JP5794659B2 - ヒストンメチル化酵素活性の測定方法 - Google Patents

ヒストンメチル化酵素活性の測定方法 Download PDF

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Description

本発明は、ヒストンメチル化酵素活性の測定方法や、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法や、ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キットや、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キットに関する。
真核生物の染色体ＤＮＡはタンパク質と複合体を形成しており、かかる複合体はクロマチンと呼ばれている。より詳細に述べると、クロマチンは、ヌクレオソームの繰り返し構造がらせん状につながったものであり、ヌクレオソームは、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の４種類のヒストンタンパク質を２分子ずつ含むヒストンコア（ヒストン８量体）に、１４６塩基対のＤＮＡが１．７５回転巻き付いた構造をとっている。ＤＮＡとヒストンの結合は転写に対して阻害的に働く。転写が活性な遺伝子座の染色体では、ヌクレオソームが緩んだり、ヒストンが解離していることが知られている。ヒストンは球形のカルボキシル末端と、直鎖状のアミノ末端（ヒストンテール）からなっており、ヒストンテールのリシン残基やアスパラギン残基は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化などの様々な化学修飾を受けることが知られている。ヒストンのリシン残基のタンパク質翻訳後修飾のうち、アセチル化とメチル化についての概要を図１に示す。図１から分かるように、アセチル化の場合は、アセチル化の程度は１段階（アセチル化リシン（ε−Ｎ−アセチルリシン））であるのに対し、メチル化の場合は、メチル化の程度は通常３段階（モノメチル化リシン（ε−Ｎ−メチルリシン）、ジメチル化リシン（ε−Ｎ，Ｎ−ジメチルリシン）、トリメチル化リシン（ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン））である。
メチル化修飾は、転写の制御・サイレンシング・クロマチン凝縮などを引き起こすことが知られている。ヒストンのメチル化は、ヒストンメチル化酵素（histone methyltransferase:ＨＭＴ）によって誘導される。これまでに知られているヒトのヒストンメチル化酵素名、該酵素がメチル化するリシンサイト（リシン部位）、及び、そのリシンサイトのメチル化による転写への影響（転写促進又は転写抑制）を図２に示す。ヒストンメチル化は、様々な疾患との関連が知られている。例えば、非特許文献１には、腫瘍の発達にＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＭＬＬ、ＮＳＤ１、ＲＩＺ等の様々なヒストンメチル化酵素が関与することが記載されている。また、非特許文献２や３には、がん細胞で発現が抑制されているがん抑制遺伝子のプロモーター領域で、ＤＮＡのメチル化の増加やヒストンのアセチル化の減少と共に、ヒストンＨ３Ｋ９、及び、ヒストンＨ３Ｋ２７のメチル化が認められることが記載されている。さらに、非特許文献４には、多くのがんに共通して、ヒストンＨ４Ｋ２０のメチル化の増加が認められることが記載されている。また、非特許文献５には、ヒストンのメチル化により誘導されるヘテロクロマチン形成が、筋緊張性ジストロフィーやフリードライヒ運動失調症といった神経変性疾患に関わっていることが記載されている。また、非特許文献６には、Oct4/Klf2と遺伝子導入したマウス胚繊維芽細胞にＬ型カルシウムチャネルのアゴニストであるBayK8644、及びヒストンメチル化酵素Ｇ９ａの阻害剤であるBIX-01294を添加することでｉＰＳ細胞へ誘導されたことが記載されている。
そのため、ヒストンメチル化酵素の阻害剤は、がんや神経変性疾患といった疾患への治療薬や、ｉＰＳ細胞を用いた再生医療への応用が期待されている。そこで、ヒストンメチル化酵素阻害剤のスクリーニングが試みられている。例えば、非特許文献７には、メチル基がトリチウムラベルされたＳ−アデノシルメチオニン（S‐(5’-Adenosyl)-L-methionine：ＳＡＭ）である［メチル−３Ｈ］−ＳＡＭと、ヒストンＨ３のアミノ酸番号１−１９のアミノ酸配列から成るペプチド（ヒストンＨ３（１−１９）ペプチド）と、ヒストンメチル化酵素とを混合して反応させた後、ヒストンＨ３（１−１９）ペプチドの放射活性を測定することによって、リシンに転移したメチル基の量を測定し、それにより、該ヒストンメチル化酵素のヒストンメチル化活性を測定する方法（いわゆるＲＩ法）が記載されている（図３）。また、非特許文献８には、Ｅｌｉｓａ法により、ヒストンメチル化酵素阻害剤をスクリーニングする方法が記載されている（図４）。しかし、ＲＩ法は、放射性同位体を用いるため安全性が十分とは言えない点や、反応生成物の濾紙への吸着、濾紙の洗浄といった実験操作数が比較的多く、煩雑である点などの問題点があった（図５）。また、図５にも示されているように、Ｅｌｉｓａ法は、洗浄操作といった実験操作数が極めて多く、所要時間も長いという問題点があった。このような状況下、ヒストンメチル化活性の評価系であって、安全性に問題がなく、かつ、実験操作が簡便で所要時間も短い評価系が求められていた。
一方、ヒストン脱アセチル化酵素活性の簡便な測定方法として、Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−（色素）で表される基質ペプチド（すなわち、特許文献１にてＸ−Ｘ−（Ａｃ）Ｌｙｓ−（色素）で表される基質ペプチド）（式中Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｌｙｓ（Ａｃ）はεアミノ基（ε位のアミノ基）がアセチル化されたリシン残基を表し、（色素）は該リシン残基に結合した色素標識を表す）を利用した方法が知られている（特許文献１参照）。この方法は、前述の基質ペプチドがアセチル化されたままの状態では、ある種のペプチダーゼによる切断活性が低下したままであるのに対し、前述の基質ペプチドが脱アセチル化されると、該ペプチダーゼによる切断活性が上昇する性質を利用している。
また、リシンのε位のメチル化に関していえば、非特許文献９や１０には、ペプチドのリシン残基のε位をメチル化すると、メチル化していないものよりも、トリプシンに分解され難くなることが記載されている。しかし、リシンのε位のメチル化は、アセチル化とは違って３段階（モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化）あることや、前述の特許文献１における脱アセチル化とは逆に、反応の進行によってある種のペプチダーゼによる切断活性が低下することなどから、ヒストンメチル化酵素活性の測定方法に実際に用い得るかどうか不明であった。
特許第４２６７０４３号公報
TRENDS in Biochemical Sciences, 27, 396-402, 2002. Nature Review Cancer, 6, 107-116, 2006. Nature Review Drug Discovery, 5, 37-50, 2006. Nature Genetics, 37, 391-400, 2005. Nature, 422, 909-913, 2003. Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008. Nature Chemical Biology, 1, 143-145, 2005. Molecular Cell, 25, 473-481, 2007. Biochim Biophys Acta, Vol.581 No.2, 360-362, 1979 J Biol Chem, Vol.258 No.3, 1844-1850, 1983
本発明は、ヒストンメチル化酵素活性の測定方法や、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法や、ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キットや、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するべく、リシン残基のεアミノ基がメチル化することによって色素の検出強度が上昇するような評価系などの構築を様々試みたが、簡便かつ高感度な評価系を構築することはできなかった。しかし、本発明者らはさらに鋭意研究を続けたところ、前述の一般式（Ｉ）で表される基質化合物を用いると、リシン残基のεアミノ基がメチル化することによって色素の検出強度が低下するような評価系であっても、ヒストンメチル化酵素活性を実際に高感度で測定し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは研究を進め、適切な励起波長及び蛍光波長を利用することによって、リシン残基のεアミノ基がメチル化すると色素の検出強度が上昇するような評価系であって、簡便且つ高感度な評価系を構築し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含むことを特徴とする、試料中のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法；
（ａ）以下の一般式（Ｉ）

（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する基質化合物又はその塩を準備する工程;
（ｂ）前記一般式（Ｉ）で表される基質化合物又はその塩と試料とを、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記基質化合物又はその塩にペプチダーゼを作用させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物又はその塩を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程；及び、
（ｅ）工程（ｄ）におけるメチル化レベルの上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価する工程；や、
（２）工程（ｄ）における前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度の測定が、
前記基質化合物又はその塩におけるアミド結合がペプチダーゼによって切断されて、蛍光特性又は発色特性が変化した色素標識を測定することによりなされるか；又は
前記基質化合物又はその塩におけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されて、アミド結合がペプチダーゼによって切断されなかった色素標識を測定することによりなされる；
ことを特徴とする上記（１）に記載の方法や、
（３）次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含むことを特徴とする、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法；
（ａ）以下の一般式（Ｉ）

（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する基質化合物又はその塩を準備する工程;
（ｂ）前記一般式（Ｉ）で表される基質化合物又はその塩と、ヒストンメチル化酵素とを、被検化合物の存在下、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記基質化合物又はその塩にペプチダーゼを作用させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物又はその塩を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程；及び、
（ｅ）工程（ｄ）における基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度が、被検化合物の非存在下における基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度と比較して、少ない被検化合物を選択する工程；や、
（４）ペプチダーゼが、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、及び、トリプシンからなる群から選択される少なくとも１種のペプチダーゼである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法に関する。
また、本発明は、（５）以下の一般式（Ｉ）

（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩や、
（６）ヒストンメチル化酵素が、Ｘ−Ｋからなるペプチドの配列に応じた基質特異性を有するヒストンメチル化酵素であり、基質化合物又はその塩におけるＸ−Ｋからなるペプチドの配列が、該ヒストンメチル化酵素に対して基質特異性を示す配列であることを特徴とする上記（５）に記載の基質化合物又はその塩に関する。
さらに、本発明は、（７）以下の（ａ）及び（ｂ）の要素を含む、ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キット；
（ａ）以下の一般式（Ｉ）

（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩；及び、
（ｂ）前記一般式（Ｉ）で表される基質化合物又はその塩を切断するペプチダーゼであって、該ペプチダーゼは基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇に伴って切断活性が低下するペプチダーゼや、
（８）ペプチダーゼが、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、及び、トリプシンからなる群から選択される少なくとも１種のペプチダーゼである上記（７）に記載の試薬キットや、
（９）上記（７）又は（８）に記載の試薬キットと、ヒストンメチル化酵素とを含む、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キットに関する。
本発明によれば、ヒストンメチル化酵素活性を測定することや、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングすることが、非常に簡便にかつ高感度で可能となる。
ヒストンのリシン残基のアセチル化（図１上）やメチル化（図１下）の概要を示す図である。 ヒトのヒストンメチル化酵素名、該酵素がメチル化するリシンサイト、そのリシンサイトのメチル化による転写への影響を示す図である。 従来のヒストンメチル化活性の測定方法（ＲＩ法）の概要を示す図である。 従来のヒストンメチル化活性の測定方法（Ｅｌｉｓａ法）の概要を示す図である。 従来法であるＲＩ法やＥｌｉｓａ法の問題点を示す図である。 ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを用いた場合のヒストンメチル化酵素活性の測定方法の概要を示す図である。 本発明の基質化合物のメチル化による、ペプチダーゼに対する感受性の低下を確認した試験の結果を示す図である。図７の左パネルは、トリプシンに対する感受性（トリプシンとの反応性）を示した結果であり、右パネルは、リシルエンドペプチダーゼに対する感受性（リシルエンドペプチダーゼとの反応性）を示した結果である。 本発明の基質化合物とペプチダーゼとの反応への、トリプシン阻害剤の影響を確認した試験の結果を示す図である。 本発明の基質化合物を用いたヒストンメチル化酵素活性の測定の結果を示す図である。なお、本発明の基質化合物の濃度と、ヒストンメチル化酵素の濃度を変化させている。 本発明の基質化合物を用いたヒストンメチル化酵素活性の測定の結果を示す図である。なお、メチル基供与体であるＳＡＭの濃度を変化させている。 ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイ（ヒストンメチル化酵素であるＧ９ａ非存在下）における反応のＬＣ／ＭＳによる解析の結果を示す図である。一番上のパネルは、ペプチダーゼを用いていない場合（無処理）の解析結果を表し、中央のパネルは、ペプチダーゼとしてトリプシンを用いた場合（＋トリプシン）の解析結果を示し、一番下のパネルは、ペプチダーゼとしてリシルエンドペプチダーゼを用いた場合（＋ＬＥＰ）の解析結果を示す。 ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイ（ヒストンメチル化酵素であるＧ９ａ存在下）における反応のＬＣ／ＭＳによる解析の結果を示す図である。一番上のパネルは、ペプチダーゼを用いていない場合（無処理）の解析結果を表し、中央のパネルは、ペプチダーゼとしてトリプシンを用いた場合（＋トリプシン）の解析結果を示し、一番下のパネルは、ペプチダーゼとしてリシルエンドペプチダーゼを用いた場合（＋ＬＥＰ）の解析結果を示す。 本発明の基質化合物におけるＸが１個以上のアミノ酸残基（ペプチド）を示すペプチジル基質化合物のＸペプチドのアミノ酸配列等を示す図である。 ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す図である。縦軸はメチル化されていないペプチジルＭＣＡの割合（％）を示し、横軸はＧＳＴ−ｍＧ９ａ又はＨｉｓ−Ｓｅｔ９の濃度（μｇ／μＬ）を示す。図１４左パネル：ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合の結果を示す。図１４右パネル：ヒストンメチル化酵素としてＳｅｔ９を用いた場合の結果を示す。 本発明の基質化合物におけるＸが１個以上のアミノ酸残基（ペプチド）を示すペプチジル基質化合物のＸペプチドのアミノ酸配列等を示す図である。 ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す図である。縦軸はメチル化されていないペプチジルＭＣＡの割合（％）を示し、横軸はＧＳＴ−ｍＧ９ａ又はＨｉｓ−Ｓｅｔ９の濃度（μｇ／μＬ）を示す。図１６左パネル：ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合の結果を示す。図１６右パネル：ヒストンメチル化酵素としてＳｅｔ９を用いた場合の結果を示す。 ヒストンメチル化酵素活性阻害剤の活性を評価するウエスタンブロットの結果を示す図である。 ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤（グリオトキシン）の活性評価の結果を示す図である。図１８左パネル：ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ９と、Ac-p53 (369-372)-MCAを用いた場合のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す。図１８中央パネル：ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａと、Ac-histone H3 (1-9)-MCAを用いた場合のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す。図１８右パネル：図１８の左パネル及び中央パネルの結果から算出した、グリオトキシンによるメチル化阻害率（％）を示す。 ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン：ＳＡＨ）の活性評価の結果を示す図である。図１９左パネル：ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａと、Ac-histone H3 (1-9)-MCAを用いた場合のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す。図１９右パネル：図１９の左パネルの結果から算出した、ＳＡＨによるメチル化阻害率（％）を示す。 ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ（ｎ＝０，１，２，３）とＡＭＣの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを示す図である。 ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ（ｎ＝０，１，２，３）とＡＭＣの蛍光スペクトルを示す図である。 ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡのメチル化による、トリプシンに対する感受性の低下を確認した試験の結果を示す図である。図２２の左パネルは、ＡＭＣの蛍光強度を測定した結果を表し、右パネルは、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ（ｎ＝０，１，２，３）の蛍光強度を測定したを示した結果を表す。 ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡのメチル化による、リシルエンドペプチダーゼに対する感受性の低下を確認した試験の結果を示す図である。図２３の左パネルは、ＡＭＣの蛍光強度を測定した結果を表し、右パネルは、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ（ｎ＝０，１，２，３）の蛍光強度を測定したを示した結果を表す。 ＢｏｃＬｙｓＭＣＡとＡＭＣの混合液の蛍光スペクトルを示す図である。図２４の左パネルは、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定した結果を表し、右パネルは、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した結果を表す。 ペプチジルＭＣＡ（Ac-histone H3 (1-9)-MCA）を用いたヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す図である。図２５の左パネルは、ＡＭＣの蛍光強度を測定した結果を表し、右パネルは、ペプチジルＭＣＡの蛍光強度を測定したを示した結果を表す。 ペプチジルＭＣＡ（Ac-ERa(299-302)-MCA）を用いたヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を示す図である。図２５の左パネルは、ＡＭＣの蛍光強度を測定した結果を表し、右パネルは、ペプチジルＭＣＡの蛍光強度を測定したを示した結果を表す。 ペプチジルＭＣＡ及びＧ９ａを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤（グリオトキシン）の活性評価の結果を示す図である。図２７の左パネルは、ＡＭＣの蛍光強度を測定した結果を表し、右パネルは、ペプチジルＭＣＡの蛍光強度を測定したを示した結果を表す。 ペプチジルＭＣＡ及びＳｅｔ７／９を用いたヒストンメチル化酵素阻害剤（グリオトキシン）の活性評価の結果を示す図である。図２８の左パネルは、ＡＭＣの蛍光強度を測定した結果を表し、右パネルは、ペプチジルＭＣＡの蛍光強度を測定したを示した結果を表す。 ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素活性の検出の概要を示す図である。
１．本発明の「基質化合物又はその塩」
本発明の基質化合物又はその塩（以下、単に「本発明の基質化合物等」とも表示する。）としては、上記一般式（Ｉ）（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、前記基質化合物又はその塩は、前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記基質化合物又はその塩は、前記リシン残基のεアミノ基がヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩である限り特に制限されるものではない。かかる本発明の基質化合物等と試料とをヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させ、次いで、ペプチダーゼを作用させた後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物等を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、前記基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出し、メチル化レベルの上昇の程度を試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価することができる。このように、本発明の基質化合物等を利用することにより、試料中のヒストンメチル化酵素活性を非常に簡便にかつ高感度で測定することができる。前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定する際の測定対象としては、前記基質化合物等におけるアミド結合がペプチダーゼによって切断されて、蛍光特性又は発色特性が変化した色素標識（以下、「色素標識Ａ」とも表示する。）であってもよいし、前記基質化合物等におけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されて、アミド結合がペプチダーゼによって切断されなかった色素標識（以下、「色素標識Ｂ」とも表示する。）であってもよい。本発明の基質化合物等として、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを用いた場合のヒストンメチル化酵素活性の測定方法の概要を図６に示す。図６から分かるように、本発明の基質化合物等がメチル化されていないと、そのアミド結合がペプチダーゼによって切断されて、蛍光特性が変化した色素標識（ＡＭＣ）となるのに対し、前記基質化合物等におけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されると、そのアミド結合がペプチダーゼによって切断されず、色素標識（ＭＣＡ基）の蛍光特性はそれほど変化しない。なお、ＡＭＣ等の色素標識Ａを測定する場合は、その色素標識Ａの低下量からヒストンメチル化酵素活性を測定することができ、ＭＣＡ基等の色素標識Ｂを測定する場合は、その色素標識Ｂの増加量からヒストンメチル化酵素活性を測定することができる。
上記Ｒ１としては、水素原子又はアミノ末端の保護基であればどのようなものでもよく、アミン末端の保護基としては、ＨＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−、Ｂｏｃ（t-butyloxycarbonyl）基、トシル基等を具体的に例示することができる。また、上記Ｒ２としては、一般式（Ｉ）におけるリシン残基（Ｋ）のカルボニル末端とアミド結合した色素標識であって、該アミド結合（リシン残基とＲ２間のアミド結合）がペプチダーゼによって切断されると色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化する色素標識である限り特に制限されない。前述のリシン残基（Ｋ）のカルボニル末端とアミド結合した色素標識であって、該アミド結合の切断によって蛍光特性の変化する基としては、ＭＣＡ（4-methyl-coumaryl-7-amide）基、ＡＮＳ（2-aminonaphthalene-6-sulfonic acid）基、ＣＭＣＡ（7-amino-4-chloromethylcoumarin）基、ＦＭＣＡ（7-amino-4-trifluoromethylcoumarin）基、ＡＭＰ（2-amino-7-methylpurine-6-thiol）基、Ｒ１１０（rhodamine 110）基、Ｒ１１０モノアミド（rhodamine 110 monoamido）基等を具体的に挙げることができ、ここでＭＣＡ基、ＡＮＳ基、ＣＭＣＡ基、ＦＭＣＡ基、ＡＭＰ基、Ｒ１１０基、Ｒ１１０モノアミド基は、以下の［化５］に示される置換基を意味する。なお、［化５］に示されるＲ１１０モノアミド基におけるペプチド基は特に制限されず、任意のペプチド基とすることができる。
また、前述のリシン残基（Ｋ）のカルボニル末端とアミド結合した色素標識であって、該アミド結合の切断によって発色特性の変化する基としてはｐＮＡ（p-nitroaniline）基，βＡＮ（β-amino naphthalene）基等を具体的に挙げることができ、βＡＮ基にはβＡＮとFast Garnet GBC，Fast Blue等との２次反応物等が便宜上含まれ、ここでｐＮＡ基，βＡＮ基，Fast Garnet GBC，Fast Blueは、以下の［化６］に示される置換基等を意味する。
なお、前述の蛍光特性の変化の有無や変化量は、蛍光強度測定機等を用いて検出や定量することができ、前述の発色特性の変化の有無や変化量は、分光光度計等を用いて検出や定量することができる。その際、前述の色素標識Ａや前述の色素標識Ｂの吸収波長や蛍光波長を解析し、いずれかを特異的に検出・定量し得るような励起波長及び蛍光波長を選択することが好ましい。本発明の基質化合物等における色素標識としてＭＣＡ基を用いているときに、ＡＭＣを特異的に測定する場合は、ＭＣＡ基を励起せずＡＭＣを励起する波長（例えば３６０ｎｍ〜４００ｎｍ、好ましくは３８５ｎｍ〜３９５ｎｍ、特に好ましくは３９０ｎｍ）を照射し、ＡＭＣが発する蛍光波長（例えば４００ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは４４０ｎｍ〜４８０ｎｍ、特に好ましくは４６０ｎｍ）を検出・測定することが好ましく、ＭＣＡ基を特異的に測定する場合は、ＭＣＡ基を励起する波長（例えば２６０ｎｍ〜３５０ｎｍ、好ましくは３００ｎｍ〜３４０ｎｍ、特に好ましくは３３０ｎｍ）を照射し、ＡＭＣは発さずＭＣＡ基が発する波長（例えば３５０ｎｍ〜３８５ｎｍ、好ましくは３６５ｎｍ〜３８５ｎｍ、特に好ましくは３８０ｎｍ）を検出・測定することが好ましい。これらの波長を用いることで、ヒストンメチル化酵素活性をより簡便且つ高感度で測定することができる。
上記一般式（Ｉ）におけるＸは、０又は１個以上、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示す。そして、一般式（Ｉ）におけるＸ−Ｋは、ヒストンＨ３、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ４、ｐ５３、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）等に由来するペプチドである。ヒストンＨ３に由来するＸ−Ｋとしては、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１−４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＴＫ；配列番号１）や、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号５−９のアミノ酸残基からなるペプチド（ＱＴＡＲＫ；配列番号２）や、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１−９のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ；配列番号３）や、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号７−９又は２５−２７のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＫ）や、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号２３−２７のアミノ酸残基からなるペプチド（ＫＡＡＲＫ；配列番号４）や、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１９−２７のアミノ酸残基からなるペプチド（ＱＬＡＴＫＡＡＲＫ；配列番号５）を好適に例示することができ、ｐ５３に由来するＸ−Ｋとしては、ヒトのｐ５３のアミノ酸番号３６９−３７２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＫＳＫ；配列番号６）や、ヒトのｐ５３のアミノ酸番号３６７−３７２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＳＨＬＫＳＫ；配列番号７）を好適に例示することができ、ＥＲαに由来するＸ−Ｋとしては、ヒトのＥＲαのアミノ酸番号２９９−３０２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＫＲＳＫ；配列番号８）や、ヒトのＥＲαのアミノ酸番号２９７−３０２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＭＩＫＲＳＫ；配列番号９）を好適に例示することができ、ＡＲに由来するＸ−Ｋとしては、ヒトのＡＲのアミノ酸番号６３０−６３３のアミノ酸残基からなるペプチド（ＲＫＬＫ；配列番号１０）や、ヒトのＡＲのアミノ酸番号６２８−６３３のアミノ酸残基からなるペプチド（ＧＡＲＫＬＫ；配列番号１１）を好適に例示することができ、ＧＲに由来するＸ−Ｋとしては、ヒトのＧＲのアミノ酸番号４９１−４９４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＲＫＴＫ；配列番号１２）や、ヒトのＧＲのアミノ酸番号４８９−４９４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＥＡＲＫＴＫ；配列番号１３）を好適に例示することができる。なお、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸配列を配列番号１４に示し、ヒトのヒストンＨ２Ａのアミノ酸配列を配列番号１５に示し、ヒトのヒストンＨ２Ｂのアミノ酸配列を配列番号１６に示し、ヒトのヒストンＨ４のアミノ酸配列を配列番号１７に示し、ヒトのｐ５３のアミノ酸配列を配列番号１８に示し、ヒトのＥＲαのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、ヒトのＡＲのアミノ酸配列を配列番号２０に示し、ヒトのＧＲのアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
本発明の基質化合物の塩としては、本発明の基質化合物をヒストンメチル化酵素活性測定用基質としてヒストンメチル化酵素活性を測定した測定値と同等な測定値を与える化合物の塩であればどのようなものでもよく、無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩等）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸若しくはスルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）のような塩基との塩又は酸付加塩を具体的に挙げることができる。
本発明の基質化合物等の中でも特に好適なものとして、Ｂｏｃ−Ｋ−ＭＣＡ（ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ）、Ａｃ−ＡＲＴＫ−ＭＣＡ（Ac-histone H3 (1-4)-MCA）、Ａｃ−ＱＴＡＲＫ−ＭＣＡ（Ac-histone H3 (5-9)-MCA）、Ａｃ−ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ−ＭＣＡ（Ac-histone H3 (1-9)-MCA）、Ａｃ−ＡＲＫ−ＭＣＡ（Ac-hisotne H3 (7-9/25-27)-MCA）、Ａｃ−ＫＡＡＲＫ−ＭＣＡ（Ac-histone H3 (23-27)-MCA）、Ａｃ−ＱＬＡＴＫＡＡＲＫ−ＭＣＡ（Ac-histone H3 (19-27)-MCA）、Ａｃ−ＬＫＳＫ−ＭＣＡ（Ac-p53 (369-372)-MCA）、Ａｃ−ＳＨＬＫＳＫ−ＭＣＡ（Ac-p53(367-372)-MCA）、Ａｃ−ＫＲＳＫ−ＭＣＡ（Ac-ERα(299-302)-MCA）、Ａｃ−ＭＩＫＲＳＫ−ＭＣＡ（Ac-ERα(297-302)-MCA）、Ａｃ−ＲＫＬＫ−ＭＣＡ（Ac-AR(630-633)-MCA）、Ａｃ−ＧＡＲＫＬＫ−ＭＣＡ（Ac-AR(628-633)-MCA）、Ａｃ−ＲＫＴＫ−ＭＣＡ（Ac-GR(491-494)-MCA）、Ａｃ−ＥＡＲＫＴＫ−ＭＣＡ（Ac-GR(489-494)-MCA）を具体的に例示することができる。
前記の本発明の基質化合物等は、前記リシン残基のεアミノ基がヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する。感受性の低下の好ましい程度としては、例えば、本発明の基質化合物等のリシン残基のεアミノ基の水素原子が１分子メチル化した本発明の基質化合物等（Ｍｅ）と、本発明の基質化合物等とで、以下の混合アッセイにおける色素標識Ａ量（色素標識Ａのシグナル強度、好適には蛍光強度、さらに好適にはＡＭＣの蛍光強度）を比較したときに、本発明の基質化合物等（Ｍｅ）の色素標識Ａ量が、本発明の基質化合物等の色素標識Ａ量に対して、割合として、３０％以下、好適には２０％以下、より好適には１０％以下、さらに好適には５％以下、より好適には３％以下、さらに好適には１％以下であることを例示することができる。このように、低下の程度が著しい本発明の基質化合物等を用いると、ヒストンメチル化酵素活性の測定を著しく高感度で行うことが可能となる。
（混合アッセイ）
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）及び１μＬの本発明の基質化合物等溶液に、蒸留水を添加して２０μＬになるように調整する。その溶液に３０μＬのペプチダーゼ溶液（好適には、２０ｍｇ／ｍＬ トリプシン、又は、２０ｍＡＵ／ｍＬ リシルエンドペプチダーゼ）を添加して混合した後、３７℃で１５分インキュベートする。次いで、その溶液中の色素標識Ａ量を測定する。また、同様の方法で、本発明の基質化合物等（Ｍｅ）の色素標識Ａ量を測定する。なお、色素標識Ａ量がＡＭＣの蛍光強度である場合は、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで蛍光強度を測定することが好ましい。この波長は、本発明の基質化合物等のＬｙｓとＭＣＡの間のアミド結合が切断されて遊離したＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を検出する波長である。
本明細書における「ヒストンメチル化酵素」としては、ヒストンのリシン残基のεアミノ基をメチル化する酵素である限り特に制限されないが、ＳＥＴ１、ＭＬＬ、ＳＥＴ９、ＳＭＹＤ３、Ｍｅｉｓｅｔｚ、ＳＵＶ３９Ｈ１、Ｇ９ａ、ＧＬＰ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１、ＲＩＺ、ＭＥＳ−２、ＥＺＨ２、ＮＳＤ１、ＳＭＹＤ２、ＤＯＴ１Ｌ、ＳＵＶ４−２０Ｈ、ＮＳＤ１、ＳＥＴ８／ＰＲ−ＳＥＴ７等を好適に例示することができ、中でもＳｅｔ９、Ｇ９ａをより好適に例示することができる。なお、ＳＥＴ１、ＭＬＬ、ＳＥＴ９、ＳＭＹＤ３、Ｍｅｉｓｅｔｚは、ヒストンＨ３のアミノ酸番号４のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ４）をメチル化する酵素であって、該メチル化によって転写促進に寄与する酵素であり、ＳＵＶ３９Ｈ１、Ｇ９ａ、ＧＬＰ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１、ＲＩＺは、ヒストンＨ３のアミノ酸番号９のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ９）をメチル化する酵素であって、該メチル化によって転写抑制に寄与する酵素であり、ＭＥＳ−２、ＥＺＨ２、Ｇ９ａは、ヒストンＨ３のアミノ酸番号２７のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ２７）をメチル化する酵素であって、該メチル化によって転写抑制に寄与する酵素であり、ＮＳＤ１、ＳＭＹＤ２は、ヒストンＨ３のアミノ酸番号３６のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ３６）をメチル化する酵素であって、該メチル化によって転写促進に寄与する酵素であり、ＤＯＴ１Ｌは、ヒストンＨ３のアミノ酸番号７９のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ７９）をメチル化する酵素であって、該メチル化によって転写促進に寄与する酵素であり、ＳＵＶ４−２０Ｈ、ＮＳＤ１、ＳＥＴ８／ＰＲ−ＳＥＴ７は、ヒストンＨ４のアミノ酸番号２０のリシン残基（ヒストンＨ４Ｋ２０）をメチル化する酵素であって、該メチル化によって転写抑制に寄与する酵素である。なお、ＳＥＴ９と呼ばれる酵素と、ＳＥＴ７と呼ばれる酵素は同一の酵素であるため、本願明細書では、ＳＥＴ７／９と表示する場合もある。
本発明の基質化合物等におけるＫとＲ２間のアミド結合を切断するヒストンメチル化酵素として、Ｘ−Ｋからなるペプチドの配列に応じて基質特異性を有するヒストンメチル化酵素を例示することができる。このようなヒストンメチル化酵素は、該酵素に特異的なＸ−Ｋからなるペプチドを有する本発明の基質化合物等のみをメチル化するため、Ｘペプチドの配列が様々な本発明の基質化合物等との反応を確認することによって、該ヒストンメチル化酵素の基質特異性を調べることができる。また、Ｘが所定の配列のペプチドである本発明の基質化合物等と、様々なヒストンメチル化酵素との反応を確認することによって、該基質化合物等に特異的なヒストンメチル化酵素を調べることができる。なお、本発明の基質化合物等におけるヒストンメチル化酵素としては、Ｘ−Ｋからなるペプチドの配列に応じて基質特異性を有するヒストンメチル化酵素であり、かつ、該本発明の基質化合物等におけるＸ−Ｋからなるペプチドの配列は、該ヒストンメチル化酵素に対して基質特異性を示す配列である本発明の基質化合物等を好適に例示することができる。
本発明の基質化合物等は、公知の方法によって合成することができる。例えば、Ｒ１−Ｘ−ＯＨと、Ｋ−Ｒ２の酸性塩とを反応させることによって、一般式（Ｉ）で表される基質化合物を合成することができる。
本発明における「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を意味し、その鎖長は特に制限されない。本発明における「メチル化酵素」とは、メチル基をその構造の一部に有する物質（例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン：ＳＡＭ）からメチル基をペプチドに転移させる反応を触媒する酵素を意味する。また、本発明における「ペプチダーゼ」とは、タンパク質を含むペプチド群に作用して、ペプチド結合を加水分解する酵素であって、本発明の基質化合物等のリシン残基のεアミノ基がメチル化されると、該基質化合物等に対する切断活性が低下する酵素を意味する。したがって、いわゆる「タンパク質分解酵素」、「プロテアーゼ(protease)」、「プロテイナーゼ(proteinase)」、「ペプチドヒドロラーゼ(peptidehydrolase)」等はいずれも、本発明における「ペプチダーゼ」に含まれる。本発明における「ペプチダーゼ」の具体例として、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、トリプシンを例示することができ、中でも、リシルエンドペプチダーゼ、トリプシンを好適に例示することができる。本発明における「ペプチド切断活性」とは、基質となるペプチド中のペプチド結合を、加水分解する活性を意味する。
２．本発明の「ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キット」
本発明のヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キットは、以下の（ａ）及び（ｂ）の要素を含むキットである限り特に制限されるものではない。
（ａ）本発明の基質化合物等；及び、
（ｂ）本発明の基質化合物等を切断するペプチダーゼであって、該ペプチダーゼは前述の本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇に伴って切断活性が低下するペプチダーゼ；
本発明のヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キットは、後述の「試料中のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法」と同様の方法で使用することができる。
３．本発明の「ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キット」
本発明のヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キットは、本発明のヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キットと、ヒストンメチル化酵素とを含むキットである限り、特に制限されるものではない。該キットに含まれるヒストンメチル化酵素としては、本発明の基質化合物等のＸ−Ｋからなるペプチドの配列に応じて基質特異性を有するヒストンメチル化酵素であり、かつ、該本発明の基質化合物等におけるＸ−Ｋからなるペプチドの配列は、該ヒストンメチル化酵素に対して基質特異性を示す配列であるものを好適に例示することができる。
本発明のヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キットは、後述の「ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法」と同様の方法で使用することができる。
４．本発明の「試料中のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法」
本発明の試料中のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法としては、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む限り特に制限されない。
（ａ）本発明の基質化合物等を準備する工程；
（ｂ）本発明の基質化合物等と試料とを、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記の本発明の基質化合物等にペプチダーゼを作用させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することによって、前記の本発明の基質化合物等を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程；及び、
（ｅ）工程（ｄ）におけるメチル化レベルの上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価する工程；
かかる方法により、試料中のヒストンメチル化酵素活性を非常に簡便にかつ高感度で測定することができる。上記工程（ａ）としては、本発明の基質化合物等を準備する工程である限り特に制限されず、本発明の基質化合物等を調製する工程も含まれる。上記工程（ｂ）としては、本発明の基質化合物等と試料とを、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程である限り特に制限されないが、本発明の基質化合物等と試料とをヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件を備えた溶液中で接触させることを好適に例示することができる。かかる条件は、当業者が適宜選択することができ、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）等のメチル基供与体を含むという条件や、ヒストンメチル化酵素がヒストンメチル化酵素活性を発揮できるような条件を含む。工程（ｂ）の好適な例としては、１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、２μＬのＢＳＡ溶液（３０μｇ／ｍＬ）、及び、所定の濃度のヒストンメチル化酵素溶液に、蒸留水を添加して１６μＬとなるように調整し、室温で１時間インキュベートしてから、そこに２μＬのＳＡＭ及び２μＬの本発明の基質化合物等を添加して３７℃で１時間インキュベートする工程を挙げることができる。
上記工程（ｃ）としては、工程（ｂ）の後、前記の本発明の基質化合物等にペプチダーゼを作用させる工程である限り特に制限されず、例えば、ペプチダーゼ溶液を添加して３７℃で１５分間インキュベートする工程を好適に例示することができる。
上記工程（ｄ）としては、工程（ｃ）の後、本発明の基質化合物等のＫとＲ２間のアミド結合の切断によって生じ得る前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、本発明の基質化合物等を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程である限り特に制限されない。色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度の測定方法は、色素標識において変化する特性の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、色素標識において変化する特性が蛍光特性である場合は、蛍光強度測定機等を用いて、蛍光特性の変化の有無を検出したり、変化量を測定することができる。また、色素標識において変化する特性が発色特性の変化である場合は、分光光度計等を用いて、発色特性変化の有無を検出したり、変化量を測定することができる。
工程（ｄ）で測定した、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度から、本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出する方法としては、まず、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度から、本発明の基質化合物等を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度を求め、その程度から、本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出する方法を好適に例示することができる。前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度から、本発明の基質化合物等を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度を求める方法としては、測定対象とした色素標識が前述の色素標識Ａ（前記基質化合物等におけるアミド結合がペプチダーゼによって切断されて、蛍光特性又は発色特性が変化した色素標識）である場合、色素標識Ａ量（色素標識Ａのシグナル強度）が、コントロールの場合の色素標識Ａ量（色素標識Ａのシグナル強度）と比較してどの程度低下しているかを求める方法を好適に例示することができ、測定対象とした色素標識が前述の色素標識Ｂ（前記基質化合物等におけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されて、アミド結合がペプチダーゼによって切断されなかった色素標識）である場合、色素標識Ｂ量（色素標識Ｂのシグナル強度）が、コントロールの場合の色素標識Ｂ量（色素標識Ｂのシグナル強度）と比較してどの程度増加しているかを求める方法を好適に例示することができる。ここで、「コントロールの場合の色素標識Ａ量又は色素標識Ｂ量（色素標識Ａ又はＢのシグナル強度）」とは、工程（ｂ）で用いた本発明の基質化合物等を試料に接触させないまま（すなわち、本発明の基質化合物等におけるリシン残基のεアミノ基をメチル化させないまま）、同様にペプチダーゼを作用させた場合の色素標識Ａ量又は色素標識Ｂ量（色素標識Ａ又はＢのシグナル強度）を意味する。また、本発明の基質化合物等はメチル化レベル（Ｋのεアミノ基のメチル化の程度）が上昇すると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するので、前述のペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づいて、本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出することができる。
上記工程（ｅ）としては、工程（ｄ）におけるメチル化レベルの上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価する工程である限り特に制限されない。工程（ｄ）におけるメチル化レベルの上昇の程度は、試料中のヒストンメチル化酵素活性によるものなので、メチル化レベルの上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価することができる。
５．本発明の「ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法」
本発明のヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法としては、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む限り特に制限されない。
（ａ）本発明の基質化合物等を準備する工程；
（ｂ）本発明の基質化合物等と、ヒストンメチル化酵素とを、被検化合物の存在下、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記の本発明の基質化合物等にペプチダーゼを作用させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記の本発明の基質化合物等を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程：及び、
（ｅ）工程（ｄ）における本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度が、被検化合物の非存在下における本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度と比較して、少ない被検化合物を選択する工程：
かかる方法により、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物を、非常に簡便にかつ高感度でスクリーニングすることができる。ヒストンメチル化酵素の阻害剤は、がんや神経変性疾患といった疾患への治療薬や、ｉＰＳ細胞を用いた再生医療への応用が強く期待されているため、このスクリーニング方法の意義は大きい。
上記工程（ａ）としては、本発明の基質化合物等を準備する工程である限り特に制限されず、本発明の基質化合物等を調製する工程も含まれる。
上記工程（ｂ）としては、本発明の基質化合物等と、ヒストンメチル化酵素とを、被検化合物の存在下、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程である限り特に制限されないが、本発明の基質化合物等と、ヒストンメチル化酵素とを、被検化合物の存在下、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件を備えた溶液中で接触させることを好適に例示することができる。ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件は、４．の項目で前述したとおりである。被検化合物としては、特に制限されないが、東京大学の生物機能制御化合物ライブラリー機構などの化合物ライブラリーの化合物を好適に利用することができる。上記工程（ｃ）や工程（ｄ）は、４．の項目で記載した工程（ｃ）や工程（ｄ）と同様である。
上記工程（ｅ）としては、工程（ｄ）における本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度（以下、「程度Ａ」とも表示する。）が、被検化合物の非存在下における本発明の基質化合物等のメチル化レベルの上昇の程度（以下、「程度Ｂ」とも表示する。）と比較して、少ない被検化合物を選択する工程である限り特に制限されない。このような被検化合物は、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物と評価することができる。程度Ａが、程度Ｂと比較して少ない程度としては、特に制限されないが、被検化合物の濃度が１０μＭであるときの程度Ａが程度Ｂに対して、割合として、８０％以下、好適には７０％以下、より好適には６０％以下、さらに好適には５０％以下、より好適には４０％以下、さらに好適には３０％以下、より好適には２０％以下、さらに好適には１０％以下であることを好ましく例示することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
［本発明の基質化合物のメチル化による、ペプチダーゼに対する感受性の低下１］
本発明の基質化合物がメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が実際に低下するかどうかを確認するために、本発明の基質化合物とペプチダーゼの混合アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）及び１μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ溶液に、蒸留水を添加して２０μＬになるように調整した。その溶液に３０μＬのペプチダーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ トリプシン、又は、２０ｍＡＵ／ｍＬ リシルエンドペプチダーゼ）を添加して混合した後、３７℃で１５分インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。この波長は、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡのＬｙｓとＭＣＡの間のアミド結合が切断されて遊離したＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を検出する波長である。また、前述の方法において、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡに代えて、モノメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（すなわち、「ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡ」）、ジメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（すなわち、「ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡ」）、又は、トリメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（すなわち、「ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡ」）を用いたこと以外は同じ方法にて混合アッセイを行い、ＡＭＣの蛍光強度を同様に測定した。
これらの混合アッセイにおける蛍光強度の測定結果を図７に示す。図７の左パネルは、トリプシンに対する感受性（トリプシンとの反応性）を示した結果であり、右パネルは、リシルエンドペプチダーゼに対する感受性（リシルエンドペプチダーゼとの反応性）を示した結果である。図７の結果から分かるように、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡは、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼのいずれを添加した場合であっても、ペプチダーゼ濃度依存的にＡＭＣの蛍光強度が増加した。それに対して、３種のメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡは、いずれのペプチダーゼを添加した場合であっても、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを用いた場合と比較して、ＡＭＣの蛍光強度が著しく弱かった。例えば、１０００μＭのＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ（ただしｎ＝０，１，２，又は３）とトリプシンを用いた場合、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを用いたときの蛍光強度を１００％としたときのＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡ、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡ、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡの蛍光強度は順に、僅か２．７％、０．１２％、０．２４％であり、１０００μＭのＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ（ただしｎ＝０，１，２，又は３）とリシルエンドペプチダーゼを用いた場合、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを用いたときの蛍光強度を１００％としたときのＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡ、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡ、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡの蛍光強度は順に、僅か０．０９６％、０．０５３％、０．２５％であった。
以上の結果から、本発明の基質化合物に含まれるＢｏｃＬｙｓＭＣＡは、そのリシン残基（のεアミノ基）がメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が著しく低下することが示された。
［本発明の基質化合物とペプチダーゼとの反応への、トリプシン阻害剤の影響］
次に、実施例１の混合アッセイで得られた、ＡＭＣの蛍光強度が、ペプチダーゼ活性に依存したものであるかを確認するために、混合アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、１μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ溶液、及び、５μＬのトリプシン阻害剤（trypsin inhibitor）溶液に、蒸留水を添加して２０μＬになるように調整した。その溶液に３０μＬのペプチダーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ トリプシン、又は、２０ｍＡＵ／ｍＬ リシルエンドペプチダーゼ）を添加して混合した後、３７℃で１５分インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。
これらの混合アッセイにおける蛍光強度の測定結果を図８に示す。図８の結果から分かるように、トリプシン阻害剤を添加すると、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼのいずれについても、トリプシン阻害剤濃度が一定以上になると、ＡＭＣの蛍光強度が著しく低下した。
以上の結果から、実施例１の混合アッセイで得られた、ＡＭＣの蛍光強度は、ペプチダーゼ活性に依存したものであることが確認された。
［本発明の基質化合物とペプチダーゼとの反応性の確認］
実施例１の混合アッセイにおける、本発明の基質化合物とペプチダーゼとの反応の詳細を分析するために、ＬＣ／ＭＳによる解析を行った。具体的には、以下のような方法で行った。
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）及び１μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ溶液に、蒸留水を添加して２０μＬになるように調整した。その溶液に３０μＬのペプチダーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ トリプシン、又は、２０ｍＡＵ／ｍＬ リシルエンドペプチダーゼ）を添加して混合した後、３７℃で１５分インキュベートした。次いで、その溶液を液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）にアプライして解析を行った。また、前述の解析において、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡに代えて、モノメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（すなわち、「ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡ」）、ジメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（すなわち、「ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡ」）、又は、トリメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（すなわち、「ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡ」）を用いたこと以外は同じ方法にて解析を行った。また、前述のペプチダーゼ溶液に代えて、同量の蒸留水を用いたこと以外は同じ方法でも解析を行った。
この解析の結果、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡに対してペプチダーゼを用いなかった場合は、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡのピークが検出されたのに対し、トリプシンを用いた場合や、リシルエンドペプチダーゼを用いた場合は、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡのピークが消失し、代わりにＢｏｃＬｙｓのピークと、ＡＭＣのピークが検出された。これにより、ほとんどのＢｏｃＬｙｓＭＣＡが、トリプシンやリシルエンドペプチダーゼによって、ＢｏｃＬｙｓとＡＭＣに加水分解されていることが確認された。一方、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡにおけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されたＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡや、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡや、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡは、トリプシンやリシルエンドペプチダーゼで処理しても、分解産物のピークはほとんど検出されず、加水分解がほとんど生じていないことが示された。
［本発明の基質化合物を用いたヒストンメチル化酵素活性の測定］
本発明の基質化合物が、インビトロにおけるヒストンメチル化酵素活性の測定に実際に用い得るかどうかを調べるために、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを試みた。具体的には、以下のような方法で行った。
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、２μＬのＢＳＡ溶液（３０μｇ／ｍＬ）、及び、所定の濃度（終濃度０，０．０１５，０．０５，又は，０．１５μｇ／μＬ）のヒストンメチル化酵素（Ｇ９ａ）溶液に、蒸留水を添加して１６μＬになるように調整した。その後、室温で１時間インキュベートした。次いで、そこに２μＬのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（１０ｍＭ）及び２μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（終濃度０．００９ｍＭ，０．０３ｍＭ，又は，０．０９ｍＭ）を添加して混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。
このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにおける蛍光強度の測定結果を図９に示す。図９の結果から分かるように、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡが０．００９ｍＭ〜０．０９ｍＭの濃度域で、ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａの濃度依存的にＡＭＣの蛍光強度が低下した。すなわち、ＡＭＣの蛍光強度の低下の程度（ペプチダーゼであるトリプシンの切断活性の低下の程度）を指標として、ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａのメチル化活性を測定し得ることが示された。
次に、前述のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにおいて、メチル基供与体であるＳＡＭを各種濃度で用いた場合の蛍光強度の測定結果を図１０に示す。図１０の結果から分かるように、ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａを添加した場合（＋Ｇ９ａ）は、ＳＡＭ濃度の濃度依存的にＡＭＣの蛍光強度が低下したのに対し、Ｇ９ａを添加しなかった場合（−Ｇ９ａ）は、ＳＡＭ濃度の濃度によるＡＭＣの蛍光強度の変化は見られなかった。
以上の結果から、本発明の基質化合物が、インビトロにおけるヒストンメチル化酵素活性の測定に実際に用い得ること、しかも、その測定は非常に簡便でかつ高感度であることが示された。
［ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにおける反応の確認］
実施例４のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにおける反応の詳細を分析するために、ＬＣ／ＭＳによる解析を行った。具体的には、以下のような方法で行った。
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、２μＬのＢＳＡ溶液（３０μｇ／ｍＬ）、及び、所定の濃度（終濃度０．１５μｇ／μＬ）のヒストンメチル化酵素（Ｇ９ａ）溶液に、蒸留水を添加して１６μＬになるように調整した。その後、室温で１時間インキュベートした。次いで、そこに２μＬのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（１０ｍＭ）及び２μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（終濃度０．０９ｍＭ）を添加して混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）又はリシルエンドペプチダーゼ溶液（２０ｍＡＵ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液を液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）にアプライして解析を行った（＋ＳＡＭ／＋Ｇ９ａ）。また、前述の解析において、ＳＡＭ溶液に代えて蒸留水を用いた解析（−ＳＡＭ／＋Ｇ９ａ）、Ｇ９ａ溶液に代えて蒸留水を用いた解析（＋ＳＡＭ／−Ｇ９ａ）、ＳＡＭ溶液とＧ９ａ溶液に代えて蒸留水を用いた解析（−ＳＡＭ／−Ｇ９ａ）についても行った。さらに、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼのいずれも用いなかった場合の解析についても行った。
−ＳＡＭ／−Ｇ９ａの場合の解析結果を図１１の左パネルに示し、＋ＳＡＭ／−Ｇ９ａの場合の解析結果を図１１の右パネルに示し、−ＳＡＭ／＋Ｇ９ａの場合の解析結果を図１２の左パネルに示し、＋ＳＡＭ／＋Ｇ９ａの場合の解析結果を図１２の右パネルに示す。なお、図１１及び１２において、一番上のパネル（上パネル）は、ペプチダーゼを用いていない場合の解析結果を表し、中央のパネル（中央パネル）は、ペプチダーゼとしてトリプシンを用いた場合の解析結果を示し、一番下のパネル（下パネル）は、ペプチダーゼとしてリシルエンドペプチダーゼを用いた場合の解析結果を示す。図１１及び１２の結果から分かるように、ＳＡＭ又はＧ９ａのいずれかを欠いている場合（−ＳＡＭ／−Ｇ９ａ、＋ＳＡＭ／−Ｇ９ａ、−ＳＡＭ／＋Ｇ９ａ）、ペプチダーゼを添加しないときは、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡのピークが検出され、ペプチダーゼ（トリプシン又はリシルエンドペプチダーゼ）を添加したときは、ＢｏｃＬｙｓとＡＭＣのピークが検出された。一方、ＳＡＭ及びＧ９ａの両方を添加した場合（＋ＳＡＭ／＋Ｇ９ａ）、ペプチダーゼを添加しないときは、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡの他、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡや、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡのピークが検出され、ペプチダーゼを添加したときは、メチル化していないＢｏｃＬｙｓＭＣＡのピークのみが消失し、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡや、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡのピークが残存していた。
以上の結果から、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにおいて、発明者の想定通りの反応が生じていることが示された。すなわち、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡがメチル化すると、ペプチダーゼにより切断されないのに対し、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡはペプチダーゼにより切断されてＢｏｃＬｙｓとＡＭＣが生成することが示された。
［ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素の基質特異性の検討１］
本発明の基質化合物におけるＸが１個以上のアミノ酸残基（ペプチド）を示すペプチジル基質化合物（ペプチジルＭＣＡ）を利用したヒストンメチル化酵素活性測定アッセイによって、ヒストンメチル化酵素の基質特異性を調べることができるかどうかを確認するために、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
まず、図１３に示されているようなペプチジルＭＣＡを作製した。Ac-histone H3 (1-4)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１−４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＴＫ；配列番号１）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-histone H3 (5-9)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号５−９のアミノ酸残基からなるペプチド（ＱＴＡＲＫ；配列番号２）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-histone H3 (1-9)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１−９のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ；配列番号３）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-hisotne H3 (7-9/25-27)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号７−９又は２５−２７のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＫ）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-histone H3 (23-27)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号２３−２７のアミノ酸残基からなるペプチド（ＫＡＡＲＫ；配列番号４）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-histone H3 (19-27)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１９−２７のアミノ酸残基からなるペプチド（ＱＬＡＴＫＡＡＲＫ；配列番号５）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-p53 (369-372)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−Ｋがヒトのｐ５３のアミノ酸番号３６９−３７２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＫＳＫ；配列番号６）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物である。なお、Ｇ９ａは、ヒストンＨ３のアミノ酸番号９のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ９）やアミノ酸番号２７のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ２７）をメチル化サイトとしており、Ｓｅｔ９は、ヒストンＨ３のアミノ酸番号４のリシン残基（ヒストンＨ３Ｋ４）や、ｐ５３タンパク質のアミノ酸番号３７２のリシン残基（ｐ５３Ｋ３７２）をメチル化サイトとしている。
ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、４．５μＬのＧＳＴ−ｍＧ９ａ（０，０．０２２−０．６６μｇ／μＬ）、及び、１．１μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、２μＬのＳＡＭ（１０ｍＭ）及び２μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（０．６ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＧＳＴ−ｍＧ９ａの終濃度は、０，０．００５，０．０１５，０．０５，又は，０．１５μｇ／μＬであった。このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１４の左パネルに示す。図１４の左パネルの結果から分かるように、Ac-histone H3 (1-4)-MCAやAc-p53 (369-372)-MCAを用いた場合は、メチル化がほとんど生じなかったが、Ac-histone H3 (5-9)-MCA、Ac-histone H3 (1-9)-MCA、Ac-hisotne H3 (7-9/25-27)-MCA、Ac-histone H3 (23-27)-MCA、Ac-histone H3 (19-27)-MCAを用いた場合は、メチル化が生じているものが多いことが示された。
一方、ヒストンメチル化酵素としてＳｅｔ９を用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、２μＬのＢＳＡ溶液（３０μｇ／ｍＬ）、３μＬのＨｉｓ−Ｓｅｔ９（０，０．３３−１０μｇ／μＬ）、及び、１μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、２μＬのＳＡＭ（１０ｍＭ）及び２μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（０．６ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＨｉｓ−Ｓｅｔ９の終濃度は、０，０．０５，０．１５，０．５，又は，１．５μｇ／μＬであった。このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１４の右パネルに示す。図１４の右パネルの結果から分かるように、Ac-histone H3 (5-9)-MCA、Ac-histone H3 (1-9)-MCA、Ac-hisotne H3 (7-9/25-27)-MCA、Ac-histone H3 (23-27)-MCA、Ac-histone H3 (19-27)-MCAを用いた場合は、メチル化がほとんど生じなかったが、Ac-histone H3 (1-4)-MCAやAc-p53 (369-372)-MCAを用いた場合は、メチル化が生じているものが多いことが示された。
図１４の左パネル及び右パネル結果から、ペプチジルＭＣＡにおけるＭＣＡとアミド結合しているＫがヒストンメチル化酵素のメチル化サイトである場合は、そのＫにおいてメチル化が多く生じたのに対し、そのＫがヒストンメチル化酵素のメチル化サイトでない場合は、そのＫにおいてメチル化がほとんど生じなかったことが示された。すなわち、リシン残基（Ｋ）のＮ末端側にペプチドを付加したペプチジルＭＣＡを用いて、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行うことにより、そのヒストンメチル化酵素の基質特異性を評価し得ることが示された。
［ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素の基質特異性の検討２］
これまでに、核内受容体の一つであるエストロゲン受容体α（estrogen receptor α；ＥＲα）のアミノ酸番号３０２のリシン残基（Ｋ３０２）がＳｅｔ９によりメチル化されることが報告されている (Molecular Cell. 30. 336-347. 2008)。そこで、ＥＲαのＫ３０２付近の配列や、該配列と相同性を有する他の核内受容体（アンドロゲン受容体やグルココルチコイド受容体）由来の配列を用いて、Ｓｅｔ９の基質特異性を評価するために、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
まず、図１５に示されるようなペプチジルＭＣＡを作製した。Ac-ERα(299-302)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのＥＲαのアミノ酸番号２９９−３０２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＫＲＳＫ；配列番号８）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-ERα(297-302)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのERαのアミノ酸番号２９７−３０２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＭＩＫＲＳＫ；配列番号９）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-AR(630-633)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−Ｋがヒトのアンドロゲン受容体（androgen receptor；ＡＲ）のアミノ酸番号６３０−６３３のアミノ酸残基からなるペプチド（ＲＫＬＫ；配列番号１０）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-AR(628-633)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのＡＲのアミノ酸番号６２８−６３３のアミノ酸残基からなるペプチド（ＧＡＲＫＬＫ；配列番号１１）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-GR(491-494)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−Ｋがヒトのグルココルチコイド受容体（glucocorticoid receptor；ＧＲ）のアミノ酸番号４９１−４９４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＲＫＴＫ；配列番号１２）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-GR(489-494)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−ＫがヒトのＧＲのアミノ酸番号４８９−４９４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＥＡＲＫＴＫ；配列番号１３）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-p53(369-372)-MCAは前述のとおりであり、Ac-p53(367-372)-MCAは、一般式（Ｉ）における保護基（Ｒ１）がアセチル基であって、Ｘ−Ｋがヒトのｐ５３のアミノ酸番号３６７−３７２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＳＨＬＫＳＫ；配列番号７）であって、色素標識（Ｒ２）がＭＣＡである基質化合物であり、Ac-histone H3 (1-9)-MCAは前述のとおりである。
ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、３．６μＬのＧＳＴ−ｍＧ９ａ（０，０．０２８，０．０８３，０．２８，０．８３μｇ／μＬ）、及び、４μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（２０ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＧＳＴ−ｍＧ９ａの終濃度は、０，０．００５，０．０１５，０．０５，又は，０．１５μｇ／μＬであった。このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１６の左パネルに示す。
ヒストンメチル化酵素としてＳｅｔ９を用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、５．９μＬのＨｉｓ−Ｓｅｔ９（０，０．０５１，０．１７，０．５１，１．７μｇ／μＬ）、及び、１．７μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（２０ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＨｉｓ−Ｓｅｔ９の終濃度は、０，０．０１５，０．０５，０．１５，又は，０．５μｇ／μＬであった。このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１６の右パネルに示す。
図１６の右パネルの結果から分かるように、Ｓｅｔ９との反応性が高い順に、Ac-ERα(299-302)-MCA、Ac-ERα(297-302)-MCA、Ac-p53 (369-372)-MCA、Ac-GR (491-494)-MCA、Ac-p53 (367-372)-MCA又はAc-AR (628-633)-MCA、Ac-AR (630-633)-MCA又はAc-GR (489-494)-MCAの順であった。一方、図１６の左パネルの結果から分かるように、Ac-histone H3 (1-9)-MCAとは異なり、ｐ５３や核内受容体由来のペプチジルＭＣＡは、Ｇ９ａとは反応しなかった。これらのことから、ＥＲα由来のペプチジルＭＣＡは、Ｓｅｔ９に対する特異性が非常に高く、Ｓｅｔ９の活性評価に非常に適していることが示された。また、Ｓｅｔ９がメチル化することが知られているＥＲαのＫ３０２を含むペプチジルＭＣＡは、Ｓｅｔ９と特に高い反応性を示したことから（図１６の右パネル）、本発明のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイが極めて高感度であることも示された。
［ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤の活性評価１］
ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにより、ヒストンメチル化酵素活性阻害剤の活性を評価し得るかどうかを調べるために、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを試みることとした。ただし、このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイに先立ち、ヒストンメチル化酵素活性阻害剤であるグリオトキシンの活性をウエスタンブロットにより評価した。グリオトキシンは、Ｓｅｔ９のメチル化活性は阻害しないが、Ｇ９ａのメチル化活性を阻害することが知られている。ウエスタンブロットの結果を図１７に示す。グリオトキシンは、その知られている性質のとおり、Ｓｅｔ９のメチル化は阻害しなかったものの、Ｇ９ａのメチル化を阻害した（図１７）。このウエスタンブロットと同様の結果がヒストンメチル化酵素活性測定アッセイでも得られるかどうかを調べるために、以下のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行った。
ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、２μＬのＧＳＴ−ｍＧ９ａ（０，０．５μｇ／μＬ）、１μＬのグリオトキシン（各種濃度）、及び、２．６μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、２μＬのＳＡＭ（１０ｍＭ）及び２μＬのペプチジルＭＣＡ（Ac-histone H3 (1-9)-MCA）溶液（０．６ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＧＳＴ−ｍＧ９ａの終濃度は、０．０５μｇ／μＬであった。このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１８の中央のパネルに示す。図１８の中央のパネルの結果から分かるように、グリオトキシンがメチル化を阻害するＧ９ａを用いた場合は、グリオトキシンの濃度が上昇するにつれて、ＡＭＣの蛍光強度（すなわち、ペプチジルＭＣＡのメチル化阻害の程度）が上昇した。
一方、ヒストンメチル化酵素としてＳｅｔ９を用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、４．５μＬのＨｉｓ−Ｓｅｔ９（０，２．２５μｇ／μＬ）、１μＬのグリオトキシン（各種濃度）、及び、０．１μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、２μＬのＳＡＭ（１０ｍＭ）及び２μＬのペプチジルＭＣＡ（Ac-p53 (369-372)-MCA）溶液（０．６ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＨｉｓ−Ｓｅｔ９の終濃度は、０．５μｇ／μＬであった。このヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１８の左パネルに示す。図１８の左パネルの結果から分かるように、グリオトキシンがメチル化を阻害しないＳｅｔ９を用いた場合は、ペプチジルＭＣＡのメチル化が依然として生じており、グリオトキシンの濃度を変化させてもＡＭＣの蛍光強度（すなわち、ペプチジルＭＣＡのメチル化阻害の程度）に変化はなかった。
図１８の左パネル及び中央パネルの結果から、グリオトキシンによるメチル化阻害率（％）を算出した。すなわち、「“ペプチダーゼ、グリオトキシンのいずれも添加したときのＡＭＣの蛍光強度”から“ペプチダーゼは添加したがグリオトキシンは添加しなかったときのＡＭＣの蛍光強度”を引いた値」を、「“ペプチダーゼ、グリオトキシンのいずれも添加しなかったときのＡＭＣの蛍光強度”から“ペプチダーゼは添加したがグリオトキシンは添加しなかったときのＡＭＣの蛍光強度”を引いた値」で割って１００をかけた値（％）を算出した。グリオトキシンによるメチル化阻害率（％）を図１８の右パネルに示す。この結果から、グリオトキシンのＧ９ａに対するＩＣ５０は２．８μＭであり、Ｓｅｔ９に対するＩＣ５０は少なくとも１００μＭより高いことが示された。図１８のこれらの結果は、図１７のウエスタンブロットの結果と同様であり、グリオトキシンはＳｅｔ９のメチル化活性を阻害しないのに対し、Ｇ９ａのメチル化活性を特異的に阻害することを示している。
［ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤の活性評価２］
ヒストンメチル化酵素阻害剤が低分子の場合であっても、ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素活性測定アッセイにより、ヒストンメチル化酵素活性阻害剤の活性を評価し得るかどうかを調べるために、以下のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを試みることとした。
具体的には、上記実施例８において、ペプチダーゼとしてＧ９ａを用いた方法において、グリオトキシンに代えてＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（S-Adenosyl-L-homocysteine：ＳＡＨ）を用いたこと以外は同様の方法にて、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行った。なお、ＳＡＨは、メチル化反応の副生成物であって、ヒストンメチル化酵素をネガティブフィードバック的に阻害することが知られている。前述のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイの結果を図１９に示す。図１９の左パネルの結果から分かるように、ＳＡＨの濃度が上昇するにつれて、ＡＭＣの蛍光強度（すなわち、ペプチジルＭＣＡのメチル化阻害の程度）が上昇した。図１９の左パネルの結果から、ＳＡＨによるメチル化阻害率（％）を算出した。その結果を図１９の右パネルに示す。この結果から、ＳＡＨのＧ９ａに対するＩＣ５０は０．４９ｍＭであることが示された。これにより、本発明のヒストンメチル化酵素活性測定アッセイは、低分子化合物の阻害活性をも高感度に評価し得ることが実証された。
［ＭＣＡを含む本発明の基質化合物と、ＡＭＣの蛍光スペクトル］
より高感度な測定アッセイ系を構築するために、本発明の基質化合物（ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ）、ＡＭＣの蛍光スペクトルの解析を試みた。具体的には、以下のような方法で行った。
１μＬのＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡ（２ｍＭ）と、４９μＬの蒸留水とを混合して、混合液を調製した。また、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡに代えて、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡ、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡ、又は、ＡＭＣを用いて、同様に混合液を調製した。各混合液について、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した結果を図２０に示す。図２０から分かるように、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡの極大吸収波長は３２０ｎｍであり、その吸収波長領域に３３０ｎｍは含まれるが、３９０ｎｍは含まれなかった。また、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡの極大蛍光波長は３９５ｎｍであり、その蛍光波長領域に３８０ｎｍが含まれた。一方、ＡＭＣの極大吸収波長は３４０ｎｍであり、その吸収波長領域には３３０ｎｍが含まれ、また、吸収の程度は低いものの３９０ｎｍも含まれた。また、ＡＭＣの極大蛍光波長は４５０ｎｍであり、その蛍光波長領域には４６０ｎｍが含まれ、３８０ｎｍ以下の波長がほとんど含まれなかった。これらの結果から、３３０ｎｍの光を照射した場合、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡと同時にＡＭＣの励起も不可避であるが、ＡＭＣの蛍光波長が含まれない３８０ｎｍで蛍光を捉えれば、ＡＭＣの蛍光を検出することなく、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡの蛍光のみを検出できることが示された。また、図２０の結果から、３９０ｎｍの光を照射した場合、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡはその波長を吸収波長に含まないため励起されず、蛍光を発しないが、ＡＭＣはその波長を吸収波長に含むため励起されて蛍光を発し、その結果、ＡＭＣの所望の蛍光波長（例えば４６０ｎｍ）でＡＭＣのみを検出できることが示された。
なお、この図２０から吸収スペクトルの波形を除き、また、励起波長が３３０ｎｍの場合と３９０ｎｍの場合で分けた図を図２１に示す。すなわち、前述の各混合液について、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３５０−５５０ｎｍで蛍光強度を測定した結果を図２１の上パネルに示し、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４２０−６００ｎｍで蛍光強度を測定した結果を図２１の下パネルに示す。３３０ｎｍの光を照射した場合、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡと同時にＡＭＣの励起も不可避であるが、ＡＭＣの蛍光波長が含まれない３８０ｎｍで蛍光を捉えれば、ＡＭＣの蛍光を検出することなく、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡの蛍光のみを検出できることが、図２１上パネルからも理解できる。また、３９０ｎｍの光を照射した場合、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡはその波長を吸収波長に含まないため励起されず、蛍光を発しないが、ＡＭＣはその波長を吸収波長に含むため励起されて蛍光を発し、その結果、ＡＭＣの所望の蛍光波長（例えば４６０ｎｍ）でＡＭＣのみを検出できることが、図２１の下パネルからも理解できる。
［本発明の基質化合物のメチル化による、ペプチダーゼに対する感受性の低下 ２］
本発明の基質化合物がメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が実際に低下することは、前述の実施例１における本発明の基質化合物とペプチダーゼの混合アッセイで示されたとおりである。かかる混合アッセイでは、メチル化されていない基質化合物から分離したＡＭＣの蛍光強度の低下量を指標として、ヒストンメチル化酵素を測定した。そこで、かかる測定が、メチル化された基質化合物におけるＭＣＡの蛍光強度の増加量を指標としても可能であるかを調べるために、混合アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）及び１μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ溶液に、蒸留水を添加して２０μＬになるように調整した。その溶液に３０μＬのペプチダーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ トリプシン）を添加して混合した後、３７℃で１５分インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定した。この波長は、前述の実施例１０で示したように、ＡＭＣの蛍光を検出することなく、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡの蛍光のみを検出する波長である。また、前述の方法において、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡに代えて、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ＭＣＡ、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）２ＭＣＡ、又は、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）３ＭＣＡを用いたこと以外は同じ方法にて混合アッセイを行い、ＭＣＡ基の蛍光強度を同様に測定した。また、ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡを全く添加しなかったものについても、蛍光強度を測定した。これらの結果を図２２の右パネルに示す。なお、比較のために、前述の実施例１にて、同様の溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した結果（図７の左パネル）を図２２の左パネルに示す。
ＢｏｃＬｙｓＭＣＡはトリプシンにより切断されてＢｏｃＬｙｓとＡＭＣが生成するため（図６）、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡの濃度依存的に遊離したＡＭＣの蛍光強度は増加した（図２２左パネル）。一方、メチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（ＢｏｃＬｙｓ（Ｍｅ）ｎＭＣＡ）はトリプシンによる切断は生じないため（図６）、ＡＭＣの蛍光強度は増加せず（図２２左パネル）、残存するメチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡの蛍光強度が、その濃度依存的に増加した（図２２右パネル）。そして、図２２右パネルから分かるように、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで蛍光強度を測定することにより、メチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを高感度に測定することができた。
また、前述の混合アッセイにおけるペプチダーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ トリプシン）に代えて、ペプチダーゼ溶液（２０ｍＡＵ／ｍＬ リシルエンドペプチダーゼ）を用いた混合アッセイにおいて、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍにて、各溶液のＭＣＡの蛍光強度を測定した。その結果を図２３の右パネルに示す。なお、比較のために、前述の実施例１にて、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍにて、各溶液のＡＭＣの蛍光強度を測定した結果（図７の右パネル）を図２３の左パネルに示す。
図２２右パネルの場合と同様に、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで蛍光強度を測定することにより、メチル化ＢｏｃＬｙｓＭＣＡを高感度に測定することができた（図２３右パネル）。すなわち、本発明の基質化合物のメチル化による、ペプチダーゼに対する感受性の低下が、ＡＭＣの蛍光強度の低下量ではなく、メチル化ペプチジルＭＣＡにおけるＭＣＡの蛍光強度の増加量を指標として、高感度で行えることが示された。
［蛍光波長の違いを利用したＢｏｃＬｙｓＭＣＡとＡＭＣの検出］
励起波長と蛍光波長を調整することにより、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡのみ、あるいはＡＭＣのみを検出し得ることは、前述の実施例１０で示したとおりである。そこで、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡとＡＭＣの混合液の場合であっても、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡのみ、あるいはＡＭＣのみを検出できるかを調べるために、蛍光測定アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
２μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（２ｍＭ）と４８μＬの蒸留水を混合して、５０μＬの溶液（ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ ４０μＭ）を調製した。また、１μＬのＢｏｃＬｙｓＭＣＡ（２ｍＭ）と、１μＬのＡＭＣ（２ｍＭ）と、４８μＬの蒸留水を混合して、５０μＬの溶液（ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ ２０μＭ＋ＡＭＣ ２０μＭ）を調製した。また、２μＬのＡＭＣ（２ｍＭ）と４８μＬの蒸留水を混合して、５０μＬの溶液（４０μＭ）を調製した（ＡＭＣ ４０μＭ）。
これら３種類の溶液の蛍光強度を、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３５０−５５０ｎｍで測定した結果を図２４の左パネルに示し、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４２０−６００ｎｍで測定した結果を図２４の右パネルに示す。図２４の結果から分かるように、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡとＡＭＣの混合液であっても、それぞれの固有の励起波長、蛍光波長、すなわち、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡの場合は励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ、ＡＭＣの場合は励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定することで、ＢｏｃＬｙｓＭＣＡ又はＡＭＣの濃度をそれぞれ定量的に測定できることが示された。
［ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素の基質特異性の検討４］
ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素の基質特異性の評価が、ＡＭＣの蛍光強度の低下量ではなく、ペプチジルＭＣＡにおけるＭＣＡの蛍光強度の増加量を指標としても行えるかどうかを調べるために、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、４μＬのＧＳＴ−ｍＧ９ａ（０，０．０２５−０．７５μｇ／μＬ）、及び、３．６μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（終濃度１ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間、インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ、又は、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＧＳＴ−ｍＧ９ａの終濃度は、０，０．００５，０．０１５，０．０５，又は，０．１５μｇ／μＬであった。
また、ヒストンメチル化酵素としてＳｅｔ７／９を用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、４μＬのＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９（０，０．０２５−０．７５μｇ／μＬ）、及び、３．６μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（終濃度０．１ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間、インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ、又は、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９の終濃度は、０，０．００５，０．０１５，０．０５，又は，０．１５μｇ／μＬであった。
ペプチジルＭＣＡとして、Ac-histone H3 (1-9)-MCAを用い、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定した結果を図２５の右パネルに示し、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した結果を図２５の左パネルに示す。また、ペプチジルＭＣＡとして、Ac-ERα(299-302)-MCAを用い、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定した結果を図２６の右パネルに示し、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した結果を図２６の左パネルに示す。なお、図２５及び２６の各パネルにおける色の薄い棒グラフは、ＧＳＴ−ｍＧ９ａを用いた場合の結果を表し、色の濃い棒グラフは、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９を用いた場合の結果を表す。
ＧＳＴ−ｍＧ９ａはAc-histone H3 (1-9)-MCAをメチル化するため、トリプシン添加後に遊離するＡＭＣ量（ＡＭＣの蛍光強度）はＧＳＴ−ｍＧ９ａの濃度依存的に減少し（図２５左パネル）、残存するメチル化ペプチジルＭＣＡの蛍光強度は増加した（図２５右パネル）。一方、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９はAc-histone H3 (1-9)-MCAをメチル化しないため、トリプシン添加後に遊離するＡＭＣ量（ＡＭＣの蛍光強度）はほとんど変化せず（図２５左パネル）、また、ペプチジルＭＣＡの蛍光強度もほとんど変化しなかった（図２５右パネル）。
また、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９はAc-ERa(299-302)-MCAをメチル化するため、トリプシン添加後に遊離するＡＭＣ量（ＡＭＣの蛍光強度）はＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９の濃度依存的に減少し（図２６左パネル）、残存するメチル化ペプチジルＭＣＡの蛍光強度は増加した（図２６右パネル）。一方、ＧＳＴ−ｍＧ９ａはAc- ERa(299-302) -MCAをメチル化しないため、トリプシン添加後に遊離するＡＭＣ量（ＡＭＣの蛍光強度）はほとんど変化せず（図２６左パネル）、また、ペプチジルＭＣＡの蛍光強度もほとんど変化しなかった（図２６右パネル）。
そして図２５及び２６の結果から分かるように、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで蛍光強度を測定することにより、ペプチジルＭＣＡを高感度に測定することができた。すなわち、ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素の基質特異性の評価が、ＡＭＣの蛍光強度の低下量ではなく、ペプチジルＭＣＡにおけるＭＣＡの蛍光強度の増加量を指標として、高感度で行えることが示された。
［ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤の活性評価３］
ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤の活性の評価が、ＡＭＣの蛍光強度の低下量ではなく、ペプチジルＭＣＡにおけるＭＣＡの蛍光強度の増加量を指標としても行えるかどうかを調べるために、ヒストンメチル化酵素活性測定アッセイを行った。具体的には、以下のような方法で行った。
ヒストンメチル化酵素としてＧ９ａを用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、４μＬのＧＳＴ−ｍＧ９ａ（０，０．２５μｇ／μＬ）、１μＬのグリオトキシン（各種濃度）、及び、２．６μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（２０ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ（Ac-histone H3 (1-9)-MCA）溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ、又は、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＧＳＴ−ｍＧ９ａの終濃度は、０μｇ／μＬ又は０．０５μｇ／μＬであった。
その溶液を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定した結果を図２７の右パネルに示し、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した結果を図２７の左パネルに示す。トリプシン添加後に遊離するＡＭＣ量（ＡＭＣの蛍光強度）は、グリオトキシンの濃度を上昇させると、増加し（図２７左パネル）、残存するメチル化ペプチジルＭＣＡの蛍光強度は増加した（図２７右パネル）。このことから、グリオトキシンがＧ９ａのメチル化を阻害することが確認できた。また、図２７右パネルの結果から、グリオトキシンのＧ９ａに対するＩＣ５０を算出したところ、２．８μＭであった。この値は、図２７左パネルの結果から算出したそのＩＣ５０の値（１．８μＭ）とほぼ同じ値であった。
また、ヒストンメチル化酵素としてＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９を用いた場合は、以下のような方法を用いた。１０μＬの２×ＨＭＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、４μＬのＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９（０，０．２５μｇ／μＬ）、１μＬのグリオトキシン（各種濃度）、及び、２．６μＬの蒸留水を混合した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（２ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ（Ac-ERα(299-302)-MCA）溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ、又は、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。なお、蛍光強度の測定時におけるＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９の終濃度は、０μｇ／μＬ又は０．０５μｇ／μＬであった。
その溶液を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定した結果を図２８の右パネルに示し、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定した結果を図２８の左パネルに示す。グリオトキシンはＧ９ａのメチル化を阻害しないため、トリプシン添加後に遊離するＡＭＣ量（ＡＭＣの蛍光強度）は、グリオトキシンの濃度を上昇させてもあまり変化せず（図２８左パネル）、残存するメチル化ペプチジルＭＣＡの蛍光強度もあまり変化しなかった（図２８右パネル）。このことから、グリオトキシンがＧ９ａのメチル化を阻害しないことが確認できた。また、図２８右パネルの結果から、グリオトキシンのＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９に対するＩＣ５０を算出したところ、１００μＭより高いことが示された。この値は、図２７左パネルの結果から算出したそのＩＣ５０の値（＞１００μＭ）と同じであった。
図２７や図２８の結果から分かるように、ペプチジルＭＣＡを用いたヒストンメチル化酵素阻害剤の活性の評価が、ＡＭＣの蛍光強度の低下量ではなく、ペプチジルＭＣＡにおけるＭＣＡの蛍光強度の増加量を指標としても、高感度で行えることが示された。
（本発明のまとめ）
本発明の基質化合物等としてペプチジルＭＣＡを用い、ペプチダーゼとしてトリプシンを用いた場合を例に、本発明のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法の好適な態様をまとめた内容を図２９に示す。ヒストンメチル化酵素を含む試料を、ペプチジルＭＣＡに接触させると、通常は一部のペプチジルＭＣＡのリシンがメチル化され、反応液中にメチル化ペプチジルＭＣＡと、非メチル化ペプチジルＭＣＡが共存した状態となる。この反応液に大過剰量のトリプシンを添加する。トリプシンは、「メチル化ペプチジルＭＣＡ」に対しては作用できないので、「メチル化ペプチジルＭＣＡ」は反応液に残存する。但し、厳密に言えば、「メチル化ペプチジルＭＣＡ」のペプチド部分にトリプシンの切断部位が含まれている場合は、その切断部位で切断された分子も併存しているが、本願明細書においては便宜上、そのような分子も「メチル化ペプチジルＭＣＡ」というように特に区別せずに表示する。
一方、トリプシンは、「非メチル化ペプチジルＭＣＡ」に対しては作用でき、「ＡＭＣ」と「非メチル化ペプチド」を生成させる。非メチル化ペプチドのペプチド部分にトリプシンの切断部位が含まれている場合は、その切断部位で切断された分子も併存することになる。なお、トリプシンを十分作用させた反応液中に、「非メチル化ペプチジルＭＣＡ」が残存していないことは、前述の実施例５（図１１及び１２）に示した通りである。そこで、反応液中に共存する「非メチル化ペプチジルＭＣＡ」と「ＡＭＣ」のいずれかを選択的に定量し、「メチル化ペプチジルＭＣＡ」のＭＣＡ基の蛍光強度の増加量、又は、「ＡＭＣ」の蛍光強度の低下量から、ペプチジルＭＣＡのメチル化レベルの上昇の程度を算出し、その上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価することができる。
本発明は、ヒストンメチル化酵素活性の測定に関する分野や、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニングに関する分野において好適に利用することができる。この他にも、本発明を利用することにより、特定のヒストンメチル化酵素の基質特異性を調べたり、特定のペプチドに特異的なヒストンメチル化酵素を調べたりすることもできる。また、本発明によりスクリーニングしたヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物は、がんや神経変性疾患といった疾患への治療薬や、ｉＰＳ細胞を用いた再生医療への応用が強く期待されている。

Claims (9)

  1. 次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含むことを特徴とする、試料中のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法；
    （ａ）以下の一般式（Ｉ）
    （一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、Ｒ ２ は、４−メチルクマリル−７−アミド基、２−アミノナフタレン−６−スルホン酸基、４−クロロメチルクマリル−７−アミド基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミド基、２−アミノ−７−メチルプリン−６−チオール基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ｐ−ニトロアニリド基及びβ−アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
    前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する基質化合物又はその塩を準備する工程;
    （ｂ）前記一般式（Ｉ）で表される基質化合物又はその塩と試料とを、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程；
    （ｃ）工程（ｂ）の後、前記基質化合物又はその塩にペプチダーゼを作用させる工程；
    （ｄ）工程（ｃ）の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物又はその塩を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程；及び、
    （ｅ）工程（ｄ）におけるメチル化レベルの上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価する工程。
  2. 工程（ｄ）における前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度の測定が、
    前記基質化合物又はその塩におけるアミド結合がペプチダーゼによって切断されて、蛍光特性又は発色特性が変化した色素標識を測定することによりなされるか；又は
    前記基質化合物又はその塩におけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されて、アミド結合がペプチダーゼによって切断されなかった色素標識を測定することによりなされる；
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含むことを特徴とする、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法；
    （ａ）以下の一般式（Ｉ）
    （一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、Ｒ ２ は、４−メチルクマリル−７−アミド基、２−アミノナフタレン−６−スルホン酸基、４−クロロメチルクマリル−７−アミド基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミド基、２−アミノ−７−メチルプリン−６−チオール基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ｐ−ニトロアニリド基及びβ−アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
    前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する基質化合物又はその塩を準備する工程;
    （ｂ）前記一般式（Ｉ）で表される基質化合物又はその塩と、ヒストンメチル化酵素とを、被検化合物の存在下、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程；
    （ｃ）工程（ｂ）の後、前記基質化合物又はその塩にペプチダーゼを作用させる工程；
    （ｄ）工程（ｃ）の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物又はその塩を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程；及び、
    （ｅ）工程（ｄ）における基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度が、被検化合物の非存在下における基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度と比較して、少ない被検化合物を選択する工程。
  4. ペプチダーゼが、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、及び、トリプシンからなる群から選択される少なくとも１種のペプチダーゼである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 以下の一般式（Ｉ）
    （一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、Ｒ ２ は、４−メチルクマリル−７−アミド基、２−アミノナフタレン−６−スルホン酸基、４−クロロメチルクマリル−７−アミド基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミド基、２−アミノ−７−メチルプリン−６−チオール基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ｐ−ニトロアニリド基及びβ−アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
    前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩。
  6. ヒストンメチル化酵素が、Ｘ−Ｋからなるペプチドの配列に応じた基質特異性を有するヒストンメチル化酵素であり、基質化合物又はその塩におけるＸ−Ｋからなるペプチドの配列が、該ヒストンメチル化酵素に対して基質特異性を示す配列であることを特徴とする請求項５に記載の基質化合物又はその塩。
  7. 以下の（ａ）及び（ｂ）の要素を含む、ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キット；
    （ａ）以下の一般式（Ｉ）
    （一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Ｘは０又は１個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Ｋはリシン残基を示し、Ｒ２はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、Ｒ ２ は、４−メチルクマリル−７−アミド基、２−アミノナフタレン−６−スルホン酸基、４−クロロメチルクマリル−７−アミド基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミド基、２−アミノ−７−メチルプリン−６−チオール基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ｐ−ニトロアニリド基及びβ−アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。）で表される基質化合物又はその塩であって、
    前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩；及び、
    （ｂ）前記一般式（Ｉ）で表される基質化合物又はその塩を切断するペプチダーゼであって、該ペプチダーゼは基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇に伴って切断活性が低下するペプチダーゼ。
  8. ペプチダーゼが、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、及び、トリプシンからなる群から選択される少なくとも１種のペプチダーゼである請求項７に記載の試薬キット。
  9. 請求項７又は８に記載の試薬キットと、ヒストンメチル化酵素とを含む、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キット。
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CN103183725B (zh) * 2011-12-27 2016-06-08 杭州景杰生物科技有限公司 一种蛋白质赖氨酸巴豆酰化修饰的检测及亲和试剂开发的方法
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US20160010059A1 (en) * 2013-03-06 2016-01-14 The Regents Of The University Of California EXPANSION OF HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS BY HISTONE METHYLTRANSFERASE G9a INHIBITION
US9175032B2 (en) 2013-03-15 2015-11-03 Epizyme, Inc. Methods of synthesizing substituted purine compounds
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2003221399A (ja) * 2001-11-22 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp 蛍光又は発色基質を用いたヒストンデアセチラーゼ活性測定法
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