JP4814466B2 - 可溶性グアニル酸シクラーゼの酸化型を検出する方法 - Google Patents
可溶性グアニル酸シクラーゼの酸化型を検出する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4814466B2 JP4814466B2 JP2001523794A JP2001523794A JP4814466B2 JP 4814466 B2 JP4814466 B2 JP 4814466B2 JP 2001523794 A JP2001523794 A JP 2001523794A JP 2001523794 A JP2001523794 A JP 2001523794A JP 4814466 B2 JP4814466 B2 JP 4814466B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- guanylate cyclase
- soluble guanylate
- heme
- activity
- soluble
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
本発明は、そのヘム複合鉄が酸化されている可溶性グアニル酸シクラーゼまたはヘム分子団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法、さらに酸化ヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化することができる化合物を特定するスクリーニング方法、さらに三価ヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する診断剤に関する。
【0002】
【従来技術】
可溶性グアニル酸シクラーゼはヘテロダイマー型蛋白質である。それらは、いずれの事例でもαサブユニットおよびβサブユニットから成り、補欠分子団としてヘムを含む。シグナル分子NOのヘムとの結合はこの酵素の活性化をもたらす。可溶性グアニル酸シクラーゼの酵素活性により生成されるcGMPは、とりわけcGMP依存蛋白キナーゼの活性化およびホスホジエステラーゼまたはイオンチャネルの調節に中心的役割を果たす。前記サブユニットの4つのアイソフォームが報告されている。これらはその配列に違いが有り、さらに組織特異的発現および発生特異的発現で異なっている。サブタイプα1およびβ1は主に肺、腎および脳に存在する。β2鎖は主に肝および腎で発現され、α2鎖は胎盤で発現される。サブユニットの二量体化は、触媒活性をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの必須条件である。ヘテロダイマーα1/β1、α2/β1およびα1/β2が知られている。全てのサブユニットについて、高度の相同性が触媒ドメイン領域に認められる。
【0003】
可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)は1つのヘテロダイマーにつき1つのヘムを含んでいる。ヘムの結合はβ1鎖のHis−105を介して生じる。β1サブユニットのN末端にHis−105をもはや含まない変異体はNOによって活性化されない。可溶性グアニル酸シクラーゼのヘムは分子の有機部分および鉄原子から成る。前記有機部分、プロトポルフィリンIXは、メチン架橋によって連結されている4つのピロール環を含み、テトラピロール系を提供する。前記ヘム内の鉄原子は、プロトポルフィリン環の中心部の4つの窒素原子と結合している。鉄原子はさらに2つの他の結合に加わることができる。ヘム内の鉄の酸化状態は+2(第一鉄形)または+3(第二鉄形;酸化型)であろう。ヘム内の鉄の酸化状態は、可溶性グアニル酸シクラーゼの酵素機能に重大な影響を与える。その三価のヘム鉄をもつ酵素は、ヘム分子団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼのように基礎酵素活性を示すだけで、NOによって活性化されない。ヘムを含まない可溶性グアニル酸シクラーゼの製造は下記の文献に報告されている:Eur. J. Biochem. 240:380-386(1996)。
【0004】
可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)は、GTPの環状グアノシン一リン酸(cGMP)およびピロホスフェートへの変換を触媒する。cGMPは細胞内メッセンジャー(第二メッセンジャー)として作用する。第二メッセンジャーはカスケード様反応で細胞内で生成される。それらのレベルは細胞外シグナル(例えばホルモン、神経伝達物質、増殖因子、臭気物質、ペプチド、光)によって制御される。第二メッセンジャーの生成はシグナルの強化のために機能する。第二メッセンジャーは、細胞タイプによって変動する特定の標的蛋白質(キナーゼ、ホスファターゼ、鉄チャネルおよびその他)に細胞内のシグナルを伝達する。
したがって、可溶性グアニル酸シクラーゼの改変は、cGMPレベルに対する影響およびcGMPレベルによって制御される標的蛋白質に対する影響を通じて多くの薬理学的な影響をもたらす。このようにして影響をうけるメカニズムの例は、(例えば血管壁の)平滑筋の弛緩、血小板活性化の抑制、平滑筋細胞の増殖抑制または白血球粘着抑制である。
【0005】
可溶性グアニル酸シクラーゼは、ヒトを含む全ての哺乳類で例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、脳のような器官で検出される。病理変化の過程または病的事象に関連する過程において、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の酸化状態は本質的な役割を果たすであろう。酸化ヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの割合の増加は、可溶性グアニル酸シクラーゼの内因性NOによる活性化の可能性の減少をもたらす。これは、とりわけ血圧の上昇、血小板の活性化、細胞増殖の増加または細胞粘着の強化を通じて、永続的な高血圧、安定または不安定狭心症、血栓症、心筋梗塞、卒中、肺浮腫、勃起障害、腫瘍形成を伴う無制御組織増殖、糖尿病、腎機能不全、肝機能不全、または血管系機能不全をもたらすであろう。
【0006】
血管壁の内皮細胞は、特に可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化するためにパラクリンホルモンとしてNOを分泌する。可溶性グアニル酸シクラーゼの薬理学的刺激のためにしばしば用いられる化合物は、介在NO遊離を通じてNOドナーとして機能する。その例は有機ナイトレートである。さらに、NO遊離を介しては作用しないが可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を改変する多様な化合物が報告されている。
【0007】
NOドナーまたは遊離NOによる可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化は、もっぱらヘム鉄の還元(すなわち(Fe2+)含有)状態で生じる。このことは、1H−[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3−a]キノキサリン−1−オン(=ODQ)を用いて実施された実験から明らかである(A. Schrammel et al., Mol. Pharmacol. 50:1(1996))。ODQは可溶性グアニル酸シクラーゼの特異的で極めて効果的な抑制物質である。ODQは補欠ヘム分子団と相互作用する。in vitroでは、これらの物質は、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の不可逆的な酸化を引き起こす。可溶性グアニル酸シクラーゼのODQによる処理はNOの本酵素に対する刺激作用の消失をもたらす。可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の酸化はまた、オキサジアゾロ(3,4−d)ベンゾ(b)(1,4)オキサジン−1−オン(Olesen et al., British Journal of Pharmacology 123:299-309(1998))またはフェリシアン化カリウム(Koesling et al., in“Reviews of Physiology Biochemistry and Pharmacology" pp.41-65, Springer Verlag 1999)によってももたらされる。さらにまた、NOの遊離を介しては作用しない可溶性グアニル酸シクラーゼ活性化物質が存在する。それについては例えば以下に記載されている:Vesely et. al., Eur. J Clin. Invest. 15:258(1985)。ヘム非含有可溶性グアニル酸シクラーゼのプロトポルフィリンIXによる賦活はIgnarro et al(Adv. Pharmacol. 26:35(1994))によって示された。プロトポルフィリンIXの作用はODQによって抑制されないが、前記化合物によって強化される(Koesling & Friebe, Physiol. Biochem. Pharmacol. 135:41(1999))。今日まで明らかにされた可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化物質は、ヘム鉄が還元(すなわちFe2+含有)状態である場合にのみその酵素活性を刺激する。
【0008】
最近になって、硫黄置換スルホニルアミノカルボン酸N−アリールアミド形をもつ別の種類の化合物が報告され(WO 00/02851)、その代表的な物質は可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化することができる。
可溶性グアニル酸シクラーゼの活性は、今日まで例えばcGMPおよびcAMPを検出する酵素的方法を用いるか、またはヘム分子団を検出する測光法によって検出されている。
【0009】
