JP4267043B2 - 脱アセチル化酵素の活性測定方法、並びにこれら酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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FR901228(藤沢製薬)
MS275(三井製薬)
しかしながら、これらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はCdk阻害タンパク質であるp21CIPの発現を誘導すること以外、制癌作用を発揮する詳細な機構は現在のところ明らかにされていない。
細胞増殖の阻害(Yoshida, M. et al., Bioassays Vol.17, 423-430, 1995(非特許文献6); Richon, V. M. et al. Proc. Natl.Acad. Sci. USA Vol.93, 5705-5708, 1996(非特許文献7); Richon, V. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.95 3003-3007, 1998(非特許文献8))、
最終分化の誘導(Yoshida, M., et al., Bioassays Vol.17, 423-430, 1995(非特許文献6); Richon, V. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.93, 5705-5708, 1996(非特許文献7))、
マウスモデルにおける腫瘍の増大を抑えること(Cohen, L. et al. Proc. AACR Vol.39, 108, abstr. 736, 1998(非特許文献9); Desai, D. et al., Proc. AACR Vol.40, 2396, abstr. 362, 1999(非特許文献10))、
急性前骨髄性白血病の治療に効果的であること(Fenrick, R. and Hiebert, S.W. J. Cell Biochem. (Suppl.) 30-31, 194-202, 1998(非特許文献5))
このようにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は新規抗癌剤として期待されており、更に抗菌物質しての可能性も考えられている。今後、さらに同様の作用を有する物質の探索の一つとしてヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤のスクリーニングが行われるものと考えられる。
以上のように、公知の測定方法は操作が煩雑なため、多くのサンプルの処理や、多様な条件下での実験が困難である。新薬開発などの大規模なスクリーニングを容易とするためには、放射性同位体を使わず且つ簡便な系が求められていた。
Taunton, J. et al., Science Vol.272, 408-411, 1996 Yoshida, M. et al., J. Biol. Chem. Vol.265, 17174-17179, 1990 Davie, J. R and Chadee, D. N. J. Cell Biochem. (Suppl.) 30-31, 203-213, 1998 Kouzarides, T. Curr. Opin. Genet. Dev. Vol.9, 40-84, 1999 Fenrick, R. and Hiebert, S. W. J. Cell Biochem. (Suppl.) 30-31, 194-202, 1998 Yoshida, M. et al., Bioassays Vol.17, 423-430, 1995 Richon, V. M. et al. Proc. Natl.Acad. Sci. USA Vol.93, 5705-5708, 1996 Richon, V. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.95 3003-3007, 1998 Cohen, L. et al. Proc. AACR Vol.39, 108, abstr. 736, 1998 Desai, D. et al., Proc. AACR Vol.40, 2396, abstr. 362, 1999 Laherty, C. D. et al Cell Vol.89, 349-356, 1997 Hassig, C. et al Cell Vol.89, 341-347, 1997 Hoffmann, K. et al., Nucleic Acids Res. Vol.27, 2057-2058, 1999
〔1〕ペプチドのアセチル化のレベルを判定する方法において、アセチル化のレベルの変化が、該ペプチドを基質とするペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検出されることを特徴とする方法。
〔2〕次の工程を含む脱アセチル化酵素活性、またはアセチル化酵素活性の測定方法。
(a)基質ペプチドと試料とを、脱アセチル化酵素による脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペプチドと試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応に必要な条件下で接触させる工程、
(b)〔1〕に記載の方法によって基質ペプチドのアセチル化レベルの変化を判定する工程
〔3〕脱アセチル化酵素が、リジン残基のεアミノ基に導入されたアセチル基に作用するものである〔2〕に記載の方法。
〔4〕脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル化酵素である〔3〕に記載の方法。
〔5〕ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、メタロエンドペプチダーゼ、およびナラタケ(Armillaria mellea)プロテアーゼからなる群から選択される少なくとも1種のペプチダーゼである〔1〕に記載の方法。
〔6〕基質ペプチドが、該ペプチドの切断によりシグナルレベルが変化する物質により標識されており、ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成する〔5〕に記載の方法。
〔7〕基質ペプチドが、色素標識されており、ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成する〔6〕に記載の方法。
〔8〕色素標識が蛍光物質標識であり、シグナルが蛍光シグナルである〔7〕に記載の方法。
〔9〕基質ペプチドがアセチル化したリジンを含む〔5〕に記載の方法。
〔10〕ペプチダーゼがリジルエンドペプチダーゼである〔9〕に記載の方法。
〔11〕次の要素を含む、アセチル化酵素活性または脱アセチル化酵素活性の測定用試薬キット。
(a)基質ペプチド
(b)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切断活性が変化するペプチダーゼ
〔12〕次の工程を含む脱アセチル化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法において、基質ペプチドのアセチル化レベルの変化が基質ペプチドのアセチル化に伴うペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検出されることを特徴とする方法。
(a)アセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化酵素とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必要な条件下で接触させる工程、
(b)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化を検出する工程、
(c)被検化合物の非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較して、基質の脱アセチル化のレベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程
〔13〕次の要素を含む、脱アセチル化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニングのための試薬キット。
(a)基質ペプチド
(b)脱アセチル化酵素
(c)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切断活性が変化するペプチダーゼ
〔14〕ペプチドのアセチル化レベルを変化させる酵素活性測定用のペプチド基質であって、前記酵素によってアセチル化または脱アセチル化されるアミノ酸残基を含み、かつこのアミノ酸残基のアセチル化のレベルによってペプチダーゼの感受性が変化することを特徴とするペプチド基質。
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
AFC: 7-Amino-4-Trifluoromethyl Coumarin
p-NA: para-nitroaniline
(Ac)Lys: Nε-Acetyl Lysine(ε-アセチル化リジン)
Boc: t-Butyloxycarbonyl residue
MCA:α-(4-Methyl-Coumaryl-7-Amide)
AMC: 7-Amino-4-Methyl-Coumarin
MOAc-Arg-Pro-Gly-Leu-(Ac)Lys-Pro-Lys(Dnp)-NH2 : (Methyloxycoumarin-4-ly)acetyl-L-Arginyl-L-Prolyl-L-Glycyl-L-Leucyl-Nε-Acetyl-L-Lysyl-Prolyl -Nε -(2,4-Dinitrophenyl)-L-Lysine Amide
MOAc-Leu-Pro-(Ac)Lys-Leu-A2pr(Dnp) -Pro-Arg-NH2 : (Methyloxycoumarin-4-ly) acetyl-L-Leucyl-L-Prolyl-Nε-Acetyl-L-Lysil-[N3-(2,4-Dinitrophenyl)-L-2,3-Diaminopropionyl]- L-Prolyl-L-Arginine Amide
本発明は第一に、ペプチドのアセチル化のレベルの変化が、該ペプチドを基質とするペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検出されることを特徴とする、ペプチドのアセチル化レベルを判定する方法に関する。
また本発明のアセチル化レベルの判定方法は、あるアセチル化酵素のアセチル化酵素活性、および脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性の測定に利用することができる。すなわち本発明は、ペプチダーゼの切断活性の変化を指標として、アセチル化レベルを判定する方法を利用した、脱アセチル化酵素活性、およびアセチル化酵素活性の測定方法に関する。本発明の脱アセチル化酵素活性、またはアセチル化酵素活性の測定方法は、(a)基質ペプチドと試料とを脱アセチル化酵素による脱アセチル化反応に必要な条件下、または基質ペプチドと試料とをアセチル化酵素によるアセチル化反応に必要な条件下で接触させる工程、(b)基質ペプチドのアセチル化のレベルを判定する工程、を含む。
中でもリシルエンドペプチダーゼは、安定性に優れる酵素であることから本発明における望ましいペプチダーゼの一つである。リシルエンドペプチダーゼは、リジン残基のC末端側を切断するペプチダーゼで、その切断活性はリジン残基のアセチル化によって有意に低下する。
この他に、基質ペプチドの切断を検出する方法として、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、あるいは質量分析計で得られるマススペクトラム等を用いた検出系を挙げることができる。
本発明で使用する基質ペプチドは、ペプチダーゼが切断するためのペプチド結合を有し、その切断活性が基質ペプチドのアセチル化レベルを反映しうるものであれば、その構造は限定されない。該基質ペプチドは、天然のもの、遺伝子組換え技術を利用して調製されたもの、合成ペプチドのいずれであってもよい。ペプチドの精製を容易にするなどの目的で、他のペプチド(例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)と融合されていてもよい。更に、脱アセチル化酵素(またはアセチル化酵素)と、ペプチダーゼの基質として機能するものであれば、アミノ酸以外の構造を含むこともできる。
Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCA
Boc-Glu-Lys-(Ac)Lys-MCA
BocはValおよびGluのNα位のアミノ基の保護基である。MCAは蛍光物質であり、隣接するリジン残基のεアミノ基がアセチル化されている。これらのペプチドはリジン残基のカルボキシル末端側で切断が起こると、AMCを遊離する。遊離したAMCの蛍光波長は、ペプチジル-MCAとは異なるので、AMCによる蛍光強度の変化を指標として、基質の切断量を測定することができる。
具体的には、まず、アセチル化された基質ペプチドを被検脱アセチル化酵素と反応させる。その結果、リジン残基からアセチル基が除去されると、上記のペプチダーゼにより、基質が切断される。この切断量を上記の方法により測定することにより、脱アセチル化酵素活性を測定することができる。つまり、第一の反応として、リジン残基の脱アセチル化、それに引き続く第二の反応として、タンパク質分解反応(ペプチド結合の解裂反応)を行うことにより、第一の反応のリジン残基の脱アセチル化量を第二の反応のタンパク質分解量に変換することが可能となる(化1)。
まず、基質ペプチドを反応バッファーに添加し、蛍光測定用マイクロプレートに分注し、保温する。次に、各ウェルにヒストン脱アセチル化酵素液を添加し、一定時間、通常60分間、脱アセチル化反応させる。ペプチダーゼ液、およびペプチダーゼ反応バッファーを各ウェルに添加し、マイクロプレート用蛍光リーダーで一定時間、通常150秒間、毎の蛍光強度を測定する。
また、予め蛍光物質の他に、基質ペプチドに消光物質を結合させておき、基質ペプチドの切断によって、蛍光を生じさせることも可能である(化2)。
MOAc-Arg-Pro-Gly-Leu-(Ac)Lys-Pro-Lys(Dnp)-NH2(配列番号:1)
MOAc-Leu-Pro-(Ac)Lys-Leu-A2pr(Dnp)-Pro-Arg-NH2(配列番号:2)
MOAcは蛍光物質、Dnpは消光物質であり、これらの間にあるリジン残基がアセチル化されている。これらの基質は、消光物質を含んでいるために、そのままでは蛍光強度が低下しているが、ペプチダーゼによりリジン残基のアミノ末端側で切断が起こると、蛍光強度が増加し、基質ペプチドの切断量を測定することができる。
本発明のキットは、(a)基質ペプチド、(b)脱アセチル化酵素(またはアセチル化酵素)、および(c)基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切断活性が変化するペプチダーゼ、を含む。本発明のキットは、更に被検化合物を含むこともできる。基質ペプチドは、脱アセチル化酵素の活性測定を目的とする場合には予めアセチル化したものを用いる。逆にアセチル化酵素の活性測定を目的とするなら、アセチル化されていないペプチドを基質とする。基質ペプチドは先に述べたように標識されていてもよい。酵素標品や基質ペプチドには、タンパク質の安定化のための他の成分を配合することができる。例えば、1%程度のBSA、および終濃度0.2〜10%、好ましくは1%のシュークロース(sucrose)、フルクトース(fructose)などのポリオール類を標品中に添加し、凍結乾燥後のタンパク質変性防止剤として用いることが好ましい。
以下、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
(1) RT-PCR によるヒストン脱アセチル化酵素遺伝子の単離
現在までに HDAC1/RPD3 (Taunton, J. et al., Science Vol.272, 408-411, 1996; Rundlett, S. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.93, 14503-14508)、HDAC2/YY-1BP(Yang, W. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.93, 12845-12850; Lusser, A. et al., Science Vol.277, 88-91, 1997)、HDAC3 (Yang, W. M. et al., J. Biol. Chem. Vol.272, 28001-28007)の3つの遺伝子がヒストン脱アセチル化酵素の遺伝子として報告されている。これらヒストン脱アセチル化酵素遺伝子のうち、HDAC1/RPD3 (Genbank Accession#: U50079)、およびHDAC3 (Genbank Accession#: U66914)を RT-PCR法を用いて増幅、単離した。以下の塩基配列からなるプライマーを PCR に用いた。
<HDAC1/RPD3 増幅用プライマー>
フォワードプライマー (HD1F) ;5'-CGCGGATCCATGGCGCAGACGCAGGGCACC-3' (配列番号:3)
( 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑におこなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (GGATCC) は制限酵素 Bam HI サイト。)
リバースプライマー (HD1R) ;5'-CGCCTCGAGGGCCAACTTGACCTCCTCCTT-3' (配列番号:4)
( 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑におこなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (CTCGAG) は制限酵素 Xho I サイト。)
このプライマーセットを用いることによって、HDAC1/RPD3 の1番目から 482 番目(全長)をコードしている DNA を増幅した。
<HDAC3 増幅用プライマー>
フォワードプライマー(HD3F) ;5'-CGCGGATCCATGGCCAAGACCGTGGCGTAT-3' (配列番号:5)
( 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑におこなわせるためのもの。5' 側 4 番目から 9 番目 (GGATCC) は制限酵素 Bam HI サイト。)
リバースプライマー(HD3R) ;5'-CGCCTCGAGAATCTCCACATCGCTTTCCTT-3' (配列番号:6)
( 5' 側 3 つの塩基 (CGC) は制限酵素処理を円滑におこなわせるためのもの。5' 側 4 番目から9 番目 (CTCGAG) は制限酵素 Xho I サイト。)
この 2 つのプライマーセットを用いることによって HDAC3 のアミノ酸 1 番目から 428 番目(全長)をコードしている DNA を増幅した。
ヒストン脱アセチル化酵素遺伝子を PCR 法で増幅する際のテンプレートとして、ヒト子宮頚ガン由来 HeLa 細胞の cDNA を用いた。まず、cDNA を作製するため、HeLa 細胞よりフェノール-チオシアン酸グアニジン法(ニッポンジーン、ISOGEN)を用いて 全RNA を抽出、精製した。抽出した 全RNAをもとにランダムプライマーを用いて cDNA を合成した(逆転写反応)。このcDNAをテンプレートとして以下の条件でPCRを行なった。1)92 ℃ 3 分間を1サイクル、2)92℃ 1分間(変性)、X℃ 1分間(アニーリング)、72℃ 1分間(伸長反応)を 35 サイクル、3)72℃ 10 分を1サイクル。アニーリングの温度(X℃)は以下のように、各遺伝子のプライマーセットで異なった設定値を用いた。プライマーセット :アニーリング温度はHD1F-HD1R :64 ℃、HD3F-HD3R :64 ℃とした。また、これら PCR用の熱耐性 DNA ポリメラーゼとしてPfu-Turbo ポリメラーゼ (StrataGene社製)を用いた。
PCR によって増幅した各 DNA バンド(PCR 産物)を1 % のアガロースゲル電気泳動によって確認した。バンドの確認後、各 PCR 産物は制限酵素 Bam HI と Xho I によって処理した。この処理によって、PCR の各プライマーの 5' 末端側に導入しておいた制限酵素サイトが切られて、PCR 産物の両末端は粘着末端(cohesive end) となる。制限酵素処理した各 PCR 産物はアガロースゲル電気泳動によって分離した。アガロースゲルで分離した PCR 産物のバンドをゲルごと切り出し、glass milk (Bio-101)を用いてアガロースから分離精製した。アガロースゲルから分離精製した PCR 産物を、発現ベクター pCMV-8XHis およびpCMV-Flagのクローニングサイトにサブクローニングした。pCMV-8Xhis、およびpCMV-Flagは、pcDNA3 (Invitrogen社)の制限サイトXhoI/XbaIにそれぞれ下記の8XHisおよびFlagをコードするアダプターオリゴヌクレオチドを挿入して作製したベクターである。
pCMV-8Xhis:
C-8XHis upper: 5'-TCGAGCTAGCACATCACCACCATCACCATCATCACTAAG-3' (配列番号:7)
C-8XHis lower: 5'-CTAGCTTAGTGATGATGGTGATGGTGGTGATGTGCTAGC-3' (配列番号:8)
pCMV-Flag:
C-Flag upper: 5'-TCGAGGGGGACTATAAGGACGATGATGATGATAAATAAT-3' (配列番号:9)
C-Flag lower: 5'-CTAGATTATTTATCATCATCATCGTCCTTATAGTCCCCC-3' (配列番号:10)
(1)で構築した発現ベクターpCMV-8XHis-HDAC1, pCMV-Flag-HDAC1, pCMV-8XHis-HDAC3, pCMV-Flag-HDAC3のそれぞれ2.5μgをCHO細胞にリポフェクション法によりトランスフェクトした後、500 μg/mlジェネティシンを添加した培地中で約2週間培養をつづけ、ネオマイシン耐性クローンを選別した。各々独立した12クローンを分離し、24 ウェルプレート で培養し、遺伝子が導入され、ヒストン脱アセチル化酵素を発現しているクローンを抗His-Tag抗体および抗Flag抗体とそれぞれのヒストン脱アセチル化酵素に対する抗体を用いたウェスターンブロット法により同定した。
(a) pCMV-8XHis-HDAC
pCMV-8XHis ベクターでは連続した8つのヒスチジン(8His-Tag)がリコンビナントタンパク質のカルボキシ末端に付加される。この 8His-Tag がニッケルと錯体を形成することを利用して、リコンビナントタンパク質の精製をおこなった。1 x 109個のリコンビナント・ヒストン脱アセチル化酵素産生細胞をHypotonic buffer によく懸濁し、氷中で30分間放置した後、低速遠心により核分画を得た。この核分画をHypotonic bufferで2回洗浄後、抽出バッファーを加え、超音波処理を行った。これを高速遠心し、その上清よりリコンビナントタンパク質を含む核可溶性分画を採取した。この核可溶性分画を Ni-NTA-アガロースカラム(キアゲン社)に展開し、8His-Tag を介して組換えタンパク質をカラムに吸着させた。カラムを 抽出バッファーで十分に洗浄した後、更に洗浄バッファーで洗浄した。リコンビナントタンパク質は溶出バッファーを用いて溶出した。この操作は、イミダゾールの濃度を 50 mM, 100 mM, 200 mM, 1 M と濃度を徐々に上げながら行った。リコンビナント・ヒストン脱アセチル化酵素を含む画分をプールして、十分量のHDAC バッファーに一昼夜透析後、-80℃に保存した。各バッファーの組成は以下の通りである。
・Hypotonic buffer:
10 mM Hepes KOH pH7.5
10 mM KCl
10 mM MgCl2
0.1% NP-40
・抽出バッファー:
20 mM Tris-HCl pH 7.9
5 mM イミダゾール
0.5 M NaCl
・洗浄バッファー:
10 mM イミダゾール
0.5 M NaCl
20 mM Tris-HCl pH7.9
・溶出バッファー:
50 mM から1 Mイミダゾール
0.5 M NaCl
20 mM Tris-HCl pH7.9
・HDACバッファー:
20 mM Hepes KOH pH 7.5
150 mM NaCl
1 mM EDTA
50 % グリセロール
pCMV-Flag-HDAC ベクターではエピトープタグであるFlag-Tagがリコンビナントタンパク質のカルボキシ末端に付加される。このFlag-Tagに抗Flag-Tag抗体が結合することを利用した抗Flag-Tag(M2)抗体カラム法を用いてリコンビナントタンパク質の精製を行った。上記と同様の方法で核可溶性分画を採取し、冷えた蒸留水で3倍希釈した。これを抗Flag-Tag(M2)抗体カラム (Sigma 社製) に展開し、Flag-Tag を介して組換えタンパク質をカラムに吸着させた。カラムを洗浄バッファーで洗浄後、250 μg/ ml のFlag ペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp--Asp-Asp-Asp-Lys)を含む溶出バッファーで溶出した。リコンビナント・ヒストン脱アセチル化酵素を含む画分をプールして、十分量のHDACバッファーに一昼夜透析後、-80℃に保存した。各バッファーの組成は以下の通りである。
・洗浄バッファー:
20 mM Tris-HCl pH7.5
250 mM NaCl
0.05 % Triton X-100
・溶出バッファー:
20 mM Tris-HCl pH7.5
150 mM NaCl
10 % グリセロール
1 mM EDTA
MCF7 細胞をPBSで洗浄後、遠心し、沈殿した細胞を4mlのLysis bufferに、懸濁した。氷中で15分間静置した後、07ローター用の細い遠心管でsucrose cushion buffer 15mlに、ライセート(Lysate)を重層した。その際、Lysis buffer 1mlで共洗いし、計5mlを得た。次に、1300g、20分間遠心し、沈殿した細胞を1.5mlのLysis bufferで回収し、洗浄後、Low-salt buffer 700μlに懸濁し30秒超音波処理し、氷中に30分間静置した。100,000 gで40分間遠心し、上清をとり、粗ヒストン脱アセチル化酵素を回収した。粗ヒストン脱アセチル化酵素プールを1.5mlチューブを用いて、50% グリセロール, 150mM NaCl, 20mM Tris pH7.5に対して、一晩透析した。この際透析液は3回交換した。以上の手順で粗精製したヒストン脱アセチル化酵素を、脱アセチル化酵素活性の測定に使用した。各バッファーの組成は以下の通りである。
・sucrose cushion buffer:
30% sucrose
10mM Tris (pH7.5)
10mM NaCl
3mM MgCl2
・Lysis buffer:
10mM Tris (pH7.5)
10mM NaCl
15mM MgCl2
0.1mM EGTA
250mM sucrose
0.45% NP-40
0.1mM PMSF
・Low-salt buffer:
50mM Hepes (pH7.5)
(1) 基質ペプチド
Boc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCA
蛍光物質であるAMC(7-アミノ-4-メチル-クマリン)のアミノ基に、ε-アミノ基がアセチル化されたリジンを含むペプチドのカルボキシル基を縮合して、基質ペプチドを作製した。該ペプチドは、ペプチド研究所に依頼して作製した。
1アッセイ当たり、基質ペプチドであるBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAの10 mM DMSO 溶液1 μlを、64 μl のHDAC反応バッファー (25 mM Tris HCl, pH 7.5) に添加し、蛍光測定用マイクロプレートに分注し、30℃に保温した。次いで各ウェルにヒストン脱アセチル化酵素液 10μlを添加し、30℃で60分間、脱アセチル化反応させた。反応後、25 mM Tris HCl, pH 7.5を用いて至適濃度に希釈したペプチダーゼ液5μlと、5Xプロテアーゼ反応バッファー20μlを各ウェルに添加し、マイクロプレート用蛍光リーダーで150秒毎の蛍光強度を測定した。蛍光強度は、Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンター(amershampharmacia biotech 社製) で測定した。反応バッファーの組成は以下の通りである。
・5Xプロテアーゼ反応バッファー:
500 mM Tris HCl, pH 9.6
50 mM βmercaptoethanol
この測定方法を用いて、ヒト培養細胞株から粗精製したヒストン脱アセチル化酵素画分およびリコンビナント・ヒストン脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性を測定した結果を図1〜5に示した。
5 x 10-6 AU のリシルエンドペプチダーゼと0.001Uのプラスミンを、Boc-Val-Leu-Lys-MCAおよびBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAに添加後、約150秒毎の蛍光強度を示した。リシルエンドペプチダーゼとプラスミン共に、明らかにBoc-Val-Leu-Lys-MCAは切断するが、そのリジン残基がアセチル化されたBoc-Val-Leu-(Ac)Lys-MCAは切断しないことが示された。
Claims (15)
- 次の工程を含む脱アセチル化酵素活性の測定方法;
(a) 次のアミノ酸配列を含む基質ペプチドと試料とを、脱アセチル化酵素による脱アセチル化反応に必要な条件下で接触させる工程であって、
X-X-(Ac)Lys-(色素);
(式中Xは任意のアミノ酸残基を表し、(Ac)Lysはεアミノ基がアセチル化されたリジン残基を表し、(色素)は該リジン残基に結合した色素標識を表す)
前記基質ペプチドが前記酵素によって脱アセチル化されるεアミノ基がアセチル化された1つのリジン残基を含み、かつこのアミノ酸残基のアセチル化のレベルによって前記基質ペプチドのペプチダーゼの感受性が変化し;
ただし当該基質ペプチドは、ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成し;および
(b) 基質ペプチドのアセチル化のレベルの変化が、該ペプチドを基質とするペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検出される工程。 - 次の工程を含む脱アセチル化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法において、基質ペプチドのアセチル化レベルの変化が基質ペプチドのアセチル化に伴うペプチダーゼの切断活性の変化を指標として検出されることを特徴とする方法;
(a) 次のアミノ酸配列を含むアセチル化した基質ペプチド、および脱アセチル化酵素とを、被検化合物の存在下、脱アセチル化反応に必要な条件下で接触させる工程であって、
X-X-(Ac)Lys-(色素);
(式中Xは任意のアミノ酸残基を表し、(Ac)Lysはεアミノ基がアセチル化されたリジン残基を表し、(色素)は該リジン残基に結合した色素標識を表す)
前記基質ペプチドが前記脱アセチル化酵素によって脱アセチル化されるεアミノ基がアセチル化された1つのリジン残基を含み、かつこのアミノ酸残基のアセチル化のレベルによって前記基質ペプチドのペプチダーゼの感受性が変化するペプチドである工程、
ただし当該基質ペプチドは、ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成し;
(b) 基質ペプチドのアセチル化レベルの変化を検出する工程、および
(c) 被検化合物の非存在下における基質の脱アセチル化のレベルと比較して、基質の脱アセチル化のレベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。 - 色素標識が蛍光物質標識であり、シグナルが蛍光シグナルである請求項1または請求項2に記載の方法。
- 蛍光物質標識された基質ペプチドに更に付加的に消光物質が結合されている請求項3に記載の方法。
- ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、およびトリプシンからなる群から選択される少なくとも1種のペプチダーゼである請求項1または請求項2に記載の方法。
- ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼである請求項5に記載の方法。
- 脱アセチル化酵素によって脱アセチル化されるεアミノ基がアセチル化された1つのリジン残基を含む基質ペプチドであって、次のアミノ酸配列を含む基質ペプチド;
X-X-(Ac)Lys-(色素);
(式中Xは任意のアミノ酸残基を表し、(Ac)Lysはεアミノ基がアセチル化されたリジン残基を表し、(色素)は該リジン残基に結合した色素標識を表す)
このアミノ酸残基のアセチル化のレベルによって前記基質ペプチドのペプチダーゼの感受性が変化し、かつ当該基質ペプチドは、ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成する脱アセチル化酵素活性測定用の基質ペプチド。 - 脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル化酵素である請求項7に記載の基質ペプチド。
- 次の要素を含む、脱アセチル化酵素活性の測定用試薬キット;
(a)脱アセチル化酵素によって脱アセチル化されるεアミノ基がアセチル化された1つのリジン残基を含む基質ペプチドであって、次のアミノ酸配列を含む基質ペプチド;
X-X-(Ac)Lys-(色素);
(式中Xは任意のアミノ酸残基を表し、(Ac)Lysはεアミノ基がアセチル化されたリジン残基を表し、(色素)は該リジン残基に結合した色素標識を表す)
このアミノ酸残基のアセチル化のレベルによって前記基質ペプチドのペプチダーゼの感受性が変化し、かつ当該基質ペプチドは、ペプチダーゼによって切断されてシグナルを生成する脱アセチル化酵素活性測定用の基質ペプチド、および
(b) 脱アセチル化された基質ペプチドを切断するペプチダーゼであって、該ペプチダーゼは基質ペプチドのアセチル化レベルの変化に伴って切断活性が変化するペプチダーゼ。 - ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、およびトリプシンからなる群から選択される少なくとも1種のペプチダーゼである請求項9に記載の試薬キット。
- ペプチダーゼが、リジルエンドペプチダーゼである請求項9〜請求項10のいずれかに記載の試薬キット。
- 20−50μMの基質ペプチドに対し、1×10−6〜1×10−4AUのリジルエンドペプチダーゼが組み合わされた請求項11に記載の試薬キット。
- 脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル化酵素である請求項9〜請求項12のいずれかに記載の試薬キット。
- 請求項9〜請求項13のいずれかに記載の試薬キットと、脱アセチル化酵素を含む、脱アセチル化酵素活性を調節する化合物のスクリーニング用キット。
- 脱アセチル化酵素が、ヒストン脱アセチル化酵素である請求項14に記載のキット。
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