に含有する対照ウェルと化合物を含有しないウェルも調製しうる。次に、酵素、蛍光変調酵素基質および試験化合物を含む調製済みのプレートを、適当な対照と共に、阻害剤が何も存在しなければ修飾酵素が活性であるような条件下でインキュベートする。このインキュベーション中に、修飾酵素の作用により、基質から修飾基質への転化が起こる。試験化合物が修飾酵素の阻害剤である場合には、酵素による蛍光変調基質から修飾基質への転化が阻害され、その場合、阻害の程度は、阻害剤の濃度および阻害剤としてのその力価に依存するであろう。もちろん、修飾酵素の活性の結果として起こる場合の以外に、基質から修飾基質への転化は起こらないことが、アッセイの実施にとって不可欠である。

アッセイに加えられる修飾酵素の量と、基質から修飾基質への転化を可能にするインキュベーションの長さは、アッセイのダイナミックレンジが最適化されるように選択しうる。例えば、加えられる酵素の量およびインキュベーション時間は、阻害剤の非存在下で基質から修飾基質への100％未満の転化が達成されるように選択することができる。

酵素、基質および阻害剤のインキュベーションが完了したら、第2酵素（例えばプロテアーゼ）を加え、適当な計器（例えばNanoTaurus（商標）プレートリーダー）を使って蛍光寿命をモニターする。別項で説明するように、本アッセイは、平均蛍光寿命の測定に基づくか、または基質もしくは生成物に対応する特異的寿命を有する特定蛍光種の量の測定、すなわち「長い」蛍光寿命を示す切断された基質/修飾基質（調整は存在しない）の特異的測定、または切断されていない基質/修飾基質（調整はまだ存在する）の特異的測定に基づきうる。どちらの場合も、蛍光寿命測定により、使用した試験化合物の各濃度について、試験化合物の存在下での修飾酵素の活性の指標が得られる。試験化合物の濃度に対する％残存修飾酵素活性のプロットから、試験化合物に関するIC₅₀値を決定することができる。

ペプチド基質
本発明のもう一つの態様では、本明細書に記載する酵素アッセイを実行する際に使用するためのペプチド基質が提供される。特に以下の基質が提供される。

（1）メチルトランスフェラーゼアッセイ用の基質
Fl-X1-N1-X2-M （I）、または
M-X1-N1-X2-Fl （I'）
［式中、X1はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX1（またはI'中のX2）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N1はメチルトランスフェラーゼの作用によってメチル化されるアミノ酸残基を表し、X2はアミノ酸の第2配列を表し、MはX2（またはI'中のX1）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］。

非限定的実施形態において、基質は、以下の蛍光変調ペプチドの一つでありうる。
ペプチド4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂
ペプチド7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂
ペプチド12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
ペプチド13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
ペプチド14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
ペプチド15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
ペプチド20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂

（2）アセチルトランスフェラーゼアッセイ用の基質
Fl-X3-N2-X4-M （III）、または
M-X3-N2-X4-Fl （III'）
［式中、X3はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX3（またはIII'中のX4）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N2はアセチルトランスフェラーゼの作用によってアセチル化されるアミノ酸残基を表し、X4はアミノ酸の第2配列を表し、MはX4（またはIII'中のX3）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］。

非限定的実施形態において、基質は、以下の蛍光変調ペプチドの一つでありうる。
ペプチド16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂
ペプチド17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂

（3）デイミナーゼアッセイ用の基質
Fl-X5-R-X6-M （V）、または
M-X5-R-X6-Fl （V'）
［式中、X5はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX5（またはV'中のX6）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、Rはデイミナーゼの作用によってシトルリンに転化されるアルギニン残基を表し、X6はアミノ酸の第2配列を表し、MはX6（またはV'中のX5）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］。

非限定的実施形態において、基質は、以下の蛍光変調ペプチドの一つでありうる。
ペプチド1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂
ペプチド3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂

（4）デメチラーゼ酵素用の基質
Fl-X7-N3(Me)-X8-M （VII）、または
M-X7-N3(Me)-X8-Fl （VII'）
［式中、X7はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX7（またはVII'中のX8）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N3(Me)はデメチラーゼの作用によって脱メチル化されるメチル化アミノ酸残基（例えばメチル化リジンまたはメチル化アルギニン）を表し、X8はアミノ酸の第2配列を表し、MはX8（またはVII'中のX7）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］。

非限定的実施形態において、基質は、以下の蛍光変調ペプチドの一つでありうる。
ペプチド10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂、または
ペプチド11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂

（5）デアセチラーゼ酵素用の基質
Fl-X9-N4(Ac)-X10-M （IX）、または
M-X9-N4(Ac)-X10-Fl （IX'）
［式中、X9はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX9（またはIX'中のX10）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N4(Ac)はデアセチラーゼの作用によって脱アセチル化されるアセチル化アミノ酸残基（例えばアセチル化リジン）を表し、X10はアミノ酸の第2配列を表し、MはX10（またはIX'中のX9）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］。

非限定的実施形態において、基質は、次の蛍光変調ペプチド：
Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
［Xaa＝任意のアミノ酸］
であるか、または
ペプチド18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂
などのペプチドでありうる。

上述の蛍光変調基質において、成分FlとMは、以下の非限定的な組み合わせの一つを形成しうる：
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、インドリル成分、特にトリプトファン残基のインドリル側鎖である調整因子成分；
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、ナフチルアラニンまたはその誘導体である調整因子成分；
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、カルバゾール成分またはその誘導体である調整因子成分；
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、調整因子成分フェノチアジンまたはその誘導体；
アクリドンまたはその誘導体である蛍光成分と、インドリル成分、特にトリプトファン残基のインドリル側鎖である調整因子成分；
キナクリドンまたはその誘導体である蛍光成分と、インドリル成分、特にトリプトファン残基のインドリル側鎖である調整因子成分。

キット
本発明のさらにもう一つの態様は、本明細書に記載するアッセイ方法を実行するためのキットに関する。キットは、典型的には、本明細書に定義する酵素基質を含み、基質、または基質に対する修飾酵素の作用によって形成される前記基質の修飾型を、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断し、それによって蛍光成分にコンジュゲートされている基質の一部を、蛍光寿命調整因子成分にコンジュゲートされている基質の一部から分離する、ある供給量の第2酵素（例えばプロテアーゼ）も含む。本キットは、さらに、修飾酵素と基質との反応用にも、プロテアーゼと基質（または前記基質の修飾型）との反応用にも、適切な酵素反応緩衝液などを含有しうる。

特に、以下のキットが提供される。

（1）メチルトランスフェラーゼアッセイ用のキット
本キットは、一般構造：
Fl-X1-N1-X2-M （I）、または
M-X1-N1-X2-Fl （I'）
［式中、X1はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX1（またはI'中のX2）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N1はメチルトランスフェラーゼの作用によってメチル化されるアミノ酸残基を表し、X2はアミノ酸の第2配列を表し、MはX2（またはI'中のX1）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する蛍光変調基質と、該基質を、少なくとも、蛍光成分Flを含む第1部分と蛍光寿命調整因子Mを含む第2部分とに切断する能力を有するプロテアーゼ酵素とを含む。

非限定的実施形態において、本キットは、以下の蛍光変調ペプチドの一つ：
ペプチド4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂
ペプチド7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂
ペプチド12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
ペプチド13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
ペプチド14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
ペプチド15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
ペプチド20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂
と、ある供給量のプロテアーゼEndo-LysCまたはEndo-ArgCとを含みうる。

（2）アセチルトランスフェラーゼアッセイ用のキット
本キットは、一般構造：
Fl-X3-N2-X4-M （III）、または
M-X3-N2-X4-Fl （III'）
［式中、X3はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX3（またはIII'中のX4）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N2はアセチルトランスフェラーゼの作用によってアセチル化されるアミノ酸残基を表し、X4はアミノ酸の第2配列を表し、MはX4（またはIII'中のX3）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する蛍光変調基質と、該基質を、少なくとも、蛍光成分Flを含む第1部分と蛍光寿命調整因子Mを含む第2部分とに切断する能力を有するプロテアーゼ酵素とを含む。

非限定的実施形態において、本キットは、以下の蛍光変調ペプチド基質の一つ：
ペプチド16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂
ペプチド17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂
と、ある供給量のプロテアーゼEndo-LysCとを含みうる。

（3）デイミナーゼアッセイ用のキット
本キットは、一般構造：
Fl-X5-R-X6-M （V）、または
M-X5-R-X6-Fl （V'）
［式中、X5はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX5（またはV'中のX6）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、Rはデイミナーゼの作用によってシトルリンに転化されるアルギニン残基を表し、X6はアミノ酸の第2配列を表し、MはX6（またはV'中のX5）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する蛍光変調基質と、該基質を、少なくとも、蛍光成分Flを含む第1部分と蛍光寿命調整因子Mを含む第2部分とに切断する能力を有するプロテアーゼ酵素とを含む。

非限定的実施形態において、本キットは、以下の蛍光変調ペプチド基質の一つ：
ペプチド1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂
ペプチド3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂
と、ある供給量のプロテアーゼ・トリプシンとを含みうる。

（4）デメチラーゼ酵素用のキット
本キットは、一般構造：
Fl-X7-N3(Me)-X8-M （VII）、または
M-X7-N3(Me)-X8-Fl （VII'）
［式中、X7はアミノ酸の第1配列を表し、Flは X7（またはVII'中のX8）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N3(Me)はデメチラーゼの作用によって脱メチル化されるメチル化アミノ酸残基（例えばメチル化リジンまたはメチル化アルギニン）を表し、X8はアミノ酸の第2配列を表し、MはX8（またはVII'中のX7）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する蛍光変調基質と、残基N3(Me)が脱メチル化された修飾型の該基質を、少なくとも、蛍光成分Flを含む第1部分と蛍光寿命調整因子Mを含む第2部分とに切断する能力を有するプロテアーゼ酵素とを含む。

非限定的実施形態において、本キットは、以下の蛍光変調ペプチド基質：
ペプチド10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂
と、ある供給量のプロテアーゼEndo-LysCとを含みうる。

さらにもう一つの非限定的実施形態において、本キットは、以下の蛍光変調ペプチド基質：
ペプチド11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂
と、ある供給量のプロテアーゼ・トリプシンとを含みうる。

（5）デアセチラーゼ酵素用のキット
本キットは、一般構造：
Fl-X9-N4(Ac)-X10-M （IX）、または
M-X9-N4(Ac)-X10-Fl （IX'）
［式中、X9はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX9（またはIX'中のX10）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N4(Ac)はデアセチラーゼの作用によって脱アセチル化されるアセチル化アミノ酸残基（例えばアセチル化リジン）を表し、X10はアミノ酸の第2配列を表し、MはX10（またはIX'中のX9）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
を有する蛍光変調基質と、残基N4(Ac)が脱アセチル化された修飾型の該基質を、少なくとも、蛍光成分Flを含む第1部分と蛍光寿命調整因子Mを含む第2部分とに切断する能力を有するプロテアーゼ酵素とを含む。

非限定的実施形態において、本キットは、以下の蛍光変調ペプチド基質：
Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
［Xaa＝任意のアミノ酸］
または
ペプチド18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂
などのペプチドと、ある供給量のトリプシンとを含む。

上述のキットにおいて、蛍光変調基質中の成分FlおよびMは、以下の非限定的組合せの一つを形成しうる：
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、インドリル成分、特にトリプトファン残基のインドリル側鎖である調整因子成分；
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、ナフチルアラニンまたはその誘導体である調整因子成分；
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、カルバゾール成分またはその誘導体である調整因子成分；
蛍光成分9-アミノアクリジン（9-AA）と、調整因子成分フェノチアジンまたはその誘導体；
アクリドンまたはその誘導体である蛍光成分と、インドリル成分、特にトリプトファン残基のインドリル側鎖である調整因子成分；
キナクリドンまたはその誘導体である蛍光成分と、インドリル成分、特にトリプトファン残基のインドリル側鎖である調整因子成分。

以下の実験例を参照することで、本発明がさらに理解されるであろう。

実施例1−デイミナーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
ペプチド/タンパク質基質中のアルギニン残基をシトルリンに転化するデイミナーゼクラスの酵素をFLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする手段を、図1に示す。ここでは、9-アミノアクリジン（9AA）（または他の適切なレポーター）の基質寿命が、配列中のトリプトファン残基（または蛍光寿命の他の既知の調整因子）の存在によって調整されている。アルギニン後を切断するプロテアーゼによる基質の処理は、タンパク質加水分解を誘発し、トリプトファン残基による蛍光寿命の調整を取り除くことになる。適当なデイミナーゼ酵素によるシトルリンへのアルギニン転化後は、生成物ペプチドをプロテアーゼで処理しても、アルギニン後での切断は誘発されず、発蛍光団（9AA）の寿命は調整されたままである。

（A）PAD4概念実証FLTプロテアーゼ保護アッセイ
組換えヒトPAD4酵素は、OriGene、AbnovaまたはModiQuest Researchなどの供給者から市販されている。

デイミナーゼのためのFLTプロテアーゼ保護アプローチを実現するには、いくつかの条件を満たさなければならない：
1）デイミナーゼのための認識配列、適切に組み込まれたトリプトファン残基（または他のFLT調整因子）および長寿命発蛍光団（例えば9-アミノアクリジン）を含有する適当なペプチド基質の設計；
2）無傷のペプチドにおいては発蛍光団のFLTが十分に低下するような調整因子と発蛍光団の適正な配置。調整因子と発蛍光団は、発蛍光団のFLTの切断依存的増加が結果として起こるように、プロテアーゼ切断後には反対のフラグメントに位置しなければならない。
3）シトルリン化されるアルギニン残基のC末端側でペプチドを選択的に切断する適切なプロテアーゼの使用。プロテアーゼはシトルリン化生成物を切断することができてはならない。

要件1〜3を満たすために、図2に示すペプチド配列を、FLTプロテアーゼ保護アプローチによるデイミナーゼPAD4のアッセイ用に設計し、合成した。
ペプチド1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂
ペプチド2：K(9AA)-QSTRGSGHWKK-CONH₂
ペプチド3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂

PAD4に対する活性を維持しつつ、適切なFLT調整が得られる可能性が増すように、3つの変異体を合成した。

ペプチドは、実験項で説明するように、標準的なFmoc固相ペプチド合成（SPPS）によって合成した。オルソゴナルな側鎖脱保護が可能になるように、ペプチド2および3には、N末端にBoc-Lys(Fmoc)-OHを含めた。レジン上で、ペプチドを、HOCt/DIC活性化を使って3-(9-アミノアクリジン-2-イル)-プロピオン酸で標識した後、標準的なTFA切断カクテルを使って切断した。9AAのモル吸光係数（1：1MeCN/水中、405nmで、8735M^-1cm^-1）を参照して、ペプチドを逆相HPLCで精製し、小分けした。

ペプチド1〜3のFLT測定
384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、ペプチド1〜3を、PAD4アッセイ緩衝液（20mM Tris pH8.0、200μM CaCl₂、5mM DTT、0.01％CHAPS）に1μMの濃度で溶解した（1ウェルあたり20μl）。実験項で説明するようにNanoTaurus蛍光寿命プレートリーダー（Edinburgh Instruments Ltd.）を使ってFLTを測定した。測定は3つ一組にして行い、7時間にわたって分析した。

