NO332145B1 - Diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av opploselig guanylatcyklase uten en hemgruppe og anvendelse derav - Google Patents

Diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av opploselig guanylatcyklase uten en hemgruppe og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO332145B1
NO332145B1 NO20021196A NO20021196A NO332145B1 NO 332145 B1 NO332145 B1 NO 332145B1 NO 20021196 A NO20021196 A NO 20021196A NO 20021196 A NO20021196 A NO 20021196A NO 332145 B1 NO332145 B1 NO 332145B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
guanylate cyclase
soluble guanylate
heme
activity
soluble
Prior art date
Application number
NO20021196A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20021196D0 (no
NO20021196L (no
Inventor
Peter Schindler
Ursula Schindler
Hartmut Strobel
Alexander Muelsch
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland filed Critical Sanofi Aventis Deutschland
Publication of NO20021196D0 publication Critical patent/NO20021196D0/no
Publication of NO20021196L publication Critical patent/NO20021196L/no
Publication of NO332145B1 publication Critical patent/NO332145B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Abstract

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for påvisning av oppløselig guanylatsyklase hvis hemjern er tilstede i en treverdig oksidasjonsform og en fremgangsmåte for påvisning av kjemiske substanser som stimulerer aktiviteten av oppløselig guanylatsyklase når det nevnte hemjernet som er tilstede i oppløselig guanylatsyklase minst delvis er treverdig oksydert. Foreliggende oppfinnelse vedrører også et diagnostisk middel for påvisning av en oppløselig guanylatsyklase som inneholder et treverdig hemjern.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av oppløselig guanylatcyklase uten en hemgruppe, og samt anvendelse av dette.
Oppløselige guanylatcyklaser er heterodimere proteiner. De består av en a- og en underenhet og inneholder hem som prostetisk gruppe. Bindingen av signalmolekylet NO til hem aktiverer enzymet. Det ved den enzymatiske aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen dannede cGMP er blant annet deltager i aktiveringen av cGMP-avhengige proteinkinaser, ved reguleringen av fosfodiesteraser eller av ionekanaler. For underenhetene er det beskrevet fire isoformer. Disse skiller seg med hensyn til sekvens samt den vevsspesifikke og utviklingsspesifikke ekspresjonen. Undertypene ai og p\ finnes overveiende i lungene, nyrene og hjernen. pVkjeden uttrykkes overveiende i lever og nyrer og ai i placenta. En dimerisering av underenhetene er forutsetning for en katalytisk aktiv oppløselig guanylatcyklase . Kjente er heterodimerene ai/(5i, (X2/P1og cti/pV Ved alle underenhetene observeres en sterk homologi i området for katalytiske domener.
Den oppløselige guanylatcyklasen (sGC) inneholder et hem per heterodimer. Bindingen av hemer foregår over His-105 av (5i-kjeden. Mutanter, som i N-terminalen av (5i underenheten ikke lenger inneholder His-105, er ikke lenger stimulerbare ved hjelp av NO. Hem av den oppløselig guanylatcyklasen består av en organisk molekyldel og et jernatom. Den organiske delen, protoporfyrin IX, inneholder fire pyrrolringer som ved hjelp av metinbroer er sammenføy et til et tetrapyrrolsystem. Jernatomet i hem er bundet til fire nitrogenatomer i sentrum av protoporfyrinringen. Det kan i tillegg inngå to ytterligere bindinger. Jernet av hem kan foreligge i oksidasjonstrinn +2 (ferroform) eller +3 (ferriform; oksidert form). Oksidasjonstrinnet av jern i hem har avgjørende innflytelse på den enzymatiske funksjonen av den oppløselige guanylatcyklasen. Enzymet med hemjernet i treverdig form viser som en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppen bare basal enzymatisk aktivitet og er ikke stimulerbar ved hjelp av NO. Fremstillingen av en hemfri oppløselig guanylatcyklase beskrives i Eur. J. Biochem. 240, 380-386(1996).
Oppløselig guanylatcyklase (sGC) katalyserer omdannelsen av GTP til syklisk guanosinmonofosfat (cGMP) og pyrofosfat. cGMP fungerer som intracellulært budbringerstoff (second messenger). Second messenger oppstår i det indre av cellen i kaskadeaktige reaksjoner. Deres nivå kontrolleres av ekstracellulære signaler så som hormoner, neurotransmittere, vekstfaktorer, luktstoffer, peptider eller lys. Dannelsen av second messenger tjener til signalforsterkning. Second messenger formidler i cellen signaler til bestemte, av celletypen avhengige, målproteiner (kinaser, fosfataser, ionekanaler og andre). Moduleringen av den oppløselige guanylatcyklasen fører derfor via innvirkningen på cGMP-nivået og dermed styrte målproteiner til en rekke farmakologiske effekter. Eksempler på, på denne måten, påvirkede mekanismer er relaksasjonen av den glatte muskulaturen (for eksempel i veggene av blodkar), inhiberingen av trombocyttaktivering, hemningen av proliferasjonen av glatte muskelceller eller adhesjonen av leukocytter.
Oppløselig guanylatcyklase er påvisbar i organer som eksempelvis hjerte, lunge, lever, nyre, hjerne hos alle pattedyr innbefattende mennesker. I patologiske prosesser eller hendelser som er relevante for patologiske prosesser kan oksidasjonstrinnet av hemjern av oppløselig guanylatcyklase spille en vesentlig rolle. En høyere andel av oppløselig guanylatcyklase med oksidert hemjern vil bare ha en lav aktiverbarhet av den oppløselige guanylatcyklasen ved hjelp av endogent NO til følge. Dette kan bl.a. føre til økning av blodtrykket, aktivering av plater, forøket proliferasjon av celler eller forsterket adhesjon av celler til varig høyt blodtrykk, stabil eller instabil angina pektoris, tromboser, myokardinfarkt, slaganfall, lungeødemer, erektil dysfunksjon, ukontrollert vevsvekst med tumordannelse, diabetes, nyrefunksjonsforstyrrelser, leverfunksjonsforstyrrelser eller vaskulær dysfunksjon.
Endotelcellene av karvegger utskiller NO som parakrint hormon blant annet for aktivering av oppløselig guanylatcyklase . For farmakologisk stimulering av oppløselig guanylatcyklase anvendes også forbindelser som via en intermediær NO-frigivelse virker som NO-donorer. Eksempler på dette er organiske nitrater. Videre er forskjellige forbindelser som ikke virker via en NO-frigivelse beskrevet, som modifiserer aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase .
Aktiveringen av oppløselig guanylatcyklase ved hjelp av NO-donorer, henholdsvis fritt NO, foregår utelukkende i redusert, dvs. (Fe<2+>)-holdig tilstand av hemjernet. Dette fremgår av forsøk som ble gjennomført av A. Schrammel et al. i Mol. Pharmacol. 50, 1
(1996) med 1H-[1,2,4] oksadiazolo [4,3-a]quinolin-l-on (=ODQ). ODQ er et spesifikt og høyvirksomt hemmestoff av oppløselig guanylatcyklase. ODQ interagerer med den prostetiske hemgruppen. Stoffet bevirker in vitro en irreversibel oksidasjon av hemjern av oppløselig guanylatcyklase . Behandlingen av den oppløselige guanylatcyklasen med ODQ har til følge at den stimulerende virkningen av NO på enzymet går tapt. Oksidasjonen av hemjernet av oppløselig guanylatcyklase kan også bevirkes med oksadiazol (3,4-d) benz(b)(l,4)oksazin-l-on (Olesen et al., British Journal of Pharmacology 123,299-309 (1998)) eller kaliumferricyanid (Koesling et al, i "Reviews of Physiology Biochemistry and Pharmacology" s. 41-65, Springer Verlag 1999). Det finnes også aktivatorer av den oppløselige guanylatcyklasen som ikke virker over en NO-frigivelse. Slike er eksempelvis beskrevet av Vesely et al., i Eur. J. Clin. Invest. 15, 258 (1985). En stimulering av den hemfrie oppløselige guanylatcyklase ved hjelp av protoporfyrin DC er påvist av Ignarro et al. i Adv. Pharmacol. 26, 35 (1994). Virkningen av protoforfyrin IX er ikke hemmbar ved hjelp av ODQ, men forsterkes derimot ved forbindelsen (Koesling og Friebe i Physiol. Biochem. Pharmacol. 135,41
(1999)). De hittil kjente aktivatorene av oppløselig guanylatcyklase stimulerer den enzymatiske aktiviteten av denne bare når hemjernet foreligger i redusert, dvs. Fe<2+->holdig tilstand.
Med de svovelsubstituerte sulfonylamino-karboksylsyre-N-arylamidene ble det nylig beskrevet en ytterligere kjemisk forbindelsesklasse (WO 00/02851), hvis representanter kan aktivere oppløselig guanylatcyklase .
Påvisningen av aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase foregår hittil eksempelvis ved hjelp av enzymatiske metoder for påvisning av cGMP samt cAMP eller ved fotometriske fremgangsmåter for påvisning av hemgruppen.
Makino R. et al. beskriver i "EPR characterization of Axial Bond in Metal Center of Native and Cobalt-substituted Guanylate Cyclase", J. Biol. Chem, 1999, vol. 274, s.7714-7723 en fremgangsmåte for å bestemme aktiviteten til en guanylatcyklase med treverdig hemjern. Fremgangsmåten innebærer inkubering av guanylatcyklase med azid for så å bestemme aktiviteten til enzymet ved å kvantifisere den dannede mengden cGMP.
En oppgave ved foreliggende oppfinnelse besto følgelig i å tilveiebringe et diagnostisk hjelpmiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av oppløselig guanylatcyklase uten en hemgruppe. En ytterligere oppgave ved oppfinnelsen var å angi en mulig anvendelse av det diagnostiske hjelpemiddelet.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig et diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe, omfattende minst en kjemisk forbindelse som stimulerer aktiviteten av nevnte oppløselige guanylatcyklase, hvor den kjemiske forbindelsen er: 2-(4-ldorfenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonyl)fenyl)benzamid.
Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse av det diagnostiske hjelpemiddelet omtalt ovenfor for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av oppløselig guanylatcyklase uten en hemgruppe.
Den oppløselige guanylatcyklasen kan anvendes i forskjellige tilstandsformer, eksempelvis som forskjellige heterodimere oppløselige guanylatcyklasen Prinsipielt kan en oppløselig guanylatcyklase av ethvert spesies, spesielt ethvert pattedyrspesies anvendes. Fortrinnsvis anvendes oppløselig guanylatcyklaser fra storfe, som fortrinnsvis isoleres fra lungevevet. Spesielt foretrukket anvendes human oppløselig guanylatcyklase. Den tilveiebragte oppløselige guanylatcyklasen kan fortrinnsvis være fra hver en a-underenhet, eksempelvis ai - eller a2-underenheten eller en ^-underenhet, eksempelvis pV eller pVunderenheten. Ved foreliggende oppfinnelse kan det fortrinnsvis anvendes underenheter av oppløselig guanylatcyklase . Tilsvarende sekvensinformasjoner er angitt i Giulli et al. (FEBS Letters 304, 83-88 (1992)) for de to underenhetene av oppløselig guanylatcyklase opprinnelig isolert fra menneskelig hjerne eller i Nakane et al. (Journal of Biol. Chem. 265, 16841-16845 (1990)) for cDNA av oppløselig guanylatcyklase fra lungevev fra rotter eller i Yuen et al. (Biochemistry 29, 10872-10878 (1990)) for en oppløselig guanylatcyklase fra nyrer av rotter.
Tilveiebringelsen av en oppløselig guanylatcyklase kan foregå ved isolering ved hjelp av biokjemiske fremgangsmåter fra et biologisk materiale. Biokjemiske metoder kan bl.a. være: Oppslutningsmetode for det biologiske materialet, sentrifugering, kromatografiske adskillelser, gelelektroforeser, isoelektrisk fokusering, immunologiske metoder. Biologisk materiale kan inneholde eukaryotiske celler eller prokaryotiske celler, oppslutningsceller eller preparater fra oppslutninger av celler, hele celler eller deler eller fraksjoner av celler. Til de eukaryotiske cellene hører bl.a. eksempelvis celler fra vev eller organer som hjerte, blodkar, lunge, blod, hjerne, lever, nyre, fettvev, muskel fra virveldyr omfattende mennesker, vevs- eller blodprøver, men også celler fra humane eller animalske cellekulturer samt insektcellekulturer. Som spesielle eksempler skal nevnes trombocytter, som utvinnes fra menneskelige eller animalske blodprøver, samt glatte muskelceller, som man eksempelvis kan isolere fra blodkar av animalsk eller humant opphav. Ytterligere eksempler er biopsimateriale, tiloversblivende organer og vev og deler av disse fra transplantasjoner, navlesnorer eller placenta. Prokaryotiske celler kan eksempelvis bety bakterier, bl.a. Escerichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, likeledes sopper som Saccharomyces cerevisiae, Sacchomyces pombe eller Pichia pastoris. I en spesielt variant kan den oppløselige guanylatcyklasen fremstilles rekombinant, for eksempel ved ekspresjon i eukaryotiske eller prokaryotiske celler, hvorved den oppløselige guanylatcyklasen kan anrikes uten prostetisk hemgruppe ved hjelp av ekspresjonsvektorer i cellene eller utskilles i medium. I en spesiell utførelsesform isoleres den oppløselige guanylatcyklasen ifølge en fremgangsmåte som beskrevet i Humbert P. et al, Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991).
Tilveiebringelsen av den oppløselige guanylatcyklasen omfatter tilveiebringelsen av egnede former for inkubasjon med tilveiebragte kjemiske forbindelser, hvorved inkubasjonen betyr at den oppløselige guanylatcyklasen og den kjemiske forbindelsen bringes i kontakt med hverandre. Proteinet kan eksempelvis suspenderes eller oppløses i vandig oppløsningsmiddel supplert med buffer, ioner eller også hjelpereagenser. Det kan eksempelvis også påføres på bærematerialer og i denne formen anvendes fiksert suspendert i oppløsningsmidler.
Tilveiebringelsen av en kjemisk forbindelse kan også omfatte oppløsningen av denne forbindelsen, i egnede oppløsningsmidler som eksempelvis dimetylsulfoksid (DMSO) eller vann samt prepareringen av en formulering med hjelpereagenser.
Inkuberingen kan ta forskjellig lang tid og foretas ved forskjellige temperaturer. Tidsbehov og temperaturinnstilling avhenger av de i det individuelle tilfellet valgte utførelsesformene såvel med tanke på valget av tilveiebragte oppløselige guanylatcyklaser, den tilveiebragte kjemiske forbindelsen og/eller også andre betingelser, som prepareringsform, konsentrasjon av den anvendte oppløselige guanylatcyklasen og/eller den anvendte kjemiske forbindelsen samt andre tilsetnings-stoffer. Tidsrommet for inkuberingen kan eksempelvis utgjøre mellom 1 minutt og 120 minutter, fortrinnsvis utgjør tidsrommet for inkuberingen mellom 1 minutt og 60 minutter, og spesielt foretrukket velges et tidsrom på 30 minutter. Temperaturen for inkuberingen skal ligge mellom 5°C og 45°C, fortrinnsvis ligger temperaturen mellom 20°C og 42°C og i den spesielt foretrukne utførelsesformen ved 37°C.
Påvisningen av aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen kan eksempelvis foregå ved en enzymtest eller en etterkoblet funksjonell analyse eller en bindingsanalyse, for eksempel i isolerte celler eller cellekulturer. I en spesiell utførelsesform kan denne påvisningen av aktiviteten foregå ved bestemmelse av hemningen av aggregeringen av trombocytter ved hjelp av et lumiaggregometer. Trombocytter aggregerer mindre sterkt etter aggregering av den oppløselige guanylatcyklasen og den ved den oppløselige guanylatcyklasen forårsakede intracellulære økningen av cGMP. Graden av hemning av aggregeringen av trombocyttene er proporsjonal med aktiveringen av den oppløselige guanylatcyklasen og gir derfor et mål for aktiveringen av enzymet. I denne utførelsen tilveiebringes den oppløselige guanylatcyklasen ikke isolert, men foreligger derimot i trombocyttene. Den oppløselige guanylatcyklasen kan prinsipielt også anvendes i denne formen, dvs. overveiende i hele celler i fremgangsmåten. I en ytterligere foretrukket utførelsesform kan aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen også bestemmes ved bestemmelse av dannet cGMP ved hjelp av RIA (radio-immun-analyse) eller EIA (enzym-immun-analyse). I en ytterligere foretrukket utførelsesform bestemmes aktiviteten via virkningen av de kjemiske forbindelsene på cGMP-dannelsen i glattmuskelcellen. Glatte muskelceller er bestanddel av for eksempel blodkarvegger. Disse muskelcellene avspennes når det intracellulære cGMP-speilet øker. Dette kan skje ved aktivering av den oppløselige guanylatcyklasen. Avspenningen av glattmuskelceller kan derfor anvendes for å påvise aktivatorer av oppløselig guanylatcyklaser.
Tilveiebringelsen av den oppløselige guanylatcyklasen for screening kan omfatte tilberedning av egnede former for inkuberingen med en kjemisk forbindelse som skal undersøkes. Den oppløselige guanylatcyklasen kan eksempelvis suspenderes eller oppløses i vandige oppløsningsmidler supplert med buffere, joner eller også hjelpereagenser. Det kan eksempelvis også påføres på bærermaterialet og i denne formen anvendes fiksert suspendert i oppløsningsmidler.
Ved de kjemiske forbindelsene som skal undersøkes i screening kan det eksempelvis dreie seg om en kjemisk syntetisert forbindelse eller om et naturstoff. Den kjemiske forbindelsen som skal undersøkes kan foreligge i forskjellige tilstandsformer, eksempelvis som enkeltstoff i renset form, som blanding ved siden av andre forbindelser, som ikke behøver å være nøyaktigkarakterisert, som blanding av forskjellige aktive forbindelser, som bestanddel av en forbindelsesblanding av biologisk opphav eller sammen med eukaryotiske og/eller prokaryotiske organismer. Fremgangsmåten for screening kan eksempelvis foregå ved hjelp av en laboratorierobot eller ved hjelp av maskiner.
Oppløselig guanylatcyklase som foreligger uten hemgruppe kan påvises ved følgende fremgangsmåte. Fremgangsmåten kan som fremgangsmåtetrinn omfatte
a) Tilveiebringelse av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe; b) Tilveiebringelse av minst en kjemisk forbindelse som kan stimulere aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen når den oppløselige guanylatcyklasen foreligger uten hemgruppe; c) Inkubasjonen av en oppløselig guanylatcyklase med en kjemisk forbindelse, som kan stimulere aktiviteten av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe; og d) Bestemmelsen av aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen uten hemgruppe etter inkubering med den kjemiske forbindelsen.
En fremgangsmåte for å finne en kjemisk forbindelse som stimulerer aktiviteten av en oppløselig guanylatcyklase, hvorved den oppløselige guanylatcyklasen foreligger uten hemgruppe kan som fremgangsmåtetrinn inneholde følgende: a) Tilveiebringelse av en oppløselig guanylatcyklase som foreligger uten hemgruppe; b) Tilveiebringelse av minst en kjemisk forbindelse som skal undersøkes; c) Inkubasjonen av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe med minst en kjemisk forbindelse som skal undersøkes; og d) Bestemmelsen av aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen etter inkubering.
Oppfinnelsen vedrører som nevnt også et diagnostikum for bestemmelse av
oksidasjonstrinnet av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe, inneholdende minst en kjemisk forbindelse som stimulerer aktiviteten av en oppløselig
guanylatcyklase, hvorved den oppløselige guanylatcyklasen foreligger uten hemgruppe og hvorved den kjemiske forbindelsen er: 2-(4-klorfenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonyl)fenyl)benzamid. Den fremgangsmåte for bestemmelse av en oppløselig guanylatcyklase som foreligger uten hemgruppe, i en biologisk prøve, kan som fremgangsmåtetrinn kan omfatte tilveiebirngelsen av en biologisk prøve som inneholder en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe, tilveiebringelse av minst en kjemisk forbindelse som kan stimulere aktiviteten av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe, som angitt ovenfor, inkuberingen av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe med den kjemiske forbindelsen som kan stimulere aktiviteten av en oppløselig guanylatcyklase samt bestemmelsen av aktiviteten av den oppløselige guanylatcyklasen uten hemgruppe etter inkubering med den kjemiske forbindelsen.
En fremgangsmåte for tilveiebringelse av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe er beskrevet i Foerster, J. et al. Eur. J. Biochem, 240, 380-386 (1996). Som kjemisk forbindelse for stimulering av en oppløselig guanylatcyklase uten hemgruppe egner seg eksempelvis den kjemiske forbindelsen 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonyl)-fenyl)-benzamid.
EKSEMPLER
Eksempel 1:
Luminometrisk påvisningsfremgangsmåte for aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase
Den oppløselige guanylatcyklasen (sGC) katalyserer omdanningen av GTP til cGMP og pyrofosfat. I nærvær av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD<*>) og nikotinamid-mono-nukleotidadenyltransferase (NAT, EC 2.7.7.1) omsettes pyrofosfat til ATP og nikotinamid-mononukleotid. Det dannede ATP kan kvantifiseres ved hjelp av en luciferase luminometrisk i mikrotiter-plater.
Stoffet som skal undersøkes oppløses i DMSO og fortynnes med DMSO/vann inntil en sluttkonsentrasjon på 50 uM i forsøksblanding. DMSO-konsentrasjonen i forsøksblanding skal utgjøre maksimalt 5% (v/v).
100 (il reaksjonsblanding skal inneholde 50 mM TEA-buffer (pH 7,4), 3 mM MgCb, 3 mM GSH, 0,1 mM GTP, 1 mM IBMX (isobutylmetylxantin), 0,2 mM NAD<+>, 0,4 mU NAT, egnet fortynnet sGC-enzymoppLøsning (isolert fra okselunge ifølge Humbert P. et al., Methods of Enzymology 195, 384-391 (1991)) samt stoffet som skal undersøkes eller oppløsningsmiddel (for bestemmelse av den basale enzymaktiviteten). Reaksjonen startes ved tilsats av sGC. Reaksjonsblandingen inkuberes i 60 minutter ved romtemperatur og stoppes deretter ved isavkjøling og tilsats av 50 mM EDTA, pH 8,0. For ATP-bestemmelse tilsettes 20 ul 100 mM MgCl2og 50 ul ATP testreagens (0,035 mM lusiferin og 10.000 U/ml luciferase i 62,5 mM tris-Acetat pH 7,75, 1,9 mM EDTA, 0,05 mM ditiotreitol, 0,1% BSA). De relative luminiscens-enhetene (RLU) kan bestemmes i et mikrotiterplate luminometer.
Aktiviteten av sGC oppnås etter subtraksjon av RLU-tomverdien (inkubasjon uten enzym) fra RLU-målverdi. Aktiveringen av sGC ved hjelp av et prøvestoff angis i prosent av den basale enzymaktiviteten (oppløsningsmiddelkontroll) og beregnes i henhold til følgende formel: 100 x (ARLU prøvestoff/DRLU kontroll) - 100 = % aktivering
Eksempel 2 (Delvis referanseeksempel):
Aktivering av oppløselig guanylatcyklase etter oksidasjon av hemjernet.
Isolert sGC foreligger i oppløsning i en hem-Fe<2+->holdig (redusert), NO-stimulerbar og en hem-Fe<3+->holdig (oksidert), ikke-NO-stimulerbar form. Andelen av den aktuelle formen kan hittil bestemmes ved hjelp av ESR-målinger.
Nitrogen-monoksid (NO) og NO-donorer aktiverer utelukkende den reduserte tilstanden av sGC. De viser ved en inkubering av hver av for eksempel 0,01 mM 1H-[l,2,4]oksadiazolo[4,3-a]quinoksalin-l-on (ODQ), som in vitro irreversibelt oksiderer sGC, et fullstendig tap av den stimulerende virkningen. En ny NO-uavhengig aktivator av sGC, l-benzyl-3-(2-hydroksymetyl-fur-5-yl)-indazol (YC-1) aktiverer likeledes den reduserte formen av sGC og er hembar ved hjelp av ODQ.
I motsetning til dette blir stimulerbarheten av stoffet som utelukkende eller overveiende aktiverer den oksiderte formen enten forsterket eller ikke påvirket ved ODQ, avhengig av andelen av den oksiderte formen i blandingen.
Ofte viser disse stoffene likeledes en aktivering av den hemfrie formen av sGC. Fremstillingen av en hemfri sGC gjennomføres ifølge J. Foerster, et al., Eur. J. Biochem, 240, 380-386 (1996).
En oppløselig guanylatcyklase lar seg fremstille med et treverdig hemjern ved at friskt preparert enzym lagres i ca. 7 dager ved 4°C. Inkuberer man på denne måten forbehandlet oppløselig guanylatcyklase med 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-N-(4-tiomorfolin-4-sulfonyl)-fenyl)-benzamid oppnår man en 17,6 gangers stimulering av aktiviteten. EC50-verdien utgjør 0,5 umol/1. Anvender man en hemfri oppløselig guanylatcyklase oppnår man en 58,2 gangers stimulering. Affiniteten ligger i dette tilfellet 2,4 umol/1.
Eksempel 3 (Referanseeksempel):
Påvisning av stimuleringen av oppløselig guanylatcyklase etter oksidasjon av hemjern ved bestemmelse av virkningen på aggregeringen av trombocytter.
Den fysiologiske virkningen av nitrogenmonoksid (NO) som for eksempel hemning av trombocyttaggregeringen og relaksasjon av den glatte karmuskulaturen er følgen av en direkte aktivering av den oppløselige (reduserte) guanylatcyklasen ved hjelp av NO under forøket dannelse av cGMP.
ODQ, en selektiv inhibitor av sGC, hemmer ved oksidasjonen av sGC cGMP-forhøyelsen og den anti-aggregatoriske virkningen av NO-donorer i vaskede menneskelige trombocytter (M.A. Moro et al, PNAS 93, 1480-1485 (1996)).
For fremstillingen av vaskede humane trombocytter (WP) tas blod fra antekubitalvenen og antikoaguleres med sitronsyre/natriumsitrat i sprøyten. Etter sentrifugering ved 16 x g i 15 minutter består supernatanten av platerikt plasma (PRP). PRP surgjøres, trombocyttene sedimenteres ved 20 minutters sentrifugering ved 400 x g og opptas i tyrodeoppløsning. Disse vaskede trombocyttene (WP, 3 x 10<5>/ul) anvendes i forsøkene.
Hemningen av aggregeringen ved hjelp av sGC aktivatorer bestemmes i et lumiaggregometer. WP'ene inkuberes i nærvær av 0,5 mM CaCb med prøvestoffet ved 37°C og reaksjonen startes ved tilsats av for eksempel 0,3 ug/ml kollagen. Virkningen av stoffene på aggregeringen undersøkes i fravær og nærvær av ODQ. Aktivatorer av sGC skulle hemme den kollagen-induserte trombocytt-aggregeringen doseavhengig. Aktivatorer som stimulerer den oksiderte formen av sGC skulle i nærvær av ODQ vise en sterkere anti-aggregatorisk virkning. IC5o-verdien for hemningen av aggregeringen skulle forskyves til lavere konsentrasjoner.
For bestemmelse av den intracellulære cGMP-konsentrasjonen inkuberes WP'er 15 minutter i nærvær av 0,1 mM isobutyl-metylxantin (IBMX) ved 37°C. Inkuberingen stoppes ved sentrifugering og bunnfallet behandles med IM perklorsyre og ultralyd i 1 minutt. Etter fornyet sentrifugering i 15 minutter ved 13.000 x g nøytraliseres supernatanten med 1 M KOH og cGMP-konsentrasjonen bestemmes med en kommersiell enzym-immunoanalyse (for eksempel Amersham) for cGMP. Proteinkonsentrasjonen bestemmes i bunnfall med Bradford-metoden.
Kjemiske forbindelser som stimulerer aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase skulle føre til en konsentrasjonsavhengig forhøyelse av den intracellulære cGMP-konsentrasjonen. Dersom inkuberingen gjennomføres i nærvær av ODQ skulle det med kjemiske forbindelser som stimulerer aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase med treverdig hemjern kunne oppnås signifikant høyere cGMP-speil enn uten ODQ, dvs. ODQ skulle forsterke effekten av stoffene.
Eksempel 4 (Referanseeksempel):
Påvisning av stimuleringen av oppløselig guanylatcyklase etter oksidasjon av hemjern ved bestemmelse av virkningen på glattmuskelceller fra rotteaorta.
Glattmuskelceller (VSMC) fra rotteraorta isoleres og dyrkes ved fremgangsmåten ifølge J.H. Chamley et al, Cell Tissue Res. 177, 503-522 (1977).
Cellene sås i 6-brønns plater og inkuberes i 15 minutter i hepes-tyrode buffer (pH 7,4 med 200 U SOD, 0,3 mM IBMX) ved 37°C. Virkningen av stoffene på VSMC undersøkes i fravær og nærvær av ODQ. Inkuberingen stoppes ved avsuging av supernatanten og tilsats av flytende nitrogen og cellene dypfryses i 6-brønns platene. For cGMP-bestemmelse opptines platene, de enkelte brønnene belegges med buffer og i supernatanten bestemmes cGMP-konsentrasjonen med en kommersiell enzym-immunoanalyse (for eksempel Amersham) for cGMP. Proteinkonsentrasjonen bestemmes etter oppløsning av proteinene i brønnene med 0,1 M NaOH med Bradford-metoden.
Kjemiske forbindelser som stimulerer aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase skulle føre til en konsentrasjonsavhengig forhøyelse av den intracellulære cGMP-konsentrasjonen. Dersom inkubasjonen gjennomføres i nærvær av ODQ skulle dermed kjemiske forbindelser som stimulerer aktiviteten av oppløselig guanylatcyklase med et treverdig hemjern kunne oppnå vesentlig høyere cGMP speil. ODQ skulle forsterke effekten av de aktiverende forbindelsene.
Eksempel 5:
Fremstilling av 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonyl)-fenyl)-benzamid
33,71 g (0,32 mol) natriumkarbonat ble oppløst i 250 ml vann og oppvarmet til 60°C. i oppløsningen ble det innført 25,00 g (0,13 mol) 2-amino-4,5-dimetoksy-benzosyre og til denne oppløsningen ble det i løpet av 15 minutter tilsatt 29,55 g (0,14 mol) 4-klor-benzen-sulfonylklorid porsjonsvis. Etter avkjøling av blandingen ble det frasuget, resten ble opptatt i 1% natriumhydrogenkarbonatoppløsning, filtrert og ved tilsats av IN saltsyre ble produktet utfelt. Man fikk 25,90 g (55%) av 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-benzosyre av smeltepunkt 212-214°C.
25,90 g (0,07 mol) 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-benzosyre ble oppslemmet i 75 ml toluen. 17,30 g (0,08 mol) fosforpentaklorid ble tilsatt og
blandingen ble omrørt i 2,5 timer ved 40-45°C. Deretter ble det i vakuum inndampet til det halve volumet, det utfelte produktet ble frasuget og ettervasket med litt toluen. Man fikk 25,30 g (93%) av 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-benzosyreklorid av smeltepunkt 175-177°C.
10,00 g (25,6 mmol) 2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-benzosyrekloridble oppslemmet i 300 ml toluen, 4,49 g (25,6 mmol) 4-aminobenzensulfonsyrefluorid ble tilsatt og blandingen ble oppvarmet i 4 timer under tilbakeløp. Etter avkjøling ble det utfelte bunnfallet frasuget og vasket med toluen. Man fikk 11,71 g (87%) av forbindelsen i overskriften av smeltepunkt 216-219°C.
500 mg (0,95 mmol) 4-((2-(4-klor-fenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-benzoyl)-amino)-benzensulfonsyrefluorid ble oppløst i 1 ml tiomorfolin og oppvarmet i 30 minutter til 90°C. For opparbeidelse ble det helt på 50 ml is/lN saltsyre, bunnfallet ble frasuget, tørket i vakuumtørkeskap over fosforpentoksid og omkrystallisert fra heksan/eddikester. Man fikk 378 mg (65%) av forbindelsen i overskriften av smeltepunkt 241°C

Claims (2)

1. Diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av oppløselig guanylatcyklase uten en hemgruppe, omfattende minst en kjemisk forbindelse som stimulerer aktiviteten av nevnte oppløselige guanylatcyklase, hvor den kjemiske forbindelsen er: 2-(4-klorfenylsulfonylamino)-4,5-dimetoksy-N-(4-(tiomorfolin-4-sulfonyl)fenyl)benzamid.
2. Anvendelse av det diagnostiske hjelpemiddel ifølge krav 1 for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av oppløselig guanylatcyklase uten en hemgruppe.
NO20021196A 1999-09-15 2002-03-11 Diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av opploselig guanylatcyklase uten en hemgruppe og anvendelse derav NO332145B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19944226A DE19944226A1 (de) 1999-09-15 1999-09-15 Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen
PCT/EP2000/008102 WO2001020023A2 (de) 1999-09-15 2000-08-19 Verfahren zum nachweis von oxidierten formen der löslichen guanylatzyklase

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20021196D0 NO20021196D0 (no) 2002-03-11
NO20021196L NO20021196L (no) 2002-03-11
NO332145B1 true NO332145B1 (no) 2012-07-02

Family

ID=7922127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20021196A NO332145B1 (no) 1999-09-15 2002-03-11 Diagnostisk hjelpemiddel for bestemmelse av oksidasjonstilstanden av opploselig guanylatcyklase uten en hemgruppe og anvendelse derav

Country Status (17)

Country Link
US (3) US6500631B1 (no)
EP (1) EP1218535B1 (no)
JP (1) JP4814466B2 (no)
KR (1) KR100818537B1 (no)
AT (1) ATE311473T1 (no)
AU (1) AU783268B2 (no)
BR (1) BR0014019B1 (no)
CA (1) CA2382488C (no)
DE (2) DE19944226A1 (no)
DK (1) DK1218535T3 (no)
ES (1) ES2252046T3 (no)
IL (3) IL148600A0 (no)
MX (1) MXPA02001835A (no)
NO (1) NO332145B1 (no)
NZ (1) NZ517783A (no)
WO (1) WO2001020023A2 (no)
ZA (1) ZA200202025B (no)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19944226A1 (de) * 1999-09-15 2001-03-29 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen
DE102006054562A1 (de) * 2006-11-20 2008-05-21 Bayer Healthcare Ag Verfahren zum Nachweis von Pyrophosphat mit Biolumineszenz Detektion
JP5350607B2 (ja) * 2007-06-14 2013-11-27 キッコーマン株式会社 グアニル酸シクラーゼ活性測定法
JP5570731B2 (ja) * 2008-02-28 2014-08-13 旭化成ファーマ株式会社 ピロリン酸の測定方法
US8277650B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU876715A1 (ru) * 1980-02-08 1981-10-30 Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР Способ вы влени распределени гуанилатциклазы в ткан х
US5618665A (en) * 1993-01-22 1997-04-08 Regents Of The University Of Minnesota Enzymatic fluorometric assay for adenylate cyclase
US6002817A (en) * 1997-09-29 1999-12-14 The Regents Of The University Of Michigan Optical sensors for the detection of nitric oxide
DE19744026A1 (de) * 1997-10-06 1999-04-08 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Pyrazol-Derivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung in Arzneimitteln
DE19830430A1 (de) * 1998-07-08 2000-01-13 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Schwefelsubstituierte Sulfonylamino-carbonsäure-N-arylamide, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate
CZ302691B6 (cs) * 1998-07-08 2011-09-07 Sanofi - Aventis Deutschland GmbH N-Arylamidová sloucenina, zpusob její prípravy, farmaceutický prostredek tuto slouceninu obsahující, tato sloucenina pro použití jako aktivátor a pro použití k terapii nebo profylaxi
DE19837015C2 (de) * 1998-08-14 2003-03-20 Vasopharm Biotech Gmbh Isolierte und gereinigte humane lösliche Guanylylcyclase alpha1/beta1 (hsGCalpha1/beta1)
DE19944226A1 (de) * 1999-09-15 2001-03-29 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zum Nachweis von oxidierten Formen der löslichen Guanylatzyklase und Verfahren zum Screening nach Aktivatoren der löslichen Guanylatzyklase mit oxidiertem Hämeisen
DE10140421A1 (de) * 2001-08-17 2003-03-06 Bayer Ag Neue Kombination
GB2395431A (en) * 2002-11-20 2004-05-26 Northwick Park Inst For Medica Combination of a metal carbonyl compound and a guanylate cyclase stimulant or stabilizer for the therapeutic delivery of carbon monoxide

Also Published As

Publication number Publication date
NZ517783A (en) 2004-06-25
BR0014019A (pt) 2002-05-21
AU783268B2 (en) 2005-10-06
JP4814466B2 (ja) 2011-11-16
DK1218535T3 (da) 2006-03-27
NO20021196D0 (no) 2002-03-11
US20030054433A1 (en) 2003-03-20
US6500631B1 (en) 2002-12-31
NO20021196L (no) 2002-03-11
US20050227308A1 (en) 2005-10-13
BR0014019B1 (pt) 2014-02-11
ATE311473T1 (de) 2005-12-15
ES2252046T3 (es) 2006-05-16
IL148600A0 (en) 2002-09-12
US6913898B2 (en) 2005-07-05
WO2001020023A2 (de) 2001-03-22
EP1218535A2 (de) 2002-07-03
EP1218535B1 (de) 2005-11-30
DE19944226A1 (de) 2001-03-29
JP2003509061A (ja) 2003-03-11
IL196874A (en) 2011-03-31
AU6839600A (en) 2001-04-17
DE50011765D1 (de) 2006-01-05
MXPA02001835A (es) 2002-08-12
IL148600A (en) 2009-09-01
CA2382488A1 (en) 2001-03-22
US7309579B2 (en) 2007-12-18
CA2382488C (en) 2012-02-07
WO2001020023A3 (de) 2001-11-15
KR20020047164A (ko) 2002-06-21
KR100818537B1 (ko) 2008-04-01
ZA200202025B (en) 2004-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005250412B2 (en) HIF prolyl hydroxylase activity assay
Wunder et al. A cell-based cGMP assay useful for ultra-high-throughput screening and identification of modulators of the nitric oxide/cGMP pathway
EP2171446B1 (en) A method for assaying fto (2-oxoglutarate dependent oxygenase) activity
US7309579B2 (en) Method for screening for activators of soluble guanylate cyclase having oxidized heme iron
Park et al. Protein ubiquitination and formation of polyubiquitin chains without ATP, E1 and E2 enzymes
Riquelme et al. SUMO‐1 modification of MEF2A regulates its transcriptional activity
US8551717B2 (en) Method for determining sumoylation
Erickson et al. Resonance energy transfer as a direct monitor of GTP-binding protein-effector interactions: activated. alpha.-transducin binding to the cGMP phosphodiesterase in the bovine phototransduction cascade
JP2008506371A (ja) グアニル酸シクラーゼ活性を検出するための方法およびアッセイ
Bhuvanasundar et al. Expression, purification and characterization of a biologically active and thermally stable human lysyl oxidase
Jones et al. Aequorin functional assay for characterization of G-protein-coupled receptors: Implementation with cryopreserved transiently transfected cells
US7794927B2 (en) Method for identifying agonists or antagonists of the G-protein coupled receptor mas-like 1
Chen et al. Characterization of Saccharomyces cerevisiae Atm1p. Functional studies of an ABC7 type transporter
Galougahi et al. Chia-Chi Liu1, Alvaro Garcia1, Yasser A. Mahmmoud2, Elisha J. Hamilton1, Keyvan Karimi Galougahi1, Natasha AS Fry1, Gemma A. Figtree1, 3, Flemming Cornelius2, Ronald J. Clarke4, and Helge H. Rasmussen1, 3
JP2001506862A (ja) タンパク質分解阻害物質のスクリーニングアッセイ

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees