JP5350607B2 - グアニル酸シクラーゼ活性測定法 - Google Patents
グアニル酸シクラーゼ活性測定法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5350607B2 JP5350607B2 JP2007157645A JP2007157645A JP5350607B2 JP 5350607 B2 JP5350607 B2 JP 5350607B2 JP 2007157645 A JP2007157645 A JP 2007157645A JP 2007157645 A JP2007157645 A JP 2007157645A JP 5350607 B2 JP5350607 B2 JP 5350607B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- guanylate cyclase
- activity
- measuring
- gtp
- atp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼやATPスルフリラーゼを用いる方法では、連続的に測定を行った場合、AMPが蓄積されるに従い、発光量が減少していくため、定量性に問題がある。また、ATPスルフリラーゼを用いる方法では、ATPスルフリラーゼの基質であるアデニロホスホスルフェート(APS)がATPに構造が類似しているため、ルシフェラーゼに対しても基質となり、発光反応が起こる。このため、バックグラウンド発光量が高くなり、感度が悪いという問題点がある。
例えば、血管内皮細胞は、NOをシグナルとして周囲の平滑筋を弛緩させ、それにより動脈を拡張させて血流量を増大させる。このNOが有する生理活性作用を利用し、心臓の冠動脈を拡張させることにより血液供給を増大させる目的で、ニトログリセリン、亜硝酸アミル、一硝酸イソソルビド等の亜硝酸誘導体が心臓病の治療に用いられる。さらには、この生理活性作用を利用した発毛剤や勃起不全治療薬も開発されている。
また、NOは、生体内の神経伝達物質としても働く。シナプス間隙のみで働く多くの神経伝達物質と異なり、NOは広い範囲に拡散して直接接していない周辺の神経細胞にも影響を与える。このメカニズムは記憶形成にも関与すると考えられている。
すなわち、これらのNO産生の活性促進剤、活性阻害剤等を高感度、かつ、簡便で迅速に測定することは、医学、薬学、バイオ研究、医薬品開発、化学安全性評価等の分野において非常に大きな意味を持つ。
また、DANやDAFは、両者ともに蛍光色素であるため励起光を必要とするため、励起光を必要としない化学発光、生物発光に比べて、検出装置が大型で、複雑で、かつ、高価になる等の問題点もある。
さらに、NO量の測定は、生理的環境に近い温和な条件下で検出できることが望ましいが、上記のGriess法や蛍光法では、生理的条件下での検出が困難である。
NOS活性を測定する方法として、NOの生成を測定する他に、L−[guanidino−14C]arginineを基質として用いて、L−[guanidino−14C]citrullineの放射能を測定する方法が知られている。この方法は、高感度ではあるが、放射性物質を使用する方法であり、作業者が被爆するおそれがあり、特別な施設を必要とするばかりでなく、arginaseによって同じ物質ができるため注意が必要である。
また、グアニル酸シクラーゼ活性測定に基づくNOSの活性測定も報告されているが(例えば、特許文献2参照)、cGMPの検出に基づく方法であり、精度が悪く、煩雑で、感度が悪い等の問題がある。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
(i)グアニル酸シクラーゼを含む試料とGTPとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってGTPを変換してcGMPとピロリン酸を生成させるステップ
(ii)上記(i)で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、AMPと反応させることによってATPを生成させるステップ
(iii)上記(ii)で生成させたATPを発光法若しくは発色法により測定するステップ
(2)以下の(i)〜(iii)のステップを含むグアニル酸シクラーゼ活性の測定法。
(i)グアニル酸シクラーゼを含む試料とGTPとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってGTPを変換してcGMPとピロリン酸を生成させるステップ
(ii)上記(i)で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、AMPと反応させることによってATPを生成させるステップ
(iii)上記(ii)で生成させたATPを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ
(3)上記(1)又は(2)記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素の検出方法。
(4)上記(1)又は(2)記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素合成酵素の活性測定方法。
(5)以下の(i)〜(iii)のステップを含むことを特徴とする、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するためのキット。
(i)グアニル酸シクラーゼを含む試料とGTPとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってGTPを変換してcGMPとピロリン酸を生成させるステップ
(ii)上記(i)で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、AMPと反応させることによってATPを生成させるステップ
