CN104677905B - 一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法，步骤如下：在不同条件下进行酶促反应，测定反应溶液中的氨基酸浓度，针对一种氨基酸检测方法，确定酶促反应后的溶液中氨基酸响应最大的酶促反应条件，确定酶促反应的温度、pH和酶浓度条件，在已确定的条件下作出反应液中氨基酸浓度‑反应底物浓度的标准曲线，取待测浓度底物的溶液，在已确定的条件下进行酶促反应，测定反应液中的氨基酸浓度，对应所述标准曲线，得出底物浓度。本发明通过直接测定酶促反应的反应液中氨基酸的量，对反应底物进行定性和定量测定，操作简便、解决了现有技术中此种检测步骤繁琐的弊端，而且采用氨基酸的量直接对应底物的量，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于酶促反应应用领域，涉及一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法。
背景技术
酶，指具有生物催化功能的高分子物质，大部分为蛋白质。它具有：高效性、专一性、低反应条件等特性。基于这些特性酶被广泛的应用于工业生产以及检测中，传统利用酶促反应检测底物的方法是通过气相色谱法、液相色谱法、旋光法、薄层色谱法、电喷雾质谱法等方法检测酶促反应产物的量来间接表征底物的量，步骤繁琐、抗干扰能力。酶与底物结合的过程中可能由于酶活性中心的氨基酸在与底物和水之间的质子流的流动导致酶的电荷状态失衡从而导致酶分子上氨基酸，脱落氨基酸的量与底物浓度成正比，基于此现象，本发明利用分光光度计检测酶促反应脱落氨基酸的量来表征底物的量，操作简便、灵敏。
发明内容
为解决现有技术中检测酶促反应中底物浓度的方法步骤繁琐，抗干扰能力低等弊端，本发明提供一种快速、准确检测酶促反应底物的方法，即能进行定性测定也能定量测定，操作简单、检测灵敏。
本发明的技术方案如下：
一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法，步骤如下：
针对不同的氨基酸检测方法，在不同条件下进行酶促反应，并测定反应溶液中的氨基酸浓度，分别作出氨基酸浓度-反应温度曲线、氨基酸浓度-反应pH曲线和氨基酸浓度-酶浓度曲线，在氨基酸浓度-反应温度曲线和氨基酸浓度-反应pH曲线上，选择氨基酸浓度响应最大的值，确定酶促反应的温度和pH条件，在氨基酸浓度-酶浓度曲线上，选择氨基酸浓度增长率最大的区间，确定酶浓度条件，在上述确定的温度、pH和酶浓度条件下作出反应液中氨基酸浓度-初始反应底物浓度的标准曲线，取待测浓度的底物溶液，在已确定的温度、pH和酶浓度条件下进行酶促反应，测定反应液中的氨基酸浓度，对应所述标准曲线，得出底物浓度。
进一步地，现有技术中可用于氨基酸检测的方法均可适用于本发明，其中优选为茚三酮法、临苯二甲醛荧光法、氨基酸分析仪、离子交换色谱法、液相色谱法和气相色谱法。
进一步地，所述酶促反应的酶包括源于枯草芽孢杆菌和米曲霉的α-淀粉酶、糖化酶、蔗糖酶和己糖激酶。
进一步地，所述标准曲线的制作过程中，酶促反应中酶与底物完全反应。
在上述技术方案中，对于温度和pH酶促反应条件，以反应液中氨基酸响应最大为基准。根据选定的氨基酸检测方法不同，对于同一种酶，确定的酶促反应条件可能是不同的。例如，采用检测氨基酸的茚三酮法应用于本发明中时，由于α-氨基酸与茚三酮显色反应的最佳pH为5-7，而此pH值不一定是酶的最适pH，而氨基酸的脱落可能由于酶分子电荷失衡导致的，体系的pH对酶的分子电荷可能有影响，因此反应的pH值还会影响氨基酸的脱落，综合以上各个影响因素，为了利用反应后的溶液直接用于茚三酮显色反应，也为了避免对反应液的后处理会引起的测定误差，确定的酶促反应条件为氨基酸响应最大的pH值，其也更接近于茚三酮显色反应的pH范围，在此条件下也更能降低所选氨基酸测定方法下检测到的底物的最低限，使得检测更为灵敏。
本发明的有益效果：
本发明通过直接测定酶促反应的反应液中氨基酸的量，对反应底物进行定性和定量测定，操作简便、解决了现有技术中此种检测步骤繁琐的弊端，而且采用氨基酸的量直接对应底物的量，检测灵敏度高。
附图说明
图1.实施例1中不同温度下茚三酮显色的OD值；
图2.实施例1中不同pH下茚三酮显色的OD值；
图3.实施例1中不同蔗糖酶浓度下茚三酮显色的OD值；
图4.实施例1中OD570值-蔗糖溶液浓度标准曲线；
图5.实施例2中不同温度下茚三酮显色的OD值；
图6.实施例2中不同pH下茚三酮显色的OD值；
图7.实施例2中不同蔗糖酶浓度下茚三酮显色的OD值；