初期安定化後に、ペプチド1および3のFLTは、経時的に安定した状態を保っている（図3）。対称的に、ペプチド2のFLTは3時間にわたって着実に増加してから、プラトーになりはじめた（図3）。ペプチド3の出発寿命がペプチド1および2と比べて短いのは、9AAの取り付け部位の隣りにあるヒスチジン残基の存在を反映している。トリプトファンと同様に、ヒスチジン残基も、発蛍光団のFLTを調整することが知られている（Marme, N., Knemeyer, J-P., Sauer, M., and Wolfrum, J., Bioconjugate Chem., 2003, 14, 1133-1139）。

ペプチド1〜3のプロテアーゼ切断
トリプシンは、ペプチドおよびタンパク質中のアルギニンまたはリジン残基のC末端側を切断する市販のプロテアーゼである。設計したペプチド1〜3（図2）は1つのアルギニン残基とC末端に2つのリジン残基とを有する。アルギニンでの切断は、9AAが調整トリプトファン残基から分離されることにより、9AAのFLTの増加につながると予想される。これに対し、また本アッセイの有用性にとって重要なことであるが、リジンにおける切断は、色素と調整因子との分離につながらないので、色素のFLTに対する影響はないはずである。

ペプチド1〜3のFLTに対するプロテアーゼ切断の効果を調べるために、384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、各ペプチドをPAD4アッセイ緩衝液（20μl）に1μMの濃度で溶解した。各ウェルに、それぞれ5nM、2.5nM、1.25nM、または0.625nMの酵素を含有する10μlのトリプシン溶液を加えた。NanoTaurusプレートリーダーを使用し、45分間にわたって、一定間隔で、FLTを測定した。対照として、アルギニンの代わりにシトルリンを含有する対応するペプチドを、同様に試験した。

3つのペプチドのFLTはいずれもトリプシン濃度の関数として増加し、調整トリプトファン残基からの9AAの分離と合致した（図4A〜C）。FLTの増加はペプチド依存的であり、ペプチド1（6ns）＞ペプチド2（4.8ns）＞ペプチド3（2.6ns）であった。ペプチド2では、緩衝液のみにおいてこのペプチドで観察された効果（図3）と合致して、トリプシンなしの対照において多少のドリフトが存在したことに注意すべきである。ペプチド3でのFLT範囲が狭いのは、切断後も9AAの隣りに調整ヒスチジン残基が存在し続けていることで、部分的に説明することができる。

トリプシン処理後にペプチド1〜3について観察されたFLTの著しい増加とは対照的に、シトルリン化類似体では、45分間のインキュベーション後でさえ、FLTの増加は観察されなかった（図4D）。この知見は、トリプシンがシトルリン残基の隣りを切断できないという予想と合致している。

アッセイのプロテアーゼ保護態様が検証されたので、次に、ペプチド1〜3がPAD4の実効的基質であるかどうかを決定することに、関心を移した。

ペプチド1〜3によるPAD4アッセイ
ペプチド1〜3がPAD4によってシトルリン化されるかどうかを確定するために、基質の消費と生成物の形成をモニターするための逆相HPLC法を開発した。第1ステップとして、各ペプチドとそのシトルリン化等価物との1：1混合物をPAD4アッセイ緩衝液中に15μMの濃度で調製し、Luna C18カラムと30分間にわたる0〜73％MeCN＋0.1％TFA勾配とを用いるRP-HPLCによってモニターした。この勾配を用いると、基質ペプチドと生成物ペプチドに対応するピークを分離することができ、それらはどちらも緩衝液構成要素から生じるピークより遅い保持時間を有するので、分析が簡単になった（図5）。

適切なHPLC法を手にしたので、ペプチド基質のそれぞれについてPAD4アッセイを設定し、アリコートを一定の時間間隔で採取して、生成物の形成をRP-HPLCによってモニターした。各アッセイは、アッセイ緩衝液（300μl）中の15μMペプチドおよび30nM PAD4（Origene）が入っている微量遠心管中で行った。アッセイは室温で行い、0分、30分および60分の時間間隔で試料を採取した。

1時間にわたる各アッセイの進行を、図6〜8のHPLCスペクトルによって示す。ペプチド1（図6）およびペプチド3（図8）を基質とするアッセイの場合、スペクトルは、30分後に、基質より遅い保持時間を有する新しいピークの形成を明確に示しており、1時間後には基質のほぼ完全な消失が明白である。新たに形成された種がシトルリン化生成物に対応することを確認するために、ピークを集め、ESI-MSで分析した。この方法により、質量は、いずれの場合も、出発ペプチドより1amu大きいことが確認され、アルギニンからシトルリンへの転化と合致した（図9および図10）。

ペプチド1および3での成功とは対照的に、基質としてペプチド2を使ったアッセイでは、アッセイ時間の経過と共にHPLCスペクトル中に数多くのピークが出現することからわかるように、ペプチドの分解が起こった（図7）。分解ピークについては識別可能な質量を観察できなかったので、シトルリン化が起こったかどうかを確認することは不可能だった。このペプチドが基質として明らかに不適であることは、FLT研究時（図3）およびプロテアーゼ切断分析時（図4B）に観察された安定性の欠如と合致している。ペプチド2を使った研究はこれ以上行わず、PAD4アッセイにおいて活性を示したペプチド1および3に、関心を集中させた。

PAD4によるペプチド1および3のシトルリン化がトリプシンからの保護を付与したかどうかを調べるために、これらのペプチドのアッセイ混合物（上述）をアッセイ緩衝液で1μMの濃度に希釈し、384ウェル黒色マイクロプレートの3つのウェルにそれぞれ20μl加えた。前述のようにNanoTaurusプレートリーダーを使ってFLTを測定した。次に、10μlのトリプシン（最終濃度10nM）を各ウェルに加え、プレートを室温で10分間インキュベートしてから、FLTを再測定した。比較のために同じ濃度でペプチドだけの対照を含めた。

PAD4の非存在下では、10nMトリプシンとのインキュベーション後に、ペプチド1および3のFLTは、それぞれ6.1nsおよび3.3ns増加した（図11）。これに対し、トリプシンとのインキュベーションに先だってPAD4に曝露したペプチドでは、FLTの増加が観察されなかった。これらの知見は、PAD4が触媒する基質のシトルリン化がプロテアーゼ処理からの保護を与えたことと合致している。

要約すると、以下の結論を引き出すことができる：
1）ペプチド1および3は、PAD4の実効的基質である。
2）適切なプロテアーゼ、すなわちトリプシンによる処理後に、最大6nsのFLT増加（ペプチド1の場合）を達成することができ、これにより、優れたアッセイダイナミックレンジがもたらされる。
3）PAD4によるペプチド1および3のシトルリン化は、FLTの増加の欠如に反映されるとおり、プロテアーゼ誘発性切断からの保護を付与する。

PAD4に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
ペプチド1が示すFLT変化はペプチド3と比較して有意に大きかったので、このペプチドをマイクロプレートアッセイ用の基質として選択した。アッセイは、384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、20μlの体積で行い、アッセイ緩衝液中にペプチド1（1μM）とPAD4酵素（500pM、250pM、または125pM）とを含有した。10μlのトリプシン（10nM）の添加によって反応を一定間隔で停止した。FLTをトリプシン添加の直前に測定し、室温で10分間インキュベートした後に、再び測定した。測定は全て3つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

トリプシンの添加前は、全てのアッセイウェルのFLTが同じぐらい（約10ns）で、アッセイ時点またはPAD4濃度が異なっても、著しい変動は観察されなかった（図12A）。これに対し、トリプシンとのインキュベーション後に測定されたFLTは、漸進的なシトルリン化がプロテアーゼ保護を付与し、固有のトリプトファン残基によるペプチド1のFLTの調整が継続されることになるので、時間およびPAD4濃度依存的な減少を示した（図12B）。

基質タイトレーション
ペプチド基質濃度に対するPAD4アッセイの依存性を調べた。アッセイは、384ウェルマイクロプレートにおいて、アッセイ緩衝液（20μl）中、250pMのPAD4を使って、室温で1時間行った。ペプチド1の濃度を2.5μMから0.04μMまで変動させた。反応が完了したら、トリプシン（10nM）を各ウェルに加え、10分間のインキュベーション期間後にFLTを測定した。標準曲線を参照することによってデータを生成物形成速度に変換してから、GraphPad Prism中のMichaelis-Mentenモデルを使って当てはめることにより、基質K _Mを決定した。図73から、基質1に関して180nMのK _Mが決定された。

Z'ファクター
PAD4 FLTアッセイがハイスループットスクリーニング（HTS）に適合することを実証するために、Z'ファクターの値を決定した。Z'ファクターは、特定のアッセイのロバストネスの尺度であり、＞0.7の値は優れているとみなされる（Zhang, J.H.；Chung, T. D.；Oldenburg, K.R. J. Biomol. Screen. 1999, 4, 67-73）。

アッセイは384ウェルマイクロプレートに設定し、プレートの半分がPAD4（125pM）とペプチド1（200nM）とをアッセイ緩衝液中に含有し、残りの半分がPAD4（125pM）とペプチド1（200nM）とをCaCl₂を含まないアッセイ緩衝液中に含有した。最終アッセイ体積は20μlであり、プレートを室温で1時間インキュベートした時点で、アッセイ緩衝液（10μl）中のトリプシン（最終濃度10nM）を各ウェルに加えた。室温でさらに10分間インキュベートしてから、FLTを測定したところ、0.70というZ'ファクターが算出された（図74）。

これらの結果は、デイミナーゼに関するFLTプロテアーゼアッセイをマイクロプレートフォーマットに移転できることを実証しており、これは薬物スクリーニングおよびHTS応用へのその利用を容易にする。

結論として、代表例としてPAD4を使用することで、デイミナーゼクラスの酵素に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイが実証された。PAD4認識配列、9-アミノアクリジン発蛍光団、および調整トリプトファン残基を組み込んだペプチド基質を設計した。FLT研究により、ペプチド配列が無傷の間は9AAの寿命は低下しているが、プロテアーゼ・トリプシンで処理すると、調整因子からの色素の有利を引き起こすペプチド切断の結果として、FLTは増加することが確認された。2つのペプチドが、インビトロアッセイにおけるPDA4の基質であることが示され、配列中の唯一のアルギニン残基をシトルリン化すると、プロテアーゼ誘発性切断からの保護がもたらされる。この保護を、酵素を含まない対照との比較で、PAD4に曝露したペプチドでの低下したFLTによって定量した。

このアッセイ技術は、適当に設計された基質を使用することにより、他のデイミナーゼ酵素に移転することができるであろうと考えられる。

（B）PAD2デイミナーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
FLTプロテアーゼ保護アプローチによるデイミナーゼアッセイのさらにもう一つの実例として、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ2（PAD2）を、適切なターゲットとして検証した。

PAD2の調節不全は、自己免疫疾患である多発性硬化症および関節リウマチならびに神経変性障害、例えばアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病に関連付けられている（Jang, B. et al., Acta Neuropathologica, 2010, 119, 199-210）。

組換えヒトPAD2は、Modiquest Researchなどの供給者から市販されている。

PAD4用の基質として先に確認されたペプチド1（図1）を、PAD2によるアッセイで試験し、シトルリン化生成物への転化をRP-HPLCおよびESI-MSによってモニターした。
ペプチド1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂

したがって、ペプチド1（15μM）を、アッセイ緩衝液（20mM Tris pH8、200μM CaCl₂、5mM DTT、0.01％CHAPS）（300μl）中で、PAD2（30nM）と共にインキュベートし、アリコートを一定の時間間隔で採取し、RP-HPLCによって分析した。アッセイは室温で行い、0分、30分、および120分の時間間隔で試料を採取した。

2時間にわたるアッセイの進行を、HPLCスペクトルにより、図31に示す。t＝0では、ペプチド基質に対応するピークだけが存在する（t_R＝14.4分）。30分後には405nmに吸光度を有する新しいピークが存在し（t_R＝14.7分）、2時間後にはこのピークが主要になって、基質については小さなピークしか検出できなくなる。この新しいピークがシトルリン化生成物に対応することを確認するために、それを集めてESI-MSによって分析した。見いだされた質量（m/z 1518.7）は、基質質量より1amu大きく、アルギニン残基のグアニジニル基からウレアへの転化と合致する（図32）。

PAD2によるペプチド1のシトルリン化がトリプシンからの保護を付与したかどうかを調べるために、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で1μM濃度に希釈し、20μlを、384ウェル黒色マイクロプレートの3つのウェルに加えた。10μlのトリプシン（最終濃度10nM）を各ウェルに加え、プレートを室温で10分間インキュベートしてから、実験項で述べるようにNanoTaurusプレートリーダーを使って蛍光寿命（FLT）を測定した。比較のために同じ濃度でペプチドだけの対照を含めた。

PAD2の非存在下では、10nMトリプシンとのインキュベーション後に、ペプチド1のFLTは、6.9ns増加した（図33）。これに対し、トリプシンとのインキュベーションに先だってPAD2に曝露したペプチドでは、FLTの増加が観察されなかった。これらの知見は、PAD2が触媒するペプチド1のシトルリン化がプロテアーゼ処理からの保護を与えることと合致している。

要約すると、ペプチド1は、PAD2をアッセイするための妥当な基質であり、活性は、プロテアーゼ誘発性切断からの保護を付与するシトルリン化の結果としてのFLTの減少によってモニターされる。

PAD2に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
次に、PAD2に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイを、マイクロプレートフォーマットで実証する。アッセイは384ウェル黒色マイクロプレート中、20μlの体積において行われ、アッセイ緩衝液中にペプチド1（1μM）およびPAD2酵素（23.5nM、11.8nM、5.9nM、2.9nM、または1.5nM）を含有した。10μlのトリプシン（10nM）を添加することにより、反応を一定間隔で停止した。トリプシンと共に室温で10分間インキュベートした後に、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

トリプシンと共にインキュベートした後に測定されたFLTは、漸進的なシトルリン化がプロテアーゼ保護を付与し、固有のトリプトファン残基によるペプチド1のFLTの調整が継続されることになるので、時間およびPAD2濃度依存的な減少を示した（図34）。したがってシトルリン化は、アッセイの蛍光寿命測定値の低下によってレポートされる。

これらの結果は、PAD2に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイをマイクロプレートフォーマットに移転できることを実証しており、これは薬物スクリーニングおよびHTS応用へのその利用を容易にする。

実施例2−タンパク質メチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
リジンまたはペプチド/タンパク質基質中のアルギニン残基に1つ以上のメチル基を転移するタンパク質メチルトランスフェラーゼ（PMT）をFLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする手段を、図13に示す。ここでは、9-アミノアクリジン（9AA）（または他の適切なレポーター）の基質寿命が、配列中のトリプトファン残基（または蛍光寿命の他の既知の調整因子）の存在によって調整されている。リジンまたはアルギニン後を切断するプロテアーゼによる基質の処理は、タンパク質加水分解を誘発し、トリプトファン残基による蛍光寿命の調整を取り除くことになる。適当なPMT酵素によるリジンまたはアルギニンのメチル化後は、生成物ペプチドをプロテアーゼで処理しても、リジンまたはアルギニン後での切断は誘発されず、発蛍光団（9AA）の寿命は調整されたままである。