(iii)上記(ii)で生成させたATPを発光法若しくは発色法により測定するステップ
(6)以下の(i)〜(iii)のステップを含むことを特徴とする、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するためのキット。
(i)グアニル酸シクラーゼを含む試料とGTPとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってGTPを変換してcGMPとピロリン酸を生成させるステップ
(ii)上記(i)で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、AMPと反応させることによってATPを生成させるステップ
(iii)上記(ii)で生成させたATPを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ
(1)グアニル酸シクラーゼの活性測定ステップ
グアニル酸シクラーゼの活性測定には、原理的に以下の3つのステップが含まれる。
(i) ピロリン酸を生成させるステップ
具体的には、グアニル酸シクラーゼを含む試料とGTPとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってGTPを変換してcGMPとピロリン酸を生成させるステップ
(ii) ATPを生成させるステップ
具体的には、上記(i)で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、AMPと反応させることによってATPを生成させるステップ
(iii) ATPを測定するステップ
具体的には、上記(ii)で生成させたATPを発光法若しくは発色法により測定するステップ
これらの(i)〜(iii)のステップは、それぞれ別に行わせてもよいし、(i)〜(ii)を同時に行ったり、(ii)〜(iii)を同時に行ったり、さらには(i)〜(iii)を同時に行ったりすることも可能である。
本発明の(i)ピロリン酸を生成させるステップにおいて、試料中の測定対象となるグアニル酸シクラーゼには、可溶型グアニル酸シクラーゼ及び膜結合型グアニル酸シクラーゼがある。さらに、さまざまな由来や複数のアイソフォームのグアニル酸シクラーゼがあるが、グアニル酸シクラーゼは、その種類を問わない。
NOによる可溶型グアニル酸シクラーゼの活性化は、NOによる特異的な反応であり、二酸化窒素等も含めた窒素酸化物を測定する方法よりも、生体内で真に有効に作用しているNOをより正確に検出することが可能になる。
NOの検出やNOSの活性測定で用いられる可溶型グアニル酸シクラーゼには、NOによって活性化される性質を持つ任意の可溶型グアニル酸シクラーゼが用いられる。可溶型グアニル酸シクラーゼにはいくつかのアイソフォームがあるが、NOによって活性化する性質をもっていればいずれも使用できる。また、これらを遺伝子組換えにより製造したもの等が挙げられる。
本発明の(i)ピロリン酸を生成させるステップにおいて使用するGTPは、ルシフェラーゼを用いた発光法の場合、ATPと構造が類似しているため、わずかではあるがルシフェラーゼの基質となり発光し、バックグラウンドとなる。
したがって、GTP濃度は、測定器の感度やルシフェラーゼ濃度等にあわせて最適化することが望ましく、1×10−9〜1×10−3Mが望ましい。
GTPの代わりに、ルシフェラーゼに対して反応性はGTPより比較的低いが、グアニル酸シクラーゼへの反応性を維持したGTP誘導体を使用しても構わない。
GTP誘導体を用いる場合には、1×10−7〜1×10−1Mが望ましい。GTPの代わりにGTP誘導体を用いることにより、GTPがルシフェラーゼの基質となり、発光してしまうことによるバックグラウンドを抑制することが可能となる。
本発明の(ii)ATPを生成させるステップにおいて使用するピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK;EC2.7.9.1)は、マグネシウムイオン存在下で、AMP、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸に作用して、ATP、ピルビン酸及びリン酸を生じる反応を触媒し、その逆の反応も触媒する酵素である。その理化学的性質及び製法についても既に知られており、入手は比較的に容易である。PPDKには、植物由来又は微生物由来のPPDKが知られている。
(5)発色法
発色法には、ピロリン酸からATPを生成する酵素を用いてATPを生成させ、該ATPにヘキソキナーゼ又はグリセロールキナーゼ等のキナーゼ及びグルコ−ス6リン酸脱水素酵素又はグリセロール3リン酸脱水素酵素等の脱水素酵素を用い、NADH又はNADPHを生成させ、該NADH又はNADPHにテトラゾリウム塩の存在下、フェナジンメト硫酸塩(PMS)、1−メトキシフェナジンメト硫酸塩(1−mPMS)、フェナジンエト硫酸塩(PES)、9−ジメチルアミノベンゾ―α―フェナゾキソニウムクロライド(メルドラブルー)又はジアフォラーゼ等の電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定したり、該NADH又はNADPHから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定したりする方法がある(特開2006−187251号公報)。
発光法と比較すると、感度や測定可能範囲の点で劣るが、発光検出装置(ルミノメーター)よりも広く普及している吸光度計を使用することができるため、すでに吸光度計を所有する測定者にとっては発光検出装置の導入コストを抑えられるという利点を有する。
PPDKを用いた発光法は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によるATP測定法とPPDKを組み合わせたサイクリング法であり(米国特許5891659、Anal Biochem. 2004年、333号、p296−302)、高感度で、かつ、1.6×10−10〜1×10−7Mという幅広い濃度範囲のピロリン酸を測定できるため、高感度で、かつ、幅広い濃度範囲のグアニル酸シクラーゼ活性測定に適している。
PPDKを用いてピロリン酸を測定する場合、基質となるホスホエノールピルビン酸やAMPはルシフェラーゼの基質とならないため、バックグラウンド発光量を低値に抑え、高感度にピロリン酸を測定することが可能になり、結果として高感度なグアニル酸シクラーゼ活性測定が可能になる。
また、PPDKとルシフェラーゼのサイクリング反応によるピロリン酸測定では、発光阻害物であるAMPもサイクリングされるため、AMP濃度は一定であり、反応が進むにつれて、AMPが蓄積されて、発光量が低下することはなく、定量性に優れた測定が可能である。
このように優れた特徴を有するPPDKを使用することにより、高感度で、簡便で、スループット性に優れたグアニル酸シクラーゼ活性測定法が可能となり、さらに、この方法を用いてグアニル酸シクラーゼの活性促進剤や活性抑制剤等、活性に影響を与える物質のスクリーニングを行うことが可能となる。
ルシフェラーゼとしては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系によるATP測定に用いられている任意のルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタル等由来のルシフェラーゼ、あるいはこれらのルシフェラーゼを遺伝子組換えにより製造したもの等が望ましい。
ルシフェラ−ゼの濃度は、0.1μg/ml(終濃度)以上、好ましくは1〜1000μg/ml(終濃度)が望ましい。ルシフェリンの濃度は、0.1μM(終濃度)以上、好ましくは1〜10,000μM(終濃度)が望ましい。
なお、本発明の試薬には、酵素反応、発光反応を円滑に行わせるために、種々の化合物を添加してもよい。このような化合物としては、例えば、安定化剤、界面活性剤、賦活剤等が挙げられる。すなわち、PPDKの賦活剤としては、塩化マンガンや硫酸アンモニウム(0.1〜100mM(終濃度))を使用することができる。また、ルシフェラーゼの安定剤として、ジチオスレイトール(0.1〜10mM(終濃度))、EDTA(0.1〜10mM(終濃度))、BSA(0.01〜10%(終濃度))などを使用することができる。そして、反応系の安定化剤としてTricine緩衝液やHEPES緩衝液(20〜200mM(終濃度))などを使用することができる。
本発明は、蛍光物質を使用する方法ではなく、発光検出による方法であるため、高価で大型な励起光照射装置を必要とせず、検出装置を低価格化、小型化することができる。
また、本発明に使用しているPPDK−ルシフェラーゼ発光試薬のATP−ピロリン酸のサイクリング反応は、発光反応で消費したATPをAMPとピロリン酸を使ってATPに再生されるため、発光量が持続する。高濃度のルシフェラーゼを試薬に添加することにより、高発光、かつ、持続型の発光試薬を作製することができる。そのため、高価で高感度な光電子増倍管のような検出部は必要とならない。すなわち、感度的には若干劣るが、低価格で小型のフォトダイオードを使用した装置やCCDカメラを使用したイメージング装置でも十分安定して測定することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、実施例は本発明を何ら限定するものではない。
以下の物質を各終濃度になるように添加溶解して調製し、実験に使用した。
1×10−7M グアノシン三リン酸(オリエンタル酵母社製)
2mM 塩化マンガン(和光純薬工業社製)
1mM ジチオトレイトール(和光純薬工業社製)
0.1% BSA(シグマ社製)
20mM Tricine(同仁化学社製)
0.234U/ml PPDK(キッコーマン社製)
5.5GLU/ml ルシフェラーゼ(キッコーマン社製)
10mM 酢酸マグネシウム(和光純薬工業社製)
0.2mM D−ルシフェリン(YMC社製)
0.04mM ホスホエノールピルビン酸(シグマ社製)
0.0125mM AMP(オリエンタル酵母社製)
0.1% BSA(シグマ社製)
0.0025U/ml アピラーゼ(シグマ社製)
30mM BES(同仁化学社製)
可溶型グアニル酸シクラーゼ(和光純薬工業社製)
2mM 塩化マンガン(和光純薬工業社製)
1mM ジチオトレイトール(和光純薬工業社製)
0.1% BSA(シグマ社製)
20mM Tricine(同仁化学社製)
10mM NOC7(同仁化学社製)
0.1M NaOH
実施例1(1)記載の基質溶液1mlに、実施例1(3)記載のグアニル酸シクラーゼ溶液(グアニル酸シクラーゼの終濃度:0、10、50、100、500、1000ng/ml)を加え、25℃にて10分間インキュベートした。インキュベート後に0.01mlずつサンプリングし、実施例1(2)記載のPPDK−ルシフェラーゼ発光試薬0.1mlに添加し、そのとき生じる発光量をルミテスターC−100N(キッコーマン社製)にて測定した。その結果を、図1に示した。図1の結果は、グアニル酸シクラーゼを含まないサンプルの発光量を差し引いた値を示した。
図1の結果から、グアニル酸シクラーゼ活性を10−3,000ng/mlの間の幅広い濃度範囲で、簡便、かつ、高感度に測定することができ、さらには、グアニル酸シクラーゼの活性促進、活性抑制等の活性に影響を及ぼす物質のスクリーニングに応用することが可能になることがわかる。
実施例1(1)記載の基質溶液1mlを25℃にて予備加温し、そこに、終濃度が100ng/mlになるように実施例1(3)記載の可溶型グアニル酸シクラーゼ溶液を加え、さらに、実施例1(4)記載のNOC7溶液を0.01ml加え、25℃にてインキュベートした。NOC7を添加した直後と10分後に反応液を0.01mlずつサンプリングし、生じたピロリン酸を測定した。
ピロリン酸量の測定は、サンプリングした0.01mlの反応液を、実施例1(2)記載のPPDK−ルシフェラーゼ発光試薬0.1mlに添加し、発光量をルミテスターC−100N(キッコーマン社製)にて測定した。
図2の結果から、NO発生剤であるNOC7を添加したサンプル(図2中のNOC7(+))のほうが、NOC7を添加していないサンプル(図2中のNOC7(−))と比較して、約25倍高い発光量を示した。この方法により、NOを簡便、かつ、高感度に検出可能であることがわかる。また、可溶型グアニル酸シクラーゼの活性化は、NOに対して特異的な反応であるため、発光量の増加もNOに対して特異的なものであり、その他の窒素酸化物も測定してしまう方法よりも優れていることがわかる。この方法は、NOの測定ばかりでなく、NOSの活性測定やNOSの活性促進剤や活性抑制剤等の活性に影響を与える物質のスクリーニング等へも応用できる。
Claims (3)
- 以下の(i)〜(iii)のステップを含む、グアニル酸シクラーゼが10ng/ml以上の濃度範囲におけるグアニル酸シクラーゼ活性測定法。
(i)グアニル酸シクラーゼを含む試料とGTPとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってGTPを変換してcGMPとピロリン酸を生成させるステップ
(ii)上記(i)で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、AMPと反応させることによってATPを生成させるステップ
(iii)上記(ii)で生成させたATPを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ - 請求項1記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素の検出方法。
- 請求項1記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素合成酵素の活性測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007157645A JP5350607B2 (ja) | 2007-06-14 | 2007-06-14 | グアニル酸シクラーゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007157645A JP5350607B2 (ja) | 2007-06-14 | 2007-06-14 | グアニル酸シクラーゼ活性測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008306978A JP2008306978A (ja) | 2008-12-25 |
JP5350607B2 true JP5350607B2 (ja) | 2013-11-27 |
Family
ID=40235159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007157645A Active JP5350607B2 (ja) | 2007-06-14 | 2007-06-14 | グアニル酸シクラーゼ活性測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5350607B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7304924B2 (ja) | 2020-12-21 | 2023-07-07 | エルジー ディスプレイ カンパニー リミテッド | 無限拡張表示装置 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19944226A1 (de) * | 1999-09-15 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen |
WO2005052185A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Detection of no by using guanylyl cyclase and cgmp production as a readout system |
-
2007
- 2007-06-14 JP JP2007157645A patent/JP5350607B2/ja active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7304924B2 (ja) | 2020-12-21 | 2023-07-07 | エルジー ディスプレイ カンパニー リミテッド | 無限拡張表示装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008306978A (ja) | 2008-12-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Maghzal et al. | Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases | |
Zargoosh et al. | Highly sensitive glucose biosensor based on the effective immobilization of glucose oxidase/carbon-nanotube and gold nanoparticle in nafion film and peroxyoxalate chemiluminescence reaction of a new fluorophore | |
Winterbourn | The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells | |
JP3618759B2 (ja) | 電気化学発光性酵素バイオセンサー | |
Auses et al. | Chemiluminescent enzyme method for glucose | |
JP5718571B2 (ja) | 生物発光検出によるピロリン酸塩の検出方法 | |
JP3409962B2 (ja) | 生物発光試薬及びその試薬を用いたアデノシンリン酸エステルの定量法並びにその試薬を用いたatp変換反応系に関与する物質の定量法 | |
da Silva et al. | Kinetics of inhibition of firefly luciferase by dehydroluciferyl-coenzyme A, dehydroluciferin and L-luciferin | |
Zargoosh et al. | Sensitive and selective determination of glucose in human serum and urine based on the peroxyoxalate chemiluminescence reaction of a new Fluorophore | |
Garcia-Campana et al. | Potential of chemiluminescence and bioluminescence in organic analysis | |
Rink et al. | Next generation luminol derivative as powerful benchmark probe for chemiluminescence assays | |
Karp et al. | Simultaneous extraction and combined bioluminescent assay of NAD+ and NADH | |
JP5350607B2 (ja) | グアニル酸シクラーゼ活性測定法 | |
Raveh et al. | Determination of NO production in melanoma cells using an amperometric nitric oxide sensor | |
Woldman et al. | Direct chemiluminescence detection of nitric oxide in aqueous solutions using the natural nitric oxide target soluble guanylyl cyclase | |
Minekawa et al. | Practical application of bioluminescence enzyme immunoassay using enhancer for firefly luciferin–luciferase bioluminescence | |
Ghafourifar et al. | Detection assays for determination of mitochondrial nitric oxide synthase activity; advantages and limitations | |
JPH0847399A (ja) | 生物発光の測定方法 | |
JP2018068278A (ja) | アンモニアの定量方法、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 | |
Evmiridis et al. | On-line detection of nitric oxide generated by the enzymatic action of nitric oxide synthase on l-arginine using a flow injection manifold and chemiluminescence detection | |
Zhang et al. | Quantitative determination of nitric oxide from tissue samples using liquid chromatography—Mass spectrometry | |
JP2000253898A (ja) | 物質または酵素の定量方法および定量試薬 | |
JPS6017347A (ja) | 一種以上の酵素を利用する検定方法 | |
JPS59166099A (ja) | Atpまたはnmnの高感度測定法 | |
Seya et al. | A fluorometric assay for cyclic guanosine 3′, 5′-monophosphate incorporating a Sep-Pak cartridge and enzymatic cycling |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100201 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120912 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121112 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20121112 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130820 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130822 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5350607 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |