CN108827945A - 一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，该方法包括以下步骤：（1）肽对照品的选择：以分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽为对照品；（2）检测条件的确定：包括络合物最大吸收波长的确定、线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定、体系最适pH的确定和体系最适TCA质量浓度的确定；（3）标准曲线的建立：以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。本发明检测鱼皮胶原蛋白肽含量简便、成本低、快捷、线性范围广、重复性好、准确度高，具有良好的市场应用空间。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法。
背景技术
罗非鱼是世界水产业科研和养殖生产的重点淡水养殖鱼类。近十年来，我国每年罗非鱼产量以平均 4.82% 左右的速度递增，稳居世界首位，但加工产品主要是品种单一、水平较低、附加值不高的冻鱼片和冻全鱼等，生产过程中产生了大量的下脚料，如鱼皮、鱼鳞等，约占鱼体总质量的40%～50%。这些副产物资源除少部分被加工成鱼粉作为饲料廉价出售，大多未得到充分利用，不仅严重导致生物资源浪费，也带来一系列环境问题。随着人们对生物分子结构及功能的认识不断深入以及国内加工技术的不断提高，利用鱼皮、鱼鳞提取明胶及胶原蛋白多肽的研究已成为热点，相关产业也逐渐壮大。
肽是由氨基酸组成的聚合物，主要来自于蛋白质分解的中间产物。胶原蛋白肽是胶原或明胶经酶解等处理后制得的具有较高消化吸收性、分子量约为2000~30000的产物，其不具有明胶的凝胶性能，但具有多种人体代谢和生理调节功能，如抗氧化、抗菌、降血压、抗疲劳、抗肿瘤等作用，因此在功能性食品、医学、化妆品等领域展现出高度的应用潜力，因此对多肽的功能性质和测定多肽含量方法的研究备受人们瞩目。
目前常见的多肽含量测定方法有双缩脲法、Folin-酚试剂法、OPA法(邻苯二甲醛法) 、紫外吸收法等，但同种方法测定不同类型、不同体系的多肽含量的最佳条件并不是相同的。双缩脲比色法中最大吸收波长、肽的检测浓度范围、体系pH、TCA用量这些因素会对检测方法的适用性、准确度及重现性有重要影响。各种检测方法中，标准品或对照品是必需的，以往文献及实际应用中多选用四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）标准品，但近几年已有文献报道说明标曲标准品或对照品的选择应尽量遵循同质性原则，即要与被测样品的生物效应尽可能具有相同的趋势，二者的反应量效曲线应当是平行的，才能进行生物效价的对比和换算，这样可以消除方法基体效应引入的系统误差。罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽与罗非鱼源酶解多肽在成分及分子量上较为接近，而各种品牌的四肽标准品不仅不是罗非鱼源酶解蛋白肽的同源物，且价格昂贵，若将其作为标准品不仅成本高，还可能会使测定结果产生较大偏差。
本发明旨在研究选择罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽为对照品，对双缩脲法测定多肽的操作方法进行改良，并评价其实际应用的适用性，以期将本法应用到企业及相关科研工作中检测罗非鱼源胶原蛋白肽含量中，提供一种低成本、高精度、高准确度，普适于罗非鱼源肽含量检测的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快捷、线性范围广、重复性好、准确度高的双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，该方法包括以下步骤：
（1）肽对照品的选择：以分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽为对照品；
（2）检测条件的确定：包括络合物最大吸收波长的确定、线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定、体系最适pH的确定和体系最适TCA质量浓度的确定；
（3）标准曲线的建立：以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
在步骤（2）中，络合物最大吸收波长的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.2 、0.5、4.0、8.0 mL于一组50 mL或100mL烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH13.5，立即在波长为470～630 nm范围内手动波段扫描确定最大吸收波长。
在步骤（2）中，线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.1 、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14%TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH12.5、13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并按照肽质量浓度分段进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度，确定溶液中多肽的最佳检测质量浓度范围。
在步骤（2）中，体系最适pH的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整pH10.5、11.0、 11.5、12.0、 12.5、 13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出pH变化不影响吸光值大小的区域，即为检测最适pH范围。
在步骤（2）中，体系最适TCA质量浓度的确定包括如下步骤：先将罗非鱼明胶置于50～60℃水浴锅中加热溶解，分别取质量浓度为7%的罗非鱼明胶溶液1.0 mL于20 mL的离心管中，立即分别加入10 mL的5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，静置10 min后，于3500 r/min下离心15 min；分别取上清液1.0 mL、2.0 mL和4.0 mL于一组50 mL烧杯中，按照体积比为1:1、1:1、2:1的比例对应加入质量浓度为0.3 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液1.0 mL、2.0 mL和2.0 mL，每个体积比一组共8份，用对应质量浓度的 TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 ml双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出TCA浓度变化不影响吸光值大小的区域，即为TCA最适质量浓度范围。
在步骤（3）中，分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用确定的TCA最适质量浓度补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制最适条件下标准曲线并进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度。
上述中，络合物最大吸收波长在545 nm处。
上述中，肽的最佳检测浓度为0.3～1.5 mg/mL。
上述中，最适pH为12.5，TCA最适质量浓度为13%。
上述中，标准曲线方程为y = 0.1449x+0.0015，R² = 0.9995。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明采用纯度高、分子量明确的罗非鱼胶原蛋白肽为肽检测的对照品，既遵循同质性原则，使对照品与被测样品的生物效应具有相同的趋势，二者的反应量效曲线平行，能更好地进行生物效价的对比和换算，从而消除方法基体效应引入的系统误差，而且价格比四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）标准品低廉，降低了检测的成本。
2、本发明为了解决双缩脲比色法中络合物最大吸收波长、肽的检测浓度范围、体系pH、TCA用量这些关键因素对检测方法的适用性、准确度及重现性的影响，对检测方法进行了系统、细化研究。
3、将本发明应用于不同种类罗非鱼肽产品体系的检测，系统评价了改良后方法的应用情况，结果显示加样回收率相差不大，偏差都较小，说明本发明适用于罗非鱼源肽含量的检测。
附图说明
图1为本发明双缩脲络合物波段扫描的曲线图。
图2-图4为本发明不同浓度多肽线性拟合的曲线图。
图5为本发明最适pH的曲线图。
图6为本发明最适TCA用量的曲线图。
图7为本发明最适条件下的标准曲线图。
具体实施方式
实施例一：
肽对照品的选择：以分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽为对照品；
检测条件的确定
络合物最大吸收波长的确定：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.2 、0.5、4.0、8.0 mL于一组50 mL烧杯中，用14% TCA溶液补足至12mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH13.5，立即在波长为470～630 nm范围内手动波段扫描确定最大吸收波长，确定最大吸收波长为545 nm，如图1所示。
线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.1 、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH12.5、13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并按照肽质量浓度分段进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度，确定溶液中多肽的最佳检测质量浓度范围，肽的最佳检测浓度为0.3～1.5 mg/mL，如图2至图4所示。
体系最适pH的确定：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整pH10.5、11.0、 11.5、12.0、 12.5、 13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出pH变化不影响吸光值大小的区域，即为检测最适pH范围，最适pH为12.5，如图5所示。
体系最适TCA质量浓度的确定：先将罗非鱼明胶置于55℃水浴锅中加热溶解，分别取质量浓度为7%的罗非鱼明胶溶液1.0 mL于20 mL的离心管中，立即分别加入10 mL的5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，静置10 min后，于3500 r/min下离心15 min；分别取上清液1.0 mL、2.0 mL和4.0 mL于一组50 mL烧杯中，按照体积比为1:1、1:1、2:1的比例对应加入质量浓度为0.3 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液1.0 mL、2.0 mL和2.0mL，每个体积比一组共8份，用对应质量浓度的 TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 ml双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出TCA浓度变化不影响吸光值大小的区域，即为TCA最适质量浓度范围，TCA最适质量浓度为13%，如图6所示。
标准曲线的建立：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用确定的TCA最适质量浓度补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制最适条件下标准曲线并进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度，标准曲线方程为y = 0.1449x+0.0015，R² = 0.9995，如图7所示。
下面通过试验对本发明的精密度和重复性进行评价：
精密度实验：分别取质量浓度为9 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液2 mL于一组50 mL烧杯中，按最佳条件下建立的测定方法测定吸光值，再计算相对标准偏差RSD，检验该方法的精密度。
重复性实验：分别取质量浓度为9 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液2mL于一组50 mL烧杯中，按最佳条件下建立的测定方法测定吸光值，根据线性回归方程计算多肽的含量，再计算RSD，检验该方法的重现性。
加样回收率的测定及偏差评价：
①鱼皮胶原蛋白肽的加样回收率试验：分别取质量浓度为9 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于一组50 mL的烧杯中，按最佳条件下建立的测定方法测定吸光值，根据线性回归方程计算多肽的含量、回收率及RSD。
②鱼皮胶原蛋白肽与罗非鱼明胶的加样回收率试验：分别取质量浓度为7%的罗非鱼明胶溶液（明胶需先置于50-60℃水浴锅中加热溶解）1.0 mL于20 mL的离心管中，立即加入10 mL 最适质量浓度的TCA，静置10 min后，于3500 r/min下离心15 min。分别取上清液2.0 mL于一组50 mL烧杯中，再分别加入质量浓度为9 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于烧杯中，按最佳条件下建立的测定方法测定吸光值，根据线性回归方程计算多肽的含量、回收率及RSD。
（5）改良后方法的应用评价：考虑实际生产中有不同分子量的罗非鱼鱼皮和鱼鳞肽产品，检测体系中肽的种类与标曲对照品（标称分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮肽）有差别，为检验本法在不同肽产品检测中的适用性，将标曲应用于标称分子量为1kDa、5kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽和标称分子量为3kDa、5kDa的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽的检测中，通过回收率及偏差检验本法的适用性。
上述试验结果见表1至表12。
表1 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（3kDa）精密度试验结果
表2 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（3kDa）重复性试验结果
表3 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（3kDa）加样回收率试验结果
表4 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（3kDa）与鱼皮明胶的加样回收率试验结果
表5 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（5kDa）加样回收率试验结果
表6 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（5kDa）与鱼皮明胶的加样回收率试验结果
表7 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（1kDa）加样回收率试验结果
表8 为本发明鱼皮胶原蛋白肽（1kDa）与鱼皮明胶的加样回收率试验结果
表9 为本发明鱼鳞胶原蛋白肽（5kDa）加样回收率试验结果
表10 为本发明鱼鳞胶原蛋白肽（5kDa）与鱼皮明胶的加样回收率试验结果
表11 为本发明鱼鳞胶原蛋白肽（3kDa）加样回收率试验结果
表12 为本发明鱼鳞胶原蛋白肽（3kDa）与鱼皮明胶的加样回收率试验结果
本发明应用于不同种类罗非鱼肽产品体系的检测，加样回收率相差不大，偏差都较小，
说明本法适用于罗非鱼源肽含量的检测。
Claims (10)
1.一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）肽对照品的选择：以分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽为对照品；
（2）检测条件的确定：包括络合物最大吸收波长的确定、线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定、体系最适pH的确定和体系最适TCA质量浓度的确定；
（3）标准曲线的建立：以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，络合物最大吸收波长的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.2 、0.5、4.0、8.0 mL于一组50 mL或100mL烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH13.5，立即在波长为470-630 nm范围内手动波段扫描确定最大吸收波长。
3.根据权利要求1所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.1 、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14%TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH12.5、13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并按照肽质量浓度分段进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度，确定溶液中多肽的最佳检测质量浓度范围。
4.根据权利要求1所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，体系最适pH的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整pH10.5、11.0、 11.5、12.0、12.5、 13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出pH变化不影响吸光值大小的区域，即为检测最适pH范围。
5.根据权利要求4所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，体系最适TCA质量浓度的确定包括如下步骤：先将罗非鱼明胶置于50-60℃水浴锅中加热溶解，分别取质量浓度为7%的罗非鱼明胶溶液1.0 mL于20 mL的离心管中，立即分别加入10 mL的5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，静置10 min后，于3500 r/min下离心15 min；分别取上清液1.0 mL、2.0 mL和4.0 mL于一组50 mL烧杯中，按照体积比为1:1、1:1、2:1的比例对应加入质量浓度为0.3 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液1.0 mL、2.0 mL和2.0 mL，每个体积比一组共8份，用对应质量浓度的 TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 ml双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出TCA浓度变化不影响吸光值大小的区域，即为TCA最适质量浓度范围。
6.根据权利要求4所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（3）中，分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用确定的TCA最适质量浓度补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制最适条件下标准曲线并进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度。
7.根据权利要求2所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，络合物最大吸收波长在545 nm处。
8.根据权利要求3所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，肽的最佳检测浓度为0.3~1.5 mg/mL。
9.根据权利要求5或6所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，最适pH为12.5，TCA最适质量浓度为13%。
10.根据权利要求1或6所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，标准曲线方程为y = 0.1449x+0.0015，R² = 0.9995。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN115374590A (zh) * | 2021-05-21 | 2022-11-22 | 广东规正质量检测有限公司 | 检测肽聚合度的方法及其在构建酱油质量评估模型的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101398375A (zh) * | 2008-11-04 | 2009-04-01 | 湖南亚华乳业有限公司 | 一种测定奶粉中肽含量的方法 |
| CN104677905A (zh) * | 2015-03-09 | 2015-06-03 | 大连工业大学 | 一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法 |
-
2018
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101398375A (zh) * | 2008-11-04 | 2009-04-01 | 湖南亚华乳业有限公司 | 一种测定奶粉中肽含量的方法 |
| CN104677905A (zh) * | 2015-03-09 | 2015-06-03 | 大连工业大学 | 一种通过检测反应液中氨基酸浓度确定酶促反应底物浓度的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 张玲等: "双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的改良及应用评价", 《食品科学》 * |
| 彭银仙: "《工业分析》", 31 January 2014, 哈尔滨工程大学出版社 * |
| 朱晓连等: "具有结合胆酸盐作用卵形鲳鲹蛋白酶解物的制备和分子量分布研究", 《南方水产科学》 * |
| 毕葳等: "应用双缩脲反应测定鳖甲中总肽含量的方法学研究", 《中国实验方剂学杂志》 * |
| 郭立安: "《高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术》", 31 August 1993, 陕西科学技术出版社 * |
| 阚建全: "《食品化学》", 30 September 2008, 中国农业大学出版社 * |
| 鲁伟等: "蛋白水解液中多肽含量的测定方法", 《食品科学》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115374590A (zh) * | 2021-05-21 | 2022-11-22 | 广东规正质量检测有限公司 | 检测肽聚合度的方法及其在构建酱油质量评估模型的应用 |
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