組換えPKMT（例えばG9a、Set7/9、GLP、EZH2）酵素および組換えPRMT（PRMT1、PRMT3、PRMT4/CARM1、PRMT5）酵素は、BPS Bioscience、Millipore、New England Biolabs、またはSigma-Aldrichなどの供給者から市販されている。

図13に概説するアプローチに適したプロテアーゼは、Endo-LysC（PKMTアッセイ用）およびEndo-ArgC（PRMTアッセイ用）である。

（A）G9a概念実証FLTプロテアーゼ保護アッセイ
PKMT G9aは詳しく特徴づけられた酵素であり（Chin, H.G., Pradhan, M., Esteve, P-O., Patnaik, D., Evans Jr., T.C., and Pradhan, S., Biochemistry, 2005, 44, 12998-13006）（Patnaik, D., Chin, H.G., Esteve, P-O., Benner, J., Jacobsen, S.E., and Pradhan, S., J. Biol. Chem., 2004, 279, 53247-53258）、さまざまな長さのヒストンペプチドが基質として報告されており（Rathert, P., Dhayalan, A., Murakami, M., Zhang, X., Tamas, R., Jurkowska, R., Komatsu, Y., Shinkai, Y., Cheng, X., and Jeltsch, A., Nat. Chem. Biol., 2008, 4, 344-346）、いくつかの供給者によって市販されているので、これを、概念実証研究のための代表例として選択した。G9aは、メチル基を、ヒストンH3のN末端テール上の残基に優先的に転移する。G9aに長時間曝露すると、リジン-9はジメチル化体またはトリメチル化体になる。Caliperのマイクロフルイディックシフト技術を使ったG9aに関するプロテアーゼ保護アッセイが、最近、報告されている（Wigle, T.J., Provencher, L.M., Norris, J.L., Jin, J., Brown, P.J., Frye, S.V., Janzen, W.P., Chem. Biol., 2010, 17, 695-704）。

最初の例では、ヒストンH3 N末端配列に基づくG9a用の潜在的基質として、一連のペプチドを合成した（図14）。デイミナーゼクラスの酵素に関して例示したとおり、FLTベースのプロテアーゼ保護アプローチが実行可能であるには、ターゲット残基（この場合はリジン-9）を挟んで反対の位置に長寿命発蛍光団（例えば9AA）と調整残基（例えばトリプトファン）とを組み込むことが必要である。これらの成分の組込みは、G9aによる認識に悪影響を与えてはならないが、発蛍光団のFLTの調整が作業アッセイ範囲にとって十分なものになるように適切に配置されなければならない。
ペプチド4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂
ペプチド6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂
ペプチド7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
ペプチド9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂

ペプチドは、実験項で説明するように、標準的なFmoc固相ペプチド合成（SPPS）によって合成した。オルソゴナルな側鎖脱保護が可能になるように、色素を取り付ける部位に、ペプチド5および9はBoc-Lys(Fmoc)-OHを含み、ペプチド6〜8はFmoc-Lys(ivDde)-OHを含んだ。レジン上で、ペプチドを、HOCt/DIC活性化を使って3-(9-アミノアクリジン-2-イル)-プロピオン酸で標識した後、標準的なTFA切断カクテルを使って切断した。9AAのモル吸光係数（1：1MeCN/水中、405nmで、8735M^-1cm^-1）を参照して、ペプチドを逆相HPLCで精製し、小分けした。

Endo-LysCは、リジン残基のC末端側を切断するが、その残基がメチル化されている場合は切断しないことが知られているので、これをプロテアーゼとして選択した。

各ウェルが20μlのアッセイ緩衝液（20mM Tris.HCl pH8.0、25mM NaCl、1mM DTT、0.025％Tween 20）中にペプチド基質（1μM）、S-アデノシルメチオニン（SAM）（100μM）、およびG9a（Millipore、500nM）を含有しているアッセイを、384ウェル黒色マイクロプレート（Greiner）に設定した。アッセイを室温で2時間行ってから、NanoTaurusプレートリーダー（Edinburgh Instruments Ltd.）を使って、FLTを測定した。次に、各ウェルを2nMプロテアーゼ（Endo-LysC）（10μl）で処理し、プレートを室温で60分間インキュベートした。次にFLTを再測定した。G9aを含有しないかプロテアーゼを含有しない対照を含めた。アッセイの結果を図15に示す。

G9a処理の非存在下では、FLTの最も大きいプロテアーゼ依存的増加が、ペプチド4で観察され（5.8ns）、最も小さいものはペプチド9で観察された（2.4ns）。この観察結果は予想外なことではなかった。というのも、9AAとトリプトファンの間の離間距離はペプチド4において最も小さく、ペプチド9において最も大きいからである。G9aを含むウェルとG9aを含まないウェルについてプロテアーゼ処理後のFLTの増加を比較すると、試験したペプチドの全てにおいて、G9aに曝露したウェルの方が増加が少なく、プロテアーゼ保護の度合を示すことが明白である。ペプチド9は、完全なプロテアーゼ保護を与えるように見える（すなわちプロテアーゼ処理後のFLTはペプチド対照と同じままであった）点でユニークだった（これは高いリジンメチル化度を含意する）。このペプチドではリジン-4がこの残基における切断を防止するために予めメチル化されており、この部位における小さな修飾の方が、この残基の欠失または置換よりも、G9にとっては許容しやすいのかもしれない。他の5つのペプチド基質が与えるプロテアーゼ保護を比較したところ、それらのそれぞれの間の相違はほとんどないようだった（図15）。そこで、以後はペプチド4および9を使って進めることにした。というのも、前者は最も大きなダイナミックレンジを与え、一方、後者はG9aにとって、より良い基質であると思われたからである。

G9aタイトレーション
384ウェル黒色マイクロプレート（Greiner）において、ペプチド4および9を、SAM（100μM）およびさまざまな濃度のG9a（Abcam）と共に、20μlのアッセイ緩衝液中でインキュベートした。アッセイを室温で2時間行った後、前述のようにFLTを測定した。次に、2nM Endo-LysC（1ウェルあたり10μl）を加え、プロテアーゼと共に10分および60分インキュベートした後に、FLTを再測定した。

図16Aに示すデータから、プロテアーゼの添加後まではどちらのペプチドのFLTも変化しないこと、すなわちリジンメチル化がFLTの変化を直接誘発しないことは、明白だった。したがって、プロテアーゼ切断後の、対照ウェルと比較したアッセイウェルのFLTの相違は、G9a活性の直接的結果である。

ペプチド4および9に完全なプロテアーゼ保護を付与するには、50nMのG9aで十分であった（図16B〜E）。この濃度は、MilliporeからのG9aを使って同様のデータを生成させるために使用した濃度の10分の1であり（図15）、Abcam酵素の活性の方が高いことを際立たせている。このデータが、ペプチド9がペプチド4より活性な基質であることも示しているのは、このペプチドでは、より低いG9a濃度でプロテアーゼ保護が起こることによって証明されるとおりである（図16B〜E）。この知見は、ペプチド4よりも長いペプチド9の配列が、G9aに対する選択性を高めていることと合致している。

図16Bと16Cおよび図16Dと16Eを比較すると、Endo-LysCとの長時間のインキュベーション（60分対10分）が、FLTの顕著な変化につながらないことは明らかであり、これは10分後には完全な切断が起こっていることを示している。そこで、以後はどの実験でも、Endo-LysCと共に10分間インキュベートした後に、データを収集した。

メチル化の証拠
基質のメチル化がG9aの存在下で実際に起こっていることを確認するために、ペプチド4および9を使ったアッセイを微量遠心チューブ中で行い、試料を一定の時間間隔で採取し、RP-HPLCおよびESI-MSによって分析した。アッセイ条件は次のとおりであった：アッセイ緩衝液（150μl）中、ペプチド基質（15μM）、G9a（100nM）、SAM（100μM）。分析はLuna C18カラムと30分間で0〜50％MeCN＋0.1％TFAの勾配とを使って行った。関連するスペクトルを図17および図18に示す。

ペプチド4を基質とするアッセイの場合、G9aと共に長時間インキュベートした後に、保持時間が基質より遅い第2ピークが現れる（図17B）。ペプチド9を使用した場合、そのような第2ピークは見えないが、これは現行の勾配法では分離が不十分であるためかもしれない。関連ピークを収集し、メチル化の証拠を得るためにESI-MSによって分析した（図19〜20）。

ペプチド4より後の保持時間を有するピークのESI-MS分析では、モノメチル化物（m/z 1166）およびジメチル化物（m/z 1180）の正しい質量をはっきり認めることができ、そのピークはメチル化生成物に対応することが明らかになった（図19B）。ペプチド9を使ったアッセイの場合は明確な第2ピークを認めることができなかったので、405nm吸光度を含有するピーク全体を収集し、ESI-MSで分析した。t＝0では、当然ながら、このピークは基質の質量（m/z 1936）だけを含有していた（図20A）。しかし、G9aと共に6時間インキュベートした後は、基質の証拠が多少は残っているものの、今度は、モノメチル化生成物（m/z 1950）およびジメチル化生成物（m/z 1964）の明確なシグナルが存在する（図20B）。したがってこれらの結果は、メチルトランスフェラーゼG9aへの曝露後にペプチド4および9がそれらのメチル化等価物に転化されることの直接的証拠になる。

G9aアッセイの経時変化
384ウェルマイクロプレートにおいて、ペプチド4および9（1μM）を使用し、さまざまなG9a濃度下で、アッセイを行った。ここでは、SAM（100μM）で反応を開始し、Endo-LysC（2nM）の添加によって一定間隔で反応を停止した。10分間のインキュベーション後に、G9aが触媒するリジンメチル化によって誘発されるプロテアーゼ保護の証拠を得るために、FLTを測定した。

図21〜22からわかるように、Endo-LysCの添加前は、どちらのペプチドにもFLTの変化はない。しかし、プロテアーゼを添加しプロテアーゼと共にインキュベートした後は、FLT調整の程度が、G9a濃度およびアッセイ時間の関数として変動し、プロテアーゼ保護を付与するリジンのメチル化と合致する。t＝0では、Endo-LysCによる処理が、調整がないことおよびプロテアーゼによる基質の完全な切断と合致する11.2nsから17.0nsへのFLTの増加（ペプチド4の場合）および13.5nsから16.5nsへのFLTの増加（ペプチド9の場合）をもたらす。反応の線形性は経時変化の多くにおいて明白である。

SAMへの依存性
基質としてペプチド4と9の両方を使って、SAMに対するG9aアッセイの依存性を調べた。アッセイは、384ウェルマイクロプレートにおいて、25nMまたは10nMのG9aと1μMの基質とを使って、アッセイ緩衝液（20μl）中で行った。SAM濃度を200μMから0.4μMまで変動させ、アッセイを室温で2時間インキュベートした。完了後に、Endo-LysC（2nM）を各ウェルに加え、10分間のインキュベーション期間後にFLTを測定した。図23に示すデータにより、SAM濃度に対するG9a活性の依存性がK _m(app)＝3〜11μMと確認される。

阻害剤タイトレーション
G9aに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイが阻害剤スクリーニングに適していることを実証するために、既知の非SAM競合性G9a阻害剤BIX-01294を購入し（Merck Chemicals Ltd.）、アッセイにおいて試験した。条件は次のとおりであった：アッセイ緩衝液（20μl）中、BIX-01294（200μM〜20nM）、G9a（25nMまたは10nM）、SAM（10μM）、およびペプチド基質（1μM）。反応を384ウェルマイクロプレートにおいて室温で2時間行い、Endo-LysC（2nM）の添加によって停止した。

ペプチド9を基質として、BIX-01294についてIC₅₀＝1.6μMが決定され（図24）、1.9μMという文献値と合致した（Chang, Y., Zhang, X., Horton, J.R., Upadhyay, A.K., Spannhoff, A., Liu, J., Snyder, J.P., Bedford, M.T., and Cheng, X., Nat. Struct. Biol., 2009, 16, 312-317）。これに対し、ペプチド4を使ったアッセイでは、IC₅₀≒28nM（低阻害剤濃度でプラトーを形成できない）が得られた（図24）。BIX-01294はヒストンH3競合阻害剤であることが知られており、ペプチド4および9の配列の相違は阻害剤結合に影響を及ぼしうるので、これらの値の不一致は、阻害機序の相違によるのかもしれない。

Z'ファクター
G9a FLTアッセイがハイスループットスクリーニング（HTS）に適合することを実証するために、Z'ファクターの値を決定した。

アッセイは384ウェルマイクロプレートに設定した。プレートの半分はG9a（BPS Bioscience）（625pM）、ペプチド9（1μM）およびSAM（100μM）を含有し、残りの半分は、G9a（625pM）、ペプチド9（1μM）を含有し、かつSAMを含有しなかった。最終アッセイ体積は20μlであり、プレートを室温で1時間インキュベートした時点で、アッセイ緩衝液（10μl）中のEndo-LysC（最終濃度2nM）を各ウェルに加えた。室温でさらに10分間インキュベートしてから、FLTを測定したところ、0.71というZ'ファクターが算出され、このアッセイのHTSスクリーニングへの適性が実証された（図75）。

結論として、FLTプロテアーゼ保護アッセイにおいて使用するために、長寿命発蛍光団（9AA）および芳香族調整因子残基（トリプトファン）を組み込んだリジンメチルトランスフェラーゼG9a用の新規ペプチド基質を設計した。G9aと共にインキュベートした後のメチル化をこれらのペプチドのうちの2つについて実証し、プロテアーゼEndo-LysCを添加した後も継続するFLT調整によって確認されるプロテアーゼ保護を、このプロセスが付与することを明らかにした。酵素、SAM、および阻害剤タイトレーションを実行することによってアッセイの性能を確かめ、0.71というZ'ファクターにより、このアッセイがHTS応用に適していることを確認した。

このようなアプローチはG9aに限定されず、適当に設計された基質を使用することにより、他のタンパク質メチルトランスフェラーゼに移転することができるであろうと考えられる。他の長寿命発蛍光団および/または調整因子も使用できるであろう。

（B）Set7/9リジンメチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
FLTプロテアーゼ保護アプローチによるタンパク質メチルトランスフェラーゼアッセイのさらにもう一つの実例として、リジンメチルトランスフェラーゼであるSet7/9を、適切なターゲットとして検証した。

Set7/9は、他のタンパク質もターゲットにするが、ヒストンH3ではLys4をメチル化する（Wilson et al., Cell 2002, 111, 105-115）。組換えSet7/9は、BPS Bioscienceなどの供給者から市販されている。

ヒストンH3のN末端配列からなり、N末端にトリプトファン残基が組み込まれ、リジン-9残基の側鎖に9-アミノアクリジン発蛍光団が取り付けられているペプチド12を、Set7/9用の基質として合成した。
ペプチド12：WARTKQTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

メチル化の証拠
ペプチド12（15μM）を、Set7/9（172nM）およびS-アデノシルメチオニン（SAM）(100μM）と共に、アッセイ緩衝液（20mM Tris pH8、25mM NaCl、1mM DTT、0.025％Tween-20）（200μl）中でインキュベートし、Set7/9によるペプチド基質のメチル化の度合を確かめるために、アリコートを一定の時間間隔で採取して、RP-HPLCおよびESI-MSによって分析した。アッセイは室温で行い、試料をそれぞれ0時間、2時間、および6時間の時間間隔で採取した。

6時間にわたるアッセイの進行を、HPLCスペクトルにより、図36に示す。6時間後に、保持時間はt_R＝18.3分（t＝0時間）からt_R＝18.4分へと明確にシフトしている。これらのピークをESI-MSで分析したところ、メチル基の付加と合致する14amuの質量シフトが確認された（図37）。6時間後に、基質質量（m/z 2814）はほとんど検出されず、モノメチル化ペプチドに対応するm/z 2828が主要種として存在した。ジメチル化ペプチドに対応する小さいピーク（m/z 2842）も観察された（図37）。

Set7/9によるペプチド12のメチル化が、Endo-LysCが触媒する切断からの保護を付与したかどうかを調べるために、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で1μMの濃度に希釈し、その結果生じた溶液のうち20μlを、384ウェル黒色マイクロプレートの3つのウェルに加えた。10μlのEndo-LysC（最終濃度2nM）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートしてから、NanoTaurusプレートリーダーを使ってFLTを測定した。比較のために同じ濃度でペプチドだけの対照を含めた。

Set7/9の非存在下では、2nM Endo-LysCと共にインキュベートした後に、ペプチド12のFLTが2.4ns増加した（図38）。これに対し、Endo-LysCとのインキュベーション前にSet7/9に曝露したペプチド12では、FLTの有意な増加は観察されなかった。これらの知見は、Set7/9が触媒するペプチド12のメチル化がプロテアーゼ誘発性切断からの保護を与えることと合致している。

Set7/9アッセイの経時変化
384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、20μlの体積でアッセイを行った。アッセイは、アッセイ緩衝液中に、ペプチド12（1μM）およびSet7/9酵素（100nM、50nM、25nM、または12.5nM）を含有した。10μlのEndo-LysC（最終濃度2nM）を添加することにより、一定間隔で反応を停止した。Endo-LysCと共に室温で15分間インキュベートした後に、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

図39Aからわかるように、Endo-LysCを添加する前のペプチド12のFLTにはほとんど変化がない。しかし、プロテアーゼを添加してインキュベートした後は、FLT調整の程度がSet7/9濃度およびアッセイ時間の関数として変動し、リジンのメチル化がプロテアーゼ保護を付与することと合致した（図39B）。基質と生成物の間の総合的寿命変化は約2.4nsであった。要約すると、Set7/9によるメチル化は、アッセイの蛍光寿命測定値の低下によってレポートされる。

アッセイの総合的ダイナミックレンジを増加させるために、ペプチド13を合成した。このペプチドは、N末端近くのアラニン残基が欠失しているので、ペプチド12より1アミノ酸短い。この変更はトリプトファンを9AA発蛍光団に近づけることによって基質のFLTの調整を増加させるであろうと予想された。ペプチド13のFLT測定値は13nsであり、ペプチド12よりおよそ1.5ns短かったので、ペプチド13により、Set7/9アッセイのダイナミックレンジを増加させうる可能性が生じた。ただし、そのような増加が実現するには、ペプチド13がSet7/9によってうまくメチル化されなければならない。そこで、Set7/9アッセイにおけるペプチド13の活性を確認するために、ペプチド12に用いたものと同じ条件を使って、上述の経時変化アッセイを繰り返した。
ペプチド13：WRTKQTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
プロテアーゼEndo-LysCを添加するまで、ペプチド13のFLTに明白な変化はなかった（図40A）。しかし、Endo-LysCと共に室温で15分間インキュベートした後は、アッセイウェルのFLTが、Set7/9濃度およびアッセイ時間の関数として変動し、ペプチド13のメチル化がプロテアーゼ保護を付与することと合致した（図40B）。重要なことに、アッセイの最大範囲は4nsまで増加しており、これによって感度の改善が得られた。そこで、Set7/9 FLTアッセイのさらなる検証は、ペプチド13を基質として行った。

S-アデノシルメチオニン（SAM）タイトレーション
基質としてペプチド13を使用してSAM補因子に対するSet7/9アッセイの依存性を調べた。アッセイは、384ウェルマイクロプレートにおいて、25nMのSet7/9および1μMの基質を使用し、アッセイ緩衝液（20μl）中、室温で2時間行った。SAM濃度を100μMから1.7nMまで変動させた。完了時に、Endo-LysC（2nM）を各ウェルに加え、20分のインキュベーション期間後に、FLTを測定した。図41に示すデータにより、Set7/9活性はK _m(app)＝500nMでSAM濃度に依存することが確認される。

S-アデノシルホモシステイン阻害剤タイトレーション
Set7/9に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイが阻害剤スクリーニングに適していることを実証するために、既知のSAM競合阻害剤、S-アデノシルホモシステイン（SAH）を購入し（Sigma）、アッセイにおいて試験した。条件は次のとおりであった：アッセイ緩衝液（20μl）中、SAH（1mM〜1.3μM）、Set7/9（50nM）、SAM（500nM）、およびペプチド13（1μM）。反応は、384ウェルマイクロプレートにおいて、室温で2時間行い、Endo-LysC（2nM）の添加によって停止した。

SAHについてIC₅₀＝37μMが決定されたが（図42）、これは、より低い濃度のSAMを使って得られた16μMというIC₅₀の報告値と同等である（Gauthier, N.；Caron, M.；Pedro, L.；Arcand, M.；Blouin, J.；Labonte, A.；Normand, C.；Paquet, V.；Rodenbrock, A.；Roy, M.；Rouleau, N.；Beaudet, L.；Padros, J.；Rodriguez-Suarez, R. J. Biomol. Screen., 2012, 17, 49-58）。

Z'ファクター
Set7/9 FLTアッセイがハイスループットスクリーニング（HTS）に適合することを実証するために、Z'ファクターの値を決定した。

アッセイは384ウェルマイクロプレートに設定した。プレートの半分はSet7/9（25nM）、ペプチド13（1μM）、およびSAM（100μM）を含有し、残りの半分は、Set7/9（25nM）、ペプチド13（1μM）を含有するが、SAMはアッセイ緩衝液で置き換えた。最終アッセイ体積は20μlとし、プレートを室温で2時間インキュベートした時点で、アッセイ緩衝液（10μl）中のEndo-LysC（最終濃度2nM）を各ウェルに加えた。室温でさらに15分間のインキュベーション後に、FLTを測定したところ、0.81というZ'ファクターが算出された（図43）。

結論として、2つの新規ペプチド（ペプチド12および13）を、FLTプロテアーゼ保護アッセイにおけるリジンメチルトランスフェラーゼSet7/9用の基質として検証した。アッセイの基礎は、リジン残基の隣りを特異的に切断するプロテアーゼEndo-LysCの作用によって調整因子と発蛍光団とが分離されるまでは9AAのFLTを調整する芳香族成分（例えばトリプトファン）を組み込んでいる、9AA標識ペプチド基質の使用である。Set7/9によるリジンメチル化は、Endo-LysC切断からの保護を付与し、それによってペプチドのFLTの調整が維持される。したがって、リジンメチル化は、アッセイのFLT測定値の低下によってレポートされる。

酵素、SAM、および阻害剤タイトレーションを実行することによってFLT Set7/9アッセイの性能を確かめ、0.81というZ'ファクターにより、このアッセイがHTS応用に適していることを確認した。

この研究は、タンパク質リジンメチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイのさらなる実例を提供し、このアプローチをリジン-4ヒストンメチルトランスフェラーゼSet7/9に拡張するものである。

（C）PRMT5概念実証FLTプロテアーゼ保護アッセイ
PRMT5は、PRMTに関する概念実証FLTプロテアーゼ保護アッセイの適切な候補である。この酵素は、BPS Bioscienceから市販されており、ヒストンH4上のアルギニン-3およびヒストンH3上のアルギニン-8を、優先的に、対称的にメチル化する（Branscombe et al., J Biol.Chem 2001, 276, 32971-32976）。FLTアッセイに適した基質を次に示す。
ペプチド15：Ac-WSGRGKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
ペプチド15は、ヒストンH4のN末端配列に基づいており、リジン側鎖を介して9AAが取り付けられ、無傷のペプチドにおける9AAのFLTを調整するためにトリプトファン残基がN末端に組み込まれている。Endo-ArgCによる処理は、アルギニン-3（N末端に隣接するセリン残基からの番号付け）においてペプチドを切断し、それによって9AAをトリプトファンから分離して、FLTの増加をもたらすと予想されるであろう。PRMT5によるアルギニン-3のメチル化はEndo-ArgCによる切断を防止し、それによって9AAのFLTの調整を維持するであろう。これに対し、PRMT5阻害剤の存在はアルギニンメチル化を防止し、それにより、ペプチドをアルギニン-3におけるプロテアーゼ誘発性切断に対して感受性のままにしておくであろう。したがって9AAのFLTは増加し、増加の程度を阻害の度合と相関させることができるであろう。

Endo-ArgC切断
ペプチド15のプロテアーゼ切断を調べるために、アッセイ緩衝液（20mM Tris pH8、25mM NaCl、1mM DTT、0.025％Tween-20）（30μl）中にペプチド15（1μM）およびさまざまな濃度のEndo-ArgC（Merck Chemicals Ltd.）（10nM〜1.25nM）を含有するアッセイを384ウェルマイクロプレートに用意した。FLTを1時間にわたって一定間隔で測定し、測定は3つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

Endo-ArgCはペプチド15をうまく切断して、FLTを9.4nsから17.2nsに増加させた（図45）。この大きなFLTの変化は、PRMT5に関する高感度アッセイの可能性をもたらした。

メチル化の証拠
ペプチド15（15μM）を、アッセイ緩衝液（20mM Tris pH8、25mM NaCl、1mM DTT、0.025％Tween-20）（200μl）中でPRMT5（150nM）およびS-アデノシルメチオニン（SAM）(100μM）と共にインキュベートし、PRMT5によるペプチド基質のメチル化の度合を確かめるために、アリコートを一定の時間間隔で採取して、RP-HPLCおよびESI-MSによって分析した。アッセイは室温で行い、試料を0時間、3.5時間、および17.5時間後の時間間隔でそれぞれ採取した。

17.5時間にわたるアッセイの進行を、HPLCスペクトルにより、図46に示す。17.5時間後に、保持時間はt_R＝20.0分（t＝0時間）からt_R＝20.3分へと明確にシフトしている。これらのピークをESI-MSで分析したところ、基質（m/z 2466）からモノメチル化生成物（m/z 2480）への質量シフトが確認された（図47）。加えて、ジメチル化ペプチド（m/z 2494）に対応する小さなピークも観察された（図47）。

RP-HPLCから判断すると反応は完了するには至っていなかったが、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で15倍希釈し、得られた溶液のうちの20μlを384ウェルマイクロプレートの3つのウェルに加えることによって、プロテアーゼによる処理後のFLTに対する効果を調べた。10μlのEndo-ArgC（最終濃度10nM）を各ウェルに加え、プレートを室温で60分間インキュベートしてから、FLTを測定した。比較のために同じ濃度でペプチドだけの対照を含めた。ここで使用したEndo-ArgCは、図45のデータを生成させるために使用したバッチとは供給者が異なり（Sigma）、活性も低いことが判明しているものであったことに留意されたい。したがって、より高い濃度と、より長いインキュベーション時間を使用した。

PRMT5の非存在下では、10nM Endo-ArgCと共にインキュベートした後に、ペプチド15のFLTが6.9ns増加した（図48）。これに対して、Endo-ArgCとのインキュベーション前にPRMT5に曝露したペプチド15では、FLTの増加が4.7nsであった。この増加は、アッセイ混合物中に存在する残存基質に起因すると考えることができ、PRMT5が触媒するメチル化がプロテアーゼ保護を与えるので、完全な増加が実現していない。

PRMT5アッセイの経時変化
384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、20μlの体積でアッセイを行った。アッセイは、アッセイ緩衝液中に、ペプチド15（1μM）およびPRMT5酵素（100nM、50nM、25nM、または12.5nM）を含有した。10μlのEndo-ArgC（最終濃度1.25nM）を添加することにより、一定間隔で反応を停止した。Endo-ArgCと共に室温で15分間インキュベートしてから、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

図49からわかるように、Endo-ArgCを添加する前のペプチド15のFLTには変化がない。しかし、プロテアーゼを添加してインキュベートした後は、FLT調整の程度がPRMT5濃度およびアッセイ時間の関数として変動し、アルギニンのメチル化がプロテアーゼ保護を付与することと合致する。したがって、PRMT5によるアルギニンメチル化は、アッセイの蛍光寿命測定値の低下によってレポートされる。

シネフンギン阻害剤タイトレーション
PRMT5に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイが阻害剤スクリーニングに適していることを実証するために、既知の汎用SAM競合阻害剤シネフンギンを購入し（Sigma）、アッセイにおいて試験した。条件は次のとおりであった：アッセイ緩衝液（20μl）中、シネフンギン（2mM〜0.1μM）、PRMT5（50nM）、SAM（10μM）およびペプチド15（1μM）。反応は、384ウェルマイクロプレートにおいて、室温で3時間、3つ一組にして行い、Endo-ArgC（1nM）の添加によって停止させた。シネフンギンについて13μMというIC₅₀が決定された（図51）。PRMT5に対するこの阻害剤のIC₅₀値が、過去に査読付き文献に報告されたことはない。

要約すると、この研究は、特異的プロテアーゼとしてEndo-ArgCを使ったタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイの実例を提供する。PRMT5を使って例証したが、このようなアプローチは、適当に設計されたペプチド基質を使用して、他のPRMTにも拡張することができる。

（D）EZH2リジンメチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
FLTプロテアーゼ保護アプローチによるタンパク質メチルトランスフェラーゼアッセイのさらにもう一つの実例として、リジンメチルトランスフェラーゼであるEZH2を、適切なターゲットとして検証した。

EZH2は、ヒストンH3上のリジン-27をメチル化し、他の4つのタンパク質、すなわちEED、SUZ12、RbAp48およびAEBP2との複合体を形成している場合に活性である。ヒト組換え五元複合体はBPS Bioscienceから入手することができる。EZH2酵素中の変異は、一定の形態の非ホジキンリンパ腫において悪性病変のリスクの増加と関連付けられている（Morin, R.D.；Johnson, N.A.；Severson, T.M.；Mungall, A.J.；An, J.；Goya, R.；Paul, J.E.；Boyle, M.；Woolcock, B.W.；Kuchenbauer, F.；Yap, D.；Humphries, R.K.；Griffith, O.L.；Shah, S.；Zhu, H.；Kimbara, M.；Shashkin, P.；Charlot, J.F.；Tcherpakov, M.；Corbett, R.；Tam, A.；Varhol, R.；Smailus, D.；Moksa, M.；Zhao, Y.；Delaney, A.；Qian, H.；Birol, I.；Schein, J.；Moore, R.；Holt, R.；Horsman, D. E.；Connors, J.M.；Jones, S.；Aparicio, S.；Hirst, M.；Gascoyne, R.D.；Marra, M.A. Nat. Genet. 2010, 42, 181-185）。したがって、EHZ2の低分子阻害剤の探索を容易にするためのアッセイは、創薬グループによって強く求められている。

H3K27配列に基づくペプチドはEZH2酵素複合体にとって適切な基質であり、この酵素に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイの開発を可能にするために、そのようなペプチドを、9AA発蛍光団とトリプトファン残基とを含むように修飾した（図68）。
ペプチド20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂

ペプチド20をEndo-LysCなどのリジン特異的プロテアーゼに曝露すると、リジン-27の隣りが切断されて、それがトリプトファン残基の調整効果からの9AAの切り離しにつながり、その結果、FLTが増加するであろう。これに対し、EZH2の作用によってリジン-27がメチル化されると、Endo-LysCによるこの残基における切断は、もはや可能ではなくなり、よって9AAのFLTの調整は維持される。したがってEZH2メチル化は、アッセイのFLT測定値の低下によってレポートされる。

ペプチド20のEndo-LysC切断
ペプチド20（1μM）を含有する384ウェルハイベースマイクロプレートにおいて、アッセイ緩衝液（20mM Bicine pH7.6、50mM NaCl、0.002％Tween-20、0.005％BSA、1mM DTT）（20μl）中、さまざまな濃度のEndo-LysC（4〜0nM）の存在下でアッセイを行うことにより、ペプチド20のプロテアーゼ切断を調べた。1時間にわたって一定間隔でFLTを測定し、測定は3つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

Endo-LysCによるペプチド20の切断は、リジン-27における切断がトリプトファンの調整効果からの9AAの分離につながるので、FLTの時間および濃度依存的増加をもたらした（図69）。FLTは12nsから16nsまで増加し、このアッセイに良好なダイナミックレンジを与えた。

EZH2アッセイの経時変化
384ウェルハイベース黒色マイクロプレートにおいて10μlの体積でアッセイを行った。アッセイは、アッセイ緩衝液（20mM Bicine pH7.6、50mM NaCl、0.002％Tween-20、0.005％BSA、1mM DTT）中にペプチド20（1μM）、SAM（3μM）およびEZH2複合体（200ng/ウェル〜75ng/ウェル）を含有した。10μlのEndo-LysC（最終濃度4nM）を添加することにより、反応を一定間隔で停止した。Endo-LysCと共に室温で35分間インキュベートした後に、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

図70からわかるように、プロテアーゼとのインキュベーション後は、FLTの測定値が、EZH2濃度およびアッセイ時間の関数として低下し、リジン-27のメチル化がプロテアーゼ誘発性切断からの保護を付与することと合致した。応答は75および100ng/ウェルのEZH2については線形であり、以後の実験における使用には、後者の濃度を選択した。EZH2複合体の回転率は低いので、アッセイを長時間にわたって行ったことに留意されたい。要約すると、EZH2によるメチル化は、アッセイの蛍光寿命測定値の低下によってレポートされる。

S-アデノシルメチオニン（SAM）タイトレーション
基質としてペプチド20を使って、SAM補因子に対するEZH2アッセイの依存性を調べた。アッセイは、384ウェルハイベースマイクロプレートにおいて、アッセイ緩衝液（10μl）中、100ng/ウェルのEZH2複合体と1μMの基質とを使って、室温で5時間行った。SAM濃度は100μMから0.05μMまで変動させた。完了後に、Endo-LysC（4nM）を各ウェルに加え、15分のインキュベーション期間後に、FLTを測定した。データをGraphPad Prismの可変スロープ用量応答モデル（variable slope dose-response model）に当てはめることで、SAMに関するK _M(app)を決定した。

図71から、EZH2アッセイにおいて、0.71μMのK _M(app)がSAMに関して決定された。この値は、放射測定アッセイフォーマットで決定された0.21〜0.30μMという文献値（Sneeringer, C.J.；Scott, M.P.；Kuntz, K.W.；Knutson, S.K.；Pollock, R.M.；Richon, V.M.；Copeland, R.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2010, 107, 20980-20985）とよく一致している。

S-アデノシルホモシステイン（SAH）阻害剤タイトレーション
EZH2に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイが阻害剤スクリーニングに適していることを実証するために、既知の汎用SAM競合阻害剤SAHを購入し（Sigma）、アッセイにおいて試験した。条件は次のとおりであった：アッセイ緩衝液（10μl）中、SAH（1mM〜0.05μM）、EZH2複合体（100ng/ウェル）、SAM（3μM）およびペプチド20（1μM）。反応は、384ウェルハイベースマイクロプレートにおいて、3つ一組にして、室温で5時間行い、Endo-LysC（4nM）の添加によって停止させた。

SAHについて9.7μMというIC₅₀が決定された（図72）。EZH2に対するこの阻害剤に関するIC₅₀値が、過去に査読付き文献に報告されたことはない。

要約すると、ペプチド20を、FLTプロテアーゼ保護アッセイにおけるリジンメチルトランスフェラーゼEZH2用の基質として検証した。アッセイの基礎は、リジン残基の隣りを特異的に切断するプロテアーゼEndo-LysCの作用によって調整因子と発蛍光団とが分離されるまでは9AAのFLTを調整する芳香族成分（例えばトリプトファン）を組み込んでいる、9AA標識ペプチド基質の使用である。EZH2によるリジンメチル化はEndo-LysC切断からの保護を付与し、それによって、このペプチドのFLTの調整が維持される。したがって、リジンメチル化は、アッセイのFLT測定値の低下によってレポートされる。

酵素、SAMおよび阻害剤タイトレーションを実行することにより、FLT EZH2アッセイの性能を確かめた。

この研究は、タンパク質リジンメチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイのさらなる実例を提供し、このアプローチをリジン-27ヒストンメチルトランスフェラーゼEZH2にも拡張するものである。

実施例3−タンパク質デメチラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
ペプチド/タンパク質基質中のリジンまたはアルギニン残基から1つ以上のメチル基を除去するタンパク質デメチラーゼ（PDM）をFLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする手段を図25に示す。ここでは、9-アミノアクリジン（9AA）（または他の適切なレポーター）の基質寿命が、配列中のトリプトファン残基（または蛍光寿命の他の既知の調整因子）の存在によって調整されている。リジンまたはアルギニン後を切断するプロテアーゼによる基質の処理はタンパク質加水分解を誘発せず、トリプトファンによる寿命調整は保たれる。適当なPDM酵素によるリジンまたはアルギニンの脱メチル化後は、生成物ペプチドをプロテアーゼで処理すると、リジンまたはアルギニン後での切断が誘発され、発蛍光団（9AA）の寿命はもはや調整されなくなる。

組換えPKDM（例えばLSD1、十文字ドメインクラス）酵素は、BPS Bioscience、Millipore、またはEnzo-Life Sciencesなどの供給者から市販されている。現在までに同定された唯一のPRDMはJMJD6である（Cheng, B., Chen, Y., Zhao, Y., Bruick, R.K., Science, 2007, 318, 444-447）が、最近の報文は、デメチラーゼとされているその活性を否定し、その主要な役割は、リジン残基のヒドロキシル化を触媒することであると述べている（Webby, C.J., Wolf, A., Gromak, N., Dreger, M., Kramer, H., Kessler, B., Neilsen, M.L., Schmitz, C., Butler, D.S., Yates III, J.R., Delahunty, C.M., Hahn, P., Lengeling, A., Mann, M., Proudfoot, N.J., Schofield, C.J., and Boettger, A., Science, 2009, 325, 90-93）。

JHDM1Aは、PKDMに関する概念実証FLTプロテアーゼ保護アッセイに適した候補である。この酵素はBPS Bioscienceから市販されており、ヒストンH3上のリジン-36を優先的に脱メチル化して、それをジ-またはモノ-メチル化状態から、ネイティブの非メチル化残基へと転化する（Tsukada, U. et al., Nature, 2006, 439, 811-826）。FLTアッセイに適した基質は図26に示すペプチド10である。

図26に示すような例では、9AAのFLTがC末端近くに組み込まれたトリプトファン残基の存在によって調整されている。JHDM1Aによるリジン-36の脱メチル化は、この残基におけるプロテアーゼ誘発性切断を可能にし、それによって、調整を解除し、9AAのFLTの増加をもたらすであろう。これに対して、JHDM1A阻害剤の存在はリジン脱メチル化を防止することによって、ペプチドをリジン-36におけるプロテアーゼ誘発性切断に対して感受性のままにしておくであろう。したがって9AAのFLTは調整されたままになり、調整の程度は脱メチル化の度合と相関させることができるであろう。この目的に適したプロテアーゼはEndo-LysCであり、これはメチル化リジン（リジン-37はこの残基における非特異的切断を防止するためにモノメチル誘導体として保護されている）を切断しないであろう。Endo-LysCはThermo-Fisherなどの供給者から市販されている。

JHDM1Aアッセイ
このアッセイは、384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、20μlの体積で行った。アッセイは、アッセイ緩衝液（50mM Tris、pH7.4、100μMアスコルビン酸ナトリウム、10μM硫酸第一鉄アンモニウム、100μM α-ケトグルタル酸、0.01％Tween-20）中にペプチド10（1μM）およびJHDM1A酵素（150nM）を含有した。ペプチドだけを含有する対照ウェルも含めた。室温で5時間のインキュベーション後に、10μlのEndo-LysC（30nM）をウェルに加え、プレートを室温で120分までインキュベートした。次に、3つ一組にして、NanoTaurusプレートリーダーで、FLTを測定した。

ペプチド10対照のFLTはプロテアーゼとのインキュベーション後も増加せず、メチル化リジンがプロテアーゼ保護を付与して、固有のトリプトファン残基による9AAのFLTの継続的調整をもたらすことと合致した（図35）。これに対して、JHDM1Aとの反応後のペプチド10のFLTは、プロテアーゼ処理後に1ns以上増加した。この結果は、JHDM1Aによるリジン-36の脱メチル化が、ペプチドをEndo-LysCによる切断に対して感受性にしたことと合致する（図35）。それゆえに、デメチラーゼによる基質の脱メチル化、したがってデメチラーゼ活性は、蛍光寿命測定値の増加によってレポートされる。

これらの結果は、FLTプロテアーゼ保護戦略をタンパク質デメチラーゼターゲットクラスに拡張できることを実証している。

実施例4−ヒストンアセチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
ペプチド/タンパク質基質中のリジン残基をアセチル化するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）をFLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする手段を図27に示す。ここでは、9-アミノアクリジン（9AA）（または他の適切なレポーター）の基質寿命が、配列中のトリプトファン残基（または蛍光寿命の他の既知の調整因子）の存在によって調整されている。リジン後を切断するプロテアーゼによる基質の処理はタンパク質加水分解を誘発し、トリプトファン残基による蛍光寿命の調整を取り除くであろう。適当なHAT酵素によるリジンアセチル化後は、生成物ペプチドをプロテアーゼで処理してもリジン後での切断は誘発されず、発蛍光団（9AA）の寿命は調整されたままである。

組換えHAT酵素（例えばGcn5、PCAF、Hat1、p300）は、AbnovaまたはMilliporeなどの供給者から市販されている。

ヒストンN末端配列に基づき、特定のHATに関してアセチル化の部位であるリジン残基を挟んで反対の位置に発蛍光団と調整残基とを組み込んでいるペプチド基質は、このクラスの酵素に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイの基礎を成すであろう。ペプチド16は、K14をPCAFによるアセチル化部位とするヒストンH3配列に基づく基質である（図28）。
ペプチド16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂

ペプチド16のEndo-LysC切断
アッセイ緩衝液（50mM Tris pH8、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.05％BSA）（30μl）中、Endo-LysC（25nM）の存在下または非存在下に、ペプチド16（1μM）を含有する384ウェルマイクロプレートにおいてアッセイを行うことにより、ペプチド16のプロテアーゼ切断を調べた。1時間にわたって一定間隔でFLTを測定し、測定は3つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

Endo-LysCと共に1時間インキュベートすると、ペプチド16のFLTは13.9nsから15.7nsまで増加した（図52）。これに対して、Endo-LysCの非存在下では、FLTがこの期間中は一定のままであった。これらの結果は、Endo-LysCによるリジン-14の切断が、トリプトファン残基の調整効果からの9AA発蛍光団の分離につながり、それが9AAのFLTの増加をもたらすことと合致している。9AAとトリプトファンとがさらに接近している第2の基質も設計した（図53）。上に詳述したEndo-LysCによる切断反応をペプチド17を使って繰り返すことで、図54に示す結果を得た。
ペプチド17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂

ペプチド17の場合、Endo-LysCへの曝露後に、FLTは10.2nsから15.0nsまで増加して、4.8nsのアッセイ範囲を与えた。これはペプチド16で観察された1.8nsという範囲と比較すると著しい改善である。さらにまた、曲線は1時間後でもプラトーに到達していなかったことから、切断反応を延長することによってアッセイ範囲をさらに増加させるという選択肢も与えられる。

アセチル化の証拠
ペプチド17（30μM）を、アッセイ緩衝液（50mM Tris pH8、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.05％BSA）（250μl）中で、PCAF（100nM）およびアセチル補酵素A（AcCoA）（50μM）と共にインキュベートし、pCAFによるペプチド基質のアセチル化の度合を確かめるために、アリコートを一定の時間間隔で採取し、RP-HPLCおよびESI-MSによって分析した。アッセイは室温で行い、試料は、0分、30分、60分および90分後の時間間隔でそれぞれ採取した。

90分にわたるアッセイの進行を、HPLCスペクトルにより、図55に示す。30分後には、基質ピーク（t_R＝16.1分）から離れた新しいピーク（t_R＝16.7分）の出現が目につく。それらのピークをESI-MSで分析したところ、t_R＝16.7分のピークは基質より42amu大きい質量を有することが確認され、アセチル基の付加と合致した（図56）。90分までには、基質ピークは無視できる程度になり、アセチル化生成物のピークと置きかわっていた。したがってこの実験はペプチド17がPCAFの良好な基質であることを裏付けている。

PCAFアッセイの経時変化
アッセイを、384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、20μlの体積で行った。アッセイは、アッセイ緩衝液中にペプチド17（1μM）、AcCoA（50μM）、およびPCAF酵素（250nM〜31nM）を含有した。10μlのEndo-LysC（最終濃度25nM）を添加することにより、反応を一定間隔で停止した。Endo-LysCと共に室温で90分インキュベートした後に、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

図57Aからわかるように、Endo-LysCの添加前は、ペプチド17のFLTの変化は無視できる程度である。しかし、プロテアーゼを添加してインキュベートした後は、FLTがPCAF濃度およびアッセイ時間の関数として減少し、リジンのアセチル化がプロテアーゼ誘発性切断からの保護を付与することと合致する（図57B）。要約すると、PCAFによるアセチル化は、アッセイの蛍光寿命測定値の減少によってレポートされる。

AcCoAタイトレーション
AcCoA濃度に対するPCAFアッセイの依存性を調べた。アッセイは、384ウェルマイクロプレートにおいて、アッセイ緩衝液（20μl）中、125nMのPCAFと1μMのペプチド17とを使って、室温で2時間行った。AcCoAの濃度は25μMから0.02μMまで変動させた。反応の完了後に、Endo-LysC（25nM）を各ウェルに加え、90分のインキュベーション期間後にFLTを測定した。データをGraphPad Prismの可変スロープ用量応答モデルに当てはめることで、AcCoAに関するK _Mを決定した。

図58から、PCAFアッセイにおいて、1.2μMのK _M(app)がAcCoAに関して決定された。この値は、報告されている1.6μMというK _Mと合致している（Poux, A. N；Cebrat, M.；Kim, C.M.；Cole, P.A.；Marmorstein, R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 14065-14070）。

要約すると、ペプチド17を、FLTプロテアーゼ保護アッセイにおけるヒストンアセチルトランスフェラーゼPCAF用の基質として検証した。このアッセイの基礎は、リジン残基の隣りを特異的に切断するプロテアーゼEndo-LysCの作用によって調整因子と発蛍光団とが分離されるまでは9AAのFLTを調整する芳香族成分（例えばトリプトファン）を組み込んでいる、9AA標識ペプチド基質の使用にある。pCAFによるリジンアセチル化はEndo-LysC切断からの保護を付与し、それによって、ペプチドのFLTの調整を維持する。したがって、リジンアセチル化は、アッセイのFLT測定値の低下によってレポートされる。

酵素およびSAMタイトレーションを行うことによってFLT PCAFアッセイの性能を確かめた。

この研究は、代表例としてPCAFを使用して、ヒストンアセチルトランスフェラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイの実例を提供するものである。

実施例5−ヒストンデアセチラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイ
ペプチド/タンパク質基質中のリジン残基を脱アセチル化するヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を、FLTプロテアーゼ保護アプローチによってアッセイする手段を図29に示す。ここでは、9-アミノアクリジン（9AA）（または他の適切なレポーター）の基質寿命が、配列中のトリプトファン残基（または蛍光寿命の他の既知の調整因子）の存在によって調整されている。基質は、リジン残基がアセチル化されているために、リジン特異的プロテアーゼによる切断から保護されており、それによって、発蛍光団のFLT調整が維持されている。適当なHDACによる脱アセチル化は、ペプチドを、リジンにおけるプロテアーゼ誘発性切断に対して感受性にして、調整残基からの発蛍光団の分離とそれに伴うFLTの増加をもたらす。組換えHDAC酵素（例えばHDAC1〜11、SIRT1〜5）は、Millipore、Signalchem、Sigma-Aldrich、Enzo Life SciencesまたはBPS Bioscienceなどの供給者から市販されている。

図30に示すように、基質は、FLTベースのプロテアーゼ保護アッセイにおける使用に適合させることができる。ここでは、脱アセチル化されるリジンに隣接するC末端に発蛍光団（9AA）が組み込まれ、トリプトファン（または他の適切な調整残基）が前述のリジンのN末端側に置かれる。HDACが触媒する脱アセチル化後のプロテアーゼ誘発性切断は、9AAをトリプトファン残基から分離するので、FLTの増加につながるであろう。したがってFLTの増加はHDAC活性の程度と直接的に相関させることができるであろう。もちろん、問題のHDACの配列特異性に応じて、他の同様に意図された基質を使用することもできると考えられる。

HDAC1は、BPS Bioscienceなどの供給者から市販されている詳しく特徴づけられた酵素であるから、ヒストンデアセチラーゼに関する概念実証FLTプロテアーゼ保護アッセイに適した候補である。HDAC1は、ヒストンH3上のリジン-27を脱アセチル化すると報告されているが、文献から得られる証拠は、HDAC1および他のメンバーが、図30に示すタイプのアセチル化リジン残基を含有する短いペプチド基質を認識できることを示唆している（Riester, D.；Hildmann, C.；Gruenewald, S.；Beckers, T.；Schwienhorst, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 357, 439-445）。したがって、HDAC1 FLTプロテアーゼ保護アッセイに適した基質は、以下に示し、図59にも示す、ペプチド18である。
ペプチド18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂
ペプチド19：Ac-IWKK(9AA)-CONH₂

ペプチド18におけるアセチル化リジン残基のN末端側にはトリプトファン残基があり、一方、C末端側には、9AA発蛍光団で標識された側鎖を持つリジン残基がある。無傷の基質では、9AAのFLTが、近接して位置するトリプトファン残基によって調整されるであろう。HDAC1によるリジン残基の脱アセチル化でペプチド19（図60）が形成されると、ペプチドは、適当なプロテアーゼ（例えばトリプシン）によるこの部位での切断に対して感受性になり、それが9AAのトリプトファンからの分離につながって、FLTの増加をもたらす。アセチル化リジンはプロテアーゼによって認識されないので、トリプシンへの基質18の曝露は切断をもたらさないであろう。さらにまた、HDAC1阻害剤の存在は、リジン脱アセチル化を防止し、それによってペプチドをプロテアーゼ誘発性切断に対して耐性のままにしておくであろう。したがって9AAのFLTは調整されたままになり、調整の程度は阻害の度合と相関させることができるであろう。

ペプチド18および19のトリプシン切断
ペプチド18および19のプロテアーゼ切断を調べるために、アッセイ緩衝液（25mM Tris pH8、137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl₂、0.01％BSA）（30μl）中にペプチド18（1μM）または19（1μM）のどちらか一方とさまざまな濃度のトリプシン（625pM〜0pM）とを含有するアッセイを、384ウェルマイクロプレート中に用意した。1時間にわたって一定間隔でFLTを測定し、測定は3つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

ペプチド18をさまざまな濃度のトリプシンに曝露してもFLTの増加は観察されず、このプロテアーゼがアセチル化リジンの隣りを切断できないことと合致した（図61A）。これに対して、対応する脱アセチル化ペプチド19をトリプシンと共にインキュベートした場合は、リジンにおける切断がトリプトファンの調整効果からの9AAの分離につながるので、FLTの時間および濃度依存的増加が起こった（図61B）。FLTは5.5nsから16nsまで増加して、10.5nsという優れたアッセイ範囲を与えた。

脱アセチル化の証拠
ペプチド18（15μM）をアッセイ緩衝液（25mM Tris pH8、137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl₂、0.01％BSA）（200μl）中でHDAC1（200nM）と共にインキュベートし、HDAC1によるペプチド基質の脱アセチル化の度合を確かめるために、アリコートを一定の時間間隔で採取して、RP-HPLCおよびESI-MSによって分析した。アッセイは室温で行い、試料を、0時間、2時間、4時間、および6時間後の時間間隔で、それぞれ採取した。

6時間にわたるアッセイの進行を、HPLCスペクトルにより、図62に示す。2時間後には、基質ピーク（t_R＝21.2分）とは十分に分離した新しいピーク（t_R＝19.1分）の出現が目につく。これらのピークをESI-MSで分析したところ、t_R＝19.1分のピークは、基質より42amu少ない質量を有することが確認され、アセチル基の喪失と合致した（図63）。t_R＝21.2分の基質ピークが存在し続けていることによって証明されるとおり、反応は6時間後でも完了には至っていないように見えたが、これは、経時的な試薬分解の結果であったかもしれない。この実験はペプチド18がHDAC1の基質であることを裏付けている。

HDAC1アッセイの経時変化
アッセイは、384ウェル黒色マイクロプレートにおいて、20 l体積中で行った。アッセイは、アッセイ緩衝液中にペプチド18（1μM）およびHDAC1酵素（200nM〜25nM）を含有した。10μlのトリプシン（最終濃度10nM）を添加することによって反応を一定間隔で停止させた。トリプシンと共に室温で10分間インキュベートした後にFLTを測定した。測定は全て2つ一組にしてNanoTaurusプレートリーダーで行った。

図64Aからわかるように、トリプシンの添加前は、アッセイのFLTの変化は無視できる程度である。しかし、プロテアーゼを添加してインキュベートした後は、FLTがHDAC1濃度およびアッセイ時間の関数として減少し、リジンの脱アセチル化がペプチドをプロテアーゼ誘発性切断に対して感受性にすることと合致する（図64B）。200nM HDAC1の使用は、FLT値のプラトーによって示されるとおり、2時間後に完全な脱アセチル化をもたらし、一方、25nM HDAC1は経時的にシグナルの直線的増加をもたらす。要約すると、HDAC1による脱アセチル化は、アッセイの蛍光寿命測定値の増加によってレポートされる。

基質タイトレーション
ペプチド基質濃度に対するHDAC1アッセイの依存性を調べた。アッセイは、384ウェルマイクロプレートにおいて、アッセイ緩衝液（20μl）中、25nMのHDAC1を使って、室温で1時間行った。ペプチド18の濃度は、40μMから0.3μMまで変動させた。反応が完了したら、トリプシン（10nM）を各ウェルに加え、10分間のインキュベーション後にFLTを測定した。標準曲線を参照することによってデータを生成物形成速度に変換してから、GraphPad Prism中のMichaelis-Mentenモデルを使って当てはめることにより、基質K _Mを決定した。

図65から、HDAC1アッセイでは、基質18に関して22.5μMのK _Mが決定された。この値は、HDACアッセイにおいて使用された他の短いペプチド基質のものと合致している（Riester, D.；Hildmann, C.；Gruenewald, S.；Beckers, T.；Schwienhorst, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 357, 439-445）。

トリコスタチンA阻害剤タイトレーション
HDAC1に関するFLTプロテアーゼ保護アッセイが阻害剤スクリーニングに適していることを実証するために、既知の汎用HDAC阻害剤トリコスタチンA（TSA）を購入し（Sigma）、アッセイにおいて試験した。条件は次のとおりであった：アッセイ緩衝液（20μl）中、TSA（1μM〜5.6nM）、HDAC1（25nM）、およびペプチド18（10μM）。反応は、384ウェルマイクロプレートにおいて、3つ一組にして室温で1.5時間行い、トリプシン（10nM）の添加によって停止させた。

TSAについて0.89nMというIC₅₀が決定されたが（図66）、これは文献に報告されている1.3nMというIC₅₀と合致している（Halley, F.；Reinshagen, J.；Ellinger, B.；Wolf, M.；Niles；A. M.；Evans, N. J.；Kirkland, T. A.；Wagner, J. M.；Jung, M.；Gribbon, P.；Gul, S. J. Biomol. Screen. 2011, 16, 1227-1235）。

Z'ファクター
HDAC1 FLTアッセイがハイスループットスクリーニング（HTS）に適合していることを実証するために、Z'ファクターの値を決定した。

アッセイは384ウェルマイクロプレートに設定した。プレートの半分がHDAC1（25nM）およびペプチド18（10μM）を含有するのに対して、残りの半分はHDAC1（25nM）、ペプチド18（10μM）、およびTSA阻害剤（1μM）を含有した。最終アッセイ体積は20μlとし、プレートを室温で1.5時間インキュベートした時点で、アッセイ緩衝液（10μl）中のトリプシン（10nMの最終濃度）を各ウェルに加えた。室温でさらに15分間のインキュベーション後に、FLTを測定したところ、0.85というZ'ファクターが算出されたことから（図67）、HTSスクリーニングに関する本アッセイの適性が実証された。

要約すると、FLTプロテアーゼ保護アッセイにおけるヒストンデアセチラーゼHDAC1用の基質としてペプチド18を検証した。このアッセイの基礎は、調整因子と発蛍光団とがリジン（またはアルギニン）残基の隣を特異的に切断するプロテアーゼ・トリプシンの作用によって分離されるまでは9AAのFLTを調整する芳香族成分（例えばトリプトファン）を組み込んでいる、9AA標識ペプチド基質の使用である。HDAC1によるリジン脱アセチル化は、ペプチドを、トリプシン切断に対して感受性にし、それは、9AA発蛍光団が調整因子から分離されるので、FLTの増加につながる。したがってリジン脱アセチル化は、アッセイのFLT測定値の増加によってレポートされる。

酵素、基質および阻害剤タイトレーションを行うことによってFLT HDAC1アッセイの性能を確かめた。また、0.85というZ'ファクターは、このアッセイがHTS応用に適していることを裏付けている。

この研究は、代表例としてHDAC1を使用して、ヒストンデアセチラーゼに関するFLTプロテアーゼ保護アッセイの実例を提供するものである。

実験項−材料と方法
以下の項では、実施例1〜5で使用した実験プロトコール、材料および方法のさらなる詳細を述べる。

一般的事項
試薬および溶媒は、Sigma-Aldrich、Merck Chemicals、New England Biolabs、Thermo-FisherまたはRathburnから購入し、別段の記載がある場合を除き、供給された状態のまま使用した。ヒト組換えPAD4酵素はInsight Biotechnologyを介してOrigeneから購入した。ヒト組換えG9a酵素はMillipore、Abcam、またはBPS BioScienceから（AMSBio、英国を介して）購入した。ヒト組換えPAD2酵素はModiquest Research（オランダ・ナイメーヘン）から購入した。ヒト組換えJHDM1A、Set7/9、PRMT5、HDAC1およびEZH2/EED/SUZ12/RbAp48/AEBP2複合体はBPS BioscienceからAMSBio（英国）を介して購入し、ヒト組換えPCAFはEnzo Life Sciencesから購入した。3-(9-アミノアクリジン-2-イル)-プロピオン酸はAlmac Sciences（北アイルランド・クレーガボン）によって調製され、供給された状態のまま使用した。384ウェルマイクロプレートはGreinerから購入した（#781076または784076）。

マススペクトルはBruker microTOFエレクトロスプレーMSで得た。分析用RP-HPLCは、Agilent 1100または1200シリーズHPLCシステムを使用し、Phenomenex Luna C18カラム（250×4.6mm）と0.1％TFAを含有する水/アセトニトリルの勾配とを使って、1ml/分の流速で行った。分取用RP-HPLCは、Gilson 305ポンプ、Gilson 811CダイナミックミキサーおよびABI 783A UV検出器からなるGilson HPLCシステムを使用し、Phenomenex Luna C18カラム（250×21.2mm）と、0.1％TFAを含有する水/アセトニトリルの勾配とを使って、9ml/分の流速で行った。

蛍光寿命は、時間相関単一光子計数法（TCSPC）を使用して、NanoTaurus蛍光寿命プレートリーダー（Edinburgh Instruments Ltd.）で測定した。励起光源は、5MHzの繰返し数でピコ秒光パルスを生成する405nmの半導体レーザーとした。放出光を438nm帯域フィルタ（Semrock）を通して20nmの帯域幅で収集した。データはピークチャンネルで3000カウントまで収集し、双指数減数モデルを使って平均寿命を算出した。

ペプチド合成
自動固相ペプチド合成は、0.20〜0.25mMolのRinkアミドレジンを使用し、標準的なFmoc/tBu SPPSケミストリーを使って、各カップリングサイクルにつき1mmolのFmoc-アミノ酸とHOCt（エチル-1-ヒドロキシ-1H-1,2,3-トリアゾール-4-カルボキシレート）またはOxyma Pure（エチル2-シアノ-2-(ヒドロキシイミノ)アセテート）/DIC（N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド）カップリング試薬とにより、ABI433ペプチド合成装置で行った。DMF中の0.5M無水酢酸溶液で処理することにより、未反応のアミノ基をキャッピングした。Fmoc除去は、DMF中の20％v/vピペリジン溶液で20分間処理することによって行った。発蛍光団ラベリングがリジン残基を介してなされる場合は、色素を取り付ける部位がN末端であるかペプチド配列内であるかに応じて、Boc-Lys(Fmoc)-OHまたはFmoc-Lys(ivDde)-OHビルディングブロックを使用することにより、オルソゴナルな脱保護を容易にした。ivDde基は、DMF中の3％ヒドラジン溶液で処理することにより、レジン上で除去した。

3-(9-アミノアクリジン-2-イル)-プロピオン酸によるペプチドの手動ラベリングは、色素（レジンに対して2等量）を最少量のDMFに溶解し、30分間の超音波処理により、DMF中の0.5M HOCt（エチル-1-ヒドロキシ-1H-1,2,3-トリアゾール-4-カルボキレート）（3等量）溶液および0.5M DIC（2等量）溶液で活性化することによって行った。次に、活性化された色素溶液を、DMF中で事前に膨潤させたレジンに加え、その反応混合物を超音波処理により、室温で5時間撹拌し、室温で一晩静置しておいた。レジンを濾過し、DMFとDCMでよく洗浄し、減圧下で一晩乾燥した。

92.5％TFA v/v、5％H₂O v/v、2.5％TIS v/vで4時間処理することにより、ペプチドを固相から切り離すと同時に側鎖脱保護を行った。レジンを濾過によって除去し、粗ペプチドを氷冷エーテルから沈殿させ、4000rpmで5分間の遠心分離によって収集した。次に、その粗ペプチドをMeCN/H₂O（50：50）に溶解し、凍結乾燥してから、分取用HPLCによって純度＞95％まで精製した。Varian Cary 50 UV分光測光器で行った測定で8735M^-1cm^-1（1：1MeCN/水中、405nmで）という9AAのモル吸光係数に基づいて、標識ペプチドを小分けした。

緩衝液条件
PAD4緩衝液とPAD2緩衝液は、pH8.0の20mM Tris/HCl、200μM CaCl₂、5mM DTT、および0.01％CHAPSからなった。
G9a緩衝液、Set7/9緩衝液、およびPRMT5緩衝液は、pH8.0の20mM Tris/HCl、25mM NaCl、1mM DTT、および0.025％Tween-20からなった。
JHDM1A緩衝液は、pH7.4の50mM Tris/HCl、100μMアスコルビン酸ナトリウム、10μM硫酸第一鉄アンモニウム、100μM α-ケトグルタル酸、および0.01％Tween-20からなった。
HDAC1緩衝液は、pH8.0の25mM Tris/HCl、137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl₂、0.01％BSAからなった。
pCAF緩衝液は、pH8.0の50mM Tris/HCl、0.1mM EDTA、0.05％BSA、1mM DTTからなった。
EZH2緩衝液は、pH7.6の20mM Bicine、50mM NaCl、0.002％Tween-20、0.005％BSA、1mM DTTからなった。

切断アッセイ
関連アッセイ緩衝液中のEndo-LysC（10μl）またはトリプシンを384ウェルマイクロプレート中のウェルに加えた。プロテアーゼをアッセイ緩衝液で置き換えた対照も含めた。関連アッセイ緩衝液中のペプチド基質（10μl）を添加することによって反応を開始させ、一定間隔でFLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

PAD4アッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、300μlの総アッセイ体積で行った。組換えPAD4酵素を含有する溶液にペプチドを添加することによって反応を開始させた。アッセイにおけるPAD4の最終濃度は30nMであり、ペプチドについては15μMであった。試料（50μl）を、0分、30分、および60分の間隔でアッセイ混合物から採取し、50μlの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

ペプチド基質のシトルリン化を確認する場合は、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で15倍希釈し、384ウェルマイクロプレートに移し（各ウェル20μl）、FLTを測定した。次に、トリプシン（アッセイ緩衝液中10μl）を各ウェルに加え、プレートを室温で10分間インキュベートした。次にFLTを再測定した。測定は全て3つ一組にして行い、ウェル中のトリプシンの最終濃度は10nMだった。

あるいは、アッセイを、384ウェルマイクロプレート中、室温において、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えPAD4酵素（10μl）を含むウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド1（10μl）を加えた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるPAD4の最終濃度は125〜500pMの間で変動させ、一方、ペプチド1の濃度は1μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、トリプシン（アッセイ緩衝液中の10μl；最終濃度10nM）の添加により、90分後に、一緒に停止させた。室温で10分間のインキュベーション後に、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。

基質タイトレーションの場合は、アッセイ緩衝液中のさまざまな濃度のペプチド1（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のPAD4（10μl）を加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした後、アッセイ緩衝液中のトリプシン10μlを各ウェルに加えた。室温でさらに10分間インキュベートした後、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

Z'ファクター決定の場合は、384ウェルマイクロプレートの半分に、アッセイ緩衝液中のPAD4とペプチド1を、10μl充填した。残りのウェルには、CaCl₂を含有しないアッセイ緩衝液中のPAD4およびペプチド1を、10μl充填した。プレートを封止し、室温で1時間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液中のトリプシン10μlを各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートしてからFLTを測定した。試薬の最終濃度は次のとおりであった：PAD4（125pM）；ペプチド1（200nM）；トリプシン（10nM）。

PAD2アッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、300μlの総アッセイ体積で行った。組換えPAD2酵素を含有する溶液にペプチド1を添加することによって反応を開始させた。アッセイにおけるPAD2の最終濃度は30nMであり、ペプチドについては15μMであった。試料（50μl）を、0分、30分、および120分の間隔でアッセイ混合物から採取し、50μlの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

ペプチド基質のシトルリン化を確認する場合は、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で15倍希釈し、384ウェルマイクロプレートに移し（各ウェル20μl）、FLTを測定した。次に、トリプシン（アッセイ緩衝液中10μl）を各ウェルに加え、プレートを室温で10分間インキュベートした。次にFLTを再測定した。測定は全て3つ一組にして行い、ウェル中のトリプシンの最終濃度は10nMだった。

あるいは、アッセイを、384ウェルマイクロプレート中、室温において、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えPAD2酵素（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド1（10μl）を加えた。ペプチドまたはシトルリン化ペプチドだけを含有する対照も含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるPAD2の最終濃度は23.5〜1.5nMの間で変動させ、一方、ペプチド1の濃度は1μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、トリプシン（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度10nM）の添加により、60分後に、一緒に停止させた。室温で10分間のインキュベーション後に、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

G9aアッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、150μlの総アッセイ体積で行った。組換えG9a酵素を含有する溶液にSAM（100μM）を添加することによって反応を開始させた。アッセイにおけるG9aの最終濃度は100であり、ペプチドについては15μMであった。試料（50μl）を、0分、2時間および6時間の間隔でアッセイ混合物から採取し、50μlの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

あるいは、アッセイを、384ウェルマイクロプレート中、室温において、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えG9a酵素（5μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド（10μl）を加えた。SAM（5μl）の添加によって反応を開始させた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。G9a濃度は200nM〜1.5nMの間で変動させ、SAM濃度は200〜0.4μMの間で変動させた。ペプチドの濃度は1μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、Endo-LysC（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度2nM）の添加により、2時間後に、一緒に停止させた。室温で10分間のインキュベーション後に、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。

阻害剤タイトレーションの場合は、化合物（5μl）をG9a（5μl）と共に室温で30分間プレインキュベートしてから、ペプチド（5μl）およびSAM（5μl）を加えた。SAMまたは阻害剤を含有しない対照を含めた。

Z'ファクター決定の場合は、384ウェルマイクロプレートの半分に、アッセイ緩衝液中のG9a、ペプチド9およびSAMを、10μl充填した。残りのウェルには、SAMの非存在下でG9aおよびペプチド9を、10μl充填した。プレートを封止し、室温で1時間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液中のEndo-LysC 10μlを各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートしてからFLTを測定した。試薬の最終濃度は次のとおりであった：G9a（625pM）；ペプチド9（1μM）；Endo-LysC（2nM）。

Set7/9アッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、200μlの総アッセイ体積で行った。組換えSet7/9酵素およびペプチド12を含有する溶液にSAMを添加することによって反応を開始させた。アッセイにおける試薬の最終濃度は172nM（Set7/9）、100μM（SAM）、および15μM（ペプチド12）であった。試料（50μl）を、0時間、2時間、および6時間の間隔でアッセイ混合物から採取し、50μlの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

ペプチド基質のメチル化を確認する場合は、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で15倍希釈し、384ウェルマイクロプレートに移し（各ウェル20μl）、FLTを測定した。次に、Endo-LysC（アッセイ緩衝液中10μl）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分間インキュベートした。次にFLTを再測定した。測定は全て3つ一組にして行い、ウェルにおけるEndo-LysCの最終濃度は2nMだった。

あるいは、アッセイを、384ウェルマイクロプレート中、室温において、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えSet7/9酵素およびペプチド12または13（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のSAM（10μl）を加えた。ペプチドだけを含有する対照も含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるSet7/9の最終濃度は100nM〜12.5nMの間で変動させ、一方、ペプチドおよびSAMの濃度はそれぞれ1μMおよび100μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、Endo-LysC（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度2nM）の添加により、120分後に、一緒に停止させた。室温で15分間インキュベートした後、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にして行った。

阻害剤タイトレーションの場合は、化合物（5μl）をSet7/9およびペプチド13（5μl）と共に室温で10分間プレインキュベートしてから、SAM（10μl）を加えた。SAMまたは阻害剤を含有しない対照を含めた。

Z'ファクター決定の場合は、アッセイ緩衝液中にSet7/9およびペプチド13を含有する溶液10μlを、384ウェルマイクロプレートの各ウェルに加えた。プレートの半分には10μlのアッセイ緩衝液を加え、他方の半分にはアッセイ緩衝液中のSAM（10μl）を加えることで反応を開始させた。プレートを封止し、室温で2時間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液中のEndo-LysC（10μl）を各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートしてからFLTを測定した。試薬の最終濃度は次のとおりであった：Set7/9（25nM）；SAM（100μM）；ペプチド13（1μM）；Endo-LysC（2nM）。

PRMT5アッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、200μlの総アッセイ体積で行った。組換えPRMT5酵素およびペプチド15を含有する溶液にSAMを添加することによって反応を開始させた。アッセイにおける試薬の最終濃度は、150nM（PRMT5）、100μM（SAM）、および15μM（ペプチド15）であった。試料（50μl）を、0時間、3.5時間、および17.5時間の間隔でアッセイ混合物から採取し、50μlの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

ペプチド基質のメチル化を確認する場合は、アッセイ混合物をアッセイ緩衝液で15倍希釈し、384ウェルマイクロプレートに移し（各ウェル20μl）、FLTを測定した。次に、Endo-ArgC（アッセイ緩衝液中10μl）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分間インキュベートした。次にFLTを再測定した。測定は全て3つ一組にして行い、ウェルにおけるEndo-ArgCの最終濃度は10nMだった。

あるいは、アッセイを、384ウェルマイクロプレート中、室温において、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えPRMT5酵素およびペプチド15（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のSAM（10μl）を加えた。ペプチドだけを含有する対照も含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるPRMT5の最終濃度5は100nM〜12.5nMの間で変動させ、一方、ペプチド15およびSAMの濃度は、それぞれ1μMおよび100μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、Endo-ArgC（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度1.25nM）の添加により、120分後に、一緒に停止させた。室温で15分間インキュベートした後、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にして行った。

阻害剤タイトレーションの場合は、化合物（5μl）をPRMT5/ペプチド15（5μl）と共に室温で30分間プレインキュベートしてから、SAM（5μl）を添加した。アッセイは室温で3時間行い、10μlのEndo-ArgCを添加することによって停止させた。室温で1時間のインキュベーション後にFLTを測定した。PRMT5または阻害剤を含有しない対照も含めた。測定は全て3つ一組にして行った。

EZH2アッセイ
酵素タイトレーションは、室温において、384ウェルハイベースマイクロプレート中、各ウェル10μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えEZH2複合体（5μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド20/SAM混合物（5μl）を加えた。EZH2を含有しない対照も含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるEZH2の最終濃度は100ng/ウェル〜75ng/ウェルの間で変動させ、一方、ペプチド20およびSAMの濃度は、それぞれ1μMおよび3μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、Endo-LysC（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度4nM）の添加により、6時間後に、一緒に停止させた。室温で35分間インキュベートした後、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にして行った。

SAMタイトレーションの場合は、アッセイ緩衝液中のさまざまな濃度のSAM（2.5μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のEZH2複合体（2.5μl）を加えた。アッセイ緩衝液中のペプチド20（5μl）を添加することによって反応を開始させた。プレートを室温で5時間インキュベートした後、アッセイ緩衝液中のEndo-LysC 10μlを各ウェルに加えた。室温でさらに15分間インキュベートした後、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

阻害剤タイトレーションの場合は、化合物（2.5μl）をEZH2複合体（2.5μl）と共に室温で20分間プレインキュベートしてから、アッセイ緩衝液中のペプチド20/SAM混合物（5μl）を加えた。アッセイを室温で5時間行い、10μlのEndo-LysCを添加することによって停止させた。室温で1時間のインキュベーション後にFLTを測定した。EZH2または阻害剤を含有しない対照も含めた。測定は全て3つ一組にして行った。

JHDM1Aアッセイ
アッセイを、384ウェルマイクロプレート中、室温において、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えJHDM1A酵素（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド10（10μl）を加えた。ペプチド10だけを含有する二組の対照ウェルを含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるJHDM1Aの最終濃度は150nMであり、ペプチド10については1μMであった。室温で5時間のインキュベーション後に、Endo-LysC（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度10nM）をアッセイウェルと一組の対照ウェルとに加えた。もう一組の対照ウェルには10μlのアッセイ緩衝液を加えた。室温で120分間インキュベートした後、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

PCAFアッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、250μlの総アッセイ体積で行った。組換えPCAF酵素およびペプチド17を含有する溶液にAcCoAを添加することによって反応を開始させた。アッセイにおける試薬の最終濃度は、100nM（PCAF）、50μM（AcCoA）、および30μM（ペプチド17）であった。試料（50μl）を、0分、30分、60分および90分の間隔でアッセイ混合物から採取し、50μlの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

酵素タイトレーションは、室温において、384ウェルマイクロプレート中、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えPCAF酵素（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド17/AcCoA混合物（10μl）を加えた。PCAFを含有しない対照も含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるPCAFの最終濃度は250nM〜31.3nMの間で変動させ、一方、ペプチド17およびAcCoAの濃度は、それぞれ1μMおよび50μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、Endo-LysC（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度25nM）の添加により、120分後に、一緒に停止させた。室温で90分間インキュベートした後、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にして行った。

AcCoAタイトレーションの場合は、さまざまな濃度のAcCoA（アッセイ緩衝液中5μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド17 5μlを加え、次にアッセイ緩衝液のPCAF 10μlを加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした後、アッセイ緩衝液中のEndo-LysC 10μlを各ウェルに加えた。室温でさらに90分間インキュベートした後、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

HDAC1アッセイ
HPLCモニタリングの場合、アッセイは、室温において、微量遠心チューブ中、200μlの総アッセイ体積で行った。組換えHDAC1酵素を含有する溶液にペプチド18を添加することによって反応を開始させた。アッセイにおける試薬の最終濃度は、200nM（HDAC1）、および15μM（ペプチド18）であった。試料（50μl）を、0時間、2時間、4時間、および6時間の間隔でアッセイ混合物から採取し、50 lの水＋0.1％TFAが入っているガラス製HPLCバイアル（Crawford Scientific）に加えた。その100μlの試料全体をHPLCシステムに注入し、関連ピークを収集し、分析のためにMS緩衝液（0.1％ギ酸を含有する1：1 MeCN/水）に希釈した。

酵素タイトレーションは、室温において、384ウェルマイクロプレート中、各ウェル20μlのアッセイ体積で行った。アッセイ緩衝液中の組換えHDAC1酵素（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のペプチド18（10μl）を加えた。ペプチドだけを含有する対照も含めた。プレートを振とうしてから、カバースリップで封止した。アッセイにおけるHDAC1の最終濃度は200nM〜25nMの間で変動させ、一方、ペプチドの濃度は1μMで一定に保った。アッセイをさまざまな時点で開始し、トリプシン（アッセイ緩衝液中10μl；最終濃度10nM）の添加により、2時間後に、一緒に停止させた。室温で10分間のインキュベーション後に、マイクロプレートを500rpmで1分間遠心分離し、FLTを測定した。測定は全て2つ一組にして行った。

基質タイトレーションの場合は、アッセイ緩衝液中のさまざまな濃度のペプチド18（10μl）を含有するウェルに、アッセイ緩衝液中のHDAC1（10μl）を加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした後、アッセイ緩衝液中のトリプシン10μlを各ウェルに加えた。室温でさらに10分間インキュベートした後、FLTを測定した。測定は全て3つ一組にして行った。

阻害剤タイトレーションの場合は、化合物（5μl）をHDAC1（5μl）と共に室温で30分間プレインキュベートしてから、アッセイ緩衝液中のペプチド18（10μl）を加えた。アッセイは室温で1.5時間行い、10μlのトリプシンを添加することによって停止させた。室温で10分間のインキュベーション後にFLTを測定した。HDAC1または阻害剤を含有しない対照も含めた。測定は全て3つ一組にして行った。

Z'ファクター決定の場合は、384ウェルマイクロプレートの半分に、アッセイ緩衝液5μlとアッセイ緩衝液中のHDAC1 5μlとを充填した。残りのウェルにはTSA阻害剤5μlとアッセイ緩衝液のHDAC1 5μlとを充填した。室温で30分間のプレインキュベーション後に、アッセイ緩衝液中のペプチド18 10μlを各ウェルに加えた。プレートを封止し、室温で1.5時間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液中のトリプシン10μlを各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートしてからFLTを測定した。試薬の最終濃度は次のとおりであった：HDAC1（25nM）；TSA（1μM）、ペプチド18（10μM）；トリプシン（10nM）。

本明細書において言及した特許公報および化学文献はすべて参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。

Claims (44)

1. 試験試料中の修飾酵素の活性をアッセイする方法であって、
   （a）試験試料を、蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされたリンカー分子を含む蛍光変調酵素基質であって、基質は修飾酵素の作用によって修飾されて修飾基質を形成し、該修飾基質のリンカー分子は修飾の結果として、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における第2酵素による切断に対して感受性になるか、または第2酵素による切断から保護され、第2酵素による基質または修飾基質の切断が、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離するようになっている蛍光変調酵素基質と、接触させること；および
   （b）修飾基質および/または基質に対する第2酵素の作用の結果としての蛍光成分の蛍光寿命の変化を検出することによって修飾基質の形成を検出すること
   を含み、修飾基質の形成が修飾酵素の活性の指標を与える方法。
2. 蛍光変調酵素基質のリンカー分子がペプチドリンカーであり、第2酵素が、ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーに対する修飾酵素の作用によって形成される修飾ペプチドリンカーのどちらか一方を切断することで、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離するプロテアーゼである、請求項1に記載の方法。
3. ペプチドリンカーが該プロテアーゼによって切断される能力を有し、該切断が、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を蛍光成分を含有する基質の一部から分離し、かつ修飾酵素によるペプチドリンカーの修飾が、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における該プロテアーゼによる切断から修飾ペプチドリンカーを保護し、修飾ペプチドリンカーの形成は、無修飾ペプチドリンカーと比較した、プロテアーゼ処理後の蛍光成分の蛍光寿命の時間依存的減少によって示される、請求項2に記載の方法。
4. 修飾ペプチドリンカーがペプチドリンカー中のアミノ酸残基のメチル化によって形成される、請求項3に記載の方法。
5. 修飾酵素がタンパク質メチルトランスフェラーゼである、請求項4に記載の方法。
6. タンパク質メチルトランスフェラーゼが、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ酵素（PKMT）、例えばG9a、Set7/9、GLPまたはEZH2である、請求項5に記載の方法。
7. タンパク質メチルトランスフェラーゼが、ヒストンアルギニンメチルトランスフェラーゼ酵素（PRMT）、例えばPRMT1、PRMT3、PRMT4/CARM1、またはPRMT5である、請求項5に記載の方法。
8. 修飾ペプチドリンカーがペプチドリンカー中のアミノ酸残基のアセチル化によって形成される、請求項3に記載の方法。
9. 修飾酵素がアセチルトランスフェラーゼである、請求項8に記載の方法。
10. アセチルトランスフェラーゼがヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えばGcn5、PCAF、Hat1またはp300である、請求項9に記載の方法。
11. 修飾ペプチドリンカーが、ペプチドリンカー中のアミノ酸残基の脱イミノ化によって形成される、請求項3に記載の方法。
12. 修飾酵素がデイミナーゼである、請求項11に記載の方法。
13. デイミナーゼがペプチジル-アルギニンデイミナーゼ、例えばPAD1、PAD2、PAD3、PAD4またはPAD6である、請求項12に記載の方法。
14. ペプチドリンカーが蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において該プロテアーゼによって切断される能力を有さず、かつ修飾酵素によるペプチドリンカーの修飾が、修飾ペプチドリンカーを、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における該プロテアーゼによる切断に対して感受性にし、修飾ペプチドリンカーの形成は、無修飾ペプチドリンカーと比較した、プロテアーゼ処理後の蛍光成分の蛍光寿命の時間依存的増加によって示される、請求項2に記載の方法。
15. 修飾ペプチドリンカーが、ペプチドリンカー中のメチル化アミノ酸残基の脱メチル化によって形成される、請求項14に記載の方法。
16. 修飾酵素がデメチラーゼである、請求項15に記載の方法。
17. デメチラーゼがヒストンデメチラーゼ、例えばLSD1、JHDM1AまたはJMJD6である、請求項16に記載の方法。
18. 修飾ペプチドリンカーが、ペプチドリンカー中のアセチル化アミノ酸残基の脱アセチル化によって形成される、請求項14に記載の方法。
19. 修飾酵素がデアセチラーゼである、請求項18に記載の方法。
20. デアセチラーゼがヒストンデアセチラーゼ、例えばHDAC1〜11またはSIRT1〜5である、請求項19に記載の方法。
21. 蛍光成分が、9-アミノアクリジンおよびその誘導体、アクリドン誘導体、アクリジン、キナクリジンおよびアクリジニウム成分からなる群より選択される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
22. 蛍光寿命調整因子成分が、アミノ酸トリプトファンの側鎖中に存在するインドリル成分を含むインドリル成分、アミノ酸チロシンの側鎖中に存在するフェノール成分を含むフェノール成分、アミノ酸ヒスチジンの側鎖中に存在するイミダゾール成分を含むイミダゾール成分、およびアミノ酸フェニルアラニンのベンジル側鎖を含むベンジル成分、フェノキシ成分、ナフチルアラニン成分、カルバゾール成分およびフェノチアジン成分からなる群より選択される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
23. 酵素の阻害剤に関するスクリーニングの方法であって、試験化合物の存在下で請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法を使って該酵素の活性をアッセイすることを含み、試験化合物の存在下における酵素活性の低下によって、試験化合物が該酵素の阻害剤であると同定される方法。
24. 蛍光成分と蛍光成分の蛍光寿命を調整するように構成された蛍光寿命調整因子成分とにコンジュゲートされたリンカー分子を含む蛍光変調酵素基質であって、基質は修飾酵素の作用によって修飾されて修飾基質を形成し、該修飾基質のリンカー分子は修飾の結果として、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における第2酵素による切断に対して感受性になるか、または第2酵素による切断から保護され、第2酵素による基質または修飾基質の切断が、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離するようになっている蛍光変調酵素基質。
25. 蛍光変調酵素基質のリンカー分子がペプチドリンカーであり、第2酵素が、ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーに対する修飾酵素の作用によって形成される修飾ペプチドリンカーのどちらか一方を切断することで、蛍光寿命調整因子成分を含有する基質の一部を、蛍光成分を含有する基質の一部から分離するプロテアーゼである、請求項24に記載の蛍光変調酵素基質。
26. ペプチドリンカーが、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において該プロテアーゼによって切断される能力を有し、かつ修飾酵素によるペプチドリンカーの修飾が、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における該プロテアーゼによる切断から修飾ペプチドリンカーを保護する、請求項25に記載の蛍光変調酵素基質。
27. 蛍光変調酵素基質が、式（I）または（I'）
    Fl-X1-N1-X2-M （I）
    M-X1-N1-X2-Fl （I'）
    ［式中、X1はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX1（またはI'中のX2）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N1はメチルトランスフェラーゼの作用によってメチル化されるアミノ酸残基を表し、X2はアミノ酸の第2配列を表し、MはX2（またはI'中のX1）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
    によって表される構造を有する、メチルトランスフェラーゼの活性のアッセイにおいて使用するための、請求項26に記載の蛍光変調酵素基質。
28. ペプチド4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂
    ペプチド5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂
    ペプチド6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂
    ペプチド7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
    ペプチド8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂
    ペプチド9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂
    ペプチド12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
    ペプチド13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂
    ペプチド14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
    ペプチド15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂
    ペプチド20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂
    からなる群より選択される、請求項27に記載の蛍光変調酵素基質。
29. 蛍光変調酵素基質が、式（III）または（III'）
    Fl-X3-N2-X4-M （III）
    M-X3-N2-X4-Fl （III'）
    ［式中、X3はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX3（またはIII'中のX4）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N2はアセチルトランスフェラーゼの作用によってアセチル化されるアミノ酸残基を表し、X4はアミノ酸の第2配列を表し、MはX4（またはIII'中のX3）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
    によって表される構造を有する、アセチルトランスフェラーゼの活性のアッセイにおいて使用するための、請求項26に記載の蛍光変調酵素基質。
30. ペプチド16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂
    ペプチド17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂
    からなる群より選択される、請求項29に記載の蛍光変調酵素基質。
31. 蛍光変調酵素基質が、式（V）または（V'）
    Fl-X5-R-X6-M （V）
    M-X5-R-X6-Fl （V'）
    ［式中、X5はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX5（またはV'中のX6）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、Rはデイミナーゼの作用によってシトルリンに転化されるアルギニン残基を表し、X6はアミノ酸の第2配列を表し、MはX6（またはV'中のX5）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
    によって表される構造を有する、デイミナーゼの活性のアッセイにおいて使用するための、請求項26に記載の蛍光変調酵素基質。
32. ペプチド1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂、または
    ペプチド3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂
    である、請求項31に記載の蛍光変調酵素基質。
33. ペプチドリンカーが、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において該プロテアーゼによって切断される能力を有さず、かつ修飾酵素によるペプチドリンカーの修飾が、修飾ペプチドリンカーを、蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間における該プロテアーゼによる切断に対して感受性にする、請求項25に記載の蛍光変調酵素基質。
34. 蛍光変調酵素基質が、式（VII）または（VII'）
    Fl-X7-N3(Me)-X8-M （VII）
    M-X7-N3(Me)-X8-Fl （VII'）
    ［式中、X7はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX7（またはVII'中のX8）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N3(Me)はデメチラーゼの作用によって脱メチル化されるメチル化アミノ酸残基（例えばメチル化リジンまたはメチル化アルギニン）を表し、X8はアミノ酸の第2配列を表し、MはX8（またはVII'中のX7）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
    によって表される構造を有する、デメチラーゼの活性のアッセイにおいて使用するための、請求項33に記載の蛍光変調酵素基質。
35. ペプチド10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂または
    ペプチド11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂
    である、請求項34に記載の蛍光変調酵素基質。
36. 蛍光変調酵素基質が、式（IX)または（IX'）
    Fl-X9-N4(Ac)-X10-M （IX）
    M-X9-N4(Ac)-X10-Fl （IX'）
    ［式中、X9はアミノ酸の第1配列を表し、FlはX9（またはIX'中のX10）にコンジュゲートされている蛍光成分を表し、N4(Ac)はデアセチラーゼの作用によって脱アセチル化されるアセチル化アミノ酸残基（例えばアセチル化リジン）を表し、X10はアミノ酸の第2配列を表し、MはX10（またはIX'中のX9）にコンジュゲートされている蛍光寿命調整因子を表す］
    によって表される構造を有する、デアセチラーゼの活性のアッセイにおいて使用するための、請求項33に記載の蛍光変調酵素基質。
37. Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)またはペプチド18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂
    である、請求項36に記載の蛍光変調酵素基質。
38. 請求項27または請求項28に記載の蛍光変調酵素基質と、該蛍光変調酵素基質を蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断するプロテアーゼとを含む、メチルトランスフェラーゼの活性のアッセイにおいて使用するためのキット。
39. 請求項29または請求項30に記載の蛍光変調酵素基質と、該蛍光変調酵素基質を蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断するプロテアーゼとを含む、アセチルトランスフェラーゼの活性のアッセイにおいて使用するためのキット。
40. 請求項31または請求項32に記載の蛍光変調酵素基質と、該蛍光変調酵素基質を蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断するプロテアーゼとを含む、デイミナーゼの活性のアッセイにおいて使用するためのキット。
41. 請求項34または請求項35に記載の蛍光変調酵素基質と、残基N3が脱メチル化されている該蛍光変調酵素基質の修飾型を蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断するプロテアーゼとを含む、デメチラーゼの活性のアッセイにおいて使用するためのキット。
42. 請求項36または請求項37に記載の蛍光変調酵素基質と、残基N4が脱アセチル化されている該蛍光変調酵素基質の修飾型を蛍光成分と蛍光寿命調整因子成分との間において切断するプロテアーゼとを含む、デアセチラーゼの活性のアッセイにおいて使用するためのキット。
43. 蛍光寿命調整因子成分が、アミノ酸トリプトファンの側鎖中に存在するインドリル成分を含むインドリル成分、アミノ酸チロシンの側鎖中に存在するフェノール成分を含むフェノール成分、アミノ酸ヒスチジンの側鎖中に存在するイミダゾール成分を含むイミダゾール成分、およびアミノ酸フェニルアラニンのベンジル側鎖を含むベンジル成分、フェノキシ成分、ナフチルアラニン成分、カルバゾール成分およびフェノチアジン成分からなる群より選択される、請求項24〜27、29、31、33、34または36のいずれか一項に記載の蛍光変調酵素基質または請求項38〜42のいずれか一項に記載のキット。
44. 蛍光成分が、9-アミノアクリジンおよびその誘導体、アクリドン誘導体、アクリジン、キナクリジンおよびアクリジニウム成分からなる群より選択される、請求項24〜27、29、31、33、34または36のいずれか一項に記載の蛍光変調酵素基質、または請求項38〜42のいずれか一項に記載のキット。