BR0014019B1 - Processo para a detecção de uma guanilatociclase solúvel - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSO PARA DETECÇÃO DE UMA GUANILATOCICLASE SOLÚ- VEL". A invenção refere-se a um processo para a detecção de guanila- tociclase solúvel, cujo ferro complexado com inibidor é oxidado ou que não contém nenhum grupo de inibição, bem como igualmente um processo de separação para a identificação de compostos, que podem ativar guanilatoci- ciase solúvel com ferro de inibição oxidado e além disso, um diagnóstico para a detecção de uma guanilatociclase solúvel com ferro de inibição triva- lente.

Guanilatociclases solúveis são proteínas heterodímeras.

Elas constituem-se de uma unidade cada de uma subunidade alfa e uma beta e contêm inibidor como grupo prostético. A ligação da molé- cula de sinal NO ao inibidor ativa a enzima. O cGMP formado pela ati- vidade enzimática da guanilatociclase solúvel participa, entre outros, da atividade das proteinaquinases dependentes de cGMP, na regulagem de fosfodiesterases ou de canais de íons. Para as subunidades foram descritas quatro isoformas. Estas diferenciam-se com respeito à sua seqüência bem como com respeito à expressão específica do tecido e específica do desenvolvimento. Os subtipos ai e βι são encontrados principalmente no pulmão, rins e cérebro. A cadeia β2 é exprimida prin- cipalmente no fígado e rins e a2 na placenta. Um dimensionamento das subunidades é condição prévia para uma guanilatociclase solúvel cata- liticamente ativa. São conhecidos os heterodímeros α-ι/βι, α2/βι e α1/β2.

Em todas as subunidades observa-se uma forte homologia no setor dos domínios catalíticos. A guanilatociclase solúvel (sGC) contém um inibidor por hetero- dímero. A ligação do inibidor é efetuada através do His-105 da cadeia βι.

Mutantes, que no término N da subunidade βι não contêm mais nenhum His- 105, não são mais estimuláveis pelo NO. O inibidor da guanilatociclase solú- vel constitui-se de uma parte da molécula orgânica e de um átomo de ferro. A parte orgânica, a protoporfirina IX, contém quatro anéis pirrol, que estão enlaçados por pontes metina em um sistema tetrapirrol. O átomo de ferro no inibidor está ligado a quatro átomos de nitrogênio no centro do anel proto- porfirina. Ele pode realizar, além disso, duas outras ligações. O ferro do ini- bidor pode apresentar-se na etapa de oxidação +2 (forma ferro) ou +3 (forma ferrita; forma oxidada). A etapa de oxidação do ferro no inibidor tem influên- cia decisiva sobre a função enzimática da guanilatociclase solúvel, A enzima com o ferro de inibição na forma trivalente mostra como uma guanilatocicla- se solúvel sem grupo de inibição só é atividade enzimática basal e não é estimulável por NO. A preparação de uma guanilatociclase solúvel sem inibi- dor é descrita na Eur. J. Biochem. 240, 380-386 (1996).

Guanilato-ciclase solúvel (sGC) catalisa a transformação de GTP em monofosfato de guanosina cíclica (cGMP) e pirofosfato. cGMP funciona como substância mensageira intracelular (second messenger). Second mes- senger originam-se no interior da célula em reações do tipo de cascata. Seu nível é controlado por sinais extraceiulares (por exemplo, hormônios, neuro- transmissores, fatores de crescimento, substâncias aromáticas, peptídios, luz). A formação de second messengers serve para o reforço de sinal. O Se- cond messenger remete na célula sinais a determinadas proteínas visadas dependentes do tipo de célula (quinases, fosfatases, canais de íons e ou- tros). A modulação da guanilatociclase solúvel conduz, por isso, através da influência do nível de cGMP e, com isso, a proteínas visadas controladas, a uma série de efeitos farmacológicos. Exemplos de mecanismos influencia- dos deste modo são a distensão da musculatura lisa (por exemplo, nas pa- redes dos vasos sanguíneos), a inibição da ativação dos trombócitos, a inibi- ção da multiplicação de células da musculatura lisa ou a adesão de leucóci- tos.

Guanilatociclase solúvel é detectável em órgãos tais como por exemplo, coração, pulmão, fígado, rins, cérebro em todos os mamíferos in- clusive do homem. Em procedimentos patológicos ou procedimentos rele- vantes para acontecimentos de doenças a etapa de oxidação do ferro de inibição da guanilatociclase solúvel pode ter um papel essencial. Uma maior parte de guanilatociclase solúvel com ferro de inibição oxidado teria como conseqüência uma menor capacidade de ativação da guanilatociclase solú- vel pelo NO endógeno. Isto podería conduzir, entre outros, através do au- mento da pressão sanguínea, ativação das plaquetas, proliferação multipli- cada de células ou adesão reforçada de células a um aumento da pressão sangüínea permanente, a uma angina pectoris estável ou instável, a trombo- ses, infarto do miocárdio, ataques apopléticos, edemas pulmonares, disfun- ção erétil, crescimento de tecidos descontrolado com formação de tumor, diabetes, distúrbios da função renal, distúrbios da função hepática ou disfun- ção vascular.

As células endoteliais de paredes de vasos excretam NO como hormônio paracrínico, entre outros, para a ativação da guanilatociclase solú- vel. Para a estimulação farmacológica da guanilatociclase solúvel aplicam-se frequentemente compostos, que atuam como doadores de NO através de uma liberação de NO intermediária. Exemplos para este fim são os nitratos orgânicos. Além disso, são descritos diversos compostos que atuam não através de uma liberação de NO, os quais modificam a atividade da guani- latociclase solúvel. A ativação da guanilatociclase solúvel por doadores de NO ou NO livre é efetuada exclusivamente no estado reduzido, isto é, contendo (Fe2+) do ferro de inibição. Isto é verificado em ensaios, que foram efetuados por A. Schrammel e outros em Mol. Pharmacol. 50, 1 (1996) com 1H[1,2,4]oxadiazol [4,3-a]quinoxalin-1-ona (=ODQ). ODQ é uma substância de inibição específica e altamente eficaz da guanilatociclase solúvel. ODQ interage com o grupo de inibição prostético. A substância provoca in vitro uma oxidação irreversível do ferro de inibição da guanilatociclase solúvel. O tratamento da guanilatociclase solúvel com ODQ te como conseqüência, que o efeito estimulante de NO sobre a enzima se perde. A oxidação do ferro de inibição da guanilatociclase solúvel também pode ser causada com oxadia- zol(3,4-d)benzo(b)(1,4)oxazin-1-ona (Olesen e outros, British Journal of Pharmacology 123, 299 - 309 (1998)} ou com ferrocianeto de potássio (Ko- esling e outros, em "Reviews of Physiology Biochemistry and Pharmacology" página 41 - 65, Springer Verlag 1999). Há também ativadores da guanilato- ciclase solúvel, que não atuam sobre uma liberação de NO. Tais foram des- critas, por exemplo, por Vesely e outros, em Eur. J. Clin. Invest. 15, 258 (1985). Uma estimulação da guanilatociclase solúvel por protoporfirina IX é comprovada por Ignarro e outros em Adv. Pharmacol. 26,35 (1994). 0 efeito de protoporfirina IX não é inibível por ODQ, mas sim, é reforçada pelo com- posto (Koesling und Friebe em Physiol. Biochem. Pharmacol. 135, 41 (1999)). Os ativadores da guanilatociclase solúvel conhecidos até agora es- timulam a atividade enzimática destas, somente se o ferro de inibição se apresenta no estado reduzido, isto é, contendo Fe2+.

Com as N-arilamidas de ácido suifonilamino-carboxílico substi- tuídas por enxofre foi descrita recentemente uma outra classe de compostos químicos (WO 00/02851), cujos representantes podem ativar guanilatocicla- se solúvel. A comprovação da atividade da guanilatociclase solúvel é efetu- ada, até agora, por exemplo, por meio de métodos enzimáticos para a de- tecção de cGMP bem como cAMP ou por processos fotométricos para a detecção do grupo de inibição.

Para determinar a dependência de um estado alterado conforme a doença do estado da guanilatociclase solúvel, não basta comprovar me- ramente a proteína por meio de processos de detecção imunológicos ou pelo emprego de técnicas de marcação. É igualmente importante, conhecer o estado redox do ferro complexado do grupo de inibição. Uma informação sobre a funcionalidade do inibidor da guanilatociclase solúvel é determinável até agora, por exemplo, através da determinação do estado redox do ferro de inibição complexado por meio de medições ESR ou fotometricamente.

Estas determinações têm a desvantagem, de dependerem da disponibilidade de uma aparelhagem técnica parcialmente complexa. Os métodos prestam- se, além disso, só limitadamente para medições específicas, pois elas são facilmente perturbadas por impurezas pelas outras proteínas contendo inibi- dor.

Um objetivo da presente invenção constituiu-se portanto, em preparar um processo simples e específico para a detecção de um estado de oxidação da guanilatociclase solúvel. Um outro objetivo da invenção foi a preparação de um processo para encontrar uma substância química, a qual ativa a guanilatociclase solúvel, quando seu ferro de inibição se apresenta oxidado trivalente. A invenção refere-se também a um diagnóstico, o qual se presta para a identificação de uma guanilatociclase solúvel, cujo ferro de inibição é oxidado trivalente. A presente invenção refere-se a um processo para a detecção de uma guanilatociclase solúvel, em que o ferro do inibidor desta guanilato- ciclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente e em que o processo contém os estágios de processo abaixo: a) Preparação de uma guanilatociclase solúvel, b) preparação de pelo menos uma ligação química, a qual estimula a ati- vidade de uma guanilatociclase solúvel, quando o ferro do inibidor desta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente; c) incubação de uma guanilatociclase solúvel, preparada de acordo com a), com um composto químico, preparado de acordo com b); d) determinação da atividade da guanilatociclase solúvel após incubação de acordo com c). A guanilatociclase solúvel pode constituir-se de uma mistura de moléculas da guanilatociclase solúvel, sendo que nem todas as moléculas de guanilatociclase solúvel se apresentam com um ferro de inibição no está- gio de oxidação trivalente. Especialmente uma parte dos grupos de inibição das moléculas de guanilatociclase solúvel pode encontrar-se no estágio de oxidação trivalente e uma outra parte no estágio de oxidação bivalente, de modo que resulta uma mistura com diferente quota dos estados de oxidação do ferro de inibição. O processo para a detecção de uma guanilatociclase solúvel, cujo ferro de inibição se apresenta em forma trivalente, pode ser efetuado, por exemplo, em comparação com valores de referência. Os valo- res de referência podem ser obtidos, entre outros, por exemplo, a partir de ensaios, nos quais a dependência da atividade da guanilatociclase solúvel foi determinada pelas quotas conhecidas de guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente. Uma medida para a respectiva quota de guanila- tociclase solúvel com ferro de inibição trivalente pode ser obtida pelo pré- tratamento da guanilatociclase solúvel com ODQ e subseqüente determina- ção da atividade desta guanilatociclase solúvel. Os valores de referência determinados podem ser empregados, depois, como curvas de calibração para determinações quantitativas da guanilatociclase solúvel com ferro de inibição no estágio de oxidação trivalente. A guanilatociclase solúvel pode ser empregada em diferentes formas de estado, por exemplo, como guanilatociclase solúvel heterodímera diferente. Fundamentalmente, pode ser aplicada uma guanilatociclase solú- vel de qualquer espécie, especialmente de cada espécie de mamífero. De preferência, aplica-se guanilatociclase solúvel de bovinos, que é preferente- mente isolada do tecido pulmonar. Com particular preferência, aplica-se guanilatociclase solúvel humana. A guanilatociclase solúvel preparada pode ser composta, de preferência, de uma subunidade alfa cada, por exemplo, da subunidade oq ou cc2 e de uma subunidade β, por exemplo, da subunida- de βι ou β2. Para o processo da presente invenção podem ser empregadas, de preferência, subunidades da guanilatociclase solúvel. Informações de seqüências correspondentes são indicadas em Giuili e outros (FEBS Letters 304, 83 - 88 (1992)) para as duas subunidades da guanilatociclase solúvel originalmente isolada de cérebro humano ou em Nakane e outros (Journal of Biol. Chem. 265, 16841 - 16845 (1990)) para cDNAs da guanilatociclase so- lúvel de tecido pulmonar de ratos ou em Yuen e outros (Biochemistry 29, 10872 - 10878 (1990)) para uma guanilatociclase solúvel de rins de ratos. A preparação de uma guanilatociclase solúvel pode ser efetuada pelo isolamento por meio de métodos bioquímicos a partir de um material biológico. Especialmente em tais casos, apresenta-se freqüentemente uma mistura de moléculas de guanilatociclase solúvel com diferentes estágios de oxidação do ferro de inibição. Métodos bioquímicos podem ser entre outros: métodos de desintegração para o material biológico, centrifugação, separa- ções cromatográficas, eletroforeses de gel, focalização isoelétrica, métodos imunológicos. Material biológico pode conter células eucarióticas ou células procarióticas, desintegrações das células ou preparados de desintegrações das células, céluias totais ou partes ou frações das células. Nas células eu- carióticas incluem-se entre outros, por exemplo, células de tecidos ou órgãos tais como coração, vasos sangüíneos, pulmão, sangue, cérebro, fígado, rins, tecido graxo, músculo de animais vertebrados inclusive do homem, amostras de tecido ou de sangue, mas também células de culturas de células huma- nas ou animais, bem como culturas de células de insetos. Como exemplos especiais mencionam-se trombócitos, que podem ser obtidos de amostras de sangue humano ou animal, bem como células da musculatura lisa, que podem ser isoladas por exemplo, de vasos sangüíneos de origem animal ou humana. Outros exemplos são material de biópsia, órgãos e tecidos rema- nescentes e partes dos mesmos de transplantes, cordões umbilicais ou pla- centas. Células procarióticas podem significar, por exemplo, bactérias entre outras Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, igualmente fungos tais como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe ou Pi- chia pastoris. Em uma forma de execução particular da invenção, a guanila- tociclase solúvel pode ser preparada recombinante, por exemplo, pela ex- pressão em células eucarióticas ou procarióticas, sendo que a guanilatoci- clase solúvel é enriquecida com ou sem grupo de inibição prostético por meio de vetores de expressão dentro das células ou é separada para o meio. Em uma forma de execução especial a guanilatociclase solúvel é iso- lada por um processo tal como descrito em Humbert P. e outros, Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991).

Em uma forma de execução põe-se à disposição a guaniiatoci- clase solúvel, que foi tratada com um agente de oxidação. Em uma forma de execução preferida põe-se à disposição uma guanilatociclase solúvel, que foi tratada com ODQ. A concentração do ODQ importa, por exemplo, em 0,001 mM até 0,5 mM, de preferência, 0,005 mM até 0,1 mM e particularmente de preferência, em 0,01 mM. De preferência, também pode ser posta à disposi- ção uma guanilatociclase solúvel, que foi tratada com oxadiazol(3,4- d)benzo(b)(1,4)oxazin-1-onas ou com um outro derivado de ODQ, Em uma outra forma de execução preferida, põe-se à disposição uma guanilatocicla- se solúvel, que foi tratada com ferrocianeto de potássio. O tratamento da guanilatociclase solúvel com agentes de oxidação e/ou ODQ e/ou outros compostos pode causar uma oxidação do ferro de inibição, isto é, uma transferência do ferro do estágio de oxidação bívalente (Fe2+) para o estágio de oxidação trivalente (Fe3+) em função das condições escolhidas ou so- mente em uma parte ou em formas de execução particulares, em todas as moléculas da guanilatociclase solúvel tratadas. Em geral, para a execução do processo da presente invenção, pode ser empregada uma forma da gua- nilatociclase solúvel, na qual o ferro de inibição se apresenta no estágio de oxidação trivalente ou somente em uma parte das moléculas de guanilatoci- clase solúvel ou em uma forma de execução preferida em todas as molécu- las de guanilatociclase solúvel. A preparação da guanilatociclase solúvel abrange a preparação de formas adequadas para a incubação com compostos químicos prepara- dos, sendo que incubação significa, que a guanilatociclase solúvel e o com- posto químico são postos em contato um com o outro. A proteína pode ser suspensa ou dissolvida por exemplo, em solventes aquosos complementa- dos por tampão, íons ou também por reagentes auxiliares. Ela também pode ser aplicada, por exemplo, sobre material de veículo e ser empregada nesta forma fixada suspensa em solventes.

Como compostos químicos para a estimulação da atividade da guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente podem ser prepara- dos compostos químicos individuais ou também combinações de compostos químicos. Os compostos químicos podem ser obtidos, por exemplo, sinteti- zados ou como substância natural. Fundamentalmente, podem ser empre- gados todos os compostos químicos para a preparação, que estimulam a atividade de uma guanilatociclase solúvel, quando o ferro do inibidor desta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente.

Para a execução do processo para a detecção da guanilatocicla- se solúvel com um ferro de inibição no estágio de oxidação trivalente, pode ser empregado, por exemplo, o composto químico 2-(4-cloro-fenilsu!fonilami- no)-4,5-dimetóxi-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonii)-feni[-benzamida.

Para a execução do processo para a detecção de uma guanila- tociciase solúvel com um ferro de inibição trivalente, podem ser empregados compostos químicos, que estimulam exclusivamente a guanilatociclase solú- vel com ferro de inibição trivalente. Igualmente podem ser empregados com- postos, que além da ativação da guanilatociclase solúvel com um ferro de inibição trivalente, ainda mostram outros efeitos sobre a guanilatociclase solúvel. Por exemplo, podem ser empregados compostos químicos, que além da ativação da guanilatociclase solúvel com um ferro de inibição triva- lente também provocam uma ativação da atividade basal da guanilatociclase solúvel ou uma ativação da guanilatociclase solúvel com um ferro de inibição bivalente. Um processo para a detecção da guanilatociclase solúvel por meio de compostos químicos, que ativam exclusivamente a forma enzimática com ferro de inibição trivalente ou por exemplo, também formas enzimáticas com ferro de inibição bivalente, é efetuado com auxílio de valores de referência, curvas de calibração e/ou em comparação com substâncias, que podem ati- var exclusivamente uma guanilatociclase solúvel com ferro de inibição biva- lente (por exemplo, doadores de NO). Para a obtenção de uma curva de ca- libração a guanilatociclase solúvel pode ser incubada com diferentes con- centrações de, por exemplo, ODQ. Em função da concentração de ODQ aplicada em cada caso, ajusta-se uma determinada razão de guanilatocicla- se solúvel com guanilatociclase com ferro de inibição trivalente para guani- latociclase solúvel com ferro de inibição bivalente. A concentração de ODQ empregada pode ser aplicada diretamente como medida para a quota de enzima com ferro de inibição trivalente. A quota absoluta de guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente pode ser revisada para fins de cali- bração por outros processos de medição, por exemplo, por medições ESR.

As guanilatociclases solúveis pré-tratadas diferentemente com ODQ são ati- vadas pelos compostos químicos em um estágio de incubação. Com isso, os compostos, os quais ativam exclusivamente uma guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente, fornecem um valor, que é diretamente pro- porcional à quantidade de guanilatociclase solúvel com o ferro de inibição trivalente. Ao empregar compostos químicos, que além da guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente também ativam ainda a forma com ferro de inibição bivalente, necessita-se de uma curva de calibração adicio- nal com uma substância, que ativa uma guanilatociclase solúvel exclusiva- mente na forma bivalente. A quota de guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente resulta, então, pela comparação das atividades, que é ob- tida pela estimulação diferenciada de uma guanilatociclase solúvel pré- tratada com ODQ. Com isso, a guanilatociclase solúvel é estimulada uma vez com um composto químico, que ativa exclusivamente guanilatociclase solúvel com ferro de inibição bivalente e por outro lado, é estimulada com um composto químico, que ativa a guanilatociclase solúvel com ferro de ini- bição trivalente, bem como com bivalente. A determinação da quota de gua- nílatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente em uma amostra biológi- ca a ser examinada resulta pela comparação da atividade da guanilatocicla- se solúvel desta amostra após incubação com um composto químico, o qual pode ativar a guanilatociclase solúvel tal como descrito acima, com os valo- res da curva de calibração. A preparação de um composto químico também pode abranger a solução deste composto, em solventes adequados tais como por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) ou água bem como a preparação de uma formula- ção com reagentes auxiliares. A incubação pode levar tempo diferente longo e ser efetuada em diversas temperaturas. A necessidade de tempo e o ajuste da temperatura dependem das formas de execução escolhidas no respectivo caso tanto com respeito à escolha da guanilatociclase solúvel preparada, do composto quí- mico preparado e/ou também de outras condições, tais como da forma de preparo, da concentração da guanilatociclase solúvel aplicada e/ou do com- posto químico aplicado bem com de outras substâncias aditivas. O espaço de tempo para a incubação pode importar, por exemplo, entre 1 minuto e 120 minutos, de preferência, o espaço de tempo para a incubação importa entre 1 minuto e 60 minutos e particularmente de preferência, esco!he-se um espaço de tempo de 30 minutos. A temperatura para a incubação pode en- contrar-se entre 5°C e 45°C, de preferência, a temperatura encontra-se entre 20°C θ 42°C e em uma forma de execução particuíarmente preferida, em 37°C. A detecção da atividade da guanilatociclase solúvel pode ser efetuada por exemplo, por um teste enzimático ou por um ensaio funcional ligado em série ou por um ensaio de ligação por exemplo, em células isola- das ou em culturas de células. Em uma forma de execução especial esta detecção da atividade pode ser efetuada pela determinação da inibição da agregação de trombócitos por meio de um lumiagregômetro. Trombócitos agregam com menos intensidade após ativação da guanilatociclase solúvel e do aumento intracelular de cGMP provocado pela guanilatociclase solúvel. A extensão da inibição da agregação dos trombócitos é proporcional à ativa- ção da guanilatociclase solúvel e, por isso, fornece uma medida para a ati- vação da enzima. Nesta forma de execução da invenção a guanilatociclase solúvel não preparada isolada, mas sim, apresenta-se nos trombócitos. A guanilatociclase solúvel pode ser empregada fundamentalmente também nesta forma, isto é, apresentando-se em células inteiras nos processos. Em uma outra forma de execução preferida a atividade da guanilatociclase solú- vel também pode ser determinada pela determinação de cGMP formado por meio de um RIA {Radio-Immun-Assay) ou EIA (Enzyme-lmmuno-Assay). Em uma outra forma de execução preferida a atividade é determinada através do efeito dos compostos químicos sobre a formação de cGMP em células da musculatura lisa. Células da musculatura lisa são componente de, por exemplo, paredes de vasos sangüíneos. Estas células da musculatura dis- tendem-se, quando o nível de cGMP intracelular aumenta. Isto pode ocorrer pela ativação da guanilatociclase solúvel. A distensão de células da muscu- latura lisa pode ser empregada, por conseguinte, para comprovar ativadores da guanilatociclase solúvel.

Uma guanilatociclase solúvel não é mais ativável pelas substân- cias ativas farmacêuticas publicadas até agora, quando seu ferro de inibição se encontra no estado trivalente. Compostos químicos, os quais podem ati- var a guanilatociclase solúvel, quando seu ferro de inibição se apresenta oxidado trivalente, não são conhecidos até agora. Tais compostos químicos poderíam ser empregados como substâncias ativas farmacêuticas em medi- camentos para estimular a guanilatociclase solúvel, por exemplo, em um estado patológico provocado por uma guanilatociclase solúvel com um ferro de inibição trivalente. igualmente tais compostos poderíam ser empregados no processo para a detecção de formas oxidadas da guanilatociclase solú- vel, tal como descrito de acordo com a invenção. Uma outra forma de exe- cução da invenção refere-se, por isso, a um processo para encontrar um composto químico, o qual estimula a atividade de uma guanilatociclase solú- vel, quando o ferro do inibidor da guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente, sendo que o processo contém os seguintes estágios de processo: a) preparação de uma guanilatociclase solúvel, em que o ferro do inibi- dor desta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxida- ção trivalente; b) preparação de pelo menos um composto químico a ser examinado; c) incubação de uma guanilatociclase solúvel de acordo com a) com pelo menos um composto químico a ser examinado de acordo com b) e d) determinação da atividade da guanilatociclase solúvel após incubação de acordo comc).

Um processo para encontrar um composto químico também é denominado como Screening. Aplicação e preparação da guanilatociclase solúvel para o processo de Screening é efetuada tal como já foi citado no processo para a detecção de uma guanilatociclase solúvel com ferro de ini- bição trivalente. A preparação da guanilatociclase solúvel para o Screening pode incluir a preparação de formas adequadas para a incubação com o com- posto químico a ser examinado. A guanilatociclase solúvel pode ser suspen- sa ou dissolvida, por exemplo, em solventes aquosos complementados por tampão, íons ou também reagentes auxiliares. Ela também pode ser aplica- da, por exemplo, sobre material de suporte e ser empregada nesta forma fixada suspensa em solventes.

No caso do composto químico a ser examinado no Screening pode tratar-se por exemplo, de um composto sintetizado quimicamente ou de uma substância natural. O composto químico a ser examinado pode apresentar-se em diferentes formas de estado, por exemplo, como substân- cia individual em forma purificada, como mistura ao lado de outros compos- tos, que não precisam ser exatamente caracterizados, como mistura de dife- rentes compostos ativos, como componente de uma mistura de compostos de origem biológica ou junto com organismos eucarióticos e/ou procarióticos. O processo para o Screening pode ser efetuado, por exemplo, por meio de um robô de laboratório ou com auxílio de máquinas. Compostos químicos a serem examinados, os quais ativam uma guanilatociclase solúvel com um ferro de inibição trivalente, podem ser empregados como substâncias ativas farmacêuticas para o tratamento de estados alterados conforme a doença tais como por exemplo, câncer, angina pectoris, diabetes, infarto do mio- cárdio, disfunção erétil, insuficiência cardíaca, pressão alta do sangue, trom- boses, anemia ou disfunção vascular. A invenção refere-se também ao com- posto químico a ser examinado, que é identificado por meio deste processo de Screening com ativador de uma guanilatociclase solúvel, cujo ferro de inibição se apresenta no estágio de oxidação trivalente. A invenção refere-se de modo muito geral a compostos, os quais podem ativar a atividade de uma guanilatociclase solúvel, cujo ferro de inibição se apresenta no estágio de oxidação trivalente e o emprego destas substâncias, de preferência, como substâncias ativas farmacêuticas. O objetivo da invenção são, por conse- guinte, também compostos, que podem ativar uma guanilatociclase solúvel, cujo ferro de inibição se apresenta no estágio de oxidação trivalente e que por isso, podem ser aplicados como substâncias ativas farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de estados patológicos, que são provocados ou reforçados pela guanilatociclase solúvel com ferro de inibição no estágio de oxidação trivalente. Nestes estados patológicos podem ser incluídos por exemplo, câncer, angina pectoris, diabetes, infarto do miocárdio, disfunção erétil, insuficiência cardíaca, pressão alta do sangue, tromboses, disfunção vascular ou anemia. A invenção refere-se também a um diagnóstico para a execução de um processo para a determinação do estágio de oxidação do ferro de inibição de uma guanilatociclase solúvel. O diagnóstico pode conter para isso pelo menos um ou vários dos seguintes componentes: a) pelo menos um composto químico, o qual estimula a atividade da guanilatociclase solú- vel, quando o ferro de inibição desta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente, bem como b) soluções e/ou reagentes para a determinação da atividade de uma guanilatociclase solúvel. Como composto químico no diagnóstico pode ser aplicada, por exemplo, 2-(4-cloro- fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi-N-(4-tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida. A determinação da atividade pode ser efetuada por um dos métodos já des- critos acima. O diagnóstico pode conter por exemplo, também guanilatocicla- se solúvel, um composto químico, que só ativa uma guanilatociclase solúvel, quando o ferro de inibição se apresenta bivalente, um agente de oxidação e/ou ODQ. Estes componentes podem ser empregados isolados ou em combinação para a determinação de um valor de referência ou de uma curva de calibração ou para a determinação quantitativa ou qualitativa da guanila- tociclase solúvel com um ferro de inibição no estágio de oxidação trivalente. O diagnóstico pode ser empregado por exemplo, para a deter- minação da quota de guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente em uma amostra biológica. Uma amostra biológica podería constituir-se, por exemplo, de células de um tecido ou órgão de um animal vertebrado ou do homem. Estas células poderíam ser retiradas de um organismo ou terem sido cultivadas por técnicas de cultura de células. Como organismos doado- res podem ser escolhidos indivíduos com tecidos ou órgãos sadios ou alte- rados conforme a doença. Por exemplo, amostras de órgãos, amostras de tecidos, amostras de sangue, células ou material para biópsia de organismos humanos ou animais podem ser removidos por meio de técnicas medicinais e servir como amostra biológica. As amostras biológicas de diversos indiví- duos também podem ser analisadas comparativamente com respeito aos seus diferentes hábitos de vida e de alimentação em conexão com o estado de oxidação do ferro de inibição da guanilatociclase solúvel. Assim, por exemplo, as células de fumantes e não-fumantes puderam ser obtidas e analisadas. A guanilatociclase solúvel dos fumantes podería ser comparada com a de não-fumantes com respeito às diferenças em relação ao ferro de inibição bivalente para o ferro de inibição trivalente. A invenção refere-se em uma forma de execução preferida a um processo in vitro para a determinação do estágio de oxidação do ferro de inibição de uma guanilatociclase solúvel em uma amostra biológica, que foi retirada de um organismo eucariótico. Na amostra biológica retirada de um organismo eucariótico podem estar contidas, por exemplo, células sadias ou alteradas conforme a doença de culturas de células, tecidos ou órgãos.

Em uma outra forma de execução preferida, para a execução do processo in vitro pode ser empregado um diagnóstico descrito de acordo com a invenção. Estados biológicos alterados conforme a doença podem ser por exemplo, câncer, angina pectoris, diabetes, disfunção erétil, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca, alta pressão do sangue, tromboses, ane- mia, disfunção vascular e outros. Também podem ser examinados certos hábitos de vida ou alimentares tais como por exemplo, fumo ou prazer em bebidas alcoólicas sobre os efeitos com relação ao estado de oxidação do ferro de inibição da guanilatociclase solúvel.

Em estados biológicos sadios os parâmetros aplicados para a caracterização caem para a faixa normal. Dados correspondentes para a determinação das faixas normais encontram-se por exemplo, em livros da química clínica (por exemplo, Keller, Herbert: Klinisch-chemische Labordia- gnostik fürdie Praxis; Thieme-Verlag, Stuttgart). A invenção refere-se também a um processo para a detecção de guanilatociclase solúvel por meio de um teste luminométrico. O teste abran- ge vários estágios do processo. Os estágios do processo podem ser efetua- dos sucessiva ou simultaneamente. O teste luminométrico constitui-se dos seguintes estágios: a) na preparação de uma guanilatociclase solúvel e GTP como substrato, b) na reação do GTP por meio da guanilatociclase solúvel preparada pelo que são formados cGMP e pirofosfato, c) na preparação de uma transferase de nicotinamida-mononucleotídio-adenila e dinucleotídio de nicotinamida (NAD+), d) na reação do pirofosfato formado em b) com a transferase de nicotinamida-mononucleotídio-adinila na presença de dinu- cleotídio de nicotinamida (NAD+), onde é formado ATP, e) na preparação de uma luciferase e seu substrato luciferina e f) na determinação luminométrica do ATPs formado pela reação com luciferina sob catálise de luciferase. A quantidade de ATP formado é proporcional à concentração de guanilatoci- clase solúvel. O processo é iniciado pela adição de guanilatociclase solúvel em um preparado de reação, que além de outras substâncias contém GTP como substrato. Outras substâncias podem ser por exemplo, tampões, íons ou proteínas. O processo para a detecção da guanilatociclase solúvel presta- se em uma forma de execução preferida para a execução de um Screening de compostos químicos a serem examinados para a sua aptidão, para esti- mular a atividade da guanilatociclase solúvel. A vantagem deste processo luminométrico comparado com os processos de detecção empregados até agora para a guanilatociclase solúvel (processos imunológicos, enzimáticos, fotométricos) consiste na possibilidade, de poder separar grandes quantida- des de compostos químicos a serem examinados em espaços de tempo es- sencialmente mais curtos em sua capacidade potencial para estimular a ati- vidade de uma guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente. Para a execução de screening o composto químico a ser examinado é colocado antes do início do processo pela adição da guanilatociclase solúvel no pre- parado de reação. O processo presta-se em uma forma de execução parti- cular de screening para a aplicação por meio de um robô de laboratório e em uma outra forma de execução particularmente preferida para a execução manual. A preparação da guanilatociclase solúvel pode ser efetuada tal como já foi citado nos parágrafos acima para a guanilatociclase solúvel. Uma vantagem especial deste teste luminométrico consiste no fato, de que os componentes para a execução do processo tais com GTP, transferase de nicotinamida-mononucleotídio-adenila, NAD+, luciferina ou luciferase podem ser preparados em um recipiente de reação. A atividade da guanilatociclase solúvel é averiguada pela determinação da quantidade de ATP formado. O início da reação é efetuado pela adição da guanilatociclase solúvel. Com isso, torna-se possível efetuar o processo em uma reação única. Isto pode ser aplicado também em um Screening com alta passagem das substâncias químicas a serem examinadas (High Throughput Screening; HTS) e efetua- do reproduzível, Este teste luminométrico é especialmente muito adequado para a detecção de pequenas quantidades de pirofosfato. O processo pode ser empregado em uma forma de execução preferida para a determinação da atividade de uma guanilatociclase solúvel. O teste luminométrico presta- se também para a execução de um processo descrito como nos parágrafos acima para a detecção da guanilatociclase solúvel com ferro de inibição tri- valente. A invenção refere-se também a um processo para a detecção de uma guanilatociclase solúvel, em que a guanilatociclase solúvel se apre- senta sem grupo de inibição. O processo pode abranger como estágios do processo a) a preparação de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de ini- bição, b) a preparação de pelo menos um composto químico, o qual pode estimular a atividade da guanilatociclase solúvel, se a guanilatociclase solú- vel se apresenta sem grupo de inibição, c) a incubação de uma guanilatoci- clase solúvel com um composto químico, o qual pode estimular a atividade de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição e d) a determinação da atividade da guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição após incuba- ção com o composto químico. A invenção refere-se também a um processo para encontrar um composto químico, o qual estimula a atividade de uma guanilatociclase solú- vel, sendo que a guanilatociclase solúvel se apresenta sem grupo de inibi- ção. Este processo pode conter como estágios do processo a) a preparação de uma guanilatociclase solúvel, a qual se apresenta sem grupo de inibição, b) a preparação de pelo menos um composto químico a ser examinado, c) a incubação de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição com pelo menos um composto químico a ser examinado e d) a determinação da ativi- dade da guanilatociclase solúvel após incubação. A invenção refere-se também a um diagnóstico para a determi- nação do estágio de oxidação de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição, contendo pelo menos um composto químico, o qual estimula a ati- vidade de uma guanilatociclase solúvel, sendo que a guanilatociclase solúvel se apresenta sem grupo de inibição. A invenção refere-se também a um pro- cesso in vitro para a determinação de uma guanilatociclase solúvel, que se apresenta sem grupo de inibição, em uma amostra biológica, sendo que o processo pode abranger como estágios do processo a preparação de uma amostra biológica, a qual contém uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição, a preparação de pelo menos um composto químico, o qual pode estimular a atividade de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição, a incubação de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição com um composto químico, o qual pode estimular a atividade de uma guanilatocicla- se solúvel bem como a determinação da atividade da guanilatociclase solú- vel sem grupo de inibição após incubação com o composto químico.

Um método para a preparação de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição é descrito em Foerster, J. e outros, Eur. J. Biochem. 240, 380 - 386 (1996). Como composto químico para a estimulação de uma guanilatociclase solúvel sem grupo de inibição prestam-se por exemplo, o composto químico 2-(4-cloro-fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi-N-(4-(tiomorfo- lin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida.

Exemplos: Exemplo 1: Processo de detecção luminométrico para a atividade da guanilatociclase solúvel A guanilato-ciclase solúvel (sGC) catalisa a transformação de GTP em cGMP e pirofosfato. Na presença de dinucleotídio de nicotnamida- adenina (NAD+) e transferase de nicotinamida-mononucleotódio-adenilila (NAT, EC 2.7.7.1) o pirofosfato é reagido em ATP e mononucleotídio de ni- cotinamida. O ATP formado pode ser quantificado com auxílio de uma lucife- rase luminometricamente em placas de microtitulação. A substância a ser examinada é dissolvida em DMSO e diluída com DMSO/água até uma concentração final de 50 μΜ no preparado do teste. A concentração de DMSO no preparado de teste deveria importar no máximo em 5 % (v/v). 100 μΙ de preparado de reação deveríam conter 50 mM de tam- pão TEA (pH 7,4), 3 mM de MgCI2,3 mM de GSH, 0,1 mM de GTP, 1 mM de IBMX (isobutilmetilxantina), 0,2 mM de NAD+, 0,4 mU de NAT, solução en- zímática de sGC diluída adequadamente (isolada de pulmão bovino de acor- do com Humbert P. e outros, Methods of Enzymology 195, 384 - 391 (1991), bem como a substância de teste ou solvente (para a determinação da ativi- dade enzimática basal). A reação é iniciada pela adição da sGC. A mistura de reação é incubada durante 60 minutos à temperatura ambiente e depois por resfriamento e adição de 50 mM de EDTA, pH 8,0 é interrompida. Para a determinação do ATP acrescentam-se 20 μΙ de 100 mM de MgCI2 e 50 μΙ de reagente de teste de ATP (0,035 mM de luciferina e 10000 U/ml de lucifera- se em 62,5 mM de acetato tris pH 7,75,1,9 mM de EDTA, 0,05 mM de ditio- treitol, 0,1 % de BSA). As unidades de luminescência relativas (RLU) podem ser medidas em um luminômetro de placas de microtitulação. A atividade das sGC é obtida após a remoção do valor vazio RLU (incubação sem enzima) do valor de medição RLU. A ativação das sGC por uma substância de teste é indicada em porcento da atividade enzimática basal (controle de solvente) e calculada pela seguinte fórmula: 100 X (Δ RLUsubstânciadoteste/DRLUcontrole) 100 — % de ativação Exemplo 2: Ativação da guanilatociclase solúvel após oxidação do ferro de inibição. sGC isolada apresenta-se em solução em uma forma contendo um Fe2+ de inibição (reduzido), em uma forma estimulável de NO e em uma forma contendo Fe3+ de inibição (oxidada) não-estimulável de NO. A quota da respectiva forma pode ser determinada até agora com auxílio de medi- ções de ESR.

Monóxido de nitrogênio (NO) e doadores de NO ativam exclusi- vamente o estado reduzido das sGC. Eles mostram em uma incubação na presença de, por exemplo, 0,01 mM de 1H-[1,2,4]oxadiazol[4,3-a]quinoxalin- 1-onas (ODQ), que in vitro oxidada irreversivelmente as sGC, uma perda completa de seu efeito estimulante. Um novo ativador de sGC independente de NO, 1-benzil-3-(2-hidroximetil-fur-5-il)-indazol (YC-1) ativa igualmente a forma reduzida das sGC e é inibível pelo ODQ.

Ao contrário disto, a capacidade de estimulação por substâncias, que ativam exclusivamente ou principalmente a forma oxidada, é reforçada por ODQ ou não-influenciada, dependendo da quota da forma oxidada no preparado.

Freqüentemente estas substâncias mostram igualmente uma ativação da forma sem inibidor da sGC. A preparação de uma sGC sem ini- bidor é efetuada por J. Foerster e outros, Eur. J. Biochem. 240, 380-386 (1996).

Uma guanilatociclase solúvel com um ferro de inibição trivalente pode ser preparada, armazenando-se enzima recentemente preparada du- rante aproximadamente 7 dias a 4°C. Incubando-se guanilatociclase solúvel pré-tratada desta maneira com 2-(4-cloro-fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi-N- 4-(tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil)-benzamida obtém-se uma estimulação 17,6 vezes maior da atividade. O valor EC50 importa em 0,5 pmol/l. Aplicando-se uma guanilatociclase solúvel sem inibidor, obtém-se uma estimulação 58,2 vezes maior. A afinidade encontra-se, neste caso, em 2,4 pmol/l.

Exemplo 3: Detecção da estimulação da guanilatociclase solúvel após oxidação do ferro de inibição pela determinação do efeito sobre a agregação de trombócitos O efeito fisiológico de monóxido de nitrogênio (NO) tal como por exemplo, inibição da agregação de trombócitos e relaxamento da musculatu- ra vascular lisa é a conseqüência de uma ativação direta da guanilatociclase (reduzida) solúvel pelo NO sob múltipla formação de cGMP. ODQ, um inibidor seletivo da sGC, inibe pela oxidação da sGC o aumento de cGMP e o efeito antiagregatório de doadores de NO em trombó- citos humanos lavados (M.A. Moro e outros, PNAS 93, 1480-1485 (1996)).

Para a preparação de trombócitos humanos lavados (WP) o sangue é retirado da veia anticubital e anticoagulada com ácido cítrico/citrato de sódio na seringa. Após centrifugação em 16 x g durante 15 minutos, o sobrenadante constitui-se de plasma rico em plaquetas (PRP). O PRP é aci- dificado, os trombócitos sedimentados por centrifugação durante 20 minutos a 400 x g e retomados em solução de Tyrode. Estes trombócitos lavados (WP, 3χ105/μΙ) são aplicados nos ensaios. A inibição da agregação pelos ativadores sGC é determinada em um lumiagregômetro. Os WPs são incubados na presença de 0,5 mM de CaCl2 com a substância tampão a 37°C e a reação é iniciada pela adição de, por exemplo, 0,3 pg/ml. O efeito das substâncias sobre a agregação é exa- minada na ausência e na presença de ODQ. Ativadores da sGC deveríam inibir a agregação dos trombócitos induzida pelo colágeno dependente da dose. Ativadores, que estimulam a forma oxidada da sGC, deveríam mostrar na presença de ODQ um efeito antiagregatório mais forte. O valor IC5o para a inibição da agregação deveria ser alterada para menores concentrações.

Para a determinação da concentração cGMP intracelular os WPs são incubados durante 15 minutos na presença de 0,1 mM de isobutil- metilxantina (IBMX) a 37°C. A incubação é interrompida pela centrifugação e o precipitado é tratado com ácido perclórico 1M por ultra-som durante um minuto. Após nova centrifugação durante 15 minutos a 13000 x g o sobrena- dante é neutralizado com KOH 1 N e a concentração cGMP é determinada com um ensaio imunológico de enzima comercial (por exemplo, Amersham) para cGMP. A concentração de proteína é determinada no precipitado com o método de Bradford.

Compostos químicos, os quais estimulam a atividade da guani- latociclase solúvel, deveríam conduzir a um aumento dependente da con- centração da concentração de cGMP intracelular. Se a incubação é efetuada na presença de ODQ, deveríam poder ser obtidos com compostos químicos, os quais estimulam a atividade da guanilatociclase solúvel com ferro de ini- bição trivalente, níveis de cGMP significativamente maiores do que sem ODQ, isto é, ODQ deveria reforçar o efeito das substâncias.

Exemplo 4: Comprovação da estimulação da guanilatociclase solúvel após oxidação do ferro de inibição pela determinação do efeito sobre células da musculatura lisa de aorta de ratos. Células da musculatura lisa (VSMC) de aorta de ratos são isola- das pelo método de J.H. Chamley e outros, Cell tissue Res. 177, 503-522 (1977) e cultivadas.

As células são semeadas em placas com 6 compartimentos e incubadas durante 15 minutos em tampão de Hepes-Tyrode (pH 7,4 com 200 U de SOD, 0,3 mM de IBMX) a 37°C. O efeito das substâncias sobre as VSMC é examinado na ausência e na presença de ODQ. A incubação é in- terrompida por filtração sob sucção do sobrenadante e adição de nitrogênio líquido e as células são congeladas em placas com 6 compartimentos. Para a determinação do cGMP as placas são descongeladas, os compartimentos individuais são sobrepostos com tampão e no sobrenadante determina-se a concentração de cGMP com um ensaio imunológico de enzima comercial (por exemplo, Amersham) para cGMP. A concentração da proteína é deter- minada após a dissolução da proteína nos compartimentos com de NaOH 0,1 M com o método de Bradford, Compostos químicos, os quais estimulam a atividade da guani- latociclase solúvel, deveríam conduzir para um aumento dependente da con- centração da concentração de cGMP intracelular. Se a incubação é efetuada na presença de ODQ, deveríam poder obter-se com compostos químicos, os quais estimulam a atividade da guanilatociclase solúvel com ferro de inibição trivalente, níveis de cGMP essencialmente maiores. ODQ deveria reforçar o efeito dos compostos em atividade.

Exemplo 5: Preparação de 2-(4-cloro-fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi-N-(4-(tiomorfoIin-4- sulfonil)feni!)-benzamida 33,71 g (0,32 mol) de carbonato de sódio foram dissolvidos em 250 ml de água e aquecidos a 60°C. Na solução foram introduzidos 25,00 g (0,13 mol) de ácido 2-amino-4,5-dimetoxibenzóico e a esta solução no espa- ço de tempo de 15 minutos acrescentam-se parceladamente 29,55 g (0,14 mol) de cloreto de 4-cloro-benzenossulfonila. Depois do resfriamento da mistura foi filtrado sob sucção, o resíduo foi retomado com solução de hidro- genocarbonato de sódio a 1 %, filtrada e pela adição de ácido clorídrico 1N o produto foi precipitado. Foram obtidos 25,90 g (55 %) de ácido 2-(4-cloro- fenÍlsulfoni!amino)-4,5-dimetóxi-benzóico do ponto de fusão de 212-214°C. 25,90 g (0,07 mol) de ácido 2-(4-cloro-fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi- benzóico foram suspensos em 75 ml de tolueno, acrescentados 17,30 g (0,08 mol) de pentacloreto de fósforo e a mistura foi agitada durante 2,5 ho- ras a 40-45°C. Em seguida, concentrou-se no vácuo para a metade do vo- lume, o produto precipitado foi filtrado sob sucção e pós-lavado com pouco tolueno. Foram obtidos 25,30 g (93 %) de cloreto de ácido 2-(4-cloro-fenil- sulfonilamino)-4,5-dimetóxi-benzóico do ponto de fusão de 175-177°C. 10,00 g (25,6 mmoles) de cloreto de ácido 2-(4-cloro- fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi-benzóico foram suspensos em 300 m! de tolueno, foram acrescentados 4,49 g (25,6 mmoles) de fluoreto de ácido 4- aminobenzenossulfônico e a mistura foi aquecida durante 4 horas sob reflu- xo. Depois de resfriar, o precipitado separado foi filtrado sob sucção e lavado com tolueno. Foram obtidos 11,71 g (87 %) do composto do título do ponto de fusão de216-219°C. 500 mg (0,95 mmol) de fluoreto de ácido 4-((2-(4-cloro-fenilsul- fonilamino)-4,5-dimetóxi-benzoil)-amino)-benzenossulfônico são dissolvidos em 1 ml de tiomorfolina e aquecidos durante 30 minutos a 90°C. Para a ela- boração foi vertido sobre 50 ml de gelo/ácido clorídrico 1N, o precipitado foi filtrado sob sucção, secado an estufa de secagem a vácuo sobre pentóxido de fósforo e recristalizado em hexano/éster acético. Foram obtidos 378 mg (65 %) do composto do título do ponto de fusão de 241 °C.

Claims (14)

1. Processo para detecção de uma guanilatociclase solúvel, em que o ferro do heme nesta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) preparação de uma guanilatociclase solúvel, b) preparação de pelo menos um composto químico, em que o composto químico é 2-(4-cloro-fenilsulfonilamino)-4,5-dimetóxi-N-(4- (tiomorfolin-4-sulfonil)-fenil-benzamida, o qual estimula a atividade de uma guanilatociclase solúvel quando o ferro do heme nesta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente; c) incubação de uma guanilatociclase solúvel, preparada tal como descrito em a), com um composto químico, preparado tal como descrito em b); d) determinação da atividade da guanilatociclase solúvel após incubação de acordo com c).

2. Processo para detecção de uma guanilatociclase solúvel, em que o ferro do heme nesta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) preparação de uma guanilatociclase solúvel, b) preparação de pelo menos um composto químico, o qual estimula a atividade de uma guanilatociclase solúvel onde o ferro do heme nesta guanilatociclase solúvel se apresenta no estágio de oxidação trivalente; c) incubação de uma guanilatociclase solúvel, preparada tal como descrita em a), com um composto químico, preparado tal como descrito em b); d) determinação da atividade da guanilatociclase solúvel após incubação de acordo com c); e) determinação da atividade da referida guanilatociclase solúvel tal como descrito em a), em uma amostra biológica de referência na presença do composto químico de b), em que a referida guanilatociclase solúvel na amostra biológica de referência foi pré-tratada com um agente de oxidação, em que a determinação de e) atua como um valor de referência para a determinação da proporção de guanilatociclase solúvel onde o ferro do heme se apresenta no estágio de oxidação trivalente.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é preparada a guanilatociclase solúvel de um mamífero.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é preparada a guanilatociclase solúvel de um bovino.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é preparada uma guanilatociclase solúvel humana.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a guanilatociclase solúvel é composta de uma subunidade α e uma subunidade β, em que a subunidade α é uma subunidade ou ou 012 e a subunidade β é uma subunidade βι ou β2.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a guanilatociclase solúvel é preparada pelo isolamento de um material biológico.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a guanilatociclase solúvel é pré-tratada com um agente de oxidação.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que a guanilatociclase solúvel é tratada com 1 H-(1,2,4)-oxadiazol(4,3-a)quinoxalin-1-ona.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que a guanilatociclase solúvel é tratada com oxadiazol(3,4-d)benz(b)(1,4)oxazin-1-ona.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizado pelo fato de que a guanilatociclase solúvel é tratada com ferrocianeto de potássio.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a atividade da guanilatociclase solúvel é determinada por um ensaio funcional ou por um ensaio de ligação.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente as seguintes etapas: e) incubação da guanilatociclase solúvel após incubação como descrita em c) e GTP como substrato, pelo qual GTP é convertido a cGMP e pirofosfato; f) adição de uma transferase de nicotinamida adenila de mononucleotídio e nicotinamida adenina de dinucleotídio (NAD+), pela qual o pirofosfato de e) é convertido a ATP; g) adição de luciferase e luciferina e determinação luminométrica do ATP formado em f) mediante reação com luciferina e luciferase.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente introdução de GTP, NAD+, transferase de nicotinamida adenila de mononucleotídio, luciferina e luciferase em um recipiente de reação, iniciação da reação pela adição da guanilatociclase solúvel, determinação da quantidade de ATP formado, e deste modo, determinação da atividade da guanilatociclase solúvel.