图8.实施例2中OD570值-淀粉溶液浓度标准曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
茚三酮法确定蔗糖酶酶促反应中的底物浓度
第一步、氨基酸响应最大的酶促反应条件的选择：
1.温度的选择：
取1mL0.02％的蔗糖酶溶液与1.5mL8％的蔗糖溶液分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下预热1min后，将蔗糖加入到蔗糖酶溶液中反应2min后(反应在pH＝6.9的0.02M PBS缓冲体系下进行)，反应充分后，在每个温度下的反应液中，加入1mL浓度为5g/L的茚三酮溶液，95℃水浴30min后，取出室温放置1h后，在570nm下测定其吸光值，如图1所示，根据图1的结果，选择50℃为酶促反应条件。
2.pH的选择
分别配制pH为4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、8.98的8％蔗糖溶液与0.02％的蔗糖溶液(试剂均由0.02M的PBS缓冲液溶解)在50℃反应，操作步骤同上，结果如图2所示，选择pH＝8为酶促反应条件。
3.酶浓度的选择：
分别配制浓度为0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.2％、0.3％的蔗糖酶溶液分别加入1.5mL0.25％pH为8的蔗糖溶液，操作步骤同上，结果如图3所示，考虑到酶成本、吸光值增长率等因素可选择酶浓度在0.08％～0.2％之间，此实施例中选择0.1％为酶促反应条件。
第二步、OD570值-反应底物浓度标准曲线的制作：
将1mL0.1％的酶与1.5mL不同浓度梯度下的底物在50℃、pH＝8的反应条件下预热1min后，将底物加到酶溶液中，反应3min后加入1mL浓度为5g/L的茚三酮溶液，95℃水浴30min，后取出室温放置1h后，在570nm下测定其吸光值，做出OD570值-反应底物浓度标准曲线，结果如图4所示。
第三步、方法检出限、精密度以及加标回收率的测定：
检出限实验：按试验方法，用相应缓冲液代替底物标准液，以酶、茚三酮与缓冲液混合溶液作参比测定吸光值，平行测定11次，计算空白液的标准偏差，根据工作曲线斜率，计算出检出限C＝3Sb/K＝60μg/mL。
精密度实验：吸取3组不同浓度的底物标准液按实验方法测定吸光度。平行测定5次，计算变异系数RSD值在2％-6％。
加标回收率：分别吸取1.5mL3个不同浓度的底物标准液按上述试验方法测定吸光度，结果见表1计算加标回收率为96％-101％。
4.检测待测底物浓度：
为验证实验的准确度，配制已知浓度的蔗糖溶液：配制1.5mLpH为8浓度为0.02M的PBS溶解的0.06％、0.07％、0.08％的蔗糖溶液，与1mL PBS缓冲液溶解的0.1％的蔗糖酶溶液反应，茚三酮法测定反应液中的氨基酸含量，得到OD570，通过图4得到蔗糖浓度，与理论浓度对比，三个样本的测定准确度分别为96.67％、95.71％、101.25％，如表1所示。说明此方法的准确性良好。
表1待测底物准确度实验结果
| 蔗糖理论浓度 | OD570 | 测定的蔗糖浓度 | 准确度 |
| 0.06％ | 0.227 | 0.058％ | 96.67％ |
| 0.07％ | 0.258 | 0.067％ | 95.71％ |
| 0.08％ | 0.307 | 0.081％ | 101.25％ |
5.待测底物加标回收率测定
表2待测底物加标回收率测定实验结果
| 反应液 | 加标量 | OD570测定值 | 加标后OD570测定值 | 回收率 |
| 1 | 0.06％ | 0.233 | 0.227 | 97.55％ |
| 2 | 0.07％ | 0.268 | 0.258 | 96.32％ |
| 3 | 0.08％ | 0.303 | 0.307 | 101.31％ |
实施例2
第一步、氨基酸响应最大的酶促反应条件的选择：
1.温度的选择：
取1mL0.1％的α-淀粉酶溶液与与1.5mL4％的淀粉溶液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下预热1min后，在pH＝6.9的磷酸盐缓冲体系，将淀粉加入到α-淀粉酶溶液中反应4min后(反应在pH＝6.9的磷酸盐缓冲体系下进行)，反应充分后分别加入1mL浓度为5g/L的茚三酮溶液，95℃水浴30min，后取出室温放置1h后，在570nm下测定其吸光值，如图5所示，选择60℃为酶促反应条件。
