JP2001506862A - タンパク質分解阻害物質のスクリーニングアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ｉ）ユビキチン、（ｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質、および（ｉｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク質（このＥ２タンパク質は基質タンパク質を直接にユビキチン化することができ、骨格筋および／または心筋において発現する、たとえばＥ２_17k）;ならびに標的タンパク質（たとえばビオチニル化ヒストン２Ａ）へのユビキチン伝達の阻害程度を測定する手段（たとえばシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ））の使用を含む、筋肉タンパク質分解阻害物質を特異的に同定するための方法およびアッセイ（ゲル−ベースアッセイを含む）に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質分解阻害物質のスクリーニングアッセイ技術分野 本発明は、筋肉タンパク質分解阻害物質をスクリーニングするのに適したアッ セイ、特に真核細胞のユビキチン依存性タンパク質分解に関与するタンパク質の 阻害物質をスクリーニングするためのアッセイに関する。そのような阻害物質は タンパク質分解に伴う疾病状態の処置に有用であるといえる。背景 真核細胞は３つの主なタンパク質分解経路、すなわちリソソーム経路、カルシ ウム依存性経路およびＡＴＰ依存性経路を含む。リソソーム経路は主に、受容体 仲介エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスにより細胞に進入した細胞外タ ンパク質を分解する。カルシウム依存性プロテアーゼ（カルパイン）がもつ生理 学的役割は現在は明らかでない。ＡＴＰ依存性経路はミスフォールディングした タンパク質または変異タンパク質の分解に際し役割をもつことが以前から知られ ているが、ごく最近になってそれは無傷の細胞タンパク質を選択的に分解し、こ れにより細胞制御に重要な役割を果たすことが明らかになった。 ＡＴＰ経路を模式的に図１に示し、以下に説明する。ＡＴＰ依存性経路に関す るプロテアーゼ活性は、２６Ｓプロテオソーム(２６Ｓ ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ ）として知られる大型の多重触媒性複合体にある。これは３つの多重サブユニッ ト複合体、すなわち７００ｋＤａの２０Ｓプロテオソームコア粒子と２つの１９ Ｓキャップ構造体からなる（Ｐｅｔｅｒｓ Ｊ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９４），１９，３７７−３８２により概説）。２６Ｓプ ロテオソーム分解を受けるタンパク質は、通常は特定のリシン残基にユビキチン (７６アミノ酸ペプチド)が付加されることにより修飾される。このユビキチン化 反応にはＥ１、Ｅ２およびＥ３と呼ばれる３種のタンパク質が必要である（Ｃｉ ｅｃｈａｎｏｖｅｒ Ａ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ（ １９９４），３７５，５６５−５８１により概説）。Ｅ１タンパク質は、ユビキ チ キチンを活性化してチオール中間体を生成するのを触媒する。Ｅ２ユビキチン− キャリヤー（またはユビキチン−コンジュゲーティング）タンパク質は、ユビキ チンをＥ１タンパク質からＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼへ伝達する。最 後にＥ３リガーゼは、ユビキチンポリペプチドと基質タンパク質（ｐｒｏｔｅｉ ｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の間のイソペプチド結合形成を触媒する（ただしある 種類のＥ２タンパク質は基質タンパク質を直接にユビキチン化できる）。タンパ ク質結合したユビキチンはそれ自体ユビキチン化されて、２６Ｓプロテオソーム による分解の標的である大型のタンパク質−ユビキチンコンジュゲートを形成す ることができる（ただしそのようなポリユビキチン化はタンパク質分解が起きる のに必須ではない）。 大部分の細胞は１種類のＥ１タンパク質を含有し、２種のＥ３酵素が確認され ているが、Ｅ２酵素をコードする遺伝子は酵母だけでも少なくとも１５種類ある （多くの場合、これらのヒト相同体が同定されている）。 既に述べたように、現在、タンパク質分解は細胞制御の重要な機構であること が明らかになりつつある。たとえばそれは細胞が変化する環境に適応するために 、また時間依存性細胞プログラムの調節に必要である。タンパク質分解は迅速で あり、このため細胞が特定のタンパク質の濃度を迅速に低下させうるので、他の 可能な調節機構より有利である。それは不可逆的でもあり、したがって分解した タンパク質の機能が完全に失われるのが確実である。しかし非特異的なタンパク 質分解は細胞にとって危険であり、これはタンパク質分解が著しく選択的でなけ ればならないことを意味する。 癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）および腫瘍サプレッサーの分解にお けるユビキチン依存性タンパク質分解が、細胞サイクルの調節ならびにストレス 応答および免疫系において果たす役割は、ここ数年で次第に明らかになりつつあ る（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ Ｍ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９ ９２），４，１０２４−１０３１；Ｄｅｓｈａｉｅｓ Ｒ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９５），５，４２８−４３４；Ｈｉｌｔ Ｗ．お よびＷｏｌｆ Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．（１９９６），２１， ９６−１０２に概説）。 しかし、悪液質（すなわち、重度の体重減少およびるいそうを示す状態：これ は外傷に付随することがあり、多くの重篤な、しばしば致命的な疾患に付随し、 実際にそれ自体、癌やエイズるいそうのような疾患において初期死亡に関与する 可能性がある）に際して起きる骨格筋損失においてＡＴＰユビキチン依存性タン パク質分解がもつ役割は、より不明である。ユビキチン依存性タンパク質分解は 、シグナル伝達受容体のダウンレギュレーションにも関与している可能性が指摘 されている。特にユビキチン−コンジュゲーション系がリガンド誘導性エンドサ イトーシスおよび成長ホルモン受容体分解に関与していることは、悪液質状態と 関連している可能性がある。 筋肉破壊に際しＡＴＰユビキチン依存性タンパク質分解系の活性増大に対する 役割が、Ｍｅｄｉｎａ Ｒ．，Ｗｉｎｇ Ｓ．，Ｈａａｓ Ａ．およびＧｏｌｄ ｂｅｒｇ Ａ．（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｉｍ．Ａｃｔａ（１９９１），５０， ４−6)によって初めて示唆された。彼らは動物モデルを用いて、筋肉を萎縮させ た場合、大量の細胞タンパク質の分解に際しＡＴＰユビキチン依存性タンパク質 分解が重要な役割を果たすことを証明した。彼らはその後、同じモデルでポリユ ビキチンおよびプロテオソームｍＲＮＡの発現が増大することを証明した（Ｍｅ ｄｉｎａ Ｒ．，Ｗｉｎｇ Ｓ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｊ．（１９９５），３０７，６３１−６３７）。同様な結果が、腫瘍を保有 するラットモデルから摘出した筋肉(Ｔｅｍｐａｒｉｓ Ｓ.,Ａｓｅｎｉ Ｍ., Ｔａｉｌｌａｎｄｉｅｒ Ｄ．，Ａｕｒｏｕｓｓｅａｕ Ｅ．，Ｌａｒｂａｕｄ Ｄ．，Ｏｂｌｅｄ Ａ．，Ｂｅｃｈｅｔ Ｄ．，Ｆｅｒｒａｒａ Ｍ．，Ｅｓ ｔｒｅｌａ Ｊ.およびＡｔｔａｉｘ Ｄ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ(１ ９９４)，５４，５５６８−５５７３；Ｌｌｏｖｅｒａ Ｍ．，Ｇａｒｃｉａ− Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｃ．，Ａｇｅｌｌ Ｎ．，Ｍａｒｚａｂａｌ Ｍ．，Ｌｏｐ ｅｚ−Ｓｏｒｉａｎｏ Ｆ．およびＡｒｇｉｌｅｓ Ｊ．,Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ ．(１９９４),３３８,３１１−３１８;Ｂａｒａｃｏｓ Ｖ.,ｄｅＶｉｖｏ Ｃ. ,Ｈｏｙｌｅ Ｄ．およびＧｏｌｄｇｅｒｇ Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ．（１９９５），２６８，Ｅ９９６−Ｅ１００６)、および敗血症モデル（Ｔｉ ａｏ Ｇ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４），９４，２２５５− ２ ２６４；Ｖｏｉｓｉｎ Ｌ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）， ９７，１６１０−１６１７）において観察された。最近の研究で、ＡＴＰユビキ チン依存性タンパク質分解系が、ミオシン、アクチン、トロポニンおよびトロポ ミオシンを含めた特定の可溶性筋肉タンパク質および主要な筋原線維成分の分解 に関与していることが確認された（Ｓｏｌｏｍｅｏｎ Ｖ．およびＧｏｌｄｂｅ ｒｇ Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６），２７１，２６６９０ −２６６９７）。 既に述べたように、ユビキチンの厳密な宿命を決定する際にそれそれきわめて 特異的な役割をもつ多数のＥ２酵素がある。たとえば酵母遺伝子ＲＡＤ６は、紫 外線誘発性損傷により起きるＤＮＡの修復に必須であると思われるＥ２をコード する。ＲＡＤ６酵母酵素は、ウサギＥ２_14kおよびヒトユビキチン−キャリヤー Ｅ２_17kタンパク質と相同である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｒ．，Ｅｃｋｅｒｋｏ ｒｎ Ｃ.,Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ Ｆ.およびＳｃｈｗｅｉｇｅｒ,ＥＭＢＯ Ｊ ．（１９９０），９，１４３１−１４３５；Ｗｉｎｇ Ｓ．，Ｄｕｍａｓ Ｆ． およびＢａｎｖｉｌｌｅ Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２），２６ ７，６４９５−６５０１）。 