病的変化が可溶性グアニル酸シクラーゼの状態に依存することを証明するためには、免疫学的検出方法または標識技術を用いて単にこの蛋白質を検出するだけでは不十分である。ヘム分子団内のこの複合鉄のレドックス状態を知ることこそ重要である。複合ヘム鉄のレドックス状態をESR測定または測光法により決定することによって、可溶性グアニル酸シクラーゼ内のヘムの官能性についての情報を得ることが今日可能であるが、このような測定は、ややもすると複雑な技術装置を利用できるか否かに左右されるという欠点を有する。さらにまた、これらの方法は、他のヘム含有蛋白質に由来する夾雑物が容易に前記方法に干渉するために、個々の測定について限定的な適合性しかもたない。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、したがって可溶性グアニル酸シクラーゼの酸化状態を検出するために特異的で単純化された方法を提供することである。本発明の別の目的は、そのヘム鉄が三価の状態で酸化されているときに可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化させる化学物質を見つける方法を提供することである。本発明はまた、そのヘム鉄が三価の状態で酸化されている可溶性グアニル酸シクラーゼを特定するために適している診断剤に関する。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の工程を含む、可溶性グアニル酸シクラーゼ(この場合本可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄は三価の酸化状態にある)を検出する方法に関する:
a)可溶性グアニル酸シクラーゼを提供し;
b)可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄が三価の酸化状態にあるとき、この可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する少なくとも1つの化合物を提供し;
c)a)のように提供された可溶性グアニル酸シクラーゼをb)のように提供された化合物とともにインキュベートし;
d)c)のようにインキュベートした後で可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を測定する。
【0012】
前記可溶性グアニル酸シクラーゼは可溶性グアニル酸シクラーゼ分子の混合物から成っていてもよく、全ての可溶性グアニル酸シクラーゼ分子が三価の酸化状態のヘム鉄を含むというわけではない。特に、前記可溶性グアニル酸シクラーゼ分子のヘム分子団のいくつかは三価の酸化状態であり、他のいくつかは二価の酸化状態にあり、結果として様々な割合のヘム鉄の酸化状態を含む混合物が生じる。ヘム鉄が三価型である可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法は、例えばリファレンス値を用いて比較することによって実施できる。リファレンス値は、特に例えば、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの既知の割合に対するグアニル酸シクラーゼ活性の依存性を測定した実験から得ることができる。三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの個々の割合についての測定値は、ODQで可溶性グアニル酸シクラーゼを予備処理し、続いてこの可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を決定することによって得ることができる。続いて、測定されたリファレンス値は、三価の酸化状態のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの定量的測定のための検量線プロットとして用いられる。
【0013】
可溶性グアニル酸シクラーゼは、様々な状態で、例えば多様なヘテロダイマー型可溶性グアニル酸シクラーゼとして用いることができる。原則として、任意の種、特に任意の哺乳類種に由来する可溶性グアニル酸シクラーゼを用いることが可能である。好ましくはウシの可溶性グアニル酸シクラーゼが用いられ、好ましくは肺臓組織から単離される。ヒトの可溶性グアニル酸シクラーゼが特に好ましい。提供される可溶性グアニル酸シクラーゼは、各事例で好ましくはαサブユニット(例えばα1またはα2サブユニット)およびβサブユニット(例えばβ1またはβ2)を含むことができる。可溶性グアニル酸シクラーゼのサブユニットを本発明の方法に用いることが可能であり、かつ好ましい。対応する配列情報は以下の文献に記載されている:ヒトの脳から最初に単離された可溶性グアニル酸シクラーゼの2つのサブユニットについては、Giuili et al., FEBS Letter 304:83-88(1992); ラット肺組織由来の可溶性グアニル酸シクラーゼのcDNAについては、Nakane et al., J. Biol. Chem. 265:16841-16845(1990);ラット腎由来の可溶性グアニル酸シクラーゼについてはYuen et al., Biochemistry 29:10872-10878(1990)。
【0014】
可溶性グアニル酸シクラーゼは、生化学的な方法を用いて生物学的な材料から単離することによって提供される。そのような場合には特に異なる酸化状態のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼ分子混合物がしばしば存在する。生化学的な方法とはとりわけ、生物学的な材料を分解する方法、遠心沈殿、クロマトグラフィー分離、ゲル電気泳動、等電点分離、免疫学的方法である。生物学的な材料には真核細胞または原核細胞、細胞分解物または細胞分解物から得られる調製物、完全細胞または細胞の部分もしくは分画が含まれる。前記真核細胞には、とりわけ例えばヒトを含む脊椎動物の心臓、血管、肺臓、血液、脳、肝臓、腎臓、脂肪組織、筋肉のような組織または器官に由来する細胞、組織または血液サンプルが含まれるが、またヒトもしくは動物細胞培養、および昆虫培養細胞に由来する細胞も含まれる。具体的な例を述べると、血小板(ヒトまたは動物の血液サンプルから得ることができる)、および平滑筋細胞(例えば動物またはヒト由来の血管から単離できる)である。さらに別の例は生検材料、器官および組織並びに移植後に残った部分、臍帯または胎盤である。原核細胞は、例えば細菌(大腸菌(Escherichia coli)、チフス菌(Salmonella typhimurium)、枯草菌(Bacillus subtilis)を含む)の他に真菌(例えばビール酵母(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミケス=ポンベ(Saccharomyces pombe)またはピキア=パストリス(Pichia pastoris))であろう。本発明の好ましい実施態様では、可溶性グアニル酸シクラーゼは、例えば真核細胞または原核細胞で発現ベクターを用いて発現させることによって調製された遺伝子組換え(リコンビナント)物質であろう。そのような場合には、ヘム補欠分子団をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼまたは前記をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼが細胞内に蓄積されるか、または培養液中に分泌される。ある実施態様では、可溶性グアニル酸シクラーゼは、P. Humbert et al.(Methods of Enzymology 195:384-391(1991))が記載した方法によって単離される。
【0015】
ある実施態様では、酸化剤で処理された可溶性グアニル酸シクラーゼが提供される。好ましい実施態様では、ODQで処理された可溶性グアニル酸シクラーゼが提供される。ODQの濃度は、例えば0.001mMから0.5mM、好ましくは0.005mMから0.1mM、特に好ましくは0.01mMである。さらにまた、オキサジアゾロ(3,4−d)ベンゾ(b)(1,4)オキサジン−1−オンまたは別のODQ誘導体で処理した可溶性グアニル酸シクラーゼを提供することも好ましい。別の好ましい実施態様では、フェリシアン化カリウムで処理した可溶性グアニル酸シクラーゼが提供される。酸化剤および/またはODQおよび/または他の化合物による可溶性グアニル酸シクラーゼの処理は、ヘム鉄の酸化、換言すれば鉄の二価酸化状態(Fe2+)から三価酸化状態(Fe3+)への変換を、処理した可溶性グアニル酸シクラーゼ分子のいくつかのみについて、または特定の実施態様では全ての分子について、選択した条件に応じてもたらすことができる。本発明を実施する場合、一般に、可溶性グアニル酸シクラーゼ分子の一部の、または好ましい実施態様では可溶性グアニル酸シクラーゼ分子の全てのヘム鉄が三価の酸化状態である一定の形態の可溶性グアニル酸シクラーゼを用いることができる。
【0016】
可溶性グアニル酸シクラーゼを提供する場合、提供される化合物とのインキュベーションに適した形状を調製することとが含まれる。ここでインキュベーションとは、可溶性グアニル酸シクラーゼおよび化合物を互いに接触させることを意味する。蛋白質は、例えば緩衝液、イオンまたは他の補助試薬を補充した水性溶媒に分散または溶解できる。蛋白質はまた、例えば担体物質に結合させて用いるか、前記の形態で固定するか、溶媒に分散させてもよい。
【0017】
三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激するために提供される化合物は単一化合物でも、または化合物の混合物でもよい。化合物は、例えば合成されたものでも、天然の物質から単離されたものでもよい。原則として、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄が三価の酸化状態のときに可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する全ての化合物を用いることができる。