2.pH的选择分别配制pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的4％淀粉溶液与0.1％的α-淀粉酶溶液在60℃反应，操作步骤同上，结果如图6所示，选择pH＝8为酶促反应条件。
3.酶浓度的选择：分别配制浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.45％的α-淀粉酶溶液分别加入1.5mL0.25％pH为8的淀粉溶液，操作步骤同上，结果如图7所示，考虑到酶成本、吸光值增长率等因素可选择酶浓度在0.18％～0.22％间，此实施例中选择0.2％为酶促反应条件。
第二步、OD570值-反应底物浓度标准曲线的制作：
将1mL0.2％的酶与1.5mL不同浓度梯度下的底物在60℃、pH＝8的条件下预热1min后，将底物加酶溶液中，反应5min后加入1mL浓度为5g/L的茚三酮溶液，95℃水浴30min，后取出室温放置1h后，在570nm下测定其吸光值，做出OD570值-反应底物浓度标准曲线，结果如图8所示。
第三步、方法检出限、精密度以及加标回收率的测定：
检出限实验：按试验方法，用相应缓冲液代替底物标准液，以酶、茚三酮与缓冲液混合溶液作参比测定吸光值，平行测定11次，计算空白液的标准偏差，根据工作曲线斜率，计算出检出限C＝3Sb/K＝200μg/mL。
精密度实验：吸取3组不同浓度的底物标准液按实验方法测定吸光度。平行测定5次，计算变异系数RSD值在3％-8％。
加标回收率：分别吸取1.5mL3个不同浓度的底物标准液按上述试验方法测定吸光度，结果见表2，计算加标回收率为95.95％-100.40％。
4.检测待测底物浓度：
采用与实施例1相同的方法，验证底物浓度测定的准确度，三个样本的测定准确度分别为100.86％、98.11％、92.82％，如表3所示。说明此方法的准确性良好。
表3.待测底物准确度实验结果
| 淀粉理论浓度 | OD570 | 测定的淀粉浓度 | 准确度 |
| 0.4％ | 0.418 | 0.403％ | 100.86％ |
| 0.5％ | 0.460 | 0.491％ | 98.11％ |
| 0.6％ | 0.492 | 0.557％ | 92.82％ |
5.待测底物加标回收率测定
表4.待测底物加标回收率测定实验结果
| 反应液 | 加标量 | OD570测定值 | 加标后OD570测定值 | 回收率 |
| 1 | 0.4％ | 0.416 | 0.418 | 100.40％ |
| 2 | 0.5％ | 0.465 | 0.460 | 99.02％ |
| 3 | 0.6％ | 0.513 | 0.492 | 95.95％ |
Claims (4)
1.一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法，其特征在于步骤如下：
针对不同的氨基酸检测方法，在不同条件下进行酶促反应，并测定反应溶液中的氨基酸浓度，分别作出氨基酸浓度-反应温度曲线、氨基酸浓度-反应pH曲线和氨基酸浓度-酶浓度曲线，在氨基酸浓度-反应温度曲线和氨基酸浓度-反应pH曲线上，选择氨基酸浓度响应最大的值，确定酶促反应的温度和pH条件，在氨基酸浓度-酶浓度曲线上，选择氨基酸浓度增长率最大的区间，确定酶浓度条件，在上述确定的温度、pH值和酶浓度条件下作出反应液中氨基酸浓度-初始反应底物浓度的标准曲线，取待测浓度的底物溶液，在已确定的温度、pH值和酶浓度条件下进行酶促反应，测定反应液中的氨基酸浓度，对应所述标准曲线，得出底物浓度。
2.根据权利要求1所述的通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法，其特征在于：所述氨基酸检测方法包括茚三酮法、临苯二甲醛荧光法、氨基酸分析仪、离子交换色谱法、液相色谱法和气相色谱法。
3.根据权利要求1所述的通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法，其特征在于：所述酶促反应的酶包括源于枯草芽孢杆菌和米曲霉的α-淀粉酶、糖化酶、蔗糖酶和己糖激酶。
4.根据权利要求1所述的通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法，其特征在于：所述标准曲线的制作过程中，所述酶促反应中酶与底物完全反应。
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2015
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