DE69725901T2

DE69725901T2 - Methode zur bestimmung von proteolytischen enzymen unter benutzung von fluoreszenzgelöschten substraten

Info

Publication number: DE69725901T2
Application number: DE69725901T
Authority: DE
Inventors: Maria Johannes TE KOPPELE; Bob Beekman
Original assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Priority date: 1996-01-04
Filing date: 1997-01-02
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2017-01-03
Also published as: EP1019528B1; WO1997025437A1; US6127139A; EP1019528A1; DE69725901D1; JP2000503533A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines proteolytischen Enzyms, umfassend die Verwendung eines Substrats mit einem Fluoreszenzmarker und einem Fluoreszenquencher.
Fluorometrische Tests für proteolytische Enzyme, bei denen ein Peptidsubstrat, das durch das Enzym spezifisch gespalten wird und ein Fluorophor auf der einen Seite und einen Fluoreszenzquencher auf der anderen Seite der Spaltstelle trägt, verwendet wird, sind auf dem Stand der Technik bekannt. So offenbart beispielsweise EP-A-428000 fluoreszenzgelöschte Substrate zum Nachweis viraler proteolytischer Enzyme, wobei die Substrate aus Peptidsequenzen bestehen, die durch die virale Protease spezifisch gespalten werden können, an die ein Fluoreszenzgeber, wie beispielsweise 5-(2-Aminoethylamino)naphthalen-1-sulfonsäure (Edans), und ein Quencher, wie beispielsweise 4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (Dabcyl) gebunden sind. Bei Kontakt mit dem spezifischen proteolytischen Enzym wird das Peptid gespalten, und der Fluoreszenzgeber wird vom Quenchingakzeptor entfernt, so dass die Bestrahlung zu einer nachweisbaren Fluoreszenz führt, die ein Maß für die spezifische Enzymaktivität darstellt. Ein ähnliches System zum Nachweis von retroviralen Proteasen wird in EP-A-435845 offenbart. Fluorogene Substrate, die durch Matrix-Metalloproteinase-3 (MMP-3) selektiv hydrolysiert werden können und an die ein substituiertes Cumarin und 2,4-Dinitrophenyl als Fluorophor bzw. Quencher gebunden sind, sind von Nagase et al., J. Biol. Chem. 269, 20952–20957 (1994) beschrieben. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von derart intern gelöschten fluorogenen Proteasesubstraten mit dem Edans-/Dabcyl-System, ist von Maggiora et al., J. Med. Chem. 35, 3727–3730 (1992) beschrieben.
Obwohl diese bekannten Substrate und Verfahren die Bestimmung von proteolytischen Enzymen mit angemessener Genauigkeit ermöglichen, wurden die bekannten Substrate und Verfahren mit fluorogenen Proteinasesubstraten mit gereinigten Enzymen und kaum mit komplexen biologischen Medien (z. B. Zellkulturmedien, Gelenkschmiere und anderen Gewebeflüssigkeiten) verwendet. Es ist wahrscheinlich, dass diese Substrate und Verfahren Störungen durch Fluoreszenz oder Licht absorbierende Bestandteile von komplexeren Lösungen als gereinigten Enzymen unterliegen. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung proteolytischer Enzyme unter Verwendung von immobilisierten fluoreszenzgelöschten Substraten bereitgestellt.
Im Falle von immobilisierten fluoreszenzgelöschten Substraten, beispielsweise auf Mikrotiterplatten, bleiben die fluoreszenten Fragmente nach der proteolytischen Spaltung an den unlöslichen Carrier gebunden. Somit können die störenden Bestandteile des Reaktionsgemisches (z. B. Blut) auf einfache Weise entfernt und damit eine reine Lösung zur Verwendung in dem tatsächlichen Messvorgang bereitgestellt werden. Als Ergebnis wird eine empfindlichere und zuverlässigere Bestimmung der proteolytischen Enzymaktivität erreicht.
Kleine Peptidsubstrate für proteolytische Enzyme haben den Nachteil, dass sie durch Komplexe mit hohem Molekulargewicht aus Proteinase und Inhibitor noch immer hydrolysiert werden können, wie es bei durch α2-Makroglobulin (α2MG) gehemmte Matrix-Metalloproteinasen der Fall ist. Genauso wie MMP-α2MG-Komplexe die physiologischen Substrate mit hohem Molekulargewicht wie beispielsweise Proteoglycane Plasmaproteine und Collagenproteine nicht hydrolysieren können, überschätzen lösliche Peptidsubstrate die tatsächliche proteolytische Aktivität. Immobilisierte fluoreszenzgelöschte Proteinasesubstrate lassen sich durch diesen Nachteil nicht beeinträchtigen: als Folge ihrer Immoblisierung werden sie durch MMP-α2MG-Komplexe nicht mehr umgewandelt. In diesem Fall und allen nachstehend genannten Fällen ist der Ausdruck "immoblisiert" nicht auf ei nen unlöslichen Carrier beschränkt. Auch lösliche Carrier, wie beispielsweise Albumin, und auf eine beliebige Art und Weise abgeleitete Makromoleküle können verwendet werden. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "Makromoleküle" so verstanden, dass diese ein Moleklargewicht von mehr als 5 kDa, insbesondere mehr als 10 kDa besitzen.
Ein weiterer Aspekt des Immobilisierungsverfahrens besteht darin, dass der Carrier (Mikrotiterplatte, Papierstreifen oder anderer Streifen) vor Durchführung des Tests getrocknet werden kann. Dies bietet den Vorteil, dass reproduzierbare und zweckmäßige Testkits entwickelt werden können, die von der den Test durchführenden Person einen minimalen Aufwand erfordern. Wichtiger noch ist, dass der "Trockenformattest" eine Bestimmung der proteolytischen Aktivität ohne Verdünnung der Probe ermöglicht: er kann direkt auf den Carrier aufgebracht werden. Daher wird eine Verdünnung der biologischen Proben mit proteolytischen Enzymen, die reversible, synthetische Inhibitoren enthalten, vermieden. Dies stellt einen Vorteil dar, da eine Verdünnung derartiger Proben wahrscheinlich das Gleichgewicht aus proteolytischem Enzym und Inhibitor stört und somit Artefakte gemessen werden.
Eine Immobilisierung fluoreszenzgelöschter Substrate eröffnet zusätzliche neue Möglichkeiten, die Enzymaktivität von Proteinasen zu bestimmen.

1) Wenn sie in Acrylatgel immobilisiert sind, können Tests des Zymographie-Typs (vgl. Hanemaaijer et al., Biochem. J. (1993) 296, 803–809) durchgeführt werden: zuerst werden die proteolytischen Enzyme und ihre Proformen auf der Grundlage ihres Molekulargewichts aufgetrennt. Nachdem Bestandteile der Elektrophorese wie Natriumdodecylsulfat ausgewaschen wurden, renaturieren die Proteinasen und ihre Proformen und werden aktiv. Bei immobilisierten fluoreszenzgelöschten Substraten wird ein Anstieg der Fluoreszenz beobachtet. Die Vorteile gegenüber einer herkömmlichen Zymographie sind wie folgt: die Peptide stellen allgemeinere Substrate dar (beispielsweise können innerhalb eines Gels mehrere MMPs und Proformen nachgewiesen werden im Gegensatz zur herkömmlichen Zymographie, bei der das eingeschlossene Substrat Gelatine oder Kasein oder andere dazu führen, dass der Test mehr oder weniger spezifisch für (eine Gruppe von) Enzyme(n) ist; Selektiviät auf spezifische Proteinasen kann durch eine Auswahl der geeigneten Peptidsequenzen erreicht werden. Als solche erlauben synthetische Peptide eine weitaus größere Auswahl zu verwendender Substrate als physiologische Substrate: begrenzte Quellen von beispielsweise Collagen sind verfügbar. Weiterhin ermöglicht die Verwendung immobilisierter fluoreszenzgelöschter Substrate eine ständige Überwachung der Fluoreszenz (im Gegensatz zum herkömmlichen "Endpunkt"-Zymographie-Verfahren). Daher können geringe Mengen von Proteinasen in Anwesenheit von überschüssigen Mengen anderer Proteinasen durch Bestimmung der Fluoreszenz zu einem frühen bzw. späten Zeitpunkt nachgewiesen werden. Die fluoreszenzgelöschte Zymographie ist eine sehr empfindliche Technik, da die Fluoreszenz auf sensitive Art und Weise gemessen werden kann. Darüber hinaus stellt sie ein quantitatives Verfahren dar, und die Messung erfolgt eher durch Zunahme eines Signal als durch Abnahme eines Signals, wie es bei der herkömmlichen Zymographie der Fall ist.
2) Immobilisierte fluoreszenzgelöschte Peptide können in Zellkultursystemen angewendet werden: Züchten der Zellen auf mit fluoreszenzgelöschten Peptiden überzogenen Kulturplatten ermöglicht eine Bestimmung der Herstellung von proteolytischen Enzymen durch die kultivierten Zellen. Die Peptide können zur Untersuchung der Zellenwanderung ebenfalls physikalisch (nicht-kovalent) gebunden sein.
3) Fluoreszenzgelöschte Peptide können bei Gewebeschnitten verwendet werden, indem Gewebe mit einem fluoreszenzgelöschten Substrat in Kontakt gebracht wird: eine Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Messung der proteolytischen Enzymaktivität auf zellulärer Stufe. Diese Anwendung kann mit gelöstem Substrat, vorzugsweise in einem zähflüssigen Medium wie Polyvinylalkohol oder Agarose, durchgeführt werden, um die Diffusion fluoreszenter Produkte zu vermindern. Idealerweise ist das Substrat covalent an ein Makromolekül, mit dem der Objektträger überzogen wird, oder den Objektträger selbst gebunden.

Von Proteinasen ist bekannt, dass sie während physiologischer und pathologischer Prozesse durch enzymatische Verdauung verschiedener Bestandteile der extrazellulären Matrix an der Gewebeneubildung beteiligt sind. Eine Änderung der aktiven proteolytischen Enzyme kann die lokale Anhäufung oder Resorption der extrazellulären Matrix, beispielsweise bei Atherosklerose, Knorpel- und Knochenerneuerung und Wundheilung, regulieren. Der Nachweis von proteolytischen Enzymen durch Immunhistologie erlaubt die Bestimmung lokaler Mengen von Proteinasen. Jedoch unterscheiden verfügbare Antikörper nicht zwischen der Proform, der aktiven Form und der gehemmten Form des Enzyms. Es wäre eher angemessen, eine Methodik zur Bestimmung der lokalen Enzymaktivität proteolytischer Enzyme zu haben, als die bekannten immunologischen Nachweisverfahren zu verwenden. Ein derartiger Aktivitätstest wurde kürzlich von Galis et al. (FASEB J., 9 (1995) 974–980) durch eine in-situ-Zymographie beschrieben. Wie die SDS-PAGE-Format-Zymographie stellt diese einen "Endpunkt"-Test dar. Immoblisierte fluoreszenzgelöschte Substrate sind hervorragend für eine Verwendung bei der mikroskopischen Lokalisierung aktiver Proteinasen geeignet, da eine derartige Verwendung (1) lokale Messungen erlaubt, (2) zeitnahe Messungen erlaubt, (3) ein quantitatives Verfahren darstellt, (4) eher eine Zunahme des Signals als eine Abnahme des Signals misst, (5) die Entfernung eines Gewebeschnitts unter ständiger Beobachtung der Fluoreszenz ermöglicht (der Gewebeschnitt hat einen Abdruck hinterlassen), (6) relativ einfach durchzuführen ist, (7) mit praktisch jedem Puffer anwendbar ist. Im Hinblick auf Punkte 2, 4, 5, 6 und 7 sind die immobilisierten fluoreszenzgelöschten Substrate gegenüber eines in-situ-Zymographie-Formats wie von Galis et al. beschrieben überlegen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines proteolytischen Enzyms, umfassend:

(a) Inkubation einer Enzym enthaltenden Probe mit einem immobilisierten, fluorogenen Peptid der Formel Que-Sub-Flu-Spa-Car oder Flu-Sub-Que-Spa-Car wobei Sub eine Peptidkette ist, die eine spezifische Spaltstelle für das proteolytische Enzym enthält; Flu ein Fluorophor ist; Que ein Quencher ist, der in der Lage ist, Fluoreszenzstrahlung zu absorbieren, die durch das Fluorophor emittiert wird, das ebenfalls die selben Gruppen wie Flu sein kann; Spa eine direkte Bindung oder eine Spacerkette ist; und Car ein unlöslicher und/oder makromolekularer Carrier ist;
(b) optionales Abtrennen der Flüssigkeit vom Carriermaterial;
(c) Bestrahlung des Carriermaterials und Messung der Fluoreszenz.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein immobilisiertes Substrat zur Messung eines proteolytischen Enzyms, enthaltend ein fluroreszenzgelöschtes Peptid der Formel
Que-Sub-Flu-Spa-Car
oder
Flu-Sub-Que-Spa-Car
wobei
Sub eine Peptidkette ist, die eine spezifische Spaltstelle für das proteolytische Enzym enthält;
Flu ein Fluorophor ist;
Que ein Quencher ist, der in der Lage ist, Fluoreszenzstrahlung zu absorbieren, die durch das Fluorophor emittiert wird;
Spa eine direkte Bindung oder eine Spacerkette ist; und
Car ein unlöslicher und/oder makromolekularer Carrier ist, der aus einem Glas- oder Polymerkorn, einer Glasplatte, einer Mikrotiterplatte, einem Papier- oder synthetischen Polymerstreifen oder einem Acrylat- oder Acrylamidgel ausgewählt wird.

Außer den vorstehend definierten Symbolen Flu, Sub, Que, Spa und Car werden in dieser Beschreibung die folgenden Abkürzungen verwendet:

Aad	α-Aminoadipinsäure
Abu	α-Aminobuttersäure.
Cha	β-Cyclohexylalanin
Dabcyl	4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure
DMF	Dimethylformamid
DMSO	Dimethylsulfoxid
DNP	Dinitrophenyl
Eaca	ε-Aminocapronsäure
Edans	5-(2-Aminoethylamino)naphthalen-1-sulfonsäure
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure
EGS	Ethylenglycol-bis(succinimidylsuccinat)
Emc	S-Mercaptoethylcystein
Fmoc	9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Gaba	γ-Aminobuttersäure
HPLC	Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Hse	Homoserin (α-Amino-γ-hydroxybuttersäure)
Hyp	4-Hydroxyprolin
Mca	7-Methoxycumarin-4-essigsäure
Mcc	7-Methoxycumarin-3-Carboxylsäure
MMP	Matrix-Metalloproteinase
Nma	N-Methylanthranilsäure
NMM	N-Methylmorpholin
NMP	N-Methylpyrrolidon
Nle	Norleucin (α-Aminocapronsäure)
Nva	Norvalin (α-Aminovaleriansäure)
Orn	Ornithin (α,δ-Diaminovaleriansäure)
PA	Plasminogenaktivator
PAGE	Polyacrylamidgel-Elektrophorese
PBS	phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung
SDS	Natriumdodecylsulfat
Sec	S-Ethylcystein (α-Amino-β-ethylthio-propionsäure)
Smc	S-Methylcystein (α-Amino-β-methylthio-propionsäure)
TFA	Trifluoressigsäure

Tris	Tris(hydroxymethyl)aminomethan

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Peptidkette Sub gemäß der spezifischen proteolytischen Enzymaktivität während der Bestimmung ausgewählt. Derzeit bekannte proteolytische Enzyme können in Serinproteasen (EC-Nr. 3.4.21), Cysteinproteasen (EC 3.4.22), Asparaginproteasen (EC 3.4.23) und Metalloproteasen (EC 3.4.24) aufgeteilt sein. So ist beispielsweise die Spaltstelle für Matrix-Metalloproteinasen (MMP) Gly-Leu, und die von dem MMP-Enzym zu erkennende Aminosäuresequenz kann Pro-Xax-Gly-Leu sein, wobei Xax eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Pro-Gln-Gly-Leu oder Pro-Leu-Gly-Leu ist. Als weiteres Beispiel spaltet Plasmin spezifisch an der Carboxylfunktion von Lysin, und die spezifische Sequenz kann beispielsweise Ile-Phe-Lys-Xay sein. Diese und andere spezifische Protease-Substratsequenzen sind auf dem Stand der Technik bekannt. Klinisch wichtige Proteasen umfassen die folgenden: Faktor VIIa, Faktor IXa, Faktor Xa, APC, Thrombin, t-PA, u-PA, Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin, Enterokinase, Pepsin, Cathepsine, Angiotensin umwandelndes Enzym, Matrix-Metalloproteinasen (Collagenasen, Stromelysine, Gelatinasen), Elastase, Cir und Cis.
Einige Proteasen, die die relevante Substratspezifität aufweisen, sind wie folgt:
Cathepsin C: Cysteinprotease, die die anschließende Entfernung von N-terminalen Dipeptiden von den Polypeptiden katalysiert. Die Reaktionsrate hängt von der vorletzten Aminosäure ab, wobei sowohl hydrophile als auch hydrophobe Reste akzeptiert werden. Ein Abbau wird durch das N-terminale Lys oder Arg blockiert. Pro als zweite oder dritte Aminosäure verhindert ebenfalls eine Spaltung.
Chymotrypsin: Serinendopeptidase, die Peptidbindungen an den C-Termini von Tyr, Phe und Trp spezifisch hydrolysiert. Leu, Ala, Asp und Glu werden in geringeren Raten gespalten. Wirkt auch bei Amiden und Estern von empfindlichen Aminosäuren.
Elastase: Serinendopeptidase, die Peptidbindungen am C-terminalen Ende von Aminosäuren mit ungeladenen nicht-aromatischen Seitenketten wie Ala, Val, Leu, Gly und Ser hydrolysiert. Faktor Xa: Serinendopeptidase, die Peptidbindungen am Carboxylende von Arg innerhalb der Sequenz -Ile-Glu-Gly-Arg-Xaz (Xaz ist eine beliebige Aminosäure) spezifisch hydrolysiert.
Kallikrein: Serinendopeptidase, die vorzugsweise Peptid- und Esterbindungen am Carboxylende von Arg, insbesondere an Phe-(oder Leu-)-Arg-Xaz-Bindungen hydrolysiert.
Pepsin: Aspartanendopeptidase mit breiter Spezifität. Spaltet vorzugsweise Bindungen am Carboxylende von Phe, Met, Leu oder Trp, das an einen anderen hydrophoben Rest gebunden ist. Tyr-Xaz-Bindungen sind relativ resistent.
Plasmin: Serinendopeptidase, die Peptid- und Esterbindungen am Carboxylende von Lys oder Arg hydrolysiert.
Subtilisin: Unspezifische Serinendopeptidase, die die meisten Peptidbindungen spaltet, insbesondere diejenigen, die an Asp, Glu, Ala, Gly und Val angrenzen.
Thermolysin: Unspezifische Zn-Metallopeptidase, die Peptidbindungen hydrolysiert, die die Aminogruppe hydrophober Aminosäuren mit umfangreichen Seitenketten wie beispielsweise Ile, Leu, Met, Phe, Trp und Val einbeziehen. Die Anwesenheit von Pro am C-Terminus einer hydrophoben Aminosäure verhindert eine Spaltung am N-Terminus der Letzteren.
Thrombin: Serinendopeptidase, die Proteine und Peptide am Carboxylende der basischen Aminosäuren Arg und Lys spezifisch hydrolysiert. Amid- und Esterbindungen von Arg und Lys werden ebenfalls gespalten.
Trypsin: Serinendopeptidase, die Proteine und Peptide am Carboxylende der basischen Aminosäuren Arg und Lys spezifisch hydrolysiert. Amid- und Esterbindungen von Arg und Lys werden ebenfalls gespalten.
Das Verfahren eignet sich beispielsweise zum Bestimmen der Aggrecanaseaktivität. Bekannte Aggrecanasespaltstellen (nachstehend mit
dargestellt), die in einem derartigen Test verwendet werden können, schließen die folgenden ein:
Diese Sequenzen tragen SEQ ID Nrn. 1–9.
In diesen Sequenzen sollten die unterstrichenen Bereiche vorhanden sein, gegebenenfalls mit konservierten Mutationen, wie beispielsweise Ala, Abu, Val, Nva oder Leu für Gly; Ala, Abu, Val, Nva, Ile oder Nle für Leu; Gly, Abu, Val, Nva, Leu, Ile oder Nle für Ala; Gln/Glu, Asn/Asp oder Aad für Glu oder Gln; Lys, Orn, His oder Trp für Arg. Vorzugsweise ist eine zusätzliche Aminosäure an jeder Seite vorhanden, besonders bevorzugt sind zwei zusätzliche und gegebenenfalls drei zusätzliche Aminosäuren an jeder Seite des unterstrichenen Bereichs vorhanden, möglicherweise ebenfalls mit konservierten Mutationen. Oft ist es von Vorteil, in das Substrat eine weitere Teilsequenz von beispielsweise 50–150 Aminosäuren einzuschließen, die dem relevanten Aggrecan entweder in der Sequenz Sub oder in Car oder in Spa entsprechen. Bei den Aggrecanen stammt eine derartige zusätzliche Sequenz vorzugsweise vom C-terminalen Bereich in Bezug auf die Spaltstelle. Ein Beispiel ist die menschliche Aggrecansequenz 382–477, wie in SEQ ID Nr.: 10 dargestellt, die eine oder mehrere Mutationen enthalten kann.
Das Verfahren eignet sich ebenfalls beispielsweise zur Bestimmung des Aggrecanabbaus durch Matrix-Metalloproteinasen. Die bekannte MMP-Spaltstelle (nachstehend mit
dargestellt), die in einem solchen Test verwendet werden kann, schließt die folgende Sequenz ein:
³³⁴Asp-Phe-Val-Asp-Ile-Pro-Asn
Phe-Phe-Gly-Val-Gly-Gly-³⁴⁸Glu (SEQ ID Nr.: 11) (menschliches Aggrecan, gespalten durch MMP-1, -2, -3, -7, -8, -9 und -13). Der unterstrichene Bereich sollte in der Sequenz des Substrats vorhanden sein, wobei konservative Austausche von ³³⁹Pro (z. B. durch Hyp) und ³⁴²Phe (z. B. durch Tyr, Trp von (Anmerkung des Übersetzers: Vermutlich Tippfehler im Orginaltext; müsste wohl "oder" heißen) Cha) erlaubt sind. Vorzugsweise ist eine zusätzliche Aminosäure an jeder Seite, besonders bevorzugt sind zwei zusätzliche und gegebenenfalls drei zusätzliche Aminosäuren an jeder Seite des unterstrichenen Bereichs vorhanden. In diesem Fall kann es auch von Vorteil sein, eine weitere Teilsequenz von beispielsweise 50–150 Aminosäuren einzuschließen, die dem relevanten Aggrecan entsprechen, wobei die Teilsequenz sowohl vom N-terminalen Ende als auch vom C-terminalen Ende der Spaltstelle stammen kann.
Das Verfahren eignet sich weiterhin beispielsweise zur Bestimmung der Matrix-Metalloproteinaseaktivität. Spaltstellen, die spezifisch beispielsweise für einen MMP-13-Test verwendet werden können, schließen die Sequenz Ala-Arg-Gly-Ser ein, wobei Ala und Gly durch eine andere aliphatische Aminosäure und Ser durch eine andere Hydroxy-aliphatische oder aliphatische Aminosäure ersetzt werden können. Somit kann ein selektives Substrat für MMP-13 z. B. Dabcyl-Gaba-Ile-Thr-Glu-Gly-Gly-Ala-Arg
Gly-Ser-Glu(Edans)-Ile-Lys-HH₂) (SEQ ID Nr.: 12) sein. Eine weitere Spaltstelle, die spezifisch für einen MMP-13-Test verwendet werden kann, schließt die Sequenz Arg-Gly-Leu-Glu ein, wobei Arg durch eine andere positiv geladene Aminosäure oder ein Analogon ersetzt werden kann, und Gly und/oder Leu durch eine andere aliphatische Aminosäure ersetzt werden kann. Somit kann ein selektives Substrat für MMP-13 z. B. Dabcyl-Gaba-Pro-Arg-Gly
Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ sein.
Ähnlich kann Dabcyl-Gaba-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu
Nva-Trp-Arg-Glu(Edans)-Gly-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 13) als selektives fluoreszenzgelöschtes Substrat für Stromelysin (MMP-3) verwendet werden; Nagase et al. (Nagase H., Fields, C. G., Fields, G. B., J. Biol. Chem. 269 (1994) 20952–20957) fanden heraus, dass die Aminosäuresequenz davon hoch selektiv für MMP-3 ist. Die Sequenz (Pro)-Val-Glu-Nva-Trp-(Arg) sollte, möglicherweise mit konservierten Variationen, vorhanden sein.
Weiterhin kann Dabcyl-Gaba-Pro-Cha-Abu
Smc-His-Ala-Glu(Edans)-Gly-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 14) als selektives Substrat zur Bestimmung der Enzymaktivität interstitieller Collagenase (MMP-1) verwendet werden; McGeehan et al. (McGeehan, G. M., Bickett, D. M., Green, M., Kassel, D., Wiseman, J. S., Berman, J., J. Biol. Chem, 269 (1994) 32814–32820) fanden heraus, dass die Aminosäuresequenz Cha-Abu-Smc-His ein Substrat bildet, das der natürlichen Sequenz Leu-Gly-Leu-Trp überlegen ist. Variationen davon, wie beispielsweise Leu für Cha; Gly oder Ala für Abu; Leu, Sec oder Emc für Smc; und Trp für His sind ebenfalls nützlich.
Das Fluorophor (Flu) kann eine substituierte Aminosäure oder eine andere substituierte Gruppe sein, die in der Lage ist, an eine Peptidsequenz wie beispielsweise eine substituierte Mercaptosäure gebunden zu sein, wobei die Seitenkette der Aminosäure oder der anderen Gruppe die fluoreszente Einheit trägt. Die substituierte Aminosäure kann ein Lysin, Ornithin oder eine andere α,ω-Diaminosäure, an die die fluoreszente Einheit an eine Aminogruppe gebunden ist, oder Glu, Asp oder Aad, an die die fluoreszente Einheit durch die terminale Carboxlfunktion gebunden ist, oder Cystein oder eine andere Thiol enthaltende Aminosäure sein, die die fluoreszente Einheit über die Thiolfunktion bindet.
Statt an die Seitenkette der Peptidkette gebunden zu sein, kann das Fluorophor zwischen zwei Aminosäuren gebunden sein und somit innerhalb der Peptidkette liegen. In dieser Ausführungsform kann das Fluorophor beispielsweise eine Amino- Mercapto- oder Hydroxyfunktion an einem Ende und eine Carboxyfunktion am anderen Ende enthalten.
In den Substraten zu verwendende Fluorophore sind auf dem Stand der Technik bekannt. Geeignete Fluorophore umfassen Edans, wie vorstehend beschrieben, und andere Aminonaphthalensulfonsäuren, Cumarin, substituierte Cumarine wie beispielsweise 7-Methoxycumarin-4-essigsäure (Mca) oder 7-Methoxycumarin-3-carbonsäure (Mcc), Tryptophan, N-Methylanthranilsäure (Nma). Die Fluorophore können Anregungswellenlängen zwischen z. B. 250 und 400 nm und Emissionswellenlängen zwischen z. B. 370 und 550 nm besitzen.
Der Quencher (Que) kann an die spezifische Substratsequenz beispielsweise mittels der Carboxylfunktion, gegebenenfalls durch eine oder mehrere Spaceraminosäuren wie ω-Aminoalkansäuren, vorzugsweise γ-Aminobuttersäure (Gaba), ε-Aminocapronsäure (Eaca), Ornithin oder Lysin gebunden sein. Liegt der Quencher zwischen dem Fluorophor und dem Carrier (Formel Flu-Sub-Que-Spa-Car), kann er an die Seitenkette einer Aminosäure oder zwischen zwei Aminosäuren, wie vorstehend für Flu beschrieben, gebunden werden.
In den Substraten zu verwendende Quencher sind auf dem Stand der Technik bekannt. Geeignete Quencher schließen das vorstehend beschriebene Dabcyl und andere Aminophenylazobenzoylderivate und Di-Nitrophenyl (DNP) und Derviate ein. Der Quencher hat vorzugsweise eine Absorptionswellenlänge, die der Emissionswellenlänge des Fuorophors entspricht. Daher passen der Quencher und das Fluorophor zusammen. Beispiele geeigneter Kombinationen von Fluorophor und Quencher sind Edans/Dabcyl, Cumarin/DNP, Tryptophan/DNP und Nma/DNP. Da eine Löschung der Fluoreszenz auch zwischen zwei identischen Fluorophoren auftreten kann, kann eine wirksame Löschung auch erreicht werden, wenn Que = Flu ist. Das Fluorophor und der Quencher sollten in einem solchen Abstand lokalisiert sein, dass ein intramolekularer Energietransfer zwischen den beiden möglich ist. Dieses Erfordernis wird gewöhnlich erfüllt, wenn die Aminosäurekette zwischen dem Fluorophor und dem Quencher 4 bis 10 Aminosäuren, vornehmlich 5 bis 8 Aminosäuren umfasst, oder wenn der Abstand zwischen dem Fluorophor und dem Quencher einem solchen Kettenabstand entspricht.
Die Spacerkette Spa kann eine direkte Bindung, eine Kette mit einem oder mehreren Atomen oder ein Peptid oder eine andere Kette sein, die einen ausreichenden Abstand zwischen dem Substratpeptid und dem unlöslichen Carrier bereitstellt. Die Spacerkette kann beispielsweise eine oder mehrere ω-Aminosäuren wie beispielsweise Eaca umfassen. An ihrem Terminus enthält die Spacerkette eine Gruppe, die zu einer kovalenten oder andersartigen (z. B. Biotin-/Avidin-) Kopplung an den unlöslichen Träger in der Lage ist. Eine Kopplung an den Träger kann durch homo- oder bifunktionelle quervernetzende Mittel erreicht werden, die mit Amino-, Thiol- oder Carboxlfunktionen koppeln. Geeignete quervernetzende oder Kopplungsmittel schließen Glutardialdehyd und im Handel erhältliche Amino-Sulfo- oder Carboverbindungsreagenzien ein. Eine Kopplung kann ebenfalls durch Acrylatderivate erfolgen, die in eine Polyacrylatmatrix eingebaut werden können.
Vorzugsweise sind die Spacerkette und der Carrier an ihrem Carboxylterminus an die Substratkette gebunden. Wenn die Kopplungsgruppe am Ende der Spacerkette an den Aminoterminus der Spacerkette gebunden sein muss, kann die "Polarität" der Aminosäurenkette durch Einführen beispielsweise eines Lysins oder einer anderen α,ω-Diaminosäure umgekehrt werden. Beispielsweise besteht eine geeignete Spacerkette aus einem Lysinrest, an den an dessen ω-Aminoposition ein Eaca-Rest gebunden ist, an den wiederum eine Acryloyl-Gruppe gebunden ist.
Der unlösliche und/oder makromolekulare Carrier Car kann einen beliebigen herkömmlichen festen, in biochemischen Tests verwendeten Träger umfassen. Diese schließen Mikrotiterplatten, Papierstreifen, synthetische Polymerstreifen, Kügelchen, Harze, Acrylatmatrices (z. B. Gele), Glas, beispielsweise nach Beschichtung, und Proteine ein.
Der unlösliche und/oder makromolekulare Carrier Car kann ebenfalls eine makromolekulare, dispergierte oder lösliche, Struktur zur Verwendung des Substrats als Modell für natürliche Enzymsubstrate umfassen. Dies ist insbesondere bei der Messung der Enzymaktivität in Abhängigkeit von Inhibitoren und ähnlichem nützlich: ein relativ kleines synthetisches Substrat, das keinen makromolekularen Carrier besitzt, könnte trotz der Anwesenheit eines Inhibitorkomplexes gespalten und somit eine Aktivität gemessen werden, die für ein "natürliches" makromolekulares Substrat nicht verfügbar wäre.
Die vorstehend beschriebene Sequenz Que-Sub-Flu-Spa-Car wird oft gegenüber der Sequenz Flu-Sub-Que-Spa-Car bevorzugt, außer wenn sie als makromolekulares, dispergiertes oder lösliches Substrat wie vorstehend beschrieben verwendet wird.
In einer typischen Anordnung ist eine Vielzahl der Gruppe Flu-Sub-Que-Spa- an einen einzelnen Carrier gebunden, was die Formel (Flu-Sub-Que-Sub)_n-Car ergibt. In Ausnahmefällen, wenn eine hohe Dichte des Fluorophors vorhanden ist (z. B. wenn n ≥ 20, beispielsweise zwischen 50 und 100 ist), kann eine wirksame Löschung ohne Que-Gruppen erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt Enzymassays in verschiedenen Ausführungsformen: 1) Bestimmen der Enzymaktivität im Zymographieformat (Substrat immobilisiert in Acrylatgel); 2) Enzymmessung in Mikrotiterplatten und auf oder in anderen festen Trägern, die es ermöglichen, dass unverdünnte biologische Proben bestimmt und störende Bestandteile der biologischen Matrix einfach ausgewaschen werden können; 3) Bestimmen der proteolytischen Enzymaktivität in Gewebeschnitten (Histologie); 4) Enzymmessung in Lösung oder Dispersion, um natürliche makromolekulare Substrate nachzuahmen.
Die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bestimmenden proteolytischen Enzyme umfassen sämtliche Proteasen, einschließlich Serinproteinasen, Cysteinproteinasen, Asparaginproteinasen und Metalloproteinasen. Das Verfahren ist insbesondere bei Endoproteinasen von Nutzen. Eine bevorzugte mit dem vorliegenden Verfahren zu bestimmende Klasse von Proteinasen umfasst die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), einschließlich Collagenasen, Gelatinasen und Stromelysine. Die MMPs spielen eine Rolle bei der Wundheilung, rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis, Tumorinvasion und Angiogenese, durch Zellmigration, Knorpelabbau und Abbau der Basalmembran bzw. Metastasierung. Somit stellt die Aktivität dieser Enzyme einen wichtigen Indikator für diese Zustände dar. Ein wichtiger Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht darin, dass nicht nur die aktiven Enzyme (MMPs) nachgewiesen werden können, sondern auch die Proenzyme, wenn das Substrat auf oder in einem Acrylamidgel im Zymographieformat immobilisiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin durch eine selektive Entfernung vor Bestimmung der zu untersuchenden Proteinase von anderen proteolytischen Enzymen, beispielsweise unter Verwendung spezifischer Antikörper oder anderer selektiver Bindungsmittel, durch eine selektive Bindung der zu untersuchenden Proteinase (mit Antikörpern oder anderen selektiven Bindungstechniken), gefolgt von einer Abtrennung der ungebundenen Enzyme oder durch Zugabe von selektiven Inhibitoren von anderen proteolytischen Enzymen oder durch Zugabe eines selektiven Inhibitors der zu untersuchenden Proteinase verbessert werden; im letzteren Fall wird das Endergebnis durch Abziehen der gemessenen Aktivität nach der Hemmung von der gesamten gemessenen Aktivität erhalten. Sämtliche derartige Tests schließen Messungen der Enzymaktivitäten ohne Vorbehandlung der Probe oder mit einer beliebigen Form der Vorbehandlung der biologischen Probe, einschließlich der Aktivierung von Proenzymen, ein.
BEISPIELE
BEISPIEL 1:
Synthese von fluorogenen Peptiden
Synthese von Fmoc-Glu(Edans)-OH
Einer gerührten Lösung von Fmoc-Glu(OH)-O-tert-butyl (1,7 g, 4 mmol), Edans (1,07 g, 4 mmol) und Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)-phosphonium-Nexafluorophosphat (1,77 g, 4 mmol) in 10 ml DMF wurde bei Raumtemperatur Di-iso-propylethylamin (2 ml, 12 mmol, destilliert von CaH₂) zugegeben. Nach 2 Stunden war die Reaktion abgeschlossen (Silica-Dünnschichtchromatographie mit Toluen/Essigsäure, 9/1, v/v). Dem Reaktionsgemisch wurden 50 ml CH₂Cl₂ und 50 ml 0,5 KHSO₄ zugegeben. Die organische Schicht wurde mit 0,1 M KHSO₄ und H₂O, gewaschen, auf MgSO₄ getrocknet und in vacuo verdampft, um 2,8 g Öl zu erhalten. Zur Enffernung der tert-Butylgruppe wurden 10 ml Eisessig und 1 ml 12 N HCl zugegeben. Nach Rühren für 1 Stunde wurden die Lösungsmittel in vacuo verdampft. Spuren von Essigsäure wurden durch Koevaporation mit DMF (2 × 10 ml) entfernt. Das Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC (Reverse Phase-HPLC, RP-HPLC) in 45%-iger Ausbeute (C18-Säule unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten in 0,1% TFA in H₂O) gereinigt.
Synthese von Fluoreszenz gelöschten Dabcyl-/Edanspeptiden
Die Substrate wurden im 10 μmol-Maßstab durch Festphasenchemie auf einem automatischen Mehrfachsynthese-Gerät unter Verwendung von tentagelS AC (Beladen 0,2 μeq, Partikelgröße 90 μm) synthetisiert. Wiederholte Kopplungen wurden durch Zugabe eines Gemischs von 90 μl 0,67 M PyBOB (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidon-phosphonium-Hexafluorphosphat) in NMP durchgeführt. 20 μl NMM (N-Methylmorpholin) in NMP (2/1, v/v) und 100 μl einer 0,6 M-Lösung der geeigneten Fmoc-Aminosäure in NMP. Koppeln von Fmoc-Glu(Edans)-OH wurde mit einem zehnfachen Überschuss für 3 Stunden durchgeführt. Die Dabcyl-Einheit wurde mit einer Suspension von 10 Äquivalenten p-(p-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure, 10 Äquivalenten PyBOP und 20 Äquivalenten NMM in 250 μl NMP für 3 Stunden gekoppelt. Abspaltung von dem Harz und Entfernung der Schutzgruppen erfolgte durch Zugabe von 200 μl TFA/H₂O (19/1, v/v) zu dem Reaktionsgefäß (sechsmal in Intervallen von 5 min). Drei Stunden nach der ersten Zugabe von TFA/H₂O wurden die Peptide von den kombinierten Filtraten durch Zugabe von 10 ml Ether/Pentan (1/1, v/v) und Abkühlen auf –20°C ausgefällt, wonach die Peptide durch Zentrifugation (–20°C, 2.500 g, 10 min) isoliert wurden. Anschließend wurden die Peptide mittels RP-HPLC mit einer SuperPac Pep-S 15 μm 9,3 × 250 mm-Säule gereinigt. Die Reinheit und die Identität der Peptide wurde durch RP-HPLC (Acetonitrilgradient in 0,1% TFA in H₂O) und durch TOF-MALDI-Massenspektrometrie festgestellt.
Daher wurden fluoreszenzgelöschtes Dabcyl-Gaba-Ile-Thr-Glu-Gly-Glu
Ala-Arg-Gly-Ser-Glu(Edans)-Ile-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 15) als fluoreszenzgelöschtes Substrat für Aggrecanase, das an ein Carrierprotein von etwa 100 Aminosäuren gekoppelt werden soll, und Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
R als Substrate für MMPs (Beispiele von R sind: -Leu-Phe-Ala-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 16); -Leu-Phe-Gly-Glu-(Edans)-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 17); -Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 18); -Leu-Glu(Edans)-Gly-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 19); -Leu-Glu(Edans)-Gly-NH₂ (SEQ ID Nr.: 19 ohne terminales Lys);
, Spaltstelle) synthetisiert. Darüber hinaus wurde R = Ala-Arg
-Gly-Ser-Glu(Edans)-Ile-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 20) als selektives Substrat für MMP-13 hergestellt. Zusätzlich wurde Dabcyl-Gaba-Pro-Arg-Gly
Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 21) als selektives Substrat für MMP-13 synthetisiert. In der letzteren Sequenz kann Leu ersetzt oder sogar entfernt sein.
BEISPIEL 2:
Immobilisierung von fluoreszenzgelöschten Peptiden auf Silicakügelchen
1 ml fluoreszenzgelöschter Peptidlösung (Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
R; 25 μM in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, R enthält einen für die Immobilisierung verwendeten Lysinrest) wurden 10 mg Aminopropyl-Silicakügelchen (40 μm Durchmesser, 1,4 mmol Aminogruppen pro Gramm) zugegeben. Nach 15 Minuten Mischen bei Raumtemperatur wurden 20 μl EGS-Lösung (25 mM in DMSO) zugegeben. Die Abnahme von A470 (Extinktionsmaximum von Dabcyl) des Überstands wurde zur Beobachtung der Reaktion verwendet. Die Kopplung wurde bis zum Ende der Abnahme von A470 fortgesetzt. Nach Zentrifugation und Entfernung des Überstands wurden die Kügelchen anschließend mit PBS (in 1,5 ml}, PBS mit 0,1% Tween-20 (1,5 ml), 1 M Tris-HCl (pH 7,5; 1,2 ml) und Inkubationspuffer (50 mM Tris, pH 7,6; 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 μM ZnCl₂, 0,01% Brij-35; 1 ml) gewaschen.
Nach Inkubation der Peptid markierten Silicakügelchen mit einem Gemisch aus aktivierten Gelatinasen (MMP-2 und MMP-9) wurde das Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly-Fragment wirksam von den Kügelchen in den Überstand gelöst, wie durch RP-HPLC (C18-Säule unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten in 0,1% TFA in N₂O) nachgewiesen wurde.
BEISPIEL 3:
Immobilisierung von fluoreszenzgelöschten Peptiden auf Glasobjektträgern
Glas-Mikroskopobjektträger wurden durch Waschen in 20% H₂SO₄, Wasser (zweimal), 0,1 N NaOH und Wasser gründlich gereinigt. Nach dem Trocknen wurden die Glasobjektträger in 3-Aminopropyltriethoxysilan 4 Minuten lang bei Raumtemperatur gelegt und mit Wasser und PBS (zweimal) gespült. Unter vorsichtigem Schütteln wurden die Glasobjektträger in eine Lösung fluoreszenzgelöschten Substrate (z. B. Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
Leu-Phe-Ala-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 16) oder Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 18); 25 μM in 1,0 ml PBS) getaucht, der anschließend 20 μl EGS (25 mM in DMSO) zugegeben wurde. Die Beobachtung von A470 zeigte, dass die Kopplung nach drei Stunden bei Raumtemperatur abgeschlossen war. Die Blockierung von N-Hydroxy-succinimidylgruppen, die aus überschüssigem EGS resultierten, erfolgte durch Zugabe von Glycin in PBS (50 mM Endkonzentration, 1 ml) für eine Stunde. Sämtliche Schritte erfolgten bei Umgebungstemperatur.
Die mit fluoreszenzgelöschten Substraten beschichteten Glasobjektträger wurden zum Nachweis der MMP-Aktivität in Gewebeschnitten wie folgt verwendet:
Kryostat-Schnitte (5 μm) von Schädeldachperiost von Ratten wurden auf einen Substrat beschichteten Glasobjektträger aufgebracht und bei 37°C in feuchter Atmosphäre in Inkubationspuffer (50 mM Tris, pH 7,6, 5 mM CaCl₂, 1 μM ZnCl₂, 1 mM 4-Aminophenylquecksilber-Acetat) inkubiert. Das Auftreten der Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroskop verfolgt. Mit der Zeit wurde ein Anstieg in der Fluoreszenz an der Stelle des Gewebes als deutliche fluoreszente Punkte beobachtet (1). Keine Fluoreszenz wurde an den Stellen des nicht mit Gewebe bedeckten Glases nachgewiesen. In Anwesenheit von EDTA oder einem synthetischen MMP-Inhibitor inkubierte Gewebeschnitte zeigten eine wesentlich geringere Fluoreszenz. Außerdem war die Fluoreszenz von nicht mit 4-Aminophenylquecksilber-Acetat aktivierten Gewebeschnitten geringer als die Fluoreszenz von mit 4-Aminophenylquecksilber-Acetat aktivierten Schnitten.
BEISPIEL 4:
Fluoreszenzgelöschte Peptide gekoppelt an Rinderserumalbumin
Fluoreszenzgelöschtes Substrat (z. B. Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
Leu-Phe-Ala-Glu-(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 16); Endkonzentration 25 μM in PBS) wurde an Rinderserumalbumin (BSA; 2 mg/ml Endkonzentration in PBS) durch EGS (Endkonzentration 0,5 mM; Endvolumen 2 ml) wie vorstehend beschrieben konjugiert. Eine RP-HPLC-Analyse (linearer Acetonitrilgradient in 0,1% TFA/H₂O) der Inkubation des BSA-Substrats mit MMP-9 bestätigte die Proteolyse der Protein gekoppelten Substrate; nach Ausfällung des Proteins wurde das Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly-Fragment in dem Überstand nachgewiesen.
BEISPIEL 5:
Fluoreszenzgelöschtes MMP-Substrat, das nicht durch α2-Makroglobulin komplexiertes MMP umgewandelt wird
Fluoreszenzgelöschtes Substrat (z. B. Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
Leu-Phe-Ala-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 16); 1 mM DMSO, 200 μl) wurde mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (10 mM in DMSO, 50 ml) in Anwesenheit von Triethylamin (100 mM in DMSO, 10 μl) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur derivatisiert. Nach Deacetylierung von 80 nmol des derivatisierten Substrats (gelöst in 20 μl Wasser, umgesetzt mit 25 μl Natriumphosphatpuffer, 50 mM, pH 7,5, umfassend 25 mM EDTA und 0,5 M Hydroxylamin, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur) wurden 10 μl Maleimid aktiviertes Ovalbumin zugegeben (10 mg/ml; Pier ce). Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde überschüssiges Maleimid-Ovalbumin durch Zugabe von L-Cystein (10 μl 20 mM in Wasser) inaktiviert. Nach Dialyse (10 kDa Cut-off-Membran) gegen Wasser und Inkubationspuffer (50 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 μM ZnCl₂, 0,01% Brij-35) wurde die Umwandlung des Ovalbumin gekoppelten Substrats durch MMP-13 (0,5 nM) anhand der Rate des Fluoreszenzanstiegs (Anregung 360 nm; Emission 490 nm; Fluoreszenzeinheiten pro Zeitraum) bestimmt.
In Anwesenheit von überschüssigem α2-Makroglobulin (5 nM; präinkubiert mit MMP-13 für 2 Stunden bei 25°C) wurde weniger als 5% des Ovalbumin gekoppelten Substrates abgebaut im Vergleich zu Inkubationen, bei denen das α2-Makroglobulin fehlte. Dies zeigt, dass Tests mit fluoreszenzgelöschten Substraten, die an einen Carrier gebunden sind, in der Tat die Hemmung der MMP-Aktivität durch Komplexbildung mit α2-Makroglobulin widerspiegeln.
BEISPIEL 6:
Einbau von fluoreszenzgelöschten Peptiden in Polyacrylamid
Fluoreszenzgelöschtes Substrat (z. B. Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
Leu-Phe-Ala-Glu-(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 16) und Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly
Leu-Glu-(Edans)-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID Nr.: 18); 25 nmol in 100 μl wasserfreiem DMSO) wird durch Zugabe von 75 nmol N-(6-Succinimidyl-oxy-6-oxyhexyl)-acrylamid oder N-(4-Succinimidyloxy-4-oxybutyl)-6-acrylamido-hexanamid, gelöst in wasserfreiem DMSO (5 mM) und 75 nmol Triethylamin (25 mM in wasserfreiem DMSO) in sein Acrylatderivat überführt. Die Umsetzung erfolgte bei Raumtemperatur und war nach 3 Stunden (RP-HPLC) abgeschlossen.
Acrylatderivate von fluoreszenzgelöschten Peptiden wurden mittels RP-HPLC (Acetonitrilgradient in 0,1% TFA/H₂O) gereinigt. Nach der Lyophilisierung wurden 12,5 nmol Acrylatderivat mit 3 ml (für 1 Gel) 10% Acrylamid-/Bisacrylamidlösung (75/2, v/v) vermischt, gefolgt vom Gießen eines SDS-PAGE-Gels nach Standardverfahren. Proben mit Matrix-Metalloproteinasen oder Gemischen davon, einschließlich inaktiver Proformen, wurden verwendet (20 μl), gefolgt von herkömmlicher SDS-PAGE-Elektrophorese (8 mA pro Gel, 4°C, 4 Stunden). Nach der Elek trophorese wurden die Acrylamidgele dreimal 30 Minuten lang in Waschpuffer (50 mM Tris, pH 7,6, 5 mM CaCl₂, 1 μM ZnCl₂, 2,5% Triton X-100) und zweimal 10 Minuten lang in Inkubationspuffer (50 mM Tris, pH 7,6; 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 μM ZnCl₂, 0,01% Brij-35) gewaschen. Nach Inkubation des Gels über Nacht bei 37°C in Inkubationspuffer wurde das Gel unter UV-Licht (366 nm) plaziert, und fluoreszente Banden bei Molekulargewichten, die den Matrix-Metalloproteinasen und ihren Proformen entsprechen, wurden beobachtet ( 2).
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Bestimmung eines proteolytischen Enzyms umfassend: (a) Inkubation einer Enzym-enthaltenden Probe mit einem immobilisierten, fluoreszenzgelöschten Peptid der Formel Que-Sub-Flu-Spa-Car oder Flu-Sub-Que-Spa-Car, wobei Sub eine Peptidkette ist, die eine spezifische Spaltstelle für das proteolytische Enzym enthält; Flu ein Fluorophor ist; Que ein Quencher ist, der in der Lage ist, Fluoreszenzstrahlung zu absorbieren, die durch das Fluorophor emittiert wird; Spa eine direkte Bindung oder eine Spacerkette ist; und Car ein wasserunlöslicher und/oder makromolekularer Carrier ist; (b) optionales Abtrennen der Flüssigkeit vom Carriermaterial; (c) Bestrahlung des Carriermaterials und Messung der Fluoreszenz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Flu eine Aminonaphtalinsulfonsäure-Gruppe wie beispielsweise Edans und Que eine Aminophenylazobenzoyl-Gruppe wie beispielsweise Dabcyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Car ein Polyacrylat oder Polyacrylamid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei Sub die Aminosäuresequenz Xab-Glu-Xad-Xae, wobei Xab eine beliebige Aminosäure, vorzugs weise Gly, Ala, Abu, Val, Nva, Leu, Glu oder Gln ist, Xad eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Gly, Ala, Abu, Val, Nva oder Leu ist, und Xae eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Arg, Gly, Ala, Abu, Val, Nva oder Leu, insbesondere Arg oder Gly ist, zur Messung der Aggrecanaseaktivität enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Sub die Aminosäuresequenz Xai-Asn-Phe-Xaj, wobei Xai eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Pro oder Hyp ist, und Xaj eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Phe, Tyr, Trp oder Cha ist, zur Messung des Aggrecanabbaus durch Matrix-Metalloproteinasen enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei Sub die Aminosäuresequenz Xad-Arg-Xaf-Xag, wobei Xad eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Gly, Ala, Abu oder Val ist, Xaf eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Gly oder Ala ist, und Xag eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Ser, Thr, Ala, Abu oder Hse ist, oder die Aminosäuresequenz Xam-Xan-Xao-Glu, wobei Xam eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Arg, Lys, Orn, His oder Trp, insbesondere Arg ist, Xan eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Gly, Ala, Abu oder Val, insbesondere Gly ist, Xao eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Ala, Abu, Val, Nva, Leu, Nle oder Ile, insbesondere Leu ist, zur Messung der Matrix-Metalloproteinase-13-Aktivität enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immobilisierte Peptid kovalent oder nichtkovalent an einen festen Träger, wie beispielsweise eine Glasplatte, zur Messung der Proteinaseaktivität in Gewebesektionen gebunden ist.
Immobilisiertes Substrat zur Messung eines proteolytischen Enzyms, enthaltend ein fluoreszenzgelöschtes Peptid der Formel Que-Sub-Flu-Spa-Car oder Flu-Sub-Que-Spa-Car, wobei Sub eine Peptidkette ist, die eine spezifische Spaltstelle für das proteolytische Enzym enthält; Flu ein Fluorophor ist; Que ein Quencher ist, der in der Lage ist, Fluoreszenzstrahlung zu absorbieren, die durch das Fluorophor emittiert wird; Spa eine direkte Bindung oder eine Spacerkette ist; und Car ein unlöslicher und/oder makromolekularer Carrier ist, der aus einem Glas- oder Polymerkorn, einer Glasplatte, einer Mikrotiterplatte, einem Papier- oder syntetischen Polymerstreifen oder einem Acrylat- oder Acrylamidgel ausgewählt wird.