JP2008506371A - グアニル酸シクラーゼ活性を検出するための方法およびアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）という酵素に関する。詳細には、本発明は、可溶性グアニル酸シクラーゼの酵素活性を高効率および高感度で検出することを可能にする細胞ベースアッセイ系を提供する。好ましい実施形態ではｓＧＣの酵素活性を刺激または阻害することによりｓＧＣと相互作用し、またｓＧＣ媒介性の機能障害もしくは疾患の診断または治療に使用することができる分子をスクリーニングする方法を提供する。本発明はさらに、前記方法で使用するための遺伝子構築物、ベクター、および細胞を提供する。

Description

本発明は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）という酵素に関する。より詳細には、本発明は、可溶性グアニル酸シクラーゼの酵素活性を高効率および高感度で検出することを可能にする細胞ベースアッセイ系を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ｓＧＣの酵素活性を刺激または阻害することによりｓＧＣと相互作用し、またｓＧＣ媒介性の機能障害もしくは疾患の診断または治療に使用することができる分子をスクリーニングする方法を提供する。本発明はさらに、前記方法で使用するための遺伝子構築物、ベクター、および細胞を提供する。

発明の背景
アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼは、種々の調節シグナルに応答してそれぞれｃＡＭＰおよびｃＧＭＰという細胞内セカンドメッセンジャーを合成する。哺乳動物のアデニル酸シクラーゼは、ヘキサヘリックス（ｈｅｘａｈｅｌｉｃａｌ）膜貫通領域、それに続くおおよそ４０ｋＤａの細胞質ゾルドメインからなる二重モジュールを含む原形質膜内在性タンパク質である（Ｓｕｎａｈａｒａら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６，４６１−４８０）。２つの細胞質ゾルドメイン内の高度保存相同配列は、酵素の活性部位に寄与する（Ｔａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，１７６９−１７７２）。活性化物質および阻害物質のどちらとも複合体を形成する酵素のこの可溶性ドメインのＸ線結晶構造も解明された（Ｔｅｓｍｅｒら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８，１９０７−１９１６）。

グアニル酸シクラーゼは、可溶性種および膜結合種の両方が存在する。どちらの型の酵素も、アデニル酸シクラーゼに類似する細胞質ドメインを含む（Ｇａｒｂｅｒｓ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１−５）。膜結合型グアニル酸シクラーゼは、ナトリウム利尿ペプチドによって刺激されるモノマーであるが、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）は、ヘムを補欠分子族として含むαおよびβサブユニット（どちらも触媒作用に必要である）からなるヘテロダイマーとして存在する。

グアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）は、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）から環状グアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）への変換を触媒する酵素のファミリーに属する。

ｓＧＣは、ｃＧＭＰをセカンドメッセンジャーとして形成することにより、種々の細胞外シグナルおよび様々な生理的過程、すなわち血管拡張、血小板凝集および血小板粘着、ならびに神経伝達においてある重要な役割を果たす。ｓＧＣの最も重要な生理活性化物質は、ＮＯおよびＮＯ関連化合物であり、これらは、この酵素のヘム部分に結合して酵素を活性化する。

補欠分子族であるヘムに一酸化窒素（ＮＯ）が結合すると、可溶性グアニル酸シクラーゼの著しい活性化が引き起こされる。種々の心臓血管疾患の病因は、ｓＧＣの不適切な活性化に関係している。ＮＯ依存性ｓＧＣ活性化の作用機序としての概念は、ＮＯドナーの臨床使用によって広く確認されている。

可溶性グアニル酸シクラーゼは、例えば、ヒトを含めたあらゆる動物の心臓、肺、肝臓、腎臓、および脳などの器官において検出可能である。病理学的過程、または病理学的事象に関連した過程において、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム基の鉄の酸化状態は、ある必須の役割を果たす可能性がある。酸化されたヘム基の鉄を有する可溶性グアニル酸シクラーゼの割合が高くなれば、内因性ＮＯによる可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化を低減する可能性をもたらすはずである。これは、永久的な高血圧、安定狭心症もしくは不安定狭心症、血栓症、心筋梗塞、卒中発作、肺水腫、勃起不全、腫瘍形成を伴う無制限組織増殖、糖尿病、腎機能障害、肝機能障害、または血管機能障害を、とりわけ、血圧の上昇、血小板の活性化、細胞増殖の増大、または細胞接着の増強をもたらす恐れがある。

グアニル酸シクラーゼの活性部位の残基が３個、アデニル酸シクラーゼのもので置換されている変異ＧＣ酵素は、完全に変化したヌクレオチド特異性を有することが示された（Ｓｕｎａｈａｒａ，Ｒ．Ｋ．ら、１９９８）。この変異グアニル酸シクラーゼという酵素は特に、それぞれのＧＣ刺激物質に対する反応性に影響を及ぼすことなく基質としてＡＴＰを有する。可溶性グアニル酸シクラーゼのこの変異型は、一酸化窒素によって誘発されるｃＡＭＰ生成の検出に有用である。

可溶性グアニル酸シクラーゼモジュレーターを検出するための従来方法は、以下のものである。

−ヌクレオチド前駆体が使用される放射能による方法
−環状ヌクレオチドに対する感受性が高いカルシウムチャネルに基づいた細胞系
−ＧＣ刺激物質の作用が組織または動物モデルで試験されるｉｎ ｖｉｖｏ法

発明の開示
本発明の目的は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の酵素活性を決定するのに有用な細胞ベースアッセイを提供することである。本発明のさらなる目的は、前記の細胞ベースアッセイを利用してｓＧＣと相互作用する分子をスクリーニングする方法を提供することである。

本発明によれば、適当な真核生物または原核生物の細胞内で、基質特異性を改変したｓＧＣ酵素を、ｃＡＭＰ感受性レポーター構築物と結合させ、それによりレポーター遺伝子の活性がｓＧＣの酵素活性を示すことにより、ｓＧＣの酵素活性を求める。基質特異性を改変したｓＧＣ酵素は、天然の酵素のアロステリック制御に影響を及ぼすことなく、ＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができる。ｓＧＣの基質特異性は、ヌクレオチド結合に関与するアミノ酸残基を、アデニル酸シクラーゼの活性部位に存在する対応残基で置換することによって改変することができる。例えば、ラットｓＧＣを使用する場合、αサブユニットのアミノ酸Ａｒｇ５９２、ならびにβサブユニットのＧｌｕ４７３およびＣｙｓ５４１をそれぞれＧｌｎ、ＬｙｓおよびＡｓｐに変更して、ＡＴＰ基質特異性が得られる。ｓＧＣの基質特異性の改変に関する詳細は、参照により本明細書に組み込むＳｕｎａｈａｒａら（１９９８）で見ることができる。

ｃＡＭＰ感受性レポーター構築物は、細胞内ｃＡＭＰレベルに対する感受性が高いｃＡＭＰ応答プロモーターを機能的に結合させたレポーター遺伝子を含む。好ましい実施形態では、ｃＡＭＰ応答プロモーターは、１〜４個のＭＲＥおよび１〜５個のＣＲＥエレメントを含有するＭＲＥ／ＣＲＥ（複数応答エレメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）−Ｒａｙ Ａら、１９８９；ｃＡＭＰ応答エレメント：Ｆｉｎｋ，Ｊ．Ｓら、１９８８）誘導性プロモーターである。細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇に対する感受性が高いＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターは、３ＭＲＥ／５ＣＲＥエレメント反復を含むことが好ましい。

このＭＲＥは、細胞系がＧα、ＧｑおよびＧｓシグナル伝達に応答することを可能にするヒトインターロイキン６プロモーター領域に対応する（ＭＲＥ：Ｒａｙ Ａ，Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ Ｐ，Ｓｅｈｇａｌ ＰＢ．，１９８９、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，ＬＲ，Ｍａｎａｎ，ＩＪ，Ｄｙｔｋｏ，ＧＭ，Ｗｕ，ＨＬ，Ｎａｍｂｉ，Ｐ，１９９９）。各ＭＲＥエレメントは、３２ｂｐであり、配列：ＡＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡに相当する。

ＣＲＥ配列（「ＴＧＡＣＧＴＣＡ」）は、１コピーまたは複数コピーの保存された配列モチーフＣＧＴＣＡを含む（Ｆｉｎｋ，Ｊ．Ｓ．ら、１９８８）。このエレメントは、ｃＡＭＰによって調節されることが知られている他の遺伝子の配列、および数種のウイルスエンハンサーに類似している。

このレポーター構築物はさらに、転写調節エレメント、選択マーカー、およびウイルスプロモーターを含んでもよい。

本発明に従って使用することができる適当なレポーター遺伝子には、それだけには限らないが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および発光タンパク質の遺伝子が含まれる。しかし、この系は、レポーター遺伝子の転写だけでなく、Ｇタンパク質結合レポーターファミリー（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｉｅｓ；ＧＰＣＲｓ）、イオンチャネル、核ホルモン受容体など対象となる任意の遺伝子の発現および誘導に極めて有用である。

本発明はさらに、ｓＧＣをコードしている遺伝子および／またはレポーター遺伝子構築物を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、ＣＨＯ細胞系であることが好ましい（以下、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動する記載したＭＲＥ−ＣＲＥエレメントを含むＣＨＯ細胞系は、ＣＨＯ ｃＡＭＰＬと称する）。本発明による宿主細胞系は、細胞内でのＮＯ放出の検出用ツールとして使用することが好都合である。

好ましい実施形態では、本発明は、培養した真核細胞または原核細胞内のｓＧＣの酵素活性を求める方法を提供し、この方法は、
Ａ）ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に結合させたレポーター遺伝子をコードしているベクター、および
ｉｉ）ＡＴＰに対する基質特異性を有するｓＧＣ、すなわちＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができるｓＧＣをコードしているベクター
を同時にまたは別々に前記細胞に導入するステップと、
Ｂ）前記細胞を、ｓＧＣの酵素活性を刺激または阻害する化合物と共にインキュベートするステップと、
Ｃ）前記レポーター遺伝子の活性を決定するステップと
を含む。

好ましい実施形態では、本発明は、ｓＧＣ活性を調節する分子を同定する方法を対象とし、この方法は、
Ａ）ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に結合させたレポーター遺伝子をコードしているベクター、および
ｉｉ）ＡＴＰに対する基質特異性を有するｓＧＣをコードしているベクター
を同時にまたは別々に前記細胞に導入するステップと、
Ｂ）前記細胞を候補分子と共にインキュベートするステップと、
Ｃ）前記レポーター遺伝子の活性を決定するステップと
を含む。

ｓＧＣ活性を刺激または阻害する分子は、レポーター遺伝子の発現／活性を測定することによって選択することができる。このアッセイは、既知のＮＯ放出物質の存在下または非存在下で実施することができ、この物質は、ＮＯが酵素のヘム部分に結合するとこの酵素を活性化する。好都合には、ＮＯ放出分子およびＮＯ非依存性のｓＧＣ活性化物質（および触媒部位に特異的でない阻害物質、例えば、ＯＤＱ）はどちらも、本発明の方法によりアッセイすることができる。選択された化合物は、ｓＧＣによる機能障害に関係する疾患を治療するのに役立つ候補物質となる。特に、ｓＧＣを刺激する化合物は、ｓＧＣの不適切な活性化が関与する疾患、特に心臓血管系の疾患の治療に使用することができる。

ｓＧＣ活性を決定するのにこれまで使用されてきた既知のアッセイに比べて、本発明の方法は、ａ）放射性試薬を必要としない、ｂ）感度が高い、ｃ）ハイスループットな形式（フォーマット）に容易に適合させることができる、およびｄ）天然の環境で実施されるという点でより有利である。

さらなる実施形態では、本発明は、培養した真核細胞または原核細胞内で対象の遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、
Ａ）ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に結合させた標的遺伝子をコードしているベクター、および
ｉｉ）ＡＴＰに対する基質特異性を有するｓＧＣをコードしているベクター
を同時にまたは別々に前記細胞に導入するステップと、
Ｂ）前記細胞を、ＮＯに依存したまたはＮＯに依存しない方法でｓＧＣを刺激することができる分子と共にインキュベートするステップと、
を含む。

本発明による典型的なアッセイ、ならびに本明細書で使用する条件および試薬を以下でより詳細に開示する。

実験の項
ラット野生型ｓＧＣのα３およびβ１サブユニットを脳ｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、部位特異的突然変異誘発のための鋳型として使用した。αサブユニットのアミノ酸Ａｒｇ５９２、ならびにβサブユニットのＧｌｕ４７３およびＣｙｓ５４１をそれぞれＧｌｎ、ＬｙｓおよびＡｓｐに変更し、これによりアデノシンに対する特異性が得られた。

ラットｓＧＣ変異ｃＤＮＡの発現ベクターを調製した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製ｐＩＲＥＳ）。ｐＭＡＭｎｅｏｌｕｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のルシフェラーゼ遺伝子の５’側にＭＲＥ−ＣＲＥ（複数応答エレメント：Ｒａｙ Ａら、１９８９；ｃＡＭＰ応答エレメント：Ｆｉｎｋ，Ｊ．Ｓ．ら、１９８８）誘導性プロモーターをクローニングすることにより、レポーターベクターを構築した。

細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇に対する感受性が高いＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性エレメントの構造は以下の通りである。

ＭＲＥエレメント：３（ＡＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡ）
ＣＲＥエレメント：５（ＴＧＡＣＧＴＣＡ）
両方のベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞中に安定した方法でトランスフェクトし、ＮＯドナー化合物ＳＮＡＰと共に４時間インキュベートすることによって得られた最善のルシフェラーゼ誘導に基づいて陽性クローンを選択した（図１）。

３回の限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ；ＬＤ）によって得られた最も応答性が高いクローンを使用して、ＮＯドナー、ＮＯ非依存性の活性化物質など、様々な化合物の活性を既知のｓＧＣ阻害剤ＯＤＱの存在下または非存在下で試験した（図２−４）。

その結果を添付の図面において示す。

図１：３回目のＬＤによるクローンの再試験
３回目のＬＤによって得られた１２個の最良のクローンを、５０μｌの無血清培地中でＳＮＡＰと共に４時間インキュベートした。５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ルシフェラーゼ活性をＣＣＤカメラ（６０秒測定、高感度）で測定した。

実験条件：９６ウェルプレートのフォーマットで５０００ｃ／ｗ、播種後４８時間。

クローン７をさらなる特徴付けのための最終クローンとして選んだ。

図２：（ａ）ＮＯドナー、ＳＮＡＰのＥＣ₅₀の算出
９６ウェルプレートに５０００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、この細胞を５０μｌの無血清培地（ＳＦＭ）中ＳＮＡＰと共に４時間インキュベートした。（ｂ）トランスフェクトしなかった細胞についても実験を平行して実施した。

５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ルシフェラーゼ活性をＣＣＤカメラ（６０秒測定、高感度）で検出した。公表ＥＣ₅₀ １．７×１０^-6Ｍ。

図３：（ａ）ＮＯドナー、ＳＩＮ−１のＥＣ₅₀の算出
３８４ウェルプレートに１５００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、この細胞をタイロード緩衝液（２５μｌ）中でＳＩＮ−１共に４時間インキュベートした。２５μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ルシフェラーゼ活性をＣＣＤカメラ（６０秒測定、高感度）で検出した。公表ＥＣ₅₀ １０^-7〜１０^-6Ｍ。

（ｂ）ＯＤＱによるＳＩＮ−１活性の阻害
３８４ウェルプレートに１５００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、ＯＤＱ（３００ｎＭ、３μＭ、３０μＭ）の存在下または非存在下でＳＩＮの用量反応試験を実施した。インキュベーションの総量はタイロード緩衝液中２５μｌである。

図４：ＮＯドナー、ＮＯＣ−１８のＥＣ₅₀の算出
９６ウェルプレートに５０００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、この細胞を５０μｌの無血清培地（ＳＦＭ）中ＮＯＣ１８と共に４時間インキュベートした。５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ルシフェラーゼ活性をＣＣＤカメラ（６０秒測定、高感度）で検出した。

図５：（ａ）ｓＧＣ刺激剤、ＢＡＹ４１−２２７２のＥＣ₅₀の算出
３８４ウェルプレートに１５００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、この細胞をタイロード緩衝液２５μｌ中でＢＡＹ４１−２２７２と共に４時間インキュベートした。２５ｕｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ルシフェラーゼ活性をＣＣＤカメラ（６０秒測定、高感度）で検出した。公表ＥＣ₅₀ ６×１０^-7Ｍ。

（ｂ）ＯＤＱによるＢＡＹ４１−２２７２活性の阻害
３８４ウェルプレートに１５００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、ＯＤＱ（３００ｎＭ、３μＭ、３０μＭ）の存在下または非存在下でＢＡＹ４１−２２７２用量反応試験を実施した。インキュベーションの総量はタイロード緩衝液中２５μｌである。ｓＧＣに対するＢＡＹ４１−２２７２の刺激作用はＯＤＱと競合する。

図６：ＳＮＡＰに関する反応速度および用量反応の実験
９６ウェルプレートに５０００ｃ／ｗで播種した。播種の４８時間後、この細胞を、ＳＮＡＰの濃度を増やしながらインキュベートした。以下に示すインキュベーション時間の後、この化合物を無血清培地と交換した。総インキュベーション時間 ４時間。

材料および方法
ＰＣＲ分析
ラット可溶性グアニル酸シクラーゼ（α３およびβ１サブユニット）：
α３サブユニットＮＭ＿０１７０９０、コード領域：６９０アミノ酸長
β１サブユニットＮＭ＿０１２７６９、コード領域：６１９アミノ酸長
ラット脳ｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した（カタログ番号６３７３１２）。非定量的発現解析のためのＰＣＲ分析における鋳型として２μｌのｃＤＮＡを使用した。さらに、陰性対照は鋳型なしで実施した。

標準的なＰＣＲ操作は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社によって示されているものであった。ＰＣＲプロトコールは以下の通りである。

プライマー：
プライマーｓＧＣα ＵＰ（Ａ）：５’ＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣ３’
プライマーｓＧＣα ＬＯＷ（Ｂ）：５’ＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＴＡＡＴＣＴＡ３’
プライマーｓＧＣβ ＵＰ（Ｃ）：５’ＣＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＧＧＴＴＴＴＧＴＧＡ３’
プライマーｓＧＣβ ＬＯＷ（Ｄ）：５’ＧＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＧ３’
ＰＣＲ反応混合液：
鋳型 ２μｌ
１０×Ｐｆｘ緩衝液（ＧＩＢＣＯ−ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）５μｌ
１０ｍＭのｄＮＴＰｓ １．５μｌ
５０ｍＭのＭｇＳＯ₄（ＧＩＢＣＯ−ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１μｌ
プライマーＡ（１０μＭ） ２．５μｌ
プライマーＢ（１０μＭ） ２．５μｌ
白金Ｐｆｘ（ＧＩＢＣＯ−ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２．５Ｕ
Ｈ₂Ｏ ３５μｌ
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００サーモサイクラーで実施した増幅プロトコール：
以下のステップを１回：
プレＰＣＲ ９４℃で２分
以下のステップを４０回：
変性 ９４℃で３０秒
アニーリング ５６℃で１分
伸長 ６８℃で２分１０秒
以下のステップを１回：
伸長 ６８℃で７分
特異的ＰＣＲ産物の予想される長さ：１３０９ｂｐ（Ａ／Ｂ増幅では６９０ｂｐ、Ｃ／Ｄ増幅では６１９ｂｐ）。

Ｍａｎｉａｔｉｓらによって記載された標準的な手順に従って、１×ＴＡＥ泳動緩衝液中での１％アガロースゲル電気泳動により増幅産物を分析した。

部位特異的突然変異誘発：
野生型遺伝子を鋳型として使用したＰＣＲにより、ｓＧＣのβサブユニットに変異を挿入した。詳細には、プライマーｓＧＣβ ＵＰおよびｓＧＣβＥ４７３Ｋ ＬＯＷを使用して遺伝子の５’部分を増幅し、プライマーｓＧＣβＥ４７３Ｋ ＵＰおよびｓＧＣβＣ５４１Ｄ ＬＯＷを使用して中央の断片を増幅し、プライマーｓＧＣβＣ５４１Ｄ ＵＰおよびｓＧＣβ ＬＯＷを使用して遺伝子の３’部分を増幅した。

完全長の変異遺伝子を再構成するために、これら３種の別個の断片を、プライマーｓＧＣβ ＵＰおよびｓＧＣβ ＬＯＷを用いて実施する最終ＰＣＲ反応における鋳型として使用した。

Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００サーモサイクラーで実施した増幅プロトコール：
以下のステップを１回：
プレＰＣＲ ９４℃で２分
以下のステップを２０回：
変性 ９４℃で３０秒
アニーリング ５２℃で１分
伸長 ６８℃で３０秒
以下のステップを１回：
伸長 ６８℃で７分
プライマーｓＧＣαＲ５９２Ｑ ＵＰおよびｓＧＣαＲ５９２Ｑ ＬＯＷを使用した部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット）により、ｓＧＣのαサブユニットに変異Ｒ５９２Ｑを挿入した。

Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００サーモサイクラーで実施した増幅プロトコール：
以下のステップを１回：
プレＰＣＲ ９５℃で１分
以下のステップを１８回：
変性 ９５℃で３０秒
アニーリング ５５℃で１分
伸長 ６８℃で１３分
以下のステップを１回：
伸長 ６８℃で７分
ＰＣＲ反応混合液：
鋳型 １μｌ
１０×Ｔｕｒｂｏ Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製） ５μｌ
２０ｍＭのｄＮＴＰｓ １μｌ
プライマーＡ（１０μＭ） ２．５μｌ
プライマーＢ（１０μＭ） ２．５μｌ
２．５Ｕ／μｌのＴｕｒｂｏ Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製） １μｌ
Ｈ₂Ｏ ３７μｌ

クローニング操作：
ｐＩＲＥＳｓＧＣβαｍｕｔ；
同一のメッセンジャーＲＮＡからの２種の連続したＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の同時翻訳を、内部リボソーム進入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）エレメントを介して可能にする、バイシストロニック哺乳動物発現ベクター（ｐＩＲＥＳ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入）中にｓＧＣの２種の変異サブユニットをそれぞれクローニングし、したがっていわゆるｐＩＲＥＳｓＧＣβαベクターが作製される。

上記のｓＧＣの変異βサブユニットをｐＩＲＥＳの独特のＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングする。

続いて、ｐＩＲＥＳｓＧＣβベクターをＳｍａＩで消化して、ｓＧＣの変異αサブユニットをＩＲＥＳエレメントの下流に挿入した。

得られたすべての構築物を完全長ジデオキシ塩基配列決定法によって検証した。

細胞培養：
培地、播種、およびインキュベーション：Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ社コード番号３１３３１−０２８）、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社コード番号１５１４０−１２２）、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝溶液（ＧＩＢＣＯ社コード番号１５６３０−０５６）、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ社コード番号１１３６０−０３９）、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム（ＧＩＢＣＯ社コード番号２５０８０−０６０）、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社コード番号３４５８１２）。

前培養条件：細胞を播種して７０〜８０％コンフルエントな状態で実験に用いた。

細胞培養条件：１週間に２回分割：３．０×１０⁵個の細胞／Ｔ７５フラスコ（回収：８×１０⁶個の細胞）。

クローン選択プロセス：
以前にＡｘｘａｍによって作製されたＣＨＯ ｃＡＭＰＬにｐＩＲＥＳｓＧＣβαｍｕｔをトランスフェクトした。

Ｇ４１８選択の８日後、安定したトランスフェクト細胞を９６ウェルプレートフォーマットに１ｃ／ｗで１回目の限界希釈法（１ｓｔ ＬＤ）により蒔いた。

２週間後、プレートを１００μＭ ＳＮＡＰと共に４時間インキュベートし、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ＣＣＤカメラで測定した。９個の最良の応答クローンを、細胞を計数する用量反応実験で再試験した。

３個の最良の応答クローンを２回目のＬＤ（０．３ｃ／ｗ、９６ウェルプレート）により蒔いた。

２週間後プレートを複製し、４８時間後１００μＭ ＳＮＡＰと共に４時間インキュベートし、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の注入後、ＣＣＤカメラで読み取った。１２個の最良の応答クローンを、細胞を計数する用量反応実験で再試験した。

４個の最良の応答クローンを３回目のＬＤ（０．３ｃ／ｗ、９６ウェルプレートフォーマット）により蒔いた。

３回目のＬＤの後、最終クローンを選び、１０μＭ ＳＮＡＰで選択した。

このアッセイの完全な最適化を最良の応答クローン７について実施した。

基準化合物：
ＳＮＡＰ（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号０５９８）は１００ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、一定分量に分けて−２０℃で保存した。標準溶液を無血清培地中で新たに調製した。

ＳＩＮ（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号０７５６）は１００ｍＭの濃度で水に溶解し、一定分量に分けて−２０℃で保存した。

ＮＯＣ１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号４８７９５７）は１００ｍＭの濃度で水に溶解し、一定分量に分けて−２０℃で保存した。

ＯＤＱ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号４９５３２０）は１００ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、一定分量に分けて−２０℃で保存した。

ＢＡＹ４１−２２７２はＡｌｅｘｉｓ社から購入し、１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、一定分量に分けて−２０℃で保存した。

ＳＩＮ−１、ＢＡＹ４１−２２７２、およびＢＡＹ５８−２６６７の標準溶液を標準タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中で新たに調製した。

タイロード緩衝液の組成：ＮａＣｌ １３０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＣａＣｌ₂ ２ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ、ＮａＨＣＯ₃ ５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４。

Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）：Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｅ２６２０。

参考文献

３回目のＬＤによるクローンの再試験の結果を示すグラフである。 ＮＯドナー、ＳＮＡＰのＥＣ₅₀の算出に用いるグラフである。 トランスフェクトしなかった細胞についてのＳＮＡＰ処理の結果を示すグラフである。 ＮＯドナー、ＳＩＮ−１のＥＣ₅₀の算出に用いるグラフである。 ＯＤＱによるＳＩＮ−１活性の阻害を示すグラフである。 ＮＯドナー、ＮＯＣ−１８のＥＣ₅₀の算出に用いるグラフである。 ｓＧＣ刺激剤、ＢＡＹ４１−２２７２のＥＣ₅₀の算出に用いるグラフである。 ＯＤＱによるＢＡＹ４１−２２７２活性の阻害を示すグラフである。 ＳＮＡＰに関する反応速度および用量反応の実験の結果を示すグラフである。

Claims (13)

1. 培養した真核細胞もしくは原核細胞内の可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の酵素活性を決定する方法であって、
   Ａ）ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に連結させたレポーター遺伝子をコードしているベクター、および
   ｉｉ）ＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができる可溶性グアニル酸シクラーゼをコードしているベクター
   を同時にまたは別々に前記細胞に導入するステップと、
   Ｂ）前記細胞を、ｓＧＣの酵素活性を刺激または阻害する化合物に接触させるステップと、
   Ｃ）前記レポーター遺伝子の活性を決定するステップと、
   を含む方法。
2. 培養した真核細胞もしくは原核細胞内のｓＧＣ活性を調節する分子を同定する方法であって、
   Ａ）ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に連結させたレポーター遺伝子をコードしているベクター、および
   ｉｉ）ＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができる可溶性グアニル酸シクラーゼをコードしているベクター
   を同時にまたは別々に前記細胞に導入するステップと、
   Ｂ）前記細胞を候補分子に接触させるステップと、
   Ｃ）前記レポーター遺伝子の活性を決定するステップと、
   を含む方法。
3. 培養した真核細胞もしくは原核細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
   Ａ）ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に連結させた標的遺伝子をコードしているベクター、および
   ｉｉ）ＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができる可溶性グアニル酸シクラーゼをコードしているベクター
   を同時にまたは別々に前記細胞に導入するステップと、
   Ｂ）前記細胞を、ＮＯに依存する又はＮＯに依存しない方式でｓＧＣの酵素活性を刺激することができる分子に接触させるステップと、
   を含む方法。
4. 前記ＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターが３ＭＲＥ／５ＣＲＥエレメントを含む、請求項１から３に記載の方法。
5. ラット可溶性グアニル酸シクラーゼをコードしているベクターを使用する、請求項１から３に記載の方法。
6. 前記ラットｓＧＣが、αサブユニットでＡｒｇ５９２→Ｇｌｎ変異、ならびにβサブユニットでＧｌｕ４７３→ＬｙｓおよびＣｙｓ５４１→Ａｓｐ変異を有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および発光タンパク質から選択されるタンパク質をコードしている、請求項１から２に記載の方法。
8. 前記候補分子が、ＮＯに依存する又はＮＯに依存しない方式でｓＧＣ活性を刺激または阻害することができる、請求項２に記載の方法。
9. 前記標的遺伝子が、イオンチャネル、ＧＰＣＲｓ、および核ホルモン受容体から選択される、請求項３に記載の方法。
10. ｉ）ＣＲＥまたはＭＲＥ−ＣＲＥ誘導性プロモーターに機能的に連結させたレポーター遺伝子をコードしているベクター、及びｉｉ）ＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができる可溶性グアニル酸シクラーゼをコードしているベクターを含む宿主の原核細胞または真核細胞。
11. ＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の宿主真核細胞。
12. ｓＧＣの酵素活性を調節する化合物をスクリーニングするための、ＡＴＰから環状ＡＭＰへの変換を触媒することができる可溶性グアニル酸シクラーゼの使用。
13. 細胞内ＮＯ放出の検出用ツールとしての、請求項１０から１１に記載の宿主細胞の使用。

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