三価の酸化状態にあるヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法を実施するために、例えば化合物2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ−N−(4−(チオモルフォリン−4−スルホニル)フェニル)ベンゾアミドを使用することができる。
【0018】
三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法を実施する場合、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼをもっぱら刺激する化合物を使用することができる。同様に、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化するだけでなく可溶性グアニル酸シクラーゼに対する他の作用を示す化合物を使用することができる。例えば、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化するだけでなく、可溶性グアニル酸シクラーゼの基礎活性を刺激するか、または二価ヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化させる化合物を使用することができる。三価のヘム鉄をもつ酵素型をもっぱら活性化するか、または例えば二価のヘム鉄をもつ酵素型をも活性化する化合物を用いて可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法は、リファレンス値、検量線プロットの補助により、および/または、二価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼをもっぱら活性化できる物質(例えばNOドナー)との比較によって実施される。検量線プロットを作製するために、可溶性グアニル酸シクラーゼを種々の濃度の、例えばODQとインキュベートすることができる。三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼ対二価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの個々の比率は、各事例で用いたODQの濃度に依存する
【0019】
使用したODQ濃度は、三価のヘム鉄をもつ酵素の割合の測定値として直接用いることができる。三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの絶対的割合は、検量線のための他の測定方法(例えばESR測定)を用いてチェックできる。それぞれ異なる濃度のODQで予備処理した可溶性グアニル酸シクラーゼは、インキュベーション工程で化合物によって活性化される。このとき、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼをもっぱら活性化する化合物は、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの量に正比例する値を提供する。三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの他に二価のヘム鉄をもつ酵素型をも活性化する化合物を使用するときは、二価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼをもっぱら活性化する物質に関するさらに別の検量線プロットが必要である。三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの割合は、ODQで予備処理した可溶性グアニル酸シクラーゼを種々に刺激した後で得られた活性を比較することによって得られる。この目的のために、可溶性グアニル酸シクラーゼは、二価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼをもっぱら活性化する化合物で一度刺激され、他方で三価および二価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化する化合物が刺激に用いられる。調査されるべきサンプル中の三価ヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの割合は、上記のように可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化できる化合物とのインキュベーションの後で得られる前記サンプル中の可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を検量線プロットの数値と比較することによって得られる。
【0020】
化合物を提供する場合、この化合物を適当な溶媒(例えばジメチルスルホキシド(DMSO)または水)に溶解することおよび補助試薬を用いて製剤化することもまた含まれる。
インキュベーションの時間は変動可能で、さらに種々の温度で実施できる。必要な時間および温度設定は、提供される可溶性グアニル酸シクラーゼ、および提供される化合物、および/または他の条件(使用される可溶性グアニル酸シクラーゼおよび/または化合物の調製形態、濃度、および他の添加剤)によって左右される。インキュベーション時間は、例えば1分から120分で、好ましくは1分から60分、特に好ましくは30分が選ばれる。インキュベーション温度は5℃から45℃で、好ましくは20℃から40℃で、特に好ましい実施態様では37℃である。
【0021】
可溶性グアニル酸シクラーゼの活性は、例えば単離細胞または細胞培養物において、例えば酵素アッセイ、またはその後の機能アッセイまたは結合アッセイによって検出できる。ある実施態様では、活性の検出はルミアグリゴメーターを用いて血小板凝集抑制を検出することによって実施できる。血小板の凝集は、可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化後、さらに可溶性グアニル酸シクラーゼにより惹起される細胞内cGMPの増加の活性化後に低下する。血小板凝集抑制の程度は可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化に比例し、したがって酵素活性の測定手段を提供する。本発明のこの実施態様では、可溶性グアニル酸シクラーゼは単離形で提供されるのではなく血小板に存在する。原則として本発明では、可溶性グアニル酸シクラーゼは、完全な細胞中に存在するような形態でも用いることができる。別の好ましい実施態様では、可溶性グアニル酸シクラーゼの活性はまた、生成cGMPをRIA(放射性イムノアッセイ)またはEIA(酵素免疫アッセイ)を用いて測定することによって決定される。別の好ましい実施態様では、活性は、化合物による平滑筋細胞内でのcGMP生成に対する影響を通じて決定される。平滑筋細胞は、例えば血管壁の構成成分である。これらの筋細胞は、細胞内cGMPレベルが増加するときに弛緩する。これは可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化を介して生じるであろう。平滑筋細胞の弛緩はしたがって、可溶性グアニル酸シクラーゼのアクチベーターを検出するために用いることができる。
【0022】
可溶性グアニル酸シクラーゼは、そのヘム鉄が三価の状態にあるときは、これまでに開示されている活性な薬剤成分ではもはや活性化されない。そのヘム鉄が三価の状態に酸化されているとき、可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化できる化合物はこれまで報告されたことはない。そのような化合物は、可溶性グアニル酸シクラーゼを刺激する医薬の活性な薬剤成分として、例えば三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼによって惹起される病的状態で用いることが可能であろう。同様に、可溶性グアニル酸シクラーゼの酸化型を検出する本発明の方法でそのような化合物を用いることが可能であろう。したがって、本発明の別の実施態様は、以下の工程を含む、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄が三価の酸化状態にあるときに前記可溶性グアニル酸シクラーゼを刺激する化合物を見つける方法に関する:
a)可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄が三価の酸化状態にある可溶性グアニル酸シクラーゼを提供し;
b)調査しようとする少なくとも1つの化合物を提供し;
c)工程a)の可溶性グアニル酸シクラーゼを工程b)の調査しようとする少なくとも1つの化合物とインキュベートし;
d)工程c)のようにインキュベートした後で前記可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を決定する。
【0023】
化合物を見つける方法はまたスクリーニングと称される。本スクリーニング方法のための可溶性グアニル酸シクラーゼの使用および提供については、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法で既に述べたとおりである。
スクリーニングのために可溶性グアニル酸シクラーゼを提供する場合、調査しようとする化合物とのインキュベーションに適した形態で調製することが含まれる。可溶性グアニル酸シクラーゼは、例えば、緩衝液、イオンまたは他の補助試薬を補充した水性媒体に分散または溶解することができる。それはまた、例えば担体物質に結合してもよく、さらに溶媒に分散させた形態で固定して用いてもよい。
【0024】