ヒトＥ２_17kタンパク質のラット相同体をコードするｍＲＮＡは、断食した悪 液質ラットモデル（Ｗｉｎｇ Ｓ．およびＢａｎｖｉｌｌｅ Ｄ．，Ａｍ．Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９４），２６７，Ｅ３９−Ｅ４８）および後足懸吊した ラット悪液質モデル（Ｔａｉｌｌａｎｄｉｅｒ Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． （１９９６），３１６，６５−７２）から得た萎縮筋肉において３倍増加してい ることが示された。しかし、筋肉消耗に際しそのような濃度上昇が特定のタイプ の筋肉に特異的に起きるのか、またはより全般的に多くの組織タイプ全体に上昇 するのかを示した研究はこれまでない。 急速かつ進行性の体重減少および筋肉消耗を伴うラット腹水肝癌吉田ＡＨ−１ ３０モデルを用いた研究で、β２−アドレナリン作用性アゴニストであるクレン ブテロール（Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ）が筋肉タンパク質分解の亢進を阻止し、 このタンパク質破壊の正常化はＡＴＰユビキチン依存性タンパク質分解系の過剰 活性化が低下することにより達成されたことを証明した(Ｃｏｓｔｅｌｌｉ Ｐ. , Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９５），９５，２３６７−２３７２)。ク レンブテロールがこれらの効果を達成した機構は分かっていない。さらに、他の どの物質がＡＴＰユビキチン依存性タンパク質分解系を調節し、筋肉タンパク質 分解を阻止または低下させる能力をもつかを新たに判定する手段は現在ない。 ＡＴＰユビキチン依存性タンパク質分解の阻害物質を迅速かつ簡便に判定する 方法またはアッセイは、研究および開発、特に悪液質のような疾患を治療するた めの薬剤および組成物の開発に有用であろう。より具体的には、有用なアッセイ 法は、筋肉タンパク質分解のみを特異的に阻止または低下しうる阻害物質を確認 できるものであろう。特にＥ２タンパク質は多数あり、かつそれらは広範な組織 タイプにおいて発現するため（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｒ．，Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒ ｎ Ｃ．，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ Ｆ．およびＳｃｈｗｅｇｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ ．（１９９０），９，１４３１−１４３５）、筋肉タンパク質分解の阻害物質と して特異性の高いアッセイを開発するのは困難である。あるアッセイは筋肉タン パク質分解を阻止する阻害物質を目立たせるかもしれないが、それらの阻害物質 が特異的でない場合、それらは他の組織のタンパク質制御をも妨害する可能性の あることが理解されるであろう。 前記により明らかなように、ＡＴＰユビキチン依存性タンパク質分解経路は複 雑であり、この経路に基づく適切な方法またはアッセイ法は、特異的な筋肉タン パク質分解阻害物質の迅速かつ簡便なスクリーニングが可能となる以前に多数の 問題を克服しなければならない。本発明の目的は、筋肉タンパク質分解に対する 特異性の高い阻害物質を同定しうる実用的な方法およびアッセイを提供すること である。発明の開示 本発明者らは、特定のヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク質が骨格筋お よび心筋に特に多量存在することを認めた。本発明者らは、ある種類のＥ２タン パク質がＥ３タンパク質の不存在下で基質タンパク質を直接にユビキチン化しう ることも認めた。本発明者らは、これら両事実を本発明の方法およびアッセイに 利用した。本発明の方法およびアッセイはＥ３タンパク質を必要としないので、 使用がより簡単で、より簡便であり、一定時間内に、より多数の化合物をスクリ ーニングすることができる。Ｅ３タンパク質は大型で不溶性であるため、純粋な 形で組換え手段により生産するのに不適切であり、本発明が述べるようなアッセ イ法に使用するのに不適切である。さらに、本発明の方法およびアッセイはＥ３ タンパク質を伴わないので、本発明の方法またはアッセイ法を用いて確認される 阻害物質は本発明の方法またはアッセイ法に用いる骨格筋および／または心筋に おいて発現するヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質または特異的なヒト Ｅ２ユビキチン−キャリヤータンパク質の阻害物質であろう。本発明の方法また はアッセイ法において標的タンパク質の存在により、ユビキチン伝達の程度を測 定するための簡便な方法が提供される。 したがって本発明は、阻害物質を、Ｅ３タンパク質の不存在下で、（ｉ）ユビ キチン、（ｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質、および（ｉｉｉ ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク質（このＥ２タンパク質は基質タン パク質を直接にユビキチン化することができ、骨格筋および／または心筋におい て発現する）と接触させ；次いで標的タンパク質へのユビキチン伝達の阻害程度 を測定することを含む、筋肉タンパク質分解阻害物質を特異的に同定する方法を 提供する。図２に示したユビキチン化反応を開始するのにＡＴＰが必要であるこ とが理解されるであろう。 以上および以下の本明細書においてヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク 質とは、筋肉以外の細胞および組織中に存在するものより高い濃度のヒトユビキ チン−キャリヤーＥ２タンパク質を意味する。たとえば参考例２は、筋肉以外の 多数の異なる組織と比較して高い濃度の例を示す。たとえば参考例２では骨格筋 および／または心筋中の濃度が膵臓組織と比較して約２〜３倍高く、胎盤組織よ り３〜６倍高いことが分かる。 本発明は、以下に本発明のアッセイに関し記載するように、筋肉タンパク質分 解阻害物質を特異的に同定する方法をも提供する。 本発明は、（ｉ）ユビキチン、（ｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タン パク質、および（ｉｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク質（このＥ ２タンパク質は基質タンパク質を直接にユビキチン化することができ、骨格筋お よび／または心筋において発現する）；ならびに標的タンパク質へのユビキチン 伝達の阻害程度を測定する手段を含む、筋肉タンパク質分解阻害物質を特異的に 同定するためのアッセイを提供する。 本発明は、Ｅ３タンパク質の不存在下で、（ｉ）ユビキチン、（ｉｉ）ヒトユ ビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質、および（ｉｉｉ）ヒトユビキチン−キャ リヤーＥ２タンパク質（このＥ２タンパク質は基質タンパク質を直接にユビキチ ン化することができ、骨格筋および／または心筋において発現する）；ならびに 標的タンパク質へのユビキチン伝達の阻害程度を測定する手段を含む、筋肉タン パク質分解阻害物質を特異的に同定するためのアッセイを提供する。 前記のように、悪液質のラットモデルはヒトＥ２_17kのラット相同体をコード するｍＲＮＡ濃度の上昇を示す。本発明者らはこの結果を神経除去した筋萎縮モ デルで確認した−参考例１参照。本発明者らはさらにノーザンブロット法により 、正常な組織でヒトユビキチンキャリヤータンパク質Ｅ２_17kが骨格筋および心 筋に特に多量存在することをも証明した−参考例２参照。。しかしラットの骨格 筋および心筋のラット相同Ｅ２タンパク質については、同様な特に高い量はみら れない（この場合は、このＥ２タンパク質濃度は全組織タイプで全般的に高い） 。これらの所見に基づき、ヒトユビキチン−キャリヤータンパク質Ｅ２_17kを用 いて、本発明において詳述する、筋肉タンパク質分解に実質的に特異的な阻害物 質を同定しうる方法およびアッセイを開発した。本発明において詳述する方法お よびアッセイが、Ｅ２_17k以外の、骨格筋および心筋に多量存在するＥ２タンパ ク質についても利用できることが理解されるであろう。 ヒトＥ２_17kユビキチン−キャリヤータンパク質は、基質タンパク質を直接に ユビキチン化することができる。本発明者らはこの事実を本発明において詳述す る方法およびアッセイに利用した。本発明において詳述する方法およびアッセイ が、Ｅ２_17k以外の、基質タンパク質を直接にユビキチン化しうるＥ２タンパク 質についても利用できることが理解されるであろう。 したがって本発明は好ましくは、以上および以下に記載するように、ヒトユビ キチン−キャリヤーＥ２タンパク質がＥ２_17kである、筋肉タンパク質分解阻害 物質を特異的に同定する方法を提供する。 本発明は好ましくは、以上および以下に記載するように、ヒトユビキチン−キ ャリヤーＥ２タンパク質がＥ２_17kである、筋肉タンパク質分解阻害物質を特異 的に同定するためのアッセイをも提供する。 他の態様において本発明は、以上および以下に記載するように、本発明方法に 使用するためのアッセイをも提供する。 他の態様において本発明は、以上および以下に記載するように、アッセイに用 いるヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質の阻害物質に関して使用するた めの、ならびに／あるいはアッセイに用いる骨格筋および／または心筋において 発現する特異的なヒトＥ２ユビキチン−キャリヤータンパク質の阻害物質に関し て使用するためのアッセイをも提供する。本発明の方法およびアッセイを使用し て同定した阻害物質を他の態様として提供する。そのような阻害物質は、図２の ユビキチン化反応の１または多数の成分に対し作用することができ、そのために 使用できる。 他の態様において本発明は、以上および以下に記載するアッセイ、ならびにア ッセイに使用するヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質の阻害物質を含め た、ならびに／あるいは骨格筋および／または心筋において発現する特異的なヒ トＥ２ユビキチン−キャリヤータンパク質の阻害物質を含めたアッセイをも提供 する。 標的タンパク質へのユビキチン伝達の阻害程度を測定する手段は、シンチレー ション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓ ｓａｙ、ＳＰＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎ ｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）またはラジオ イムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定するものである。 本発明の１態様において、使用する標的タンパク質はヒストン２Ａ、ビオチニ ル化ヒストン２Ａ、トロポニンＴまたはαアクチンである。 本発明の他の態様において、使用する標的タンパク質はヒストン２Ａである。 本発明の他の態様において、使用する標的タンパク質はビオチニル化ヒストン ２Ａである。 好ましくは、使用するＥ１およびＥ２タンパク質は組換え手段で得られる。 本発明に記載するアッセイのゲル−ベース方式（ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｖｅｒ ｓｉｏｎ）を用いて、阻害物質がＥ１および／またはＥ２タンパク質を特異的に 阻害するか否かを判定できる。したがってゲル−ベースアッセイによれば、図２ のユビキチン化反応において阻害物質が作用している段階を確認できる。したが って本発明のさらに別の態様においては、ゲル−ベース方式の方法およびアッセ イを使用する。そのようなアッセイは、標準的な試薬および条件を用いて実施さ れる。 図２のユビキチン化反応を阻害するのに好ましい段階は、ユビキチンをＥ２タ ンパク質へ伝達する段階、またはユビキチンを標的タンパク質へ伝達する段階で ある。後者の段階が阻害に特に好ましい。その理由は、この段階で作用する阻害 物質は基質および／または酵素特異的である可能性が最も高いからである。本発 明のアッセイに標的タンパク質が存在することにより、そのような阻害物質の同 定が可能となる。 本発明方法の図式による説明を図２に、本発明のアッセイの図式による説明を 図３に示す。詳細は後述する。発明の詳細な記述 Ｅ２_17k阻害物質に関する方法またはアッセイ タンパク質 ヒトＥ１およびＥ２_17kユビキチン−キャリヤータンパク質の両方をコードす るヒト骨格筋ｃＤＮＡクローンを、ヒト骨格筋ポリＡ⁺ ｍＲＮＡ（クローンテ ク、米国パロアルト）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。これらを ＢＬ２１細胞において、社内の（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）ベクターｐＴＢ３７５ＮＢ ＳＥ（アンピシリン耐性ではなくテトラサイクリン耐性を組み込むことにより修 飾して収率を最大限に高めたもの）から、Ｎ−末端メチオニンのすぐ隣に６−ヒ スチジン標識を含有する組換えタンパク質を産生するように発現させた。ｐＴＢ ３７５ＮＢＳＥベクターに代わる市販品は、ノバゲン Ｒ＆Ｄシステムズ・ヨー ロッパ社（英国）から入手可能なｐＥＴ２１ａ（カタログＮｏ．６９７６２−１ ）である。ＢＬ２１細胞もノバゲンから市販されている（カタログＮｏ．６９４ ４ ３−１）。６−Ｈｉｓ標識を用いたのは、ニッケルキレート化カラムを用いた組 換えタンパク質精製を補助するためである。Ｅ１タンパク質は、最初にＬａ Ｖ ａｌｌｉｅら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９３，１１，１８７−１９ ３）が記載したように２０℃で、０．０１ｍＭ ＩＰＴＧを誘導に用いて低速増 殖法（ｓｌｏｗ−ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）で得られた。Ｅ２タンパク 質は、３７℃で０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いる慣用の増殖法で得られた。詳細を さらに後記の“実施例”と題する節に示す。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ） 上記により得た組換えＥ１およびＥ２_17kタンパク質を用い、ＡＴＰおよび塩 化マグネシウムの存在下で¹²⁵Ｉ標識モノ−ユビキチン（アマシャム）を標的タ ンパク質に取り込ませることにより、“混合および計量(ｍｉｘ ａｎｄ ｍｅ ａｓｕｒｅ)”９６ウェルＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ−アマシャム ）を開発した。ヒストン２Ａ、トロポニンＴおよびαアクチンが、標識タンパク 質として用いるのに有効であった。プロテインＡ標識ＳＰＡビーズ(アマシャム) 、および目的とする標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて、ユビ キチン化標的タンパク質を検出した。 プロテインＡおよびアビジン結合ＳＰＡビーズの両方が、ヒストン２Ａまたは ヒオチニル化ヒストン２Ａを標的基質として用いるアッセイに有効であった。 ＳＰＡの図式による説明を図３に示す。酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ） Ｔａｋａｄａ Ｋ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），２３３ ，４２−４７）が記載し、のちにＴａｋａｄａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ ｙｓ．Ａｃｔａ（１９９６），１２９０，２８２−２８８）が改変した方法に主 として基づく細胞ベースＥＬＩＳＡを、ＳＰＡアッセイの開発に用いた。 ＳＰＡの代わりに高処理量スクリーニング法または二次スクリーニング法とし ても使用できるように、ＥＬＩＳＡ法を改変した。標的タンパク質をＰＥＩ（ポ リエチレンイミン）の存在下で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの底に“固定”し た。組換えＥ１およびＥ２_17k、モノユビキチン、ＡＴＰおよび塩化マグネシウ ムを含む反応混合物を用いた。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した、ポリユ ビキチンに対するポリクローナル抗体を用いて、ユビキチン化標的タンパク質を 検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼをＡＴＢＳまたはＥＣＬ（増強化学ルミ ネセンス）検出システムにより検出した。 ＥＬＩＳＡの図式による説明を図３に示す。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） Ｔａｋａｄａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９６）， １２９０，２８２−２８８）が記載した方法を用いて、ＳＰＡまたはＥＬＩＳＡ アッセイをラジオイムノアッセイシステムに適用した。 ＲＩＡの図式による説明を図３に示す。Ｅ２_17k抗体の産生 精製した組換え６−Ｈｉｓ標識Ｅ２_17kタンパク質をフロイントアジュバント と共に用い、ニュージーランドシロウサギに抗体を産生させた。悪液質を含めた 特定の病理学的状態において起きる正常タンパク質の不適正な分解亢進を低下さ せるために、抗血清（すなわちＥ２_17k抗体またはそのフラグメント）を用いた 。実施例 本発明を以下の実施例により説明する。実施例で用いた材料および方法を以下 に示す：−１ ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＩＩベクター Ｙａｎｉｓｃｈ−ｐｅｒｒｏｎ Ｃ．ら（Ｇｅｎｅ（１９８５），３３，１０ ９−１１９）が用いたものと同様な組換えクローニングベクター系であって、下 記を含む：Ｔ３およびＴ７バクテリオファージのプロモーター配列によってフラ ンキングされた(ｆｌａｎｋｅｄ)多重ユニーク制限部位(ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕ ｎｉｑｕｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ)を含むポリリンカーＤＮＡ フラグメント、繊維状ファージ複製起点、およびアンピシリン薬物耐性マーカー 遺伝子を保有する、ｃｏｌＥＩベース−レプリコン。２ ハイボンド−Ｎ⁺（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺）（ＴＭ） ポアサイズ０．４５ミクロンの支持されたナイロン−６６メンブラン。核酸を ＵＶ架橋またはオーブンベーキング（ｏｖｅｎ ｂａｋｉｎｇ）により固定化す るために使用。アマシャム・インタナショナル社（英国バックス州アマシャム） により供給。３ ＳＳＣ（食塩−クエン酸ナトリウム） ０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０４ デンハート試薬（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ） ０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌ）４００， ０００(ショ糖の非イオン合成ポリマー、透析および凍結乾燥され、約４００， ０００の分子量をもつ)および０．０２％ポリビニルピロリドンを含有する溶液 。５ ｍＲＮＡの調製 ポリＡ⁺ ｍＲＮＡは約１×１０⁸ Ｃ２Ｃ１２細胞から直接に、ファストトラ ック（ＦａｓｔＴｒａｃｋ）ｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン）を用いて調 製された。４Ｍグアニジンイソチオシアナート、２．５ｍＭシトレート、０．５ ％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）（ＳＤＳ）、１００ｍＭ β−メルカプトエ タノール中でポリトロンホモジナイゼーション（ｐｏｌｙｔｒｏｎ ｈｏｍｏｇ ｅｎｉｓａｔｉｏｎ）し、続いて５．７Ｍ ＣｓＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウム を通して１３５，０００ｇ（最大）で遠心分離することにより、ラット組織全ｍ ＲＮＡを調製した。ファストトラックｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン）を 用いてラットポリＡ⁺を得た。６ 形質転換 一般にエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換を行っ た。菌株ＤＨ５αまたはＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物４００ｍｌをＬブロス中で ＯＤ６００が０．５になるまで増殖させ、２，０００ｇで採集した。細胞を氷冷 脱イオン水中で２回洗浄し、１０％グリセロール１ｍｌに再懸濁し、アリコート として−７０℃で保存した。リゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）ミックスをミリ ポアＶシリーズメンブラン（ポアサイズ０．００２５ｍｍ）で脱塩した。細胞４ ０μｌを１μｌのリゲーションミックスまたはプラスミドＤＮＡと共に０．２ｃ ｍのエレクトロポレーションキュベット中、氷上で１０分間インキュベートし、 次いでジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）装置（バイオラッド）によ り０．５ｋＶｃｍ^-1、２５μＦ、２５０ｍｓｅｃでパルス処理した。テトラサイ クリン１０μｇ／ｍｌまたはアンビシリン１００μｇ／ｍｌを補充したＬ寒天上 で、形質転換体を選択した。７ ノーザンブロット ポリＡ⁺ ＲＮＡ試料２μｇまたは全ＲＮＡ試料２０μｇを、ＭＯＰＳ緩衝液 中１％変性用ホルムアルデヒドアガロースグル上での電気泳動により分析し（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ”,第２版（１９８９）,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ ー・プレス）、ハイボンドＮ⁺（アマシャム）上に移した。プローブをランダム ヘキサマープライミングによりＰ³²で標識し、０．２８Ｍリン酸ナトリウム（ｐ Ｈ７．２）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、０．１％ＳＤＳ中 、６５℃でハイブリダイゼーションを行った。メンブランを０．２×ＳＳＣ、０ ．１％ＳＤＳの最終ストリンジェンシーになるまで６５℃で洗浄した。装填量の 変動を調節するために、ブロットをオートラジオグラフィー後に０．１％ＳＤＳ 中で煮沸することによりストリッピングし、次いで１．２ｋｂラットグリセロア ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼｃＤＮＡ（ＧＡＰＤＨ）を含有す るプローブを用いて再度ハイブリダイズした（Ｆｏｒｔ Ｐ．，Ｍａｒｔｙ Ｌ ．，Ｐｉｅｅｃｈａｃｚｙｋ Ｍ.,Ｅ１ Ｓａｂｒｏｕｔｙ Ｓ.,Ｊｅａｎｔｅ ｕｒ Ｐ．およびＢｌａｎｃｈａｒｄ Ｊ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８５），１３，１４３１−１４４２）。市販のプレブロット( ｐｒｅ−ｂｌｏｔｔｅｄ)ＲＮＡパネル（クローンテク、米国カリフオルニア州 パロアルト）を用いて、ヒト組織由来ポリＡ⁺ ＲＮＡの分析を行った。８ ユビキチンコンジュゲーションアッセイ ３７℃で２時間、コンジュゲーションアッセイを行った。反応混合物は５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０． ５ｍＭ ＤＴＴ、組換えＥ１、組換えＥ２_17k、１μｇの¹²⁵Ｉ−ユビキチン（ア マシャム）および２μｇのヒストン（シグマ）を含有していた。インキュベーシ ョン後、５％β−メルカプトエタノールを含有するか、または含有しない試料装 填用緩衝液の添加により反応を停止した。５％β−メルカプトエタノールを含有 する反応物を５分間煮沸した。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリル アミドゲル、バイオラッド）で溶解し、ゲルを乾燥させた後、オートラジオグラ フィーにより視覚化した。９ ヒストン２Ａのビオチニル化 ベーリンガー・マンハイムから購入したキット（カタログＮｏ．１４１８１６ ５）を用い、その説明に従ってヒストン２Ａをビオチニル化した。要約すると、 標的タンパク質（この場合、ヒストン２Ａ）の遊離アミノ基とＤ−ビオチニル− ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−７ −ＮＨＳ）を安定なアミド結合の形成により反応させた。未反応ビオチン−７− ＮＨＳをセフアデックスＧ−２５カラムで分離した。用いたモル濃度はリン酸緩 衝食塩液１ｍｌ中ヒストン２Ａ ４ｍｇであり、これに２０ｍｇ／ｍｌのビオチ ン−７−ＮＨＳを添加した。周囲温度で２時間、おだやかに振とうしながらイン キュベーションを行った。１０ シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ） 室温で２時間、コンジュゲーションアッセイを行った。。反応混合物は５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ 塩化マグネシウム 、０．５ｍＭ ＤＴＴ、組換えＥ１、組換えＥ２_17k、１μｇの¹²⁵Ｉ−ユビキチ ン（アマシャム）および２μｇのビオチニル化ヒストン（シグマ）を含有し、最 終容量を１００μｌとした。インキュベーション後、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび ０．１ｍｇ／ウェルのアビジン結合ＳＰＡビーズ（アマシャム・インタナショナ ル）の添加により反応停止した。参考例１：筋萎縮の神経除去モデルの確認 前記に従い、ランダムプライミングにより標識した全長Ｅ２_17kを用いて、ノ ーザンブロット法を行った。ブロットを対照としてのＧＡＰＤＨで再プローブし た。ＭＤホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）により分析した後 のＥ２_17k／ＧＡＰＤＨ強度比のグラフを図４に示す。図中、 １列目は、神経支配下のラットヒラメ筋全ＲＮＡ（２μｇ）である。 ２列目は、神経除去したラットヒラメ筋全ＲＮＡ（２μｇ）である。 ３列目は、神経除去したラットヒラメ筋全ＲＮＡ（２μｇ）＋１ｍｇ／ｋｇクレ ンブテロールである。 ４列目は、Ｃ２Ｃ１２細胞の対照ｍＲＮＡ（２μｇ）である。 シリーズ１は４回の測定値の平均であり、シリーズ２は測定値の標準偏差を示 す。参考例２：種々の組織タイプにおけるＥ２量レベルのノーザンブロット法 前記に従い、ランダムプライミングにより標識した全長Ｅ２_17kを用いて、ノ ーザンブロット法を行った。ヒト多（健康）組織ブロット（ｈｕｍａｎ ｍｕｌ ｔｉｐｌｅ（ｈｅａｌｔｈｙ）ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｔ）をクローンテクから入 手した。これらは下記の各組織に由来するポリＡ⁺ ｍＲＮＡ ２μｇを含有し ていた： １列目 膵臓、２列目 腎臓、３列目 骨格筋、４列目 肝臓、５列目 肺、６ 列目 胎盤、７列目 脳および８列目 心臓 図５に示すように、３列目と８列目（心臓と骨格筋）に特に多量のＥ２_17kが みられた（参考例１につき記載したものと同様な方法で作成し、同様に測定値の 標準偏差を示す）。実施例１ Ｅ２_17kおよびビオチニル化ヒストン２Ａへのユビキチン伝達程度を測定する ためのＳＰＡ手段を用いた前記方法およびアッセイを、標準物質としての競合阻 害物質Ｍｅ−ユビキチン（調製についてはＨｅｒｓｃｈｋｏ Ａ．およびＨｅｌ ｌｅｒ Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９８ ５），１２８，１０７９−１０８６に記載）の存在下および不存在下で用いた。 Ｍｅ−ユビキチンの存在下では、Ｍｅ−ユビキチンによる標的タンパク質への標 識ユビキチンの伝達を遮断したため（ＳＰＡ）計数低下がみられた。種々のＭｅ −ユビキチン阻害物質濃度で（ＳＰＡ）計数を測定することにより用量応答曲線 を作成して、３．３×１０^-6Ｍ（ユビキチンの１００％化学的メチル化を基準） のＩＣ₅₀（非阻害シグナルの５０％阻害を生じるのに必要な濃度）を得た。実施例２ 実施例２の化合物 Ｅ２_17kおよびビオチニル化ヒストン２Ａへのユビキチン伝達程度を測定する ためのＳＰＡ手段を用いた前記方法およびアッセイを用いて、一連の化合物をス クリーニングした。 上記の実施例２の化合物の存在下では、化合物がによる標的タンパク質への標 識ユビキチンの伝達を遮断したため（ＳＰＡ）計数低下がみられた。種々の阻害 物質濃度で（ＳＰＡ）計数を測定することにより用量応答曲線を作成して、２． ９９×１０^-5ＭのＩＣ₅₀測定値を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）ユビキチン、（ｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ１タンパク質 、および（ｉｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク質（このＥ２タン パク質は基質タンパク質を直接にユビキチン化することができ、骨格筋および／ または心筋において発現する）；ならびに標的タンパク質へのユビキチン伝達の 阻害程度を測定する手段を含む、筋肉タンパク質分解阻害物質を特異的に同定す るためのアッセイ。 ２．Ｅ３タンパク質の不存在下で、（ｉ）ユビキチン、（ｉｉ）ヒトユビキチ ン−キャリヤーＥ１タンパク質、および（ｉｉｉ）ヒトユビキチン−キャリヤー Ｅ２タンパク質（このＥ２タンパク質は基質タンパク質を直接にユビキチン化す ることができ、骨格筋および／または心筋において発現する）；ならびに標的タ ンパク質へのユビキチン伝達の阻害程度を測定する手段を含む、筋肉タンパク質 分解阻害物質を特異的に同定するためのアッセイ。 ３．ヒトユビキチン−キャリヤーＥ２タンパク質がＥ２_17kである、筋肉タン パク質分解阻害物質を特異的に同定するための請求項１および２記載のアッセイ 。 ４．標的タンパク質べのユビキチン伝達の阻害程度を測定する手段が、シンチ レーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬ ＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によるものである、請求項１〜 ３のいずれか１項記載のアッセイ。 ５．標的タンパク質へのユビキチン伝達の阻害程度を測定する手段が、シンチ レーション近接アッセイ（ＳＰＡ）によるものである、請求項４記載のアッセイ 。 ６．使用する標的タンパク質がヒストン２Ａ、ビオチニル化ヒストン２Ａ、ト ロポニンＴまたはαアクチンである、請求項１〜５のいずれか１項記載のアツセ イ。 ７．使用する標的タンパク質がビオチニル化ヒストン２Ａである、請求項６記 載のアッセイ。 ８.ユビキチン化反応において阻害物質が作用している段階を確認するための 、ゲル−ベース方式の請求項１〜７のいずれか１項記載のアッセイ。 ９．阻害物質を請求項１〜７のいずれか１項記載のアッセイの成分と接触させ ることを含む、筋肉タンパク質分解阻害物質を特異的に同定する方法。