JP3207120B2 - 酵素活性測定方法 - Google Patents
酵素活性測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の酵素活性の測
定方法に関し、特に、蛍光検出等電点電気泳動法を用い
た酵素活性測定方法に関する。本発明はまた、該測定方
法に用いる発蛍光団色素が結合された酵素活性測定用の
基質に関する。
定方法に関し、特に、蛍光検出等電点電気泳動法を用い
た酵素活性測定方法に関する。本発明はまた、該測定方
法に用いる発蛍光団色素が結合された酵素活性測定用の
基質に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素は、生体機能の維持ばかりでなく、
多くの有用な生産物を効率よく製造するために用いられ
ている。それ故、酵素活性の測定は、生体機能の解明や
有用生産物の製造をはじめとして多くの分野にて必須の
測定系である。
多くの有用な生産物を効率よく製造するために用いられ
ている。それ故、酵素活性の測定は、生体機能の解明や
有用生産物の製造をはじめとして多くの分野にて必須の
測定系である。
【０００３】従来、こうしたプロテアーゼの活性を特異
的かつ迅速に測定する方法はなく、特に補体系のプロテ
アーゼにあっては主に溶血反応を、また凝固系や線溶系
のプロテアーゼにあってはフィブリンクロットの形成と
溶解を指標にした活性測定系であった。
的かつ迅速に測定する方法はなく、特に補体系のプロテ
アーゼにあっては主に溶血反応を、また凝固系や線溶系
のプロテアーゼにあってはフィブリンクロットの形成と
溶解を指標にした活性測定系であった。
【０００４】しかしながら、このような系では試料を大
量に必要とすること、及び結果として複数の反応が関与
した結果を測定することとなり精度に問題があった。そ
の改良法として、合成基質を用いてプロテアーゼ活性を
測定する方法が提案されている。その一つは、発色団を
ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基に導入
したペプチド合成基質を用いた測定方法であり、例え
ば、発色団としてｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）をＣ末
端アミノ酸残基のカルボキシル基にアミド結合により結
合させたペプチド基質（ｐ−ニトロアニリド基質）を用
いた測定方法を挙げることができる（WITT, I. "New me
thods for the analysis of coagulationusing chromog
enic substrates" 1977, Walter de Gruyter, Berlin a
nd New York）。この発色団としてｐ−ニトロアニリン
（ｐＮＡ）を用いた測定法の原理は、ｐ−ニトロアニリ
ド基質にプロテアーゼを作用させるとｐＮＡが遊離する
ので、その変化を４０５ｎｍでの吸光度を用いて測定す
ることにより求め、プロテアーゼの活性を測定するとい
うものである。
量に必要とすること、及び結果として複数の反応が関与
した結果を測定することとなり精度に問題があった。そ
の改良法として、合成基質を用いてプロテアーゼ活性を
測定する方法が提案されている。その一つは、発色団を
ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基に導入
したペプチド合成基質を用いた測定方法であり、例え
ば、発色団としてｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）をＣ末
端アミノ酸残基のカルボキシル基にアミド結合により結
合させたペプチド基質（ｐ−ニトロアニリド基質）を用
いた測定方法を挙げることができる（WITT, I. "New me
thods for the analysis of coagulationusing chromog
enic substrates" 1977, Walter de Gruyter, Berlin a
nd New York）。この発色団としてｐ−ニトロアニリン
（ｐＮＡ）を用いた測定法の原理は、ｐ−ニトロアニリ
ド基質にプロテアーゼを作用させるとｐＮＡが遊離する
ので、その変化を４０５ｎｍでの吸光度を用いて測定す
ることにより求め、プロテアーゼの活性を測定するとい
うものである。
【０００５】また、発色団として蛍光物質である７−ア
ミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）をＣ末端アミノ酸
残基のカルボキシル基にアミド結合により結合させたペ
プチド基質（４−メチルクマリン−７−アミド（ＭＣ
Ａ）基質；非蛍光物質）を用いた方法が提案されてい
る。この方法の原理は、４−メチルクマリン−７−アミ
ド（ＭＣＡ）基質（これは非蛍光物質である）にプロテ
アーゼを作用させると、蛍光物質であるＡＭＣが遊離し
蛍光を発するので、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６
０ｎｍにおけるその蛍光強度からプロテアーゼの活性を
測定するというものである（Kawabata S., et al., Eur
opean Journal of Biochemistry, 172, 17-25, 198
8）。
ミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）をＣ末端アミノ酸
残基のカルボキシル基にアミド結合により結合させたペ
プチド基質（４−メチルクマリン−７−アミド（ＭＣ
Ａ）基質；非蛍光物質）を用いた方法が提案されてい
る。この方法の原理は、４−メチルクマリン−７−アミ
ド（ＭＣＡ）基質（これは非蛍光物質である）にプロテ
アーゼを作用させると、蛍光物質であるＡＭＣが遊離し
蛍光を発するので、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６
０ｎｍにおけるその蛍光強度からプロテアーゼの活性を
測定するというものである（Kawabata S., et al., Eur
opean Journal of Biochemistry, 172, 17-25, 198
8）。
【０００６】上記のような発色団をペプチドのＣ末端ア
ミノ酸残基のカルボキシル基に導入したペプチド合成基
質を用いた測定法は、いずれも用いるプロテアーゼの種
類に依存して発色団と結合しているアミノ酸の配列が選
ばれる。
ミノ酸残基のカルボキシル基に導入したペプチド合成基
質を用いた測定法は、いずれも用いるプロテアーゼの種
類に依存して発色団と結合しているアミノ酸の配列が選
ばれる。
【０００７】ペプチド合成基質を用いた上記の測定法
は、簡便な測定方法として汎用されており、特に発色団
としてＡＭＣを結合させたペプチド基質を用いた場合は
高感度な測定方法として期待されている（青木延雄、岩
永貞昭、凝固・線溶・キニン、中外医学社、１９８０、
新生化学実験講座１、タンパク質Ｖ、日本生化学会編、
１９９１）。
は、簡便な測定方法として汎用されており、特に発色団
としてＡＭＣを結合させたペプチド基質を用いた場合は
高感度な測定方法として期待されている（青木延雄、岩
永貞昭、凝固・線溶・キニン、中外医学社、１９８０、
新生化学実験講座１、タンパク質Ｖ、日本生化学会編、
１９９１）。
【０００８】しかしながら、ペプチドのＣ末端アミノ酸
残基のカルボキシル基と発色団とのアミド結合をプロテ
アーゼが切断することを必須の要件とする上記の方法
は、天然基質を用いた場合の切断の様式と異なることが
指摘されている。すなわち、基質の特異性が異なると酵
素活性に影響するので、天然基質を用いないと本来の酵
素活性を測定できないという問題がある。
残基のカルボキシル基と発色団とのアミド結合をプロテ
アーゼが切断することを必須の要件とする上記の方法
は、天然基質を用いた場合の切断の様式と異なることが
指摘されている。すなわち、基質の特異性が異なると酵
素活性に影響するので、天然基質を用いないと本来の酵
素活性を測定できないという問題がある。
【０００９】また、ペプチド合成基質を用いた上記の測
定法は比較的大量のプロテアーゼが必要であり、微量な
プロテアーゼを測定するような測定系には向いていな
い。
定法は比較的大量のプロテアーゼが必要であり、微量な
プロテアーゼを測定するような測定系には向いていな
い。
【００１０】そこで、天然基質を用いてプロテアーゼに
より切断されたペプチドをキャピラリーゾーン電気泳動
を用いて分離することにより、プロテアーゼの活性を測
定するという測定系が提案された（Mulholland, F.ら、
J. Chromatography, 636, 63-68, 1993 ; Vinther, A.
らElectrophoresis, 14, 486-491, 1993）。しかしなが
ら、この方法は検出感度が不十分であり、微量試料の測
定には適していない。
より切断されたペプチドをキャピラリーゾーン電気泳動
を用いて分離することにより、プロテアーゼの活性を測
定するという測定系が提案された（Mulholland, F.ら、
J. Chromatography, 636, 63-68, 1993 ; Vinther, A.
らElectrophoresis, 14, 486-491, 1993）。しかしなが
ら、この方法は検出感度が不十分であり、微量試料の測
定には適していない。
【００１１】また、強酸性を有するシアニン誘導体をＮ
末端アミノ酸残基に結合したペプチド基質を用いて、プ
ロテアーゼにより切断されたペプチド断片をキャピラリ
ーゾーン電気泳動を用いて分離し、蛍光検出を行うこと
によりプロテアーゼ活性を検出する方法が提案されてい
る（Fu-tai A. Chen, Analytical Biochemistry, 225,
341-345, 1995）。
末端アミノ酸残基に結合したペプチド基質を用いて、プ
ロテアーゼにより切断されたペプチド断片をキャピラリ
ーゾーン電気泳動を用いて分離し、蛍光検出を行うこと
によりプロテアーゼ活性を検出する方法が提案されてい
る（Fu-tai A. Chen, Analytical Biochemistry, 225,
341-345, 1995）。
【００１２】一方、蛋白質リン酸化酵素の測定方法は、
一般に、リンの放射性同位元素が用いられている。その
ような方法では、リン酸化された蛋白質を電気泳動によ
り分離し、オートラジオグラフィーにより活性を確認す
るものである。しかしながら、この方法では、放射性物
質を用いるので操作が煩雑となりまた用途が限定されて
しまうという問題があり、また、再現性も満足のいくも
のではなかった。その改良法として、ペプチド基質を用
いて、ペプチド基質のリン酸化をキャピラリーゾーン電
気泳動により検出する方法が提案されている（Jhon F.
Dawsonら、Analytical Biochemistry 220, 340-345, 19
94）。しかしながら、この方法は、放射性同位元素を用
いる方法に比べて感度がまだ不十分であった。
一般に、リンの放射性同位元素が用いられている。その
ような方法では、リン酸化された蛋白質を電気泳動によ
り分離し、オートラジオグラフィーにより活性を確認す
るものである。しかしながら、この方法では、放射性物
質を用いるので操作が煩雑となりまた用途が限定されて
しまうという問題があり、また、再現性も満足のいくも
のではなかった。その改良法として、ペプチド基質を用
いて、ペプチド基質のリン酸化をキャピラリーゾーン電
気泳動により検出する方法が提案されている（Jhon F.
Dawsonら、Analytical Biochemistry 220, 340-345, 19
94）。しかしながら、この方法は、放射性同位元素を用
いる方法に比べて感度がまだ不十分であった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の従来の
欠点を解決して、微量の酵素の活性を高感度でしかも簡
便に測定できる酵素活性測定法を提供することを目的と
する。特に、本発明は、微量のプロテアーゼ活性を高感
度でしかも簡便に測定できる酵素活性測定法を提供する
ことを目的とする。
欠点を解決して、微量の酵素の活性を高感度でしかも簡
便に測定できる酵素活性測定法を提供することを目的と
する。特に、本発明は、微量のプロテアーゼ活性を高感
度でしかも簡便に測定できる酵素活性測定法を提供する
ことを目的とする。
【００１４】従来の技術の項で記したように、天然基質
を用いたプロテアーゼの活性測定方法は満足のいくもの
ではなかった。上記したシアニン誘導体をペプチドのＮ
末端アミノ酸残基のアミノ基に結合したペプチド基質を
用いたプロテアーゼの活性測定方法は、ペプチド基質と
該ペプチド基質のプロテアーゼによる分解産物の分離に
キャピラリーゾーン電気泳動を用いている。しかしなが
ら、天然基質を用いたプロテアーゼの測定方法として
は、キャピラリーゾーン電気泳動では分析できる試料の
量がキャピラリーの容積の約１／１００に限られ、その
結果として検出感度に限界があると判った。また、キャ
ピラリーゾーン電気泳動では、分離される画分に広がり
が生じ、結果として高感度な検出が困難であるというこ
とが判った。また、キャピラリーゾーン電気泳動法にお
いては、あらかじめ分離坦体となる緩衝液を満たしたキ
ャピラリー中に導入される試料は微量であることが要求
され、再現性の問題があるということが判った。また、
キャピラリー中に導入できる試料が微量であるため、分
離に先立つ酵素反応において比較的高濃度のプロテアー
ゼが要求され、微量なプロテアーゼを用いる場合は適し
ていないという問題があるということが判った。
を用いたプロテアーゼの活性測定方法は満足のいくもの
ではなかった。上記したシアニン誘導体をペプチドのＮ
末端アミノ酸残基のアミノ基に結合したペプチド基質を
用いたプロテアーゼの活性測定方法は、ペプチド基質と
該ペプチド基質のプロテアーゼによる分解産物の分離に
キャピラリーゾーン電気泳動を用いている。しかしなが
ら、天然基質を用いたプロテアーゼの測定方法として
は、キャピラリーゾーン電気泳動では分析できる試料の
量がキャピラリーの容積の約１／１００に限られ、その
結果として検出感度に限界があると判った。また、キャ
ピラリーゾーン電気泳動では、分離される画分に広がり
が生じ、結果として高感度な検出が困難であるというこ
とが判った。また、キャピラリーゾーン電気泳動法にお
いては、あらかじめ分離坦体となる緩衝液を満たしたキ
ャピラリー中に導入される試料は微量であることが要求
され、再現性の問題があるということが判った。また、
キャピラリー中に導入できる試料が微量であるため、分
離に先立つ酵素反応において比較的高濃度のプロテアー
ゼが要求され、微量なプロテアーゼを用いる場合は適し
ていないという問題があるということが判った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、発蛍光団
色素が結合したペプチド基質と等電点電気泳動法を組み
合わせることにより、微量の酵素の活性が、高感度でし
かも簡便に測定できることを見いだし本発明を完成し
た。すなわち、本発明者らは、発蛍光団色素が結合され
た酵素活性測定用のポリペプチド基質が、酵素の作用に
より、該ポリペプチド基質とは異なる等電点を有する１
又は２以上のポリペプチドになること、及びそれらのポ
リペプチドが等電点電気泳動により分離されることを見
いだし本発明を完成した。
色素が結合したペプチド基質と等電点電気泳動法を組み
合わせることにより、微量の酵素の活性が、高感度でし
かも簡便に測定できることを見いだし本発明を完成し
た。すなわち、本発明者らは、発蛍光団色素が結合され
た酵素活性測定用のポリペプチド基質が、酵素の作用に
より、該ポリペプチド基質とは異なる等電点を有する１
又は２以上のポリペプチドになること、及びそれらのポ
リペプチドが等電点電気泳動により分離されることを見
いだし本発明を完成した。
【００１６】本発明でポリペプチドとは、ペプチドが数
個から十数個結合したオリゴペプチド及びペプチドがそ
れ以上、例えば数十個結合したポリペプチドを含む意味
である。
個から十数個結合したオリゴペプチド及びペプチドがそ
れ以上、例えば数十個結合したポリペプチドを含む意味
である。
【００１７】
【発明の実施の態様】本発明の第１の特徴は、合成オリ
ゴペプチドを基質として用いる酵素活性測定方法におい
て、該合成オリゴペプチドがローダミン、フルオレセイ
ン、シアニン（Ｃｙ３を除く）、インドシアニン、イン
ドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キ
ナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニル
メレイミド及びアントラセンからなる群より選ばれる少
なくとも１つの発蛍光団色素と結合しており、かつ、該
合成オリゴぺプチドがプロテアーゼ、蛋白質リン酸化酵
素及び転移酵素からなる群より選ばれるいずれか一つの
酵素の作用により、該合成オリゴペプチドと異なる等電
点を有する１又は２以上のオリゴペプチドを生じるよう
なアミノ酸配列を有し、該酵素の作用によって生じた該
１又は２以上のオリゴペプチドを蛍光検出等電点電気泳
動法を用いて検出することを特徴とする酵素活性測定方
法である。
ゴペプチドを基質として用いる酵素活性測定方法におい
て、該合成オリゴペプチドがローダミン、フルオレセイ
ン、シアニン（Ｃｙ３を除く）、インドシアニン、イン
ドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キ
ナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニル
メレイミド及びアントラセンからなる群より選ばれる少
なくとも１つの発蛍光団色素と結合しており、かつ、該
合成オリゴぺプチドがプロテアーゼ、蛋白質リン酸化酵
素及び転移酵素からなる群より選ばれるいずれか一つの
酵素の作用により、該合成オリゴペプチドと異なる等電
点を有する１又は２以上のオリゴペプチドを生じるよう
なアミノ酸配列を有し、該酵素の作用によって生じた該
１又は２以上のオリゴペプチドを蛍光検出等電点電気泳
動法を用いて検出することを特徴とする酵素活性測定方
法である。
【００１８】本発明の第二の特徴は、発蛍光団色素が結
合基を介してポリペプチドに結合してなることを特徴と
する酵素活性測定方法である。
合基を介してポリペプチドに結合してなることを特徴と
する酵素活性測定方法である。
【００１９】
【００２０】本発明の第三の特徴は、前記の等電点の異
なるオリゴペプチドを蛍光検出キャピラリー電気泳動法
により分離することを特徴とする酵素活性測定方法であ
る。
なるオリゴペプチドを蛍光検出キャピラリー電気泳動法
により分離することを特徴とする酵素活性測定方法であ
る。
【００２１】本発明の第四の特徴は、発蛍光団色素が結
合した合成オリゴペプチド基質及びキャピラリー等電点
電気泳動法を用いたプロテアーゼ活性測定法である。
合した合成オリゴペプチド基質及びキャピラリー等電点
電気泳動法を用いたプロテアーゼ活性測定法である。
【００２２】
【００２３】本発明で用いる発蛍光団色素としては、用
いる合成オリゴペプチド基質、及び該合成オリゴペプチ
ド基質に酵素を作用させた後に生じるオリゴペプチドの
間に等電点の差異を生じるものである限り特に制限はな
い。すなわち、強酸性のＣｙ３色素（商標：バイオロジ
カル ディテクション システムズの商品）のように、
強い電荷を有しており、合成オリゴペプチド基質の等電
点を等電点電気泳動による分離範囲外にするような発蛍
光団色素でない限り本発明において使用可能である。実
際には、用いるペプチドの電荷に応じて、適宜、適当な
色素が選択されうる。発蛍光団色素として、ローダミ
ン、フルオレセイン、シアニン、インドシアニン、イン
ドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キ
ナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニル
メレイミド、アントラセン等を挙げることができる。上
記のうち、ローダミン系色素、電気的に陰性或いは陽性
の電荷を持つシアニン系色素が、特に、基質の等電点に
極端に影響しない点及び蛍光の検出が容易である点より
好ましい。ここでいう蛍光の検出が容易であるとは、該
発蛍光団色素の励起が容易であること、発する蛍光が大
きく、また反応系の夾雑物により影響されにくいという
ことである。
いる合成オリゴペプチド基質、及び該合成オリゴペプチ
ド基質に酵素を作用させた後に生じるオリゴペプチドの
間に等電点の差異を生じるものである限り特に制限はな
い。すなわち、強酸性のＣｙ３色素（商標：バイオロジ
カル ディテクション システムズの商品）のように、
強い電荷を有しており、合成オリゴペプチド基質の等電
点を等電点電気泳動による分離範囲外にするような発蛍
光団色素でない限り本発明において使用可能である。実
際には、用いるペプチドの電荷に応じて、適宜、適当な
色素が選択されうる。発蛍光団色素として、ローダミ
ン、フルオレセイン、シアニン、インドシアニン、イン
ドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キ
ナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニル
メレイミド、アントラセン等を挙げることができる。上
記のうち、ローダミン系色素、電気的に陰性或いは陽性
の電荷を持つシアニン系色素が、特に、基質の等電点に
極端に影響しない点及び蛍光の検出が容易である点より
好ましい。ここでいう蛍光の検出が容易であるとは、該
発蛍光団色素の励起が容易であること、発する蛍光が大
きく、また反応系の夾雑物により影響されにくいという
ことである。
【００２４】本発明で用いる発蛍光団色素が結合された
合成オリゴペプチド基質とは、活性測定の目的とする酵
素に応じて選択された合成オリゴペプチド基質に、上記
の発蛍光団色素を結合したものである。合成オリゴペプ
チドへの発蛍光団色素の結合は、発蛍光団色素を直接、
合成オリゴペプチドに結合させてもよいし、また結合基
を介して結合させても良い。結合基としては、発蛍光団
色素をアミノ酸に結合するために一般に用いられるもの
が満足に使用でき、例えば、アミド、チオアミド、スル
フォンアミド、尿素、チオ尿素、ウレタン結合基等を挙
げることができるが、特に、アミドが好ましい。
合成オリゴペプチド基質とは、活性測定の目的とする酵
素に応じて選択された合成オリゴペプチド基質に、上記
の発蛍光団色素を結合したものである。合成オリゴペプ
チドへの発蛍光団色素の結合は、発蛍光団色素を直接、
合成オリゴペプチドに結合させてもよいし、また結合基
を介して結合させても良い。結合基としては、発蛍光団
色素をアミノ酸に結合するために一般に用いられるもの
が満足に使用でき、例えば、アミド、チオアミド、スル
フォンアミド、尿素、チオ尿素、ウレタン結合基等を挙
げることができるが、特に、アミドが好ましい。
【００２５】発蛍光色素団を結合する箇所は、目的とす
る酵素の活性に大きく影響しない限り特に制限されず、
Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基に結合させても、Ｃ末端
アミノ基のカルボキシル基に結合させても、また、側鎖
を有するアミノ基の側鎖に結合させてもよい。特に、合
成オリゴペプチド基質がシステインを含む場合は、シス
テインのチオール基に発蛍光色素団を結合させるのが、
合成オリゴペプチド基質の等電点への影響を最少とでき
好ましい。発蛍光団色素を結合させる方法としては、例
えば、上記の結合基とアミノ基を共有結合させる方法
（例えば、大野素憲ら、蛋白質の化学修飾（下）、学会
出版センター、１９８１参照）を挙げることができる。
る酵素の活性に大きく影響しない限り特に制限されず、
Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基に結合させても、Ｃ末端
アミノ基のカルボキシル基に結合させても、また、側鎖
を有するアミノ基の側鎖に結合させてもよい。特に、合
成オリゴペプチド基質がシステインを含む場合は、シス
テインのチオール基に発蛍光色素団を結合させるのが、
合成オリゴペプチド基質の等電点への影響を最少とでき
好ましい。発蛍光団色素を結合させる方法としては、例
えば、上記の結合基とアミノ基を共有結合させる方法
（例えば、大野素憲ら、蛋白質の化学修飾（下）、学会
出版センター、１９８１参照）を挙げることができる。
【００２６】本発明で測定できる酵素活性は、合成オリ
ゴペプチドを基質とするものであれば制限されないが、
プロテアーゼ、蛋白質リン酸化酵素及び転移酵素が好ま
しく、プロテアーゼが特に好ましい。酵素としてプロテ
アーゼを用いた場合は、本発明の蛍光標識オリゴペプチ
ド基質はプロテアーゼにより分解されて該オリゴペプチ
ド基質とは等電点の異なるオリゴペプチドを生じること
ができる。また、酵素として蛋白質リン酸化酵素を用い
た場合は、本発明の蛍光標識オリゴペプチド基質はリン
酸化されて、該オリゴペプチド基質とは等電点の異なる
オリゴペプチドを生じることができる。
ゴペプチドを基質とするものであれば制限されないが、
プロテアーゼ、蛋白質リン酸化酵素及び転移酵素が好ま
しく、プロテアーゼが特に好ましい。酵素としてプロテ
アーゼを用いた場合は、本発明の蛍光標識オリゴペプチ
ド基質はプロテアーゼにより分解されて該オリゴペプチ
ド基質とは等電点の異なるオリゴペプチドを生じること
ができる。また、酵素として蛋白質リン酸化酵素を用い
た場合は、本発明の蛍光標識オリゴペプチド基質はリン
酸化されて、該オリゴペプチド基質とは等電点の異なる
オリゴペプチドを生じることができる。
【００２７】プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解
を触媒とするＥＣ３．４群の酵素の総称であり、動物、
植物、微生物界に広く分布し、細胞内にも細胞外にも存
在する。プロテアーゼの生理的意義は、その存在と同
様、極めて重要でありまた多岐にわたっている。また、
蛋白質リン酸化酵素は、蛋白質のリン酸化を触媒するＥ
Ｃ２．７群の酵素であり、動物、植物、微生物界に広く
分布する重要な酵素である。これらの酵素の活性は、本
発明の方法により満足に測定できる。
を触媒とするＥＣ３．４群の酵素の総称であり、動物、
植物、微生物界に広く分布し、細胞内にも細胞外にも存
在する。プロテアーゼの生理的意義は、その存在と同
様、極めて重要でありまた多岐にわたっている。また、
蛋白質リン酸化酵素は、蛋白質のリン酸化を触媒するＥ
Ｃ２．７群の酵素であり、動物、植物、微生物界に広く
分布する重要な酵素である。これらの酵素の活性は、本
発明の方法により満足に測定できる。
【００２８】上記のプロテアーゼのうち、消化管内に分
泌されるペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどの
は栄養素としての蛋白質をアミノ酸へと消化する担い手
である。また、細胞内ではリソソームに含まれているカ
テプシン群のプロテアーゼは、不要な蛋白質の除去機構
に寄与していると考えられる。これらの酵素の活性も本
発明の方法により満足に測定できる。
泌されるペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどの
は栄養素としての蛋白質をアミノ酸へと消化する担い手
である。また、細胞内ではリソソームに含まれているカ
テプシン群のプロテアーゼは、不要な蛋白質の除去機構
に寄与していると考えられる。これらの酵素の活性も本
発明の方法により満足に測定できる。
【００２９】消化管や血流中で見られるチモーゲン活性
化反応は、不活性な前駆体活性から活性な酵素を切り出
すものであり、また、細胞内においてホルモン前駆体、
例えば、プロインスリンからホルモンを生成したり、活
性ペプチドを限定的に切断して不活性化したりする反応
は、プロテアーゼの生体防御、調節機構への重要な役割
と見なすことができる。特に、血漿中には数多くのプロ
テアーゼが含まれており、その多くは血液凝固及び線溶
系・補体系・キニン系などの生体防御に直接関与するも
ので、病態時におけるこれらの酵素の活性変動は疾患の
診断に欠かせない情報である。これらの酵素は微量の場
合があり、本発明の方法は、これらの疾患の診断に欠か
せない酵素の活性の測定にもまた適している。
化反応は、不活性な前駆体活性から活性な酵素を切り出
すものであり、また、細胞内においてホルモン前駆体、
例えば、プロインスリンからホルモンを生成したり、活
性ペプチドを限定的に切断して不活性化したりする反応
は、プロテアーゼの生体防御、調節機構への重要な役割
と見なすことができる。特に、血漿中には数多くのプロ
テアーゼが含まれており、その多くは血液凝固及び線溶
系・補体系・キニン系などの生体防御に直接関与するも
ので、病態時におけるこれらの酵素の活性変動は疾患の
診断に欠かせない情報である。これらの酵素は微量の場
合があり、本発明の方法は、これらの疾患の診断に欠か
せない酵素の活性の測定にもまた適している。
【００３０】本発明の酵素活性測定方法は、等電点電気
泳動を用いることを特徴とし、それによりオリゴペプチ
ドが焦点的に濃縮されて分離されるため非常に高い分解
能を有する。すなわち本発明においては、発蛍光団色素
が結合された合成オリゴペプチド基質を用いることによ
る高検出感度及び等電点電気泳動法を用いることによる
高分解能が組み合わされることにより、検出の高感度化
を可能とし、微量な酵素の活性の測定を可能としたので
ある。本発明においては、一般の等電点電気泳動法が満
足に使用できるが、試料が微量の場合は、特にキャピラ
リー等電点電気泳動法が好ましい。本発明においては、
キャピラリー等電点電気泳動法を用いているため、キャ
ピラリーの全長にわたって試料を満たして分析が開始で
きるため、キャピラリーゾーン電気泳動法で問題とな
る、微量試料のキャピラリーへの導入に伴う再現性の問
題や、微量操作の煩雑さの問題を生じない。さらに、本
発明の、キャピラリー等電点電気泳動法と蛍光検出法を
組み合わせた分析方法においては、その高い分解能と検
出感度により、超高感度化が可能であり、極微量の酵素
の活性の測定が可能となる。さらに、本発明において
は、等電点電気泳動法として、マイクロチップ化したキ
ャピラリーを用いたマイクロチップキャピラリー電気泳
動法（Stephen C. Jacobsonら、Analytical Chemistr
y, 66, 3472-3476,1994）も用いることができ、それに
より、さらなる微量化、高感度化期待される。
泳動を用いることを特徴とし、それによりオリゴペプチ
ドが焦点的に濃縮されて分離されるため非常に高い分解
能を有する。すなわち本発明においては、発蛍光団色素
が結合された合成オリゴペプチド基質を用いることによ
る高検出感度及び等電点電気泳動法を用いることによる
高分解能が組み合わされることにより、検出の高感度化
を可能とし、微量な酵素の活性の測定を可能としたので
ある。本発明においては、一般の等電点電気泳動法が満
足に使用できるが、試料が微量の場合は、特にキャピラ
リー等電点電気泳動法が好ましい。本発明においては、
キャピラリー等電点電気泳動法を用いているため、キャ
ピラリーの全長にわたって試料を満たして分析が開始で
きるため、キャピラリーゾーン電気泳動法で問題とな
る、微量試料のキャピラリーへの導入に伴う再現性の問
題や、微量操作の煩雑さの問題を生じない。さらに、本
発明の、キャピラリー等電点電気泳動法と蛍光検出法を
組み合わせた分析方法においては、その高い分解能と検
出感度により、超高感度化が可能であり、極微量の酵素
の活性の測定が可能となる。さらに、本発明において
は、等電点電気泳動法として、マイクロチップ化したキ
ャピラリーを用いたマイクロチップキャピラリー電気泳
動法（Stephen C. Jacobsonら、Analytical Chemistr
y, 66, 3472-3476,1994）も用いることができ、それに
より、さらなる微量化、高感度化期待される。
【００３１】以下、本発明を実施例を用いて説明する
が、本発明の範囲は実施例に限定されるものではなく、
本発明の範囲は、特許請求の範囲の基づいて判断される
べきものである。
が、本発明の範囲は実施例に限定されるものではなく、
本発明の範囲は、特許請求の範囲の基づいて判断される
べきものである。
【００３２】
（蛍光標識ペプチド基質の合成） （１） ペプチド（H-Gly-Cys-His-Glu-Ala-Arg-Ala-Glu
-Glu-OH）の調製 ペプチド（H-Gly-Cys-His-Glu-Ala-Arg-Ala-Glu-Glu-O
H）をペプチド研究所（株）（大阪）に依頼して合成し
た。ペプチドの合成は、アプライドバイオシステムズ社
製のペプチド自動合成装置を用いて行い、合成後、ポリ
ペプチドをＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ社製、Ｓ−５、１
２０Ａ ＯＤＳ、内径３０ｍｍ、全長２５０ｍｍ；流
速：２０ｍｌ／ｍｉｎ；検出波長：２２０ｎｍ；移動
相：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ、１−２１％グラジュエ
ント／８０ｍｉｎ）を用いて分取した。その後、凍結乾
燥を行った。凍結乾燥品を、使用前に、２０ｍＭの塩酸
溶液に溶解し（３）の操作に用いた。
-Glu-OH）の調製 ペプチド（H-Gly-Cys-His-Glu-Ala-Arg-Ala-Glu-Glu-O
H）をペプチド研究所（株）（大阪）に依頼して合成し
た。ペプチドの合成は、アプライドバイオシステムズ社
製のペプチド自動合成装置を用いて行い、合成後、ポリ
ペプチドをＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ社製、Ｓ−５、１
２０Ａ ＯＤＳ、内径３０ｍｍ、全長２５０ｍｍ；流
速：２０ｍｌ／ｍｉｎ；検出波長：２２０ｎｍ；移動
相：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ、１−２１％グラジュエ
ント／８０ｍｉｎ）を用いて分取した。その後、凍結乾
燥を行った。凍結乾燥品を、使用前に、２０ｍＭの塩酸
溶液に溶解し（３）の操作に用いた。
【００３３】（２） リサミンローダミンＢ（ＬＲＢ）
ヨードアセタミドの調製 （ａ）ＬＲＢアミンの調製 エチレンジアミン104 mgとジメチルホルムアミド0.4ｍ
ｌの混液に、0,3 mlのジメチルホルムアミドに溶解した
10 mgのリサミンローダミンＢ塩化スルホニル（米国、
モレキュラーブローブス社製）を滴下し、暗所、室温に
て１時間反応させた。反応液を減圧下にて蒸発乾固した
後、２０％アセトニトリル−１％ギ酸溶液２ｍｌに溶解
し、２０％アセトニトリル−１％ギ酸溶液で平衡化した
１ｍｌのDowex-1（Ｈ1型）カラムに全量を流して素通り
画分を集め、減圧下にて蒸発乾固し、ＬＲＢアミンの粗
製品とした。これを、アセトニトリル0.4 mlと0.1 Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）1.6 mlに溶解し、570
nmにおけるモル吸光係数を93,000として吸光度測定によ
ってその濃度を決定した。ＬＲＢアミン粗製品１５０nm
olを２５％アセトニトリル−0.1 %トリフルオロ酢酸溶
液で平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（東ソー
ODS-80Ts、直径4.6 mm、長さ２５cm）にアプライし、３
０分間にわたって２５−５５％のアセトニトリルの濃度
直線勾配をかけて色素を溶出し、２８０nmの吸収で検出
を行った。最も大きなピークを分取し（１２７nmol）、
精製ＬＲＢアミンとして以下の操作に用いた。
ヨードアセタミドの調製 （ａ）ＬＲＢアミンの調製 エチレンジアミン104 mgとジメチルホルムアミド0.4ｍ
ｌの混液に、0,3 mlのジメチルホルムアミドに溶解した
10 mgのリサミンローダミンＢ塩化スルホニル（米国、
モレキュラーブローブス社製）を滴下し、暗所、室温に
て１時間反応させた。反応液を減圧下にて蒸発乾固した
後、２０％アセトニトリル−１％ギ酸溶液２ｍｌに溶解
し、２０％アセトニトリル−１％ギ酸溶液で平衡化した
１ｍｌのDowex-1（Ｈ1型）カラムに全量を流して素通り
画分を集め、減圧下にて蒸発乾固し、ＬＲＢアミンの粗
製品とした。これを、アセトニトリル0.4 mlと0.1 Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）1.6 mlに溶解し、570
nmにおけるモル吸光係数を93,000として吸光度測定によ
ってその濃度を決定した。ＬＲＢアミン粗製品１５０nm
olを２５％アセトニトリル−0.1 %トリフルオロ酢酸溶
液で平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（東ソー
ODS-80Ts、直径4.6 mm、長さ２５cm）にアプライし、３
０分間にわたって２５−５５％のアセトニトリルの濃度
直線勾配をかけて色素を溶出し、２８０nmの吸収で検出
を行った。最も大きなピークを分取し（１２７nmol）、
精製ＬＲＢアミンとして以下の操作に用いた。
【００３４】（ｂ）ＬＲＢアミンのヨードアセチル化 （ａ）で調製した画分を減圧下に乾固し、その後、アセ
トニトリルと0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）
の１：４混合液８８μlに溶解し、これに１０mMモノヨ
ード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルのジメチル
ホルムアミド溶液１２μlを添加し、室温にて１時間反
応させた。反応液の全量を（ａ）で述べたのと同条件に
て逆相クロマトグラフィーにかけ、溶出した主ピークを
ＬＲＢ−ヨードアセタミドとして分取し（７０nmol）、
ペプチドの標識に用いた。
トニトリルと0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）
の１：４混合液８８μlに溶解し、これに１０mMモノヨ
ード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルのジメチル
ホルムアミド溶液１２μlを添加し、室温にて１時間反
応させた。反応液の全量を（ａ）で述べたのと同条件に
て逆相クロマトグラフィーにかけ、溶出した主ピークを
ＬＲＢ−ヨードアセタミドとして分取し（７０nmol）、
ペプチドの標識に用いた。
【００３５】（３） ペプチドの標識 （２）で調製した精製色素（ＬＲＢ−ヨードアセタミ
ド）２５nmolを含むカラム溶液を試験管中で乾固し、そ
の後、アセトニトリル２０μlに溶解した。これに、
（１）で調製したペプチド水溶液１０μl（濃度５mM、
５０nmol）と緩衝液（0.1 M Na-Pi、５mM EDTA、pH 7.
5）を加え、暗所にて一晩室温で反応させた。反応液
を、２５％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸溶
液で平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（東ソー
ODS-80Ts、直径4.6 mm、長さ２５cm）にアプライし、１
ｍｌ／分の流速にて、３０分間にわたって２５−５５％
のアセトニトリルの濃度直線勾配をかけて標識ペプチド
を溶出し、分取した。検出は２８０nmの吸収にて行っ
た。標識ペプチドの収量は、約８０％であった。標識ペ
プチドの濃度は、５７０nmにおけるモル吸光係数を93,0
00として、吸光度測定によって決定した。
ド）２５nmolを含むカラム溶液を試験管中で乾固し、そ
の後、アセトニトリル２０μlに溶解した。これに、
（１）で調製したペプチド水溶液１０μl（濃度５mM、
５０nmol）と緩衝液（0.1 M Na-Pi、５mM EDTA、pH 7.
5）を加え、暗所にて一晩室温で反応させた。反応液
を、２５％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸溶
液で平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（東ソー
ODS-80Ts、直径4.6 mm、長さ２５cm）にアプライし、１
ｍｌ／分の流速にて、３０分間にわたって２５−５５％
のアセトニトリルの濃度直線勾配をかけて標識ペプチド
を溶出し、分取した。検出は２８０nmの吸収にて行っ
た。標識ペプチドの収量は、約８０％であった。標識ペ
プチドの濃度は、５７０nmにおけるモル吸光係数を93,0
00として、吸光度測定によって決定した。
【００３６】（トリプシン活性の測定） （１）トリプシンによる反応 ４％ファルマライト（pH 3-10、ファルマシアバイオテ
ク社製）、0.1％Tween 20の溶液をNaOHでpH８に調製し
た溶液を反応用緩衝液として用いた。トリプシンは、Si
gma社より購入し、反応用緩衝液に１μg／mlの濃度にな
るように溶解した。前記で調製したＬＢＲヨードアセト
アミドで標識したペプチド基質を10-8Mの濃度にて含む
反応用緩衝液１０μlに、トリプシン溶液１μl（トリプ
シン１ng）を加え、３７℃で１０分間、インキュベート
した。その後、１μｌの反応用緩衝液に溶解したダイズ
トリプシンインヒビター１００ngを加え反応を停止し
た。
ク社製）、0.1％Tween 20の溶液をNaOHでpH８に調製し
た溶液を反応用緩衝液として用いた。トリプシンは、Si
gma社より購入し、反応用緩衝液に１μg／mlの濃度にな
るように溶解した。前記で調製したＬＢＲヨードアセト
アミドで標識したペプチド基質を10-8Mの濃度にて含む
反応用緩衝液１０μlに、トリプシン溶液１μl（トリプ
シン１ng）を加え、３７℃で１０分間、インキュベート
した。その後、１μｌの反応用緩衝液に溶解したダイズ
トリプシンインヒビター１００ngを加え反応を停止し
た。
【００３７】（２）キャピラリー等電点電気泳動による
分離 上記の反応液を、内壁を直鎖状ポリアクリルアミドでコ
ーティング処理した溶融シリカキャピラリー（内径５０
μm、外径３７５μm、全長２２cm、ジーエルサイエンス
社製）に充填し、陽極液として２０mMリン酸溶液、陰極
液として２０mMＮａＯＨ溶液を用いて、0.5 kV／cmで５
分間通電することにより、等電点への焦点化を行った。
その後、電場をかけ続けると同時に、陽極を陰極より５
cm高く上げ、焦点化した試料を陰極方向へと移動させキ
ャピラリーより溶出させた。検出は、キャピラリーの陰
極端より２cmの位置にて行った。
分離 上記の反応液を、内壁を直鎖状ポリアクリルアミドでコ
ーティング処理した溶融シリカキャピラリー（内径５０
μm、外径３７５μm、全長２２cm、ジーエルサイエンス
社製）に充填し、陽極液として２０mMリン酸溶液、陰極
液として２０mMＮａＯＨ溶液を用いて、0.5 kV／cmで５
分間通電することにより、等電点への焦点化を行った。
その後、電場をかけ続けると同時に、陽極を陰極より５
cm高く上げ、焦点化した試料を陰極方向へと移動させキ
ャピラリーより溶出させた。検出は、キャピラリーの陰
極端より２cmの位置にて行った。
【００３８】蛍光物質の励起はヘリウム−ネオンレーザ
ー（波長543.5 nm、出力１mW、モデル05-LGR-151-S、メ
レスグリオ社製）を用いて行い、発生した蛍光を４０倍
の対物レンズにて集光した後、バンドパルスフィルター
（590 nm、30 nmバンド幅、モデルDIF-BP-3、日本真空
光学社製）を通して光電子増倍管（モデルR1387、浜松
ホトニクス社製）にて測定し、測定結果はインテグレー
ター（モデルCR4A、島津製作所社製）を用いて解析し
た。その結果を、図１及び図２に示す。
ー（波長543.5 nm、出力１mW、モデル05-LGR-151-S、メ
レスグリオ社製）を用いて行い、発生した蛍光を４０倍
の対物レンズにて集光した後、バンドパルスフィルター
（590 nm、30 nmバンド幅、モデルDIF-BP-3、日本真空
光学社製）を通して光電子増倍管（モデルR1387、浜松
ホトニクス社製）にて測定し、測定結果はインテグレー
ター（モデルCR4A、島津製作所社製）を用いて解析し
た。その結果を、図１及び図２に示す。
【００３９】（３） 酵素活性の測定 上記の如くしてトリプシンの反応液を蛍光検出キャピラ
リー等電点電気泳動により分析したところ、焦点化バン
ドの移動開始後約４分と5.3分に大きな蛍光ピークが見
られた（図１）。一方、トリプシンを加えない場合に
は、5.3分の位置に蛍光標識されたペプチド基質が見ら
れるのみであった（図２）。約４分の位置に現れるピー
クは、別途合成した蛍光標識ペプチド断片との比較によ
り、用いた蛍光標識ペプチド基質からArgよりＣ末端側
のペプチドがはずれた蛍光標識ペプチド断片であること
が確認され、トリプシンの触媒作用による生産物である
ことが確認された。この生産物は、計算によると基質よ
り高い等電点を有するが、実際にもその通りと成ってお
り、塩基性側から検出を行うと、基質より先に生産物が
検出された。また、ピークより計算すると、この生産物
の量は6.1×10-15molであり、１ngのトリプシンの活性
が満足に測定できた。この結果は、この測定法がさらに
少量の、例えば100 pg以下のトリプシンでも十分にその
活性を検出できることを示している。
リー等電点電気泳動により分析したところ、焦点化バン
ドの移動開始後約４分と5.3分に大きな蛍光ピークが見
られた（図１）。一方、トリプシンを加えない場合に
は、5.3分の位置に蛍光標識されたペプチド基質が見ら
れるのみであった（図２）。約４分の位置に現れるピー
クは、別途合成した蛍光標識ペプチド断片との比較によ
り、用いた蛍光標識ペプチド基質からArgよりＣ末端側
のペプチドがはずれた蛍光標識ペプチド断片であること
が確認され、トリプシンの触媒作用による生産物である
ことが確認された。この生産物は、計算によると基質よ
り高い等電点を有するが、実際にもその通りと成ってお
り、塩基性側から検出を行うと、基質より先に生産物が
検出された。また、ピークより計算すると、この生産物
の量は6.1×10-15molであり、１ngのトリプシンの活性
が満足に測定できた。この結果は、この測定法がさらに
少量の、例えば100 pg以下のトリプシンでも十分にその
活性を検出できることを示している。
【００４０】
【発明の効果】以上の結果は、本発明の測定方法が、数
ｐＭ以下の濃度のペプチドを検出できることを示してお
り、本発明の酵素活性測定方法が、非常に高感度であ
り、特に微量の酵素の活性を測定するのに適しているこ
とを示している。
ｐＭ以下の濃度のペプチドを検出できることを示してお
り、本発明の酵素活性測定方法が、非常に高感度であ
り、特に微量の酵素の活性を測定するのに適しているこ
とを示している。
【図１】トリプシンを加えた系での、蛍光検出キャピラ
リー等電点電気泳動を行った際の移動時間と蛍光強度を
示す図である。ピーク１は、反応生成物であり、ピーク
２は、蛍光標識ペプチド基質である。
リー等電点電気泳動を行った際の移動時間と蛍光強度を
示す図である。ピーク１は、反応生成物であり、ピーク
２は、蛍光標識ペプチド基質である。
【図２】トリプシンを加えていない系での、蛍光検出キ
ャピラリー等電点電気泳動を行った際の移動時間と蛍光
強度を示す図である。ピーク２は、蛍光標識ペプチド基
質である。
ャピラリー等電点電気泳動を行った際の移動時間と蛍光
強度を示す図である。ピーク２は、蛍光標識ペプチド基
質である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高本 尚宜 静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分 子バイオホトニクス研究所内 (72)発明者 牧野 強 静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分 子バイオホトニクス研究所内 (72)発明者 大須賀 慎二 静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分 子バイオホトニクス研究所内 (56)参考文献 特開 平３−251598（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／28166（ＷＯ，Ａ１) Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．25，Ｎｏ．２, （1995）ｐ．341−345 生物物理化学 Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．６ （1995）ｐ．349−353 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66 G01N 27/447 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (11)
- 【請求項１】 合成オリゴペプチドを基質として用いる
酵素活性測定方法において、 該合成オリゴペプチドが、ローダミン、フルオレセイ
ン、シアニン（Ｃｙ３を除く）、インドシアニン、イン
ドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キ
ナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニル
メレイミド及びアントラセンからなる群より選ばれる少
なくとも１つの発蛍光団色素と結合しており、 かつ、該合成オリゴぺプチドがプロテアーゼ、蛋白質リ
ン酸化酵素及び転移酵素からなる群より選ばれるいずれ
か一つの酵素の作用により、該合成オリゴペプチドと異
なる等電点を有する１又は２以上のオリゴペプチドを生
じるようなアミノ酸配列を有し、 該酵素の作用によって生じた該１又は２以上のオリゴペ
プチドを蛍光検出等電点電気泳動法を用いて検出するこ
とを特徴とする酵素活性測定方法。 - 【請求項２】 前記発蛍光団色素が結合基を介して前記
合成オリゴペプチドに結合してなることを特徴とする請
求項１に記載の酵素活性測定方法。 - 【請求項３】 前記蛍光検出等電点電気泳動法が蛍光検
出キャピラリー電気泳動法であることを特徴とする請求
項１又は２に記載の酵素活性測定方法。 - 【請求項４】 前記酵素がプロテアーゼであることを特
徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の酵素活性
測定方法。 - 【請求項５】 前記合成オリゴペプチドが、トリプシン
又はキモトリプシンの基質であることを特徴とする請求
項１〜４のいずれか一つに記載の酵素活性測定方法。 - 【請求項６】 等電点電気泳動法を用いた酵素活性測定
用の合成オリゴペプチド基質において、 該合成オリゴペプチドが、ローダミン、フルオレセイ
ン、シアニン（Ｃｙ３を除く）、インドシアニン、イン
ドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キ
ナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニル
メレイミド及びアントラセンからなる群より選ばれる少
なくとも１つの発蛍光団色素と結合しており、 かつ、該合成オリゴぺプチドがプロテアーゼ、蛋白質リ
ン酸化酵素及び転移酵素からなる群より選ばれるいずれ
か一つの酵素の作用により、該合成オリゴペプチドと異
なる等電点を有する１又は２以上のオリゴペプチドを生
じるようなアミノ酸配列を有していることを特徴とする
合成オリゴペプチド基質。 - 【請求項７】 前記発蛍光団色素が、シアニン（Ｃｙ３
を除く）、インドシアニン、インドカルボシアニン、ピ
ロニン、キナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロ
アンセニルメレイミド及びアントラセンのうちの少なく
とも一つであることを特徴とする請求項６に記載の合成
オリゴペプチド基質。 - 【請求項８】 前記発蛍光団色素が、ローダミン又はシ
アニン（Ｃｙ３を除く）のいずれかであることを特徴と
する請求項６に記載の合成オリゴペプチド基質。 - 【請求項９】 前記発蛍光団色素が、リサミンローダミ
ンＢであることを特徴とする請求項６に記載の合成オリ
ゴペプチド基質。 - 【請求項１０】 前記合成オリゴペプチド基質が、プロ
テアーゼ活性測定用基質であることを特徴とする請求項
６〜９のいずれか一項に記載の合成オリゴペプチド基
質。 - 【請求項１１】 前記合成オリゴペプチド基質が、トリ
プシン又はキモトリプシンの基質であることを特徴とす
る請求項６〜９のいずれか一項に記載の合成オリゴペプ
チド基質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19507996A JP3207120B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 酵素活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19507996A JP3207120B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 酵素活性測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033197A JPH1033197A (ja) | 1998-02-10 |
| JP3207120B2 true JP3207120B2 (ja) | 2001-09-10 |
Family
ID=16335208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２，（１９９５）ｐ．３４１−３４５ |
| 生物物理化学 Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．６（１９９５）ｐ．３４９−３５３ |
Also Published As
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