スクリーニングで調査しようとする化合物は、例えば化学的に合成された化合物でも天然の生成物でもよい。調査しようとする化合物は、多様な物質状態で、例えば精製された単一物質として、他の化合物(必ずしも詳細に性状が判明している必要はない)との混合物として、種々の活性化合物との混合物として、生物に由来する物質の混合物の成分として存在することができ、または真核細胞および/または原核細胞生物とともに存在しているものでもよい。本スクリーニング方法は、例えば実験室ロボットまたは補助機械を用いて実施してもよい。調査しようとする化合物(三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化する)は、病的変化を示す状態(例えば癌、狭心症、糖尿病、心筋梗塞、勃起不全、心不全、高血圧、血栓症、貧血または脈管機能不全)を治療するための活性な薬剤成分として用いることができる。
【0025】
本発明はまた、そのヘム鉄が三価の酸化状態にある可溶性グアニル酸シクラーゼのアクチベーターであると本スクリーニング方法によって特定される化合物に関する。特に本発明は、そのヘム鉄が三価の酸化状態にある可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を賦活することができる化合物、およびこのような物質の使用、好ましくは活性な薬剤成分としての使用に関する。したがって、本発明はまた、そのヘム鉄が三価の酸化状態にある可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化することができる、したがって三価の酸化状態のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼによって惹起されるか、または進行する病的状態の治療または予防のために活性を有する薬剤成分として用いることができる化合物に関する。そのような病的状態には、例えば癌、狭心症、糖尿病、心筋梗塞、勃起不全、心不全、高血圧、血栓症、脈管機能不全または貧血が含まれる。
【0026】
本発明はまた、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の酸化状態を決定する方法で使用される診断剤に関する。本診断剤は、前記の目的のために少なくとも1つまたは2つ以上の以下の成分を含む:a)可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄が三価の酸化状態にあるとき、この可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する少なくとも1つの化合物、およびb)可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を決定するための溶液および/または試薬。診断剤で用いることができる化合物の例は、2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ−N−(4−(チオモルフォリン−4−スルホニル)フェニル)ベンズアミドである。前記活性は上記で既に述べた方法の1つによって決定できる。
【0027】
診断剤はまた、例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼ、そのヘム鉄が二価の状態にあるときにのみ可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化する化合物、酸化剤および/またはODQを含むことができる。これらの構成成分は単独または組み合わせて用い、三価の酸化状態のへム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの定量的または定性的測定のためのリファレンス値または検量線プロットを作製することができる。
【0028】
診断剤は、例えば三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの生物学的サンプル中の濃度を決定するために用いることができる。生物学的サンプルは、例えば脊椎動物またはヒトの組織または器官に由来する細胞から成る。これらの細胞は生物から採取しても、または細胞培養技術によって増殖させてもよい。選択できる生物は、健常または病的変化を示す組織または器官をもつ個体である。例えば器官サンプル、組織サンプル、血液サンプル、細胞または生検材料は、ヒトまたは動物から医療技術を用いて採取でき、生物学的サンプルとして供することができる。種々の個体の異なる生活習慣および食習慣の観点から可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の酸化状態について、異なる個体に由来する生物学的サンプルの比較分析を実施することもまた可能である。したがって、例えば喫煙者および非喫煙者の細胞を入手して分析することができる。二価ヘム鉄と三価ヘム鉄との比における相違について、喫煙者の可溶性グアニル酸シクラーゼを非喫煙者のそれと比較することができる。
【0029】
本発明の好ましい実施態様は、真核細胞生物から採取された生物学的サンプル中に存在する可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の酸化状態を決定するためのin vitroでの方法に関する。真核細胞生物から得られた生物学的サンプルは、例えば細胞培養、組織または器官に由来する健常細胞または病的変化をもつ細胞を含むことができる。
【0030】
別の好ましい実施態様では、本発明の診断剤は前記in vitroの方法を実施するために用いられる。 病的変化をもつ生物学的状態の可能な例は、 癌、 狭心症、糖尿病、勃起不全、心筋梗塞、心不全、高血圧、血栓症、貧血、脈管機能不全などである。さらにまた、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄の酸化状態に対する影響について、例えば喫煙またはアルコール摂取のようなある種の生活習慣または食習慣を調査することが可能である。
健常な生物学的状態では、性状決定のために用いられるパラメーターは正常な範囲に入る。正常な範囲を確立するための適切な情報は、例えば臨床化学のテキスト(例えば、Keller, Herbert: Klinisch-chemische Labordiagnostik fuer die Praxis; Thieme-Verlag, Stuttgart)で見つけることができる。
【0031】
本発明はまた、発光測定アッセイを用いて可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法に関する。本アッセイはいくつかの工程を含む。前記工程は連続的にまたは同時に実施できる。発光測定アッセイは以下の工程から成る:a)可溶性グアニル酸シクラーゼおよび基質としてのGTPを提供し;b)前記GTPを前記提供された可溶性グアニル酸シクラーゼによって変換してcGMPおよびピロホスフェートを生成し;c)ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼおよびニコチンアミドジヌクレオチド(NAD+)を提供し;d)工程b)で生成されたピロホフェートをニコチンアミドジヌクレオチド(NAD+)の存在下でニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼによって変換してATPを生成し;e)ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンを提供し;さらにf)生成されたATPをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることによって発光測定により測定する。
【0032】
生成ATP量は可溶性グアニル酸シクラーゼの濃度と相関する。本方法は、可溶性グアニル酸シクラーゼを反応混合物に添加することによって開始する。前記反応混合物は、他の物質の他に基質としてGTPを含んでいる。他の物質とは、例えば緩衝液、イオンまたは蛋白質であろう。可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する本方法は、可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する適切な化合物をスクリーニングする好ましい実施態様で適切である。可溶性グアニル酸シクラーゼを検出するためにこれまで用いられてきた方法(免疫的方法、酵素法、測光法)と比較して本発光測定法の利点は、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する潜在的能力について大量の化合物を極めて短時間にスクリーニングできるその可能性にある。スクリーニングを実施するために、調査しようとする化合物は、可溶性グアニル酸シクラーゼの添加によって前記方法を開始する前に反応混合物に添加される。本方法は、特定のスクリーニングの実施態様では実験室ロボットでの使用に適しており、さらに別の特に好ましい実施態様では手動操作に適している。
【0033】
可溶性グアニル酸シクラーゼの提供は、可溶性グアニル酸シクラーゼについてこれまでの節で既に述べたように実施できる。本発光測定アッセイの具体的な利点は、本方法を実施するための成分(例えばGTP、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、NAD+、ルシフェリンまたはルシフェラーゼ)を1つの反応容器に提供できるということである。可溶性グアニル酸シクラーゼの活性は、生成されるATPの量を測定することによって確定される。この反応は可溶性グアニル酸シクラーゼを添加することによって開始される。このことは本反応を一容器反応で実施することを可能にする。これはまた、調査しようとする化学物質の高速スクリーニング(HTS)にも適用でき、さらに再現性をもって実施することができる。本発光測定アッセイは、少量のピロホスフェートの検出に特に適している。本方法は、好ましい実施態様では可溶性グアニル酸シクラーゼの活性の測定に用いられる。本発光測定アッセイはまた、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼを検出するために先行する節で述べたような方法を実施する場合に適している。
【0034】
