JP4713835B2 - 酵素活性測定方法 - Google Patents
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Description
i)酵素活性を高める反応混合物中で基質の1種以上の標識の蛍光寿命を測定する段階、
ii)反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii)段階ii)の後に1種以上の蛍光標識の蛍光寿命の増加を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法が提供される。
i)酵素活性を高める反応混合物中で基質の1種以上の標識の蛍光強度を測定する段階、
ii)反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii)段階ii)の後に1種以上の蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法が提供される。
R2及びR3基はZ1環構造に結合していると共に、R4及びR5基はZ2環構造に結合しており、
Z1及びZ2は1又は2の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される2以下の原子から選択される5又は6の原子を有しており、
R1、R2、R3、R4及びR5は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル、−E−F基(式中、Eは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される1〜60の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Fは標的結合基である。)及び−(CH2−)nY基(式中、Yはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である。)から独立に選択される。
R3及びR4基はZ1環構造に結合していると共に、R5及びR6基はZ2環構造に結合しており、
Z1及びZ2は1又は2の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される2以下の原子から選択される5又は6の原子を有しており、
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル、−E−F基(式中、Eは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される1〜60の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Fは標的結合基である。)及び−(CH2−)nY基(式中、Yはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である。)から独立に選択される。
i)試験剤の存在下で上述したような本発明の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下での酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。
i)試験剤の存在下及び不存在下で上述したような本発明の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下及び不存在下で酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。
i)無細胞環境中で基質の標識の蛍光強度及び/又は蛍光寿命を測定する段階、
ii)1以上の細胞に基質を添加する段階、及び
iii)段階ii)の後に蛍光標識の蛍光強度及び/又は寿命を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び/又は蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素の活性及び局在の両方を測定できる、方法が提供される。
i)上述したような基質、及び
ii)該基質を開裂できる酵素
を含んでなるキットが提供される。
i)酵素活性を高める反応混合物中で標識の蛍光強度及び/又は蛍光寿命を測定する段階、
ii)反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii)段階ii)の後に蛍光標識の蛍光強度及び/又は寿命の減少を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び/又は寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法が提供される。
i)試験剤の存在下で上述したような本発明の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下での酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。試験剤は、例えば、合成分子又は天然物(例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド)のような任意の有機又は無機化合物であり得るか、或いはエネルギー形態(例えば、光又は熱又は他の形態の電磁放射)であり得る。
i)試験剤の存在下及び不存在下で上述したような方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下及び不存在下で酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。
i)無細胞環境中で標識の蛍光強度及び/又は蛍光寿命を測定する段階、
ii)1以上の細胞に基質及び反応体を添加する段階、並びに
iii)段階ii)の後に蛍光標識の蛍光強度及び/又は寿命を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び/又は蛍光寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素の活性及び局在の両方を測定できる、方法が提供される。
i)上述したような基質及び反応体、並びに
ii)基質を反応体に結合できる酵素
を含んでなるキットが提供される。
図1は、サーモリシンによる6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAYの消化を示し、
図2は、ペプシンによる6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAYの消化を示し、
図3は、キモトリプシンによる6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAYの消化を示し、
図4は、サーモリシンによる6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAF−NO2の消化を示し、
図5は、Asp−nによる6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−CHLDIIWの消化を示し、
図6は、マトリックスメタロプロテイナーゼ3による6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−RPKPVE(Nva)WRKの消化を示し、
図7は、ペプスタチンAによるプロテアーゼ酵素カテプシンDの阻害を示し、
図8は、ペプスタチンAによるペプシンの阻害を示し、
図9は、キモスタチンによるキモトリプシンの阻害を示す。
6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAY−OHの合成
標準的なHBTU/DIEA結合による固相FastMoc化学を用いてABI 433a合成装置で合成を行った。次のアミノ酸、即ちTyr(tBu)については、fmoc保護アミノ酸の二次保護を使用した。
プロテアーゼ基質(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−Ala−Ala−Phe−Phe−Ala−Ala−Tyr[AAFFAAY])をトリス緩衝液(100mM、pH8.0)で100nMに希釈した。マイクロタイタープレート中の標識基質の溶液(100μl)に、10ngのサーモリシン(容積10μl)を添加した。プロテアーゼ添加前の蛍光基線及びその後の強度増加を適当な波長で記録した。蛍光化学種の寿命も記録した。結果を図1に示す。未変化の基質では、蛍光の効率的な消光の結果として低い信号が生じる。プロテアーゼで触媒される基質の加水分解はこの消光を取り除き、蛍光を回復させる。蛍光強度の増加は連続的に監視でき、プロテアーゼ活性に比例する。生成物及び基質の寿命は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能である。固有の寿命は、反応の進行の物理化学的マーカーを提供する。
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−AAFFAAY(125nM、0.1Mクエン酸塩緩衝液(pH3.6)、0.005%Tween20中)80μlに、10μlの緩衝液及び10μlのペプシン(0〜2ng)を添加した。酵素の代わりに10μlの緩衝液を有する無酵素対照品(NEC)も使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。基質の寿命(10.3ns)及び生成物の寿命(13.8ns)は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能であった。結果を図2に示す。
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−AAFFAAY(100nM、50mMトリス緩衝液(pH7.8)、10mM CaCl2、0.005%Tween(商標)20中)100μlに、10μlのキモトリプシン(0〜4ng)を添加した。酵素の代わりに10μlの緩衝液を有する無酵素対照品(NEC)も使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。トリス緩衝液中での基質の寿命(11.5ns)及び生成物の寿命(14.5ns)は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能であった。結果を図3に示す。
アクリドン標識ペプチドNH−AAFFAAF(NO 2 )−NH 2 の合成
標準的なFmoc化学を用い、Applied Biosystemsモデル433Aペプチド合成装置でペプチドを合成した。合成の終了時にN−末端Fmoc基を除去した。しかし、保護されたペプチドは固形支持体に結合したままに残され、この状態でO−(N−スクシンイミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノエートと反応させた。次いで、標準技術を用いて標識ペプチドを固形支持体から開裂し、逆相HPLCで精製した。
セルに入れたプロテアーゼ基質6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−AAFFAAF−ニトロ(1μM、PBS緩衝液(pH7)中)2000μlに、100μlのサーモリシン(1単位/μl)を添加した。酵素の代わりに100μlの緩衝液を有する無酵素対照品(NEC)も含めた。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。伸張指数型非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。基質の寿命(2.5ns)及び生成物の寿命(13.7ns)は著しく異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能であった。結果を図4に示す。
プロテアーゼ酵素のアッセイ
Asp−nプロテアーゼ基質(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−Ala−Ala−Phe−Phe−Ala−Ala−Tyr[AAFFAAY])をトリス緩衝液(100mM、pH8.0)で100nMに希釈した。マイクロタイター中の標識基質の溶液(100μl)に、10ngの酵素(容積10μl)を添加した。プロテアーゼ添加前の蛍光基線及びその後の強度増加を適当な波長で記録した。蛍光化学種の寿命も記録した。結果を図5に示す。未変化の基質では、蛍光の効率的な消光の結果として低い信号が生じる。プロテアーゼで触媒される基質の加水分解はこの消光を取り除き、蛍光を回復させる。蛍光強度の増加は連続的に監視でき、プロテアーゼ活性に比例する。生成物及び基質の寿命は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能である。固有の寿命は、反応の進行の物理化学的マーカーを提供する。
アクリドン標識ペプチドRPKPVE(Nva)WRKの合成及び標識
標準的なFmoc化学を用い、Applied Biosystemsモデル431Aペプチド合成装置でペプチドを合成した。合成の終了時にN−末端Fmoc基を除去したが、保護されたペプチドは固形支持体に結合したままに残され、この状態でO−(N−スクシンイミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノエートと反応させた。次いで、標準技術を用いて標識ペプチドを固形支持体から開裂し、逆相HPLCで精製した。
MMP−3基質(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−Arg−Pro−Lys−Pro−Val−Glu−Nva−Trp−Arg−Lys−NH2(ここで、Nvaはノルバリンである))(250nM)を、150mM塩化ナトリウム、10mM塩化カルシウム、10μM塩化亜鉛及び0.05%w/vのBrij(登録商標)−35を含む50mMトリス緩衝液(pH7.5)中のMMP−3酵素(0〜24nM)と共に、周囲温度で2時間インキュベートした。黒色の不透明96ウェルプレートを用い、100μlの最終反応容積でアッセイを行った。PMTベースのライフタイムプレートリーダー上で蛍光信号を記録した。
プロテアーゼ阻害剤のアッセイ:カテプシンD活性の阻害
0.005%Tween(商標)20を含む0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.6)中のウシ腎臓カテプシンD酵素(3ng/ウェル)の存在下又は不存在下で、ペプチド基質6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸標識AAFFAAY(100nM)を室温でインキュベートした。黒色の不透明96ウェルプレートを用い、100μlの最終反応容積で周囲温度でアッセイを行った。PMTベースのライフタイムプレートリーダー上で蛍光信号を測定した。阻害試験のためには、ペプスタチンAを0〜12nMの範囲で使用した。
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−AAFFAAY(125nM、0.1Mクエン酸塩緩衝液(pH3.6)、0.005%Tween20中)80μlに、10μlのペプスタチンA及び10μlのペプシン(0.5ng)を添加した。ペプスタチンAは0〜10nMの範囲で使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。図8の結果は、ペプスタチンAが0.88nMの見掛けIC50でペプチド基質のペプシン消化を阻害することを示している。
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−AAFFAAY(125nM、50mMトリス緩衝液(pH7.8)、10mM CaCl2、0.005%Tween(商標)20中)80μlに、10μlのキモスタチン及び10μlのキモトリプシン(1ng)を添加した。キモスタチンは0〜100nMの範囲で使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。図9の結果は、キモスタチンが1.48nMの見掛けIC50でペプチド基質のキモトリプシン消化を阻害することを示している。
6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸−RPKPVE(Arg−Pro−Lys−Pro−Val−Glu)の合成
固相FastMoc化学を用い、ABI 433a合成装置でペプチドRPKPVEを合成した。上記実施例1と同様にして、これを6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸で標識し、樹脂から開裂し、HPLCで精製した。
前述の実施例と同様にして、ペプチドRPKPVENvaWRKを合成し、6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサン酸で標識し、精製した。
表2に示す通り、非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで各ペプチドの蛍光寿命が得られた。
Claims (26)
- 1以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含むポリマーに、アクリドン又はキナクリドン染料から選択される1種類の蛍光標識が結合した基質にして、前記部分が酵素で開裂可能な結合基で前記1種類の蛍光標識から隔てられている基質の開裂に関する前記酵素の活性を測定する方法であって、
i)酵素活性を高める反応混合物中で基質の前記蛍光標識の蛍光寿命を測定する段階、
ii)前記反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii)段階ii)の後に前記蛍光標識の蛍光寿命の増加を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定でき、さらに、各々が複数の異なる標識に結合された複数の異なる基質を使用することを含んでなり、前記標識の各々がその固有の蛍光発光及び/又はその蛍光寿命で他のものから個別に識別可能であり、それによって複数の酵素開裂活性の同時測定が可能である、方法。 - 蛍光標識が次式のアクリドン染料である、請求項1記載の方法。
R2及びR3基はZ1環構造に結合していると共に、R4及びR5基はZ2環構造に結合しており、
Z1及びZ2は1又は2の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される2以下の原子から選択される5又は6の原子を有しており、
R1、R2、R3、R4及びR5は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル、−E−F基(式中、Eは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される1〜60の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Fは標的結合基である。)及び−(CH2−)nY基(式中、Yはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である。)から独立に選択される。) - 蛍光標識が次式のキナクリドン染料である、請求項1記載の方法。
R3及びR4基はZ1環構造に結合していると共に、R5及びR6基はZ2環構造に結合しており、
Z1及びZ2は1又は2の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される2以下の原子から選択される5又は6の原子を有しており、
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル、−E−F基(式中、Eは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される1〜60の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Fは標的結合基である。)及び−(CH2−)nY基(式中、Yはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である。)から独立に選択される。) - 前記ポリマーが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ核酸、タンパク質核酸、多糖及びポリグリセリドからなる群から選択される、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- ポリマーが4〜40のアミノ酸残基を含む、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 前記結合基がECクラス3の酵素で開裂可能である、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 酵素が、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、ヌクレアーゼ及びグリコシダーゼから選択されるヒドロラーゼ酵素である、請求項6記載の方法。
- 前記ペプチダーゼが、アンギオテンシン変換酵素(ACE)、カスパーゼ、カテプシンD、キモトリプシン、ペプシン、ズブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、asp−n、マトリックスメタロプロテイン1〜20、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼ及びウロキーゼからなる群から選択される、請求項7記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、エキソデオキシリボヌクレアーゼIII(E.C.3.1.112)、エキソデオキシリボヌクレアーゼI(E.C.3.1.11.1)、エキソデオキシリボヌクレアーゼV(E.C.3.1.11.5)、ヘビ毒エキソヌクレアーゼ(E.C.3.1.15.1)、デオキシリボヌクレアーゼI(E.C.3.1.21.1)、デオキシリボヌクレアーゼII(E.C.3.1.22.1)、リボヌクレアーゼH(E.C.3.1.26.4)、リボヌクレアーゼT1(E.C.3.1.27.3)、膵臓リボヌクレアーゼ(E.C.3.1.27.5)及びミクロコッカスヌクレアーゼ(E.C.3.1.31.1)からなる群から選択されるエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼである、請求項7記載の方法。
- 前記グリコシダーゼが、α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.1)、β−アミラーゼ(E.C.3.2.1.2)、グルカン1,4−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.3)、セルラーゼ(E.C.3.2.1.4)、エンド−1,3−グルカナーゼ(E.C.3.2.1.6)、オリゴ−1,6−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.10)及びリゾチーム(E.C.3.2.1.17)からなる群から選択される、請求項7記載の方法。
- 基質の開裂についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
i)前記試験剤の存在下で請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下での前記酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での前記既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。 - 既知値が電子データベース上に保存されている、請求項11記載の方法。
- 基質の開裂についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
i)試験剤の存在下及び不存在下で請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下及び不存在下で前記酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。 - 試験剤の不存在下及び存在下での酵素の活性間における前記活性の差が基準化され、電子的に保存され、参照化合物の値と比較される、請求項13記載の方法。
- 酵素が請求項7乃至請求項10のいずれか1項に定義した酵素から選択される、請求項11乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- 6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAY、6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−AAFFAAF(ニトロ)、6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−CHLDIIW及び6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)ヘキサノイル−RPKPVE(Nva)WRKからなる群から選択される基質。
- 請求項16記載の基質の、酵素開裂活性の測定用及び/又はインビトロ撮影プローブとしての使用。
- i)請求項16記載の基質、及び
ii)前記基質を開裂できる酵素
を含んでなるキット。 - 反応体への基質の結合に関する酵素の活性を測定する方法であって、前記基質がアクリドン又はキナクリドン染料から選択される1種類の蛍光標識からなり、かつ前記反応体が1以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含むものであるか、或いは前記反応体がアクリドン又はキナクリドン染料から選択される1種類の蛍光標識からなり、かつ前記基質が1以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含むものであり、当該方法が、
i)酵素活性を高める反応混合物中で前記蛍光標識の蛍光寿命を測定する段階、
ii)前記反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii)段階ii)の後に前記蛍光標識の蛍光寿命の減少を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素活性を測定でき、さらに、各々が複数の異なる標識に結合された複数の異なる基質及び/又は反応体を使用することを含んでなり、前記標識の各々がその固有の蛍光発光及び/又はその蛍光寿命で他のものから個別に識別可能であり、それによって複数の酵素結合活性の同時測定が可能である、方法。 - 蛍光標識が、請求項2記載のアクリドン染料又は請求項3記載のキナクリドン染料である、請求項19記載の方法。
- 基質及び/又は反応体が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ核酸、タンパク質核酸、多糖及びポリグリセリドからなる群から選択される、請求項19又は請求項20記載の方法。
- 酵素がECクラス6のリガーゼ又はECクラス2のトランスフェラーゼである、請求項19乃至請求項21のいずれか1項記載の方法。
- 反応体への基質の結合についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
i)試験剤の存在下で請求項19乃至請求項22のいずれか1項記載の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下での前記酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での前記既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。 - 既知値が電子データベース上に保存されている、請求項23記載の方法。
- 反応体への基質の結合についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
i)試験剤の存在下及び不存在下で請求項19乃至請求項22のいずれか1項記載の方法を実施する段階、及び
ii)試験剤の存在下及び不存在下で前記酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。 - 試験剤の不存在下及び存在下での酵素の活性間における前記活性の差が基準化され、電子的に保存され、参照化合物の値と比較される、請求項25記載の方法。
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