本発明はまた、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法に関する。本方法は工程として以下を含む:a)ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを提供し;b)可溶性グアニル酸シクラーゼがヘム分子集団をもたないときに、この可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激できる少なくとも1つの化合物を提供し;c)可溶性グアニル酸シクラーゼをヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激することができる化合物とインキュベートし;さらにd)前記化合物とインキュベートした後で、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を測定する。
【0035】
本発明はまた、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する化合物を見つける方法に関する。本方法は工程として以下を含む:a)ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを提供し;b)調査しようとする少なくとも1つの化合物を提供し;c)ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを調査しようとする少なくとも1つの化合物とインキュベートし;さらにd)インキュベートした後で可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を測定する。
【0036】
本発明はまた、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの酸化状態を決定する診断剤に関する。本剤は、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する少なくとも1つの化合物を含んでいる。本発明はまた、生物学的サンプル中のヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を測定するin vitroの方法に関する。 本方法は工程として以下を含むであろう:ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを含む生物学的サンプルを提供し、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激できる少なくとも1つの化合物を提供し、ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激することができる化合物とインキュベートし、さらに前記化合物とインキュベートした後でヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を測定する。
ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを提供する方法は以下の文献に記載されている:J. Foerster et al., Eur. J. Biochem. 240:380-386(1996)。ヘム分子集団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを刺激する適当な化合物の例は、2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ−N−(4−チオモルフォリン−4−スルホニル)フェニル)ベンゾアミドである。
【0037】
【実施例】
実施例1:
可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を検出する発光測定法
可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)は、GTPのcGMPおよびピロホスフェートへの変換を触媒する。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ(NAT, EC2.7.7.1)の存在下で、ピロホスフェートはATPおよびニコチンアミドモノヌクレオチドに変換される。生成されたATPはルシフェラーゼによる発光を測定することによってマイクロタイタープレートで定量される。
調査しようとする物質をDMSOに溶解し、アッセイ混合物中での最終濃度が50μMになるようにDMSO/水で希釈する。アッセイ混合物中のDMSO濃度は5%(v/v)を越えてはならない。
【0038】
100μlの反応混合物は以下を含む:50mMのTEA緩衝液(pH7.4)、3mMのMgCl2、3mMのGSH、0.1mMのGTP、1mMのIBMX(イソブチルメチルキサンチン)、0.2mMのNAD+、0.4mUのNAT、適当に希釈したsGC酵素溶液(文献(P. Humbert et al., Methods of Enzymology 195:384-391(1991))の記載にしたがってウシから単離)および被検物質または溶媒(基礎酵素活性を測定するため)。 反応はsGCの添加によって開始される。 反応混合物を室温で60分インキュベートし、続いて氷中で冷却し、さらに50mMのEDTA(pH8.0)を添加して反応を停止させる。ATPの測定のために、20μlの100mM MgCl2および50μlのATPアッセイ試薬(62.5mMのトリスアセテート(pH7.75)中のルシフェリン(0.035mM)およびルシフェラーゼ(10000U/ml)、1.9mMのEDTA、0.05mMのジチオスレイトール、0.1%BSA)を用いる。相対的ルミネセンス単位(RLU)はマイクロタイタープレートルミノメーターで決定できる。
sGC活性は、前記測定RLUからブランクRLU(酵素無しでインキュベート)を差し引いて得られる。被検物質によるsGCの活性化は、基礎酵素活性(溶媒コントロール)の百分率として示され、以下の式によって算出される:
100×(ΔRLU被検物質/DRLUコントロール)−100=活性化%
【0039】
実施例2:
ヘム鉄酸化後の可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化
単離sGCは、ヘムFe2+−含有(還元型)形(これはNOによって刺激される)およびFe3+−含有(酸化型)形(これはNOによって刺激されない)で溶液中に存在する。各形態の割合はこれまではESR測定によって決定されている。酸化窒素(NO)およびNOドナーはもっぱら還元状態のsGCを活性化する。例えば0.01mMの1H−[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3−a]キノキサリン−1−オン(ODQ)(これはin vitroでsGCを不可逆的に酸化する)の存在下でインキュベートされると、それらはその刺激作用を完全に消失する。sGCの新規なNO非依存性アクチベーター、1−ベンジル−3−(2−ヒドロキシメチル−5−フリル)インダゾール(YC−1)は、同様にsGCの還元型を活性化し、ODQによって抑制される。
【0040】
これとは反対に、もっぱらまたは優先的に酸化型を活性化する物質による刺激は、ODQによって強化されるかまたは影響を受けないかのどちらかで、混合物中の酸化型の割合に左右される。
これらの物質は、同様にしばしばsGCのヘム非含有型の活性化を示す。ヘム非含有sGCの調製は文献(J. Foster et al., Eur. J. Biochem. 240:380-386(1996))にしたがって実施される。
三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼは、新しく調製した酵素を4℃で7日間保存することによって調製できる。前記のように予備処理した可溶性グアニル酸シクラーゼを2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ−N−(4−(チオモルフォリン−4−スルホニル)フェニル)ベンゾアミドとともにインキュベートすることによって、17.6倍の活性刺激が得られた。EC50は0.5μmol/Lである。ヘム非含有可溶性グアニル酸シクラーゼを使用した場合の刺激は58.2倍に達する。この場合のアフィニティーは2.4μmol/Lである。
【0041】
実施例3:
血小板凝集に対する作用を決定することによってヘム鉄酸化後の可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化の検出
酸化窒素(NO)の生理学的作用(例えば血小板凝集抑制および血管平滑筋の弛緩)は、cGMPの生成増加を伴う可溶性(還元型)グアニル酸シクラーゼのNOによる直接的活性化の結果である。
選択的sGC抑制物質であるODQはsGCの酸化を介して、洗浄ヒト血小板におけるcGMPの増加およびNOドナーの抗凝集作用を抑制する(M.A. Moro et al., PNAS 93:1480-1485(1996))。
【0042】
洗浄ヒト血小板(WP)を調製するために、肘前静脈から血液を採取し、クエン酸/クエン酸ナトリウムで注射筒内で凝固防止する。16×gで15分遠心後、上清は血小板濃縮血漿(PRP)から成る。PRPを酸性にし、血小板を400×gで20分遠心して沈殿させタイロード溶液に分散させる。このような洗浄血小板(WP、3×105/μl)を本テストに用いる。
sGCアクチベーターによる凝集抑制はルミアグレゴメーターで決定される。WPを0.5mMのCaCl2の存在下で被検物質とともに37℃でインキュベートし、反応を例えば0.3μg/mlのコラーゲンの添加により開始する。凝集に対する前記被検物質の作用はODQの非存在下および存在下で調べる。sGCアクチベーターは、コラーゲン誘発血小板凝集の用量依存性抑制を示すはずである。sGCの酸化型を刺激するアクチベーターは、ODQの存在下でより強い抗凝固作用を示すはずである。凝集抑制のIC50は低濃度にシフトするはずである。
【0043】
細胞内cGMP濃度を決定するために、WPを0.1mMのイソブチルメチル−キサンチン(IBMX)の存在下で37℃で15分インキュベートする。インキュベーションを遠心によって停止させ、沈殿物を1Mの過塩素酸で処理し、1分超音波処理する。13000×gで15分新たに遠心した後、上清を1MのKOHで中和し、市販のcGMP用酵素免疫アッセイ(例えばAmersham)を用いてcGMP濃度を決定する。沈殿物の蛋白質濃度はブラッドフォード法で決定する。
可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を賦活する化合物は、細胞内cGMP濃度において濃度依存性増加をもたらすはずである。インキュベーションがODQの存在下で実施される場合は、ODQが存在しない場合よりも三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する化合物を用いて極めて高いcGMPレベルを得ることが可能なはずである。すなわち、ODQは前記物質の作用を強化するはずである。
【0044】
実施例4:
ラット大動脈の平滑筋細胞に対する作用を決定することによってヘム鉄酸化後の可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化の検出
ラット大動脈の平滑筋細胞(VSMC)を単離し、文献(J.H. Chamley et al., Cell Tissue Res. 177:503-522(1977))の方法によって培養する。細胞を6ウェルプレートに播種し、ヘペス−タイロード緩衝液(pH7.4、200UのSOD、0.3mMのIBMX含有)中で37℃で15分インキュベートする。VSMCに対する物質の作用をODQの非存在下および存在下で調べる。上清を吸引して除き、さらに液体窒素を添加することによってインキュベーションを停止し、前記細胞を6ウェルプレート中で急速冷凍する。cGMPを測定するために、プレートを融解し、個々のウェルを緩衝液でチャージし、上清中のcGMP濃度を市販のcGMP用酵素免疫アッセイ(例えばAmersham)を用いて決定する。蛋白濃度は、ウェル中の蛋白質を0.1MのNaOHを用いて溶解した後ブラッドフォード法によって決定する。
可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する化合物は、細胞内cGMP濃度について濃度依存性増加をもたらすはずである。インキュベーションがODQの存在下で実施される場合は、三価のヘム鉄をもつ可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を刺激する化合物を用いて極めて高いcGMPレベルを得ることが可能なはずである。ODQは前記アクチベーター化合物の作用を強化するはずである。
【0045】
実施例5:
2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ−N−(4−(チオモルフォリン−4−スルホニル)フェニル)ベンゾアミドの製造
炭酸ナトリウム33.71g(0.32mol)を250mlの水に溶解し、60℃に加熱した。25.00g(0.13mol)の2−アミノ−4,5−ジメトキシ安息香酸を前記溶液に導入し、さらに29.55g(0.14mol)の4−クロロベンゼンスルホニルクロリドをこの溶液に15分かけて少しずつ添加した。混合物を冷却した後、残留物を吸引によって濾過して、1%濃度の重炭酸ナトリウム溶液に取り、濾過した後、1Nの塩酸を添加して生成物を沈殿させた。融点が212−214℃の25.90g(55%)の2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ安息香酸が得られた。25.90g(0.07mol)の2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ安息香酸を75mlのトルエンに分散させ、17.30g(0.08mol)の五塩化リンを添加した後、この混合物を40−45℃で2.5時間撹拌した。続いてこれを真空中で半分の容積まで濃縮し、沈殿生成物を吸引を用いて濾過し、少量のトルエンで洗浄した。融点175−177℃の2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシベンゾイルクロリド25.30g(93%)を得た。
【0046】
10.00g(25.6mmol)の2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシベンゾイルクロリドを300mlのトルエンに分散させ、4.49g(25.6mmol)の4−アミノベンゼン−スルホニルフルオリドを添加し、この混合物を還流下で4時間加熱した。冷却後、分離した沈殿物を吸引を用いて濾過し、トルエンで洗浄した。11.71g(87%)の表題の化合物(融点216−219℃)が得られた。
500mg(0.95mmol)の4−((2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシベンゾイル)アミノ)ベンゼンスルホニルフルオリドを1mlのチオモルフォリンに溶解し、90℃で30分加熱した。最終工程のために、前記混合物を50mlの氷/1N塩酸に注ぎ入れ、沈殿物を吸引を用いて濾過し、真空乾燥装置の五酸化リン上で乾燥させ、ヘキサン/酢酸エチルで再結晶化させた。378mg(65%)の表題化合物(融点241℃)が得られた。
Claims (4)
- 以下の工程を含む可溶性グアニル酸シクラーゼの発光検出方法:
a)可溶性グアニル酸シクラーゼおよび基質としてGTPを提供し、さらに前記GTPをcGMPおよびピロホスフェートに変換し;
b)ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)を提供し、さらに工程a)のピロホスフェートを用いてATPに変換し;
c)ルシフェラーゼおよびルシフェリンを提供し、工程b)で生成されたATPの量をルシフェリンおよびルシフェラーゼとの反応によって発光測定により決定する。 - GTP、NAD+、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを反応容器に導入し、反応を可溶性グアニル酸シクラーゼを添加することによって開始し、生成されたATPの量を測定し、そこから前記可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を決定する、請求項1に記載の可溶性グアニル酸シクラーゼの発光検出方法。
- 可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を決定することを目的として可溶性グアニル酸シクラーゼを検出するための、請求項1または2に記載の方法。
- 以下の工程を含む、ヘム分子団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを検出する方法:
a)ヘム分子団をもたない可溶性グアニル酸シクラーゼを提供し;
b)少なくとも1つの化合物を提供し、ここで、化合物は2−(4−クロロフェニルスルホニルアミノ)−4,5−ジメトキシ−N−(4−(チオモルフォリン−4−スルホニル)フェニル)ベンゾアミドであり;
c)工程a)により提供された可溶性グアニル酸シクラーゼを工程b)により提供された化合物とインキュベートし;
d)工程c)でインキュベートした後に可溶性グアニル酸シクラーゼの活性を決定する。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944226.6 | 1999-09-15 | ||
DE19944226A DE19944226A1 (de) | 1999-09-15 | 1999-09-15 | Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen |
PCT/EP2000/008102 WO2001020023A2 (de) | 1999-09-15 | 2000-08-19 | Verfahren zum nachweis von oxidierten formen der löslichen guanylatzyklase |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003509061A JP2003509061A (ja) | 2003-03-11 |
JP2003509061A5 JP2003509061A5 (ja) | 2010-09-24 |
JP4814466B2 true JP4814466B2 (ja) | 2011-11-16 |
Family
ID=7922127
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001523794A Expired - Fee Related JP4814466B2 (ja) | 1999-09-15 | 2000-08-19 | 可溶性グアニル酸シクラーゼの酸化型を検出する方法 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6500631B1 (ja) |
EP (1) | EP1218535B1 (ja) |
JP (1) | JP4814466B2 (ja) |
KR (1) | KR100818537B1 (ja) |
AT (1) | ATE311473T1 (ja) |
AU (1) | AU783268B2 (ja) |
BR (1) | BR0014019B1 (ja) |
CA (1) | CA2382488C (ja) |
DE (2) | DE19944226A1 (ja) |
DK (1) | DK1218535T3 (ja) |
ES (1) | ES2252046T3 (ja) |
IL (3) | IL148600A0 (ja) |
MX (1) | MXPA02001835A (ja) |
NO (1) | NO332145B1 (ja) |
NZ (1) | NZ517783A (ja) |
WO (1) | WO2001020023A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200202025B (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19944226A1 (de) * | 1999-09-15 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen |
DE102006054562A1 (de) * | 2006-11-20 | 2008-05-21 | Bayer Healthcare Ag | Verfahren zum Nachweis von Pyrophosphat mit Biolumineszenz Detektion |
JP5350607B2 (ja) * | 2007-06-14 | 2013-11-27 | キッコーマン株式会社 | グアニル酸シクラーゼ活性測定法 |
JP5570731B2 (ja) * | 2008-02-28 | 2014-08-13 | 旭化成ファーマ株式会社 | ピロリン酸の測定方法 |
US8293100B2 (en) | 2009-03-13 | 2012-10-23 | Terrasep, Llc | Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5618665A (en) * | 1993-01-22 | 1997-04-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Enzymatic fluorometric assay for adenylate cyclase |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU876715A1 (ru) * | 1980-02-08 | 1981-10-30 | Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР | Способ вы влени распределени гуанилатциклазы в ткан х |
US6002817A (en) * | 1997-09-29 | 1999-12-14 | The Regents Of The University Of Michigan | Optical sensors for the detection of nitric oxide |
DE19744026A1 (de) * | 1997-10-06 | 1999-04-08 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Pyrazol-Derivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung in Arzneimitteln |
CA2336807C (en) * | 1998-07-08 | 2010-04-13 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Sulfur substituted sulfonylaminocarboxylic acid n-arylamides, their preparation, their use and pharmaceutical preparations comprising them |
DE19830430A1 (de) * | 1998-07-08 | 2000-01-13 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Schwefelsubstituierte Sulfonylamino-carbonsäure-N-arylamide, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate |
DE19837015C2 (de) * | 1998-08-14 | 2003-03-20 | Vasopharm Biotech Gmbh | Isolierte und gereinigte humane lösliche Guanylylcyclase alpha1/beta1 (hsGCalpha1/beta1) |
DE19944226A1 (de) * | 1999-09-15 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen |
DE10140421A1 (de) * | 2001-08-17 | 2003-03-06 | Bayer Ag | Neue Kombination |
GB2395431A (en) * | 2002-11-20 | 2004-05-26 | Northwick Park Inst For Medica | Combination of a metal carbonyl compound and a guanylate cyclase stimulant or stabilizer for the therapeutic delivery of carbon monoxide |
-
1999
- 1999-09-15 DE DE19944226A patent/DE19944226A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-08-19 KR KR1020027003427A patent/KR100818537B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-08-19 MX MXPA02001835A patent/MXPA02001835A/es active IP Right Grant
- 2000-08-19 WO PCT/EP2000/008102 patent/WO2001020023A2/de active Application Filing
- 2000-08-19 EP EP00956466A patent/EP1218535B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-19 BR BRPI0014019-8A patent/BR0014019B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-08-19 IL IL14860000A patent/IL148600A0/xx unknown
- 2000-08-19 DK DK00956466T patent/DK1218535T3/da active
- 2000-08-19 AU AU68396/00A patent/AU783268B2/en not_active Ceased
- 2000-08-19 CA CA2382488A patent/CA2382488C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-08-19 ES ES00956466T patent/ES2252046T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-19 JP JP2001523794A patent/JP4814466B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-08-19 DE DE50011765T patent/DE50011765D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-19 NZ NZ517783A patent/NZ517783A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-08-19 AT AT00956466T patent/ATE311473T1/de active
- 2000-09-14 US US09/661,915 patent/US6500631B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-03-10 IL IL148600A patent/IL148600A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-03-11 NO NO20021196A patent/NO332145B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-03-12 ZA ZA200202025A patent/ZA200202025B/xx unknown
- 2002-10-10 US US10/268,533 patent/US6913898B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-06-03 US US11/144,265 patent/US7309579B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-02-03 IL IL196874A patent/IL196874A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5618665A (en) * | 1993-01-22 | 1997-04-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Enzymatic fluorometric assay for adenylate cyclase |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20030054433A1 (en) | 2003-03-20 |
US6500631B1 (en) | 2002-12-31 |
BR0014019A (pt) | 2002-05-21 |
AU783268B2 (en) | 2005-10-06 |
DE50011765D1 (de) | 2006-01-05 |
JP2003509061A (ja) | 2003-03-11 |
IL196874A (en) | 2011-03-31 |
CA2382488A1 (en) | 2001-03-22 |
BR0014019B1 (pt) | 2014-02-11 |
IL148600A (en) | 2009-09-01 |
NO20021196L (no) | 2002-03-11 |
US7309579B2 (en) | 2007-12-18 |
ZA200202025B (en) | 2004-04-28 |
ES2252046T3 (es) | 2006-05-16 |
MXPA02001835A (es) | 2002-08-12 |
ATE311473T1 (de) | 2005-12-15 |
EP1218535A2 (de) | 2002-07-03 |
DK1218535T3 (da) | 2006-03-27 |
EP1218535B1 (de) | 2005-11-30 |
IL148600A0 (en) | 2002-09-12 |
US20050227308A1 (en) | 2005-10-13 |
KR100818537B1 (ko) | 2008-04-01 |
DE19944226A1 (de) | 2001-03-29 |
WO2001020023A3 (de) | 2001-11-15 |
NO20021196D0 (no) | 2002-03-11 |
US6913898B2 (en) | 2005-07-05 |
KR20020047164A (ko) | 2002-06-21 |
AU6839600A (en) | 2001-04-17 |
NZ517783A (en) | 2004-06-25 |
WO2001020023A2 (de) | 2001-03-22 |
NO332145B1 (no) | 2012-07-02 |
CA2382488C (en) | 2012-02-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhang et al. | NOX4-dependent hydrogen peroxide overproduction in human atrial fibrillation and HL-1 atrial cells: relationship to hypertension | |
Smolyarova et al. | A guide to genetically encoded tools for the study of H2O2 | |
US7309579B2 (en) | Method for screening for activators of soluble guanylate cyclase having oxidized heme iron | |
Koudelkova et al. | Novel FRET-based Src biosensor reveals mechanisms of Src activation and its dynamics in focal adhesions | |
Cormier et al. | Plant and fungal calmodulin: Ca2+-dependent regulation of plant NAD kinase | |
Teng et al. | Platelet aggregation induced by equinatoxin | |
Elgert et al. | A novel soluble guanylyl cyclase activator, BR 11257, acts as a non-stabilising partial agonist of sGC | |
Belia et al. | Sodium nitroprusside, a NO donor, modifies Ca2+ transport and mechanical properties in frog skeletal muscle | |
EP1100912A1 (en) | Method for screening of modulators of calcineurin activity | |
Kudriaeva et al. | In-depth characterization of ubiquitin turnover in mammalian cells by fluorescence tracking | |
CA2573257C (en) | Probe for detection and quantification of nitric oxide, and method for detecting and quantifying nitric oxide using the same | |
Poeggel et al. | Histochemistry of nucleotidyl cyclases and cyclic nucleotide phosphodiesterases | |
Dalgarno et al. | Preparation and properties of a mitochondrial fraction from carrot tissue | |
Park et al. | Phosphorylation induces conformational changes in the leukocyte NADPH oxidase subunit p47phox | |
Ag et al. | A genetically encoded biosensor roKate for monitoring the redox state of the glutathione pool | |
Gödecke et al. | Nitric oxide‐mediated protein modification in cardiovascular physiology and pathology | |
Bhuvanasundar et al. | Expression, purification and characterization of a biologically active and thermally stable human lysyl oxidase | |
Beyer et al. | Effect of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and other carbodiimides on electron transfer catalyzed by submitochondrial particles | |
Cowey et al. | Studies on crystalline lactate dehydrogenase from cardiac and skeletal muscle of plaice (Pleuronectes platessa) with particular reference to temperature | |
Nagatomo et al. | Differences in lipid composition and fluidity of cardiac sacrolemma prepared from newborn and adult rabbits | |
Melnytchuk et al. | Energy-Related Function of the Mitochondria from Rat Cardiomyocytes in Artificial Hypobiosis | |
Gui | Development of cell-permeable ubiquitin probes for investigation of deubiquitinases | |
Liou | Binding studies of rabbit muscle phosphofructokinase: I. Binding of ATP and of 1, N⁶-ethenoadenosine-triphosphate to phosphofructokinase. II. Binding and activation of phosphofructokinase by F-actin | |
YATSUYANAGI et al. | Enhancement of zymosan-induced respiratory burst of rat neutrophils by lead in vitro | |
RU2123046C1 (ru) | Донор оксида азота и активатор растворимой формы гуанилатциклазы |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070727 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090929 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100601 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100805 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100805 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110706 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110802 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110826 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140902 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |