JP2001161385A - 新規ポリペプチド - Google Patents

新規ポリペプチド

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JP2001161385A
JP2001161385A JP2000320749A JP2000320749A JP2001161385A JP 2001161385 A JP2001161385 A JP 2001161385A JP 2000320749 A JP2000320749 A JP 2000320749A JP 2000320749 A JP2000320749 A JP 2000320749A JP 2001161385 A JP2001161385 A JP 2001161385A
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pfi
polynucleotide
sequence
compound
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Roderick Walsh
ウォルシュ ロドリック
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Original Assignee
Pfizer Inc
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の提
供。 【解決手段】 ポリペプチド配列は、１つ又はそれ以上
の：（ａ）ヒト由来の特定のポリヌクレオチド配列から
翻訳される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、並
びにその変異体、断片、相同体、類似体及び誘導体；
（ｂ）ヒト由来の特定配列のポリペプチド、並びにその
変異体、断片、相同体、類似体及び誘導体；又は（ｃ）
NCIMB 41072のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ド、並びにその変異体、断片、相同体、類似体及び誘導
体を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】［技術分野］本発明は、Ｇタンパク質共役
型受容体（ＧＰＣＲ）として知られているタンパク質の
種類に属する新規のポリペプチドをコードする新規のポ
リヌクレオチド配列に関する。本発明は、特に、ポリペ
プチドの製造方法およびその使用にも関する。
【０００２】［発明の背景］細胞および組織は、広範な
種々の細胞外情報分子の特異的細胞表面受容体との相互
作用により、これらの分子に応答する。このような一種
類の受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）
として知られており、これらは一連の７つの疎水性膜貫
通セグメントを含有することを特徴とする。細胞外配位
子のその受容体との結合時に、細胞内信号は、受容体が
活性化されたことによって順次多数の異なる細胞内事象
をもたらし得る異種三量体Ｇタンパク質との相互作用に
より開始される。例えば、いくつかのＧＰＣＲはアデニ
ルシクラーゼ活性に影響を及ぼし、一方、その他のＧＰ
ＣＲはホスホリパーゼＣを介して作用する。
【０００３】ＧＰＣＲスーパーファミリーの成員は、広
範な種々の配位子、例えば小分子アミン（例えばセロト
ニン、ドーパミン、アセチルコリン）、脂質由来メディ
エーター（例えば、ＬｐＡ）、アミノ酸誘導体（例えば
グルタメート）および神経伝達物質ペプチドおよびホル
モン（例えばニューロキニン、ガラニン、グルカゴン、
ガストリン）に応答する。ＧＰＣＲは広範囲の配位子に
より活性化されるが、しかし、個々のＧＰＣＲは小さく
且つ非常に特異的なレパートリーの配位子を有するとい
うことに留意すべきである。新規のＧＰＣＲの一次構造
の分析に基づいて、ここでそれらを特定のサブファミリ
ーに分類し、それにより考え得る配位子の範囲を狭め得
る。
【０００４】多くの場合、ＧＰＣＲの内因性配位子は相
対的に小さく、合成類似体によりそれらを模倣させ得る
か、または遮断させ得る。例えば、プラゾシン、ドキサ
ゾシン、シメチジン、ラニチジンのような薬剤は、すべ
て、それらのそれぞれの標的ＧＰＣＲの有効な拮抗薬で
ある。したがって、ＧＰＣＲの調整が治療的コンセンサ
スを有し得る場合、新規のＧＰＣＲおよびそれらの関連
作動薬および拮抗薬を提供する必要性が引き続き存在す
る。
【０００５】［発明の要約］広範な局面において、本発
明は、新規のアミノ酸配列に関する。この点で、特定の
新規のアミノ酸配列が単離されており、そして、本発明
は、その配列、ならびにその新規の変異体、断片、誘導
体および相同体を網羅すると理解されるべきである。
【０００６】別の広範な局面では、本発明は、新規の核
酸配列に関する。この点では、特定の新規の核酸配列が
単離されており、そして、本発明は、その配列、ならび
にその新規の変異体、断片、誘導体および相同体を網羅
すると理解されるべきである。したがって、要するに、
本発明のいくつかの局面は、以下の： １．新規アミノ酸、 ２．新規ヌクレオチド配列、 ３．前記の新規配列を用いる検定、 ４．前記の検定の使用により同定される化合物／組成
物、 ５．前記の新規配列を包含するかまたは発現する発現
系、 ６．前記の新規配列を基礎にした治療方法、 ７．前記の新規配列を基礎にした製剤組成物 に関する。
【０００７】本発明のアミノ酸配列および／または本発
明のヌクレオチド配列に関するその他の局面としては、
本発明の配列を包含するかまたは発現し得る構築物；本
発明の配列を包含するかまたは発現し得るベクター；本
発明の配列を包含するかまたは発現し得るプラスミド；
本発明の配列を包含するかまたは発現し得る構築物／ベ
クター／プラスミドでトランスフェクトされるかまたは
ウイルス的形質導入される細胞；本発明の配列を包含す
るかまたは発現し得る組織；本発明の配列を包含するか
または発現し得る器官；本発明の配列を包含するかまた
は発現し得る形質転換宿主；ならびに本発明の配列を包
含するか発現し得る形質転換生物体が挙げられる。本発
明は、同一物の移入方法を含めた微生物中での発現とい
ったような同一物の発現方法も包含する。
【０００８】参照を容易にするために、本発明の局面を
適切な項目見出しを付けて、ここで考察する。しかしな
がら、各項での教示内容は、必ずしも各々の特定の項に
限定されない。以下の注釈において、「本発明のヌクレ
オチド配列」および「本発明のアミノ酸配列」に対する
参照は、それぞれ、本明細書中に示されたかまたは考察
されたいずれか１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列
を、あるいは本明細書中に示されたかまたは考察された
いずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を指す。さ
らに、そして本明細書中で用いる場合、「アミノ酸配
列」とはペプチドまたはタンパク質配列を指し、ならび
にそれらの一部を指し得る。さらに、「本発明のアミノ
酸配列」という用語は、「本発明のポリペプチド配列」
という語句と同義語である。さらに、「本発明のヌクレ
オチド配列」という用語は、「本発明のポリヌクレオチ
ド配列」という語句と同義語である。
【０００９】本発明の局面の詳述 本発明の一局面によれば、１つ又はそれ以上の以下の： （ａ）配列番号２で記述されるようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を包含するポリヌ
クレオチド； （ｃ）NCIMB 41072中に含入されるＤＮＡにより発現さ
れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドと
少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を包
含するポリヌクレオチド； （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと
ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含するポリ
ヌクレオチド； （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドに
対する補体；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか
のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片を包含する
単離および／または精製ポリヌクレオチドが提供され
る。
【００１０】好ましくは、ポリヌクレオチドは、（ａ）
〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドと少なくとも75
％の同一性を有するヌクレオチド配列を包含する。さら
に好ましくは、ポリヌクレオチドは、（ａ）〜（ｃ）の
いずれかのポリヌクレオチドと少なくとも80％の同一性
を有するヌクレオチド配列を包含する。さらに好ましく
は、ポリヌクレオチドは、（ａ）〜（ｃ）のいずれかの
ポリヌクレオチドと少なくとも85％の同一性を有するヌ
クレオチド配列を包含する。さらに好ましくは、ポリヌ
クレオチドは、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレ
オチドと少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド
配列を包含する。さらに好ましくは、ポリヌクレオチド
は、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドと少
なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を包含
する。最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、（ａ）〜
（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドと少なくとも98％
の同一性を有するヌクレオチド配列を包含する。
【００１１】前記のポリヌクレオチドは、好ましくは、
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードする。
本発明は、前記のポリヌクレオチドの少なくとも15連続
ヌクレオチドを包含するポリヌクレオチドプローブまた
はプライマーも提供する。本発明はさらに、前記のポリ
ヌクレオチドを包含するベクターを提供する。
【００１２】本発明のさらに別の局面によれば、前記の
ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる宿主
細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は哺乳類、昆
虫、真菌、細菌または酵母菌細胞である。本発明のさら
に別の局面によれば、前記のポリヌクレオチドの転写Ｒ
ＮＡ生成物が提供される。ＲＮＡ生成物に関してアンチ
センスであり、それとハイブリダイズし得るＲＮＡ分子
またはその断片も提供される。
【００１３】前記のポリヌクレオチドと結合し得るリボ
ザイムまたはジンクフィンガータンパク質がさらに提供
される。本発明のさらに別の局面によれば、前記のポリ
ペプチドまたは断片の発現に十分な条件下で前記の宿主
細胞を培養することを包含するポリペプチドまたはその
断片の産生方法が提供される。好ましくは、前記のポリ
ペプチドまたは断片は前記の細胞の表面で発現される。
方法は、好ましくは、培養からポリペプチドまたは断片
を回収することをさらに含む。
【００１４】ポリペプチドまたはその断片を発現し得る
細胞の産生方法であって、前記のベクターで細胞を形質
転換またはトランスフェクトすることを包含する方法
も、本発明により提供される。本発明のさらに別の実施
態様によれば、前記の方法により産生される細胞が提供
される。前記の細胞の膜調製物も提供される。
【００１５】本発明の別の局面によれば、以下の： （ａ）配列番号１におけるポリヌクレオチド配列から翻
訳される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、なら
びにその変異体、断片、相同体、類似体および誘導体； （ｂ）配列番号２のポリペプチド、ならびにその変異
体、断片、相同体、類似体および誘導体；または （ｃ）NCIMB 41072のｃＤＮＡによりコードされるポリ
ペプチド、ならびにその変異体、断片、相同体、類似体
および誘導体を包含するポリペプチドが提供される。
【００１６】前記のポリペプチドに対する抗体も、本発
明により提供される。本発明はさらに、前記のポリペプ
チドを調整する化合物を提供する。好ましくは、化合物
は、ポリペプチドに拮抗するかまたは選択的に拮抗す
る。あるいは、化合物は、ポリペプチドを作動する。前
記の抗体または化合物、および１つ又はそれ以上の製薬
上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤
を包含する製剤組成物も、本発明により提供される。
【００１７】本発明の別の局面によれば、前記のポリペ
プチドと結合し、それを調節する化合物の同定方法であ
って、前記のポリペプチドを候補化合物と接触させて、
調整が生じたか否かを確定することを包含する方法が提
供される。好ましくは、前記の方法は、以下の： （ａ）化合物を、それらの表面で前記のポリペプチドを
発現する細胞と接触させ、前記のポリペプチドが化合物
の前記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能信号を
提供し得る二次構成成分に会合され、前記の接触がポリ
ペプチドの化合物との結合を可能にするのに十分な条件
下で生じ；そして（ｂ）前記の二次構成成分により生成
される信号を検出することによりポリペプチド結合し得
る化合物を同定する工程を包含する。
【００１８】あるいは、前記の方法は、以下の： （ａ）（ｉ）前記のポリペプチドと結合することが知ら
れている検出可能一次構成成分および（ｉｉ）化合物
を、それらの表面で前記のポリペプチドを発現する細胞
と接触させ、前記のポリペプチドが化合物の前記ポリペ
プチドとの結合に応答して検出可能信号を提供し得る二
次構成成分に会合され、前記の接触がポリペプチドの化
合物との結合を可能にするのに十分な条件下で生じ；そ
して（ｂ）一次構成成分のポリペプチドとの相互作用か
ら生成される信号の非存在または存在を検出することに
より一次構成成分がポリペプチドと結合するか否かを確
定する工程を包含する。
【００１９】前記の方法のいずれかにより同定される化
合物は、好ましくは、（ｉ）前記のポリペプチドと結合
し、そして拮抗するかまたは選択的に拮抗し、あるいは
（ｉｉ）前記のポリペプチドと結合し、そして作動す
る。ＧＰＣＲは信号伝達に関与するので、本発明のポリ
ペプチドのモジュレーター（例えば作動薬または拮抗
薬）は、信号伝達工程における干渉に用途を見出し得
る。
【００２０】したがって、本発明のさらに別の実施態様
によれば、製剤として用いるための前記の抗体、化合物
または組成物が提供される。本発明のポリペプチドを調
整し得るこのような抗体、化合物および組成物は、した
がって、信号伝達の局面に関する治療領域に用途を見出
す。治療的に有用な領域としては、肥満、糖尿病および
代謝疾患、神経学的疾患、精神療法、泌尿生殖器疾患、
生殖および性医学、炎症、癌、組織修復、皮膚科学、皮
膚色素沈着、光老化、薄弱性、骨粗鬆症、心臓血管性疾
患、胃腸疾患、抗感染、アレルギーおよび呼吸器疾患、
感覚器官障害、睡眠障害および毛髪損失が挙げられる
が、これらに限定されない。
【００２１】したがって、前記のポリペプチドの調整の
必要性を有する患者の治療のための薬剤の製造における
前記の化合物の使用も提供される。好ましくは、治療
は、ポリペプチドを拮抗しまたは選択的に拮抗する必要
性を有する患者のためである。あるいは、治療は、ポリ
ペプチドを作動する必要性を有する患者のためである。
本発明のさらに別の局面によれば、治療的有効量の前記
の化合物を患者に投与することを包含する前記のポリペ
プチドを調整する必要性を有する患者の治療方法が提供
される。好ましくは、前記の方法は、ポリペプチドを拮
抗しまたは選択的に拮抗する必要性を有する患者の治療
のためである。あるいは、前記の方法は、ポリペプチド
を作動する必要性を有する患者の治療のためである。
【００２２】好ましくは、前記の化合物はポリペプチド
であり、そして治療的有効量の化合物が、前記の化合物
をコードするＤＮＡを患者に提供し、前記化合物をin v
ivoで発現することにより投与される。前記のポリペプ
チドを調整する必要性を有する患者の治療のための薬剤
の製造における前記の抗体の使用も、本発明により提供
される。好ましくは、前記の方法は、前記のポリペプチ
ドを拮抗しまたは選択的に拮抗する必要性を有する患者
の治療のためである。あるいは、前記の方法は、前記の
ポリペプチドを作動する必要性を有する患者の治療のた
めである。
【００２３】治療的有効量の前記の抗体を患者に投与す
ることを包含する前記のポリペプチドを調節する必要性
を有する患者の治療方法が、さらに本発明により提供さ
れる。好ましくは、前記の方法は、ポリペプチドを拮抗
しまたは選択的に拮抗する必要性を有する患者の治療の
ためである。あるいは、前記の方法は、ポリペプチドを
作動する必要性を有する患者の治療のためである。
【００２４】本発明のさらに別の局面によれば、本発明
のポリペプチドを発現、過剰発現、不十分発現し、ある
いはその標的化挿入または欠失を示すようex vivoまた
はinvivoで遺伝子工学処理される細胞が提供される。 PFI-011ポリペプチド 前記で説明したように、本発明は、内部ではPFI-011と
呼ばれてきた新規のＧＰＣＲに、そして同一物をコード
するヌクレオチド配列に関する。本発明は、疾患の診断
および治療における新規の核酸およびアミノ酸配列の使
用にも関する。本発明は、ＧＰＣＲを調整し得る薬剤に
関して評価および／またはスクリーニングするための新
規の核酸およびアミノ酸配列の使用に関する。本発明は
さらに、ＧＰＣＲを調整し得る薬剤に関して評価および
／またはスクリーニングするための新規の核酸およびア
ミノ酸配列を包含または発現する遺伝子工学処理化宿主
細胞に関する。
【００２５】PFI-011ポリペプチドは、天然形態と同一
であり得る−この局面に関しては、好ましくはPFI-011
ポリペプチドは非ネイティブアミノ酸配列（即ち、それ
はその天然環境中には存在しない）である−か、あるい
はその変異体、相同体、断片または誘導体である。さら
に、あるいは代替的方法では、PFI-011ポリペプチドは
単離PFI-011ポリペプチドおよび／または精製PFI-011ポ
リペプチドである。PFI-011ポリペプチドは、天然であ
るか否かにかかわらず、あらゆる適切な供給源から入手
可能であるかまたはそれにより生成され得るし、あるい
はそれは合成、半合成または組換え体であり得る。
【００２６】PFI-011コード配列は、天然形態と同一で
あり得る−この局面に関しては、好ましくはPFI-011コ
ード配列は非ネイティブヌクレオチド配列（即ち、それ
はその天然環境中には存在しない）である−か、あるい
はその変異体、相同体、断片または誘導体である。さら
に、あるいは代替的方法では、PFI-011コード配列は単
離PFI-011コード配列および／または精製PFI-011コード
配列である。PFI-011コード配列は、天然であるか否か
にかかわらず、あらゆる適切な供給源から入手可能であ
るかまたはそれにより生成され得るし、あるいはそれは
合成、半合成または組換え体であり得る。
【００２７】PFI-011ポリペプチドおよびスクリーニン
グ PFI-011ポリペプチドおよび／またはそのコード配列お
よび／またはそれとハイブリダイズし得る配列は、異な
るＧＰＣＲ間の薬剤候補の選択性を検査するために有用
である。PFI-011はニューロテンシン受容体ともっとも
よく似ており、PFI-011はその配位子がペプチドである
と思われる新規のＧＰＣＲをコードする、ということが
（本明細書中で）実証されている。
【００２８】新規のPFI-011受容体を調節する薬剤は、
したがって、信号伝達工程を調整すると思われる。した
がって、PFI-011受容体のモジュレーターは、信号伝達
と関連した多数の異なる障害の治療に有用であると考え
られ、それらの例としては、肥満、糖尿病および代謝疾
患、神経学的疾患、精神療法、泌尿生殖器疾患、生殖お
よび性医学、炎症、癌、組織修復、皮膚科学、皮膚色素
沈着、光老化、薄弱性、骨粗鬆症、心臓血管性疾患、胃
腸疾患、抗感染、アレルギーおよび呼吸器疾患、感覚器
官障害、睡眠障害および毛髪損失が最も考えられるが、
これらに限定されない。
【００２９】したがって、PFI-011ポリペプチドおよび
／またはそのコード配列および／またはそれとハイブリ
ダイズし得る配列は、信号伝達に関連した疾患の治療の
ための薬剤候補をスクリーニングするのに有用であり得
る。さらに、PFI-011ポリペプチドおよび／またはその
コード配列および／またはそれとハイブリダイズし得る
配列は、前記のような疾患の治療のための薬剤候補をス
クリーニングするのに有用であり得る、と考えられる。
【００３０】PFI-011ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列またはPFI-011ポリペプチドそれ自体のいず
れかまたは両方を用いて、ＧＰＣＲ活性に影響し得る作
用物質をスクリーニングし得る。特に、PFI-011受容体
それ自体をコードするヌクレオチド配列を用いて、ＧＰ
ＣＲ活性を拮抗し得る作用物質をスクリーニングし得
る。さらに、PFI-011ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列またはPFI-011ポリペプチドそれ自体を用い
て、ＧＰＣＲ活性に選択的に影響する、例えばPFI-011
受容体を選択的に拮抗する作用物質をスクリーニングし
得る。
【００３１】本発明のポリペプチド 「ポリペプチド」−これは「タンパク質」という用語と
互換性がある−という用語は、一本鎖ポリペプチド分子
ならびに個々の構成成分ポリペプチドが共有または非共
有的手段により連結される多ポリペプチド複合体を含
む。好ましくは、本発明のポリペプチドは一本鎖ポリペ
プチドである。
【００３２】本発明のポリペプチドは、実質的に単離形
態であり得る。ポリペプチドはポリペプチドの意図され
た目的を妨げない担体または稀釈剤と混合され得るが、
依然として実質的に単離されたとみなされる、と理解さ
れる。本発明のポリペプチドは、実質的に精製形態でも
あり、この場合、それは一般に、調製物中の90％より多
い、例えば95％、98％または99％のポリペプチドが本発
明のポリペプチドである調製物中のポリペプチドを包含
する。本発明のポリペプチドは、例えばヒスチジン残基
の付加により修飾されて、それらの精製を補佐し得る。
【００３３】本発明のポリペプチドは、合成的手段（例
えば、Geysen et al., 1996に記載されているような）
により、または下記のように組換え的に産生され得る。
好ましい実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、それ
自体、それがその天然環境にある場合、そして同じく天
然環境にあるそのネイティブヌクレオチドコード配列に
よりそれが発現された場合、そしてそのヌクレオチド配
列が同じくその天然環境にあるそのネイティブプロモー
ターの制御下にある場合には、本発明のネイティブPFI-
011受容体を包含しない。参照を容易にするために、こ
の好ましい実施態様を、「非ネイティブアミノ酸配列」
と我々は呼んでいる。
【００３４】本発明のポリペプチドのためのアミノ酸配
列に関して「変異体」、「相同体」、「断片」、「類似
体」または「誘導体」という用語は、結果的に生じるポ
リペプチドがＧＰＣＲ活性を有し、好ましくは、添付の
配列番号２に示されたポリペプチドと同様に少なくとも
生物学的に活性であるという条件で、その配列からのま
たは配列への１つ（またはそれ以上）のアミノ酸のあら
ゆる置換、変異、修飾、交替、欠失または付加を含む。
特に、「相同体」という用語は、構造および／または機
能に関する相同を包含する。配列相同性に関しては、配
列番号２に示された配列との少なくとも70％、好ましく
は少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも80％、
さらに好ましくは少なくとも85％、さらに好ましくは少
なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％の相同
が認められる。最も好ましくは、配列番号２で示された
配列との少なくとも98％の相同が存在する。
【００３５】典型的には、本発明の変異体、相同体また
は断片に関しては、作製され得るアミノ酸置換の種類
は、アミノ酸配列の疎水性／親水性を保持すべきであ
る。アミノ酸置換は、例えば1、2または3〜10、20また
は30置換から作製され得るが、但し、修飾化配列は本発
明のＧＰＣＲとして作用する能力を保持する。アミノ酸
置換は、非天然類似体の使用を含み得る。
【００３６】本発明のアミノ酸配列は、適切な発現系に
おいて同一物をコードするヌクレオチド配列の発現によ
り産生され得る。さらに、または代替的に、タンパク質
それ自体は、PFI-011の全部または一部を合成するため
の化学的方法を用いて、産生され得る。例えば、ペプチ
ドは固相技法により合成され、樹脂から切断されて、分
取高速液体クロマトグラフィーにより精製され得る（例
えば、Creighton（1983）Proteins Structures and Mol
ecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N
Y, USA）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析また
はシーケンシングにより確証され得る（例えばエドマン
分解法）。
【００３７】直接ペプチド合成は、種々の固相技法（Ro
berge JY et al Science Vol 269,1995, 202-204）を用
いて実施され得るし、そして自動合成は、例えばＡＢＩ
431Ａペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて、メー
カーの使用説明書にしたがって成し遂げられ得る。さら
に、PFI-011またはその任意の部分のアミノ酸配列は、
直接合成中に変えられ得るし、および／またはその他の
サブユニットまたはその任意の部分からの配列を用いる
化学的方法を用いて併合されて、変異体ペプチドを産生
し得る。
【００３８】本発明の別の実施態様では、PFI-011天
然、修飾化または組換えアミノ酸配列は異種配列と結紮
されて、融合タンパク質をコードし得る。例えば、PFI-
011ＧＰＣＲ活性を有する化合物およびペプチド作動薬
および拮抗薬に関してライブラリーをスクリーニングす
るためには、市販の抗体により認識される異種エピトー
プを発現するキメラPFI-011タンパク質をコードするこ
とが有用であり得る。融合タンパク質はさらに、PFI-01
1が開裂され、そして異種部分から精製され得るよう
に、PFI-011配列と異種タンパク質配列との間に位置す
る開裂部位を含有するよう工学処理され得る。
【００３９】PFI-011は、タンパク質精製を促進するた
めに付加された１つ又はそれ以上の付加的ポリペプチド
ドメインを有する組換えタンパク質としても発現され得
る。このような精製促進ドメインとしては、金属キレー
ト化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にす
るヒスチジン−トリプトファンモジュール（Porath J,
Protein Expr Purif Vol 3 1992 p263-281）、固定化免
疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメ
イン、ＦＬＡＧＳ延長／アフィニティー精製系に利用さ
れるドメイン（Immunex Corp, Seatle, WA, USA）が挙
げられるが、これらに限定されない。精製ドメインとPF
I-011との間の開裂可能リンカー配列、例えばＸＡ因子
またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA,
USA）の含入は、精製を促進するのに有用である。
【００４０】PFI-011の特定のアミノ酸配列は、配列番
号２で示される。しかしながら、本発明は、その特定の
アミノ酸配列との少なくとも70％の同一性（好ましくは
少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも80％、さ
らに好ましくは少なくとも85％、さらに好ましくは少な
くとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好
ましくは少なくとも98％の同一性）を有するアミノ酸配
列を含むその他のＧＰＣＲをコードするアミノ酸配列を
包含する。
【００４１】本発明のポリペプチドは、本発明のアミノ
酸配列およびその変異体の断片も含む。適切な断片は、
少なくとも5、例えば少なくとも10、12、15または20ア
ミノ酸のサイズである。本発明のポリペプチドはさら
に、１つ又はそれ以上の（例えば、少なくとも2、3、5
または10）置換、欠失または挿入、例えば保存性置換を
含有するよう修飾され得る。これらの局面は、後の項で
考察される。
【００４２】本発明のヌクレオチド配列 「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書中で用い
る場合、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチ
ド配列、ならびにその変異体、相同体、断片、類似体お
よび誘導体（例えばその一部）を指す。ヌクレオチド配
列は、センス鎖を表わそうとまたはアンチセンス鎖を表
わそうと、二本鎖または一本鎖であり得るゲノムまたは
合成または組換え起源のものであり得るＤＮＡまたはＲ
ＮＡであり得る。
【００４３】好ましくは、「ヌクレオチド配列」という
用語は、ＤＮＡを意味する。さらに好ましくは、「ヌク
レオチド配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術の使用
により調製されたＤＮＡ（即ち、組換えＤＮＡ）を意味
する。好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配
列は、それ自体、それが同じくその天然環境にあるその
ネイティブプロモーターの制御下にある場合にその天然
環境中で本発明のネイティブヌクレオチドコード配列を
包含しない。参照を容易にするために、この好ましい実
施態様を「非ネイティブヌクレオチド配列」と我々は呼
んでいる。
【００４４】本発明のヌクレオチド配列は、その中に合
成または修飾化ヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレ
オチドに対する多数の異なる種類の修飾が当業界で知ら
れている。これらの例としては、メチルホスホネートお
よびホスホロチオエート主鎖、分子の３’および／また
は５’末端でのアクリジンまたはポリリジンの付加が挙
げられる。本発明の目的のために、本明細書中に記載さ
れたヌクレオチド配列は、当業界で利用可能なあらゆる
方法により修飾され得る、と理解されるべきである。こ
のような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のin vivo
活性または寿命を増強するために実行され得る。
【００４５】本発明は、本明細書中に示された配列と相
補的であるヌクレオチド配列、あるいはそのあらゆる変
異体、相同体、類似体、断片または誘導体も包含する。
配列がその断片と相補的である場合には、その配列は他
の生物体等における同様のコード配列を同定するための
プローブとして用いられ得る。本発明は、本明細書中に
示された配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配
列、あるいはそのあらゆる変異体、相同体、類似体、断
片または誘導体も包含する。
【００４６】本明細書中に示された配列と相補的である
配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、あるい
はそのあらゆる変異体、相同体、類似体、断片または誘
導体も包含する。「変異体」という用語は、本明細書中
に示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る配
列と相補的である配列も包含する。
【００４７】好ましくは、「変異体」という用語は、緊
縮条件（例えば、65℃および0.1 xSSC｛1 x SSC=0.15 M
ＮａＣｌ、0.015Ｎａ3クエン酸塩、ｐＨ7.0｝）下で本
明細書中に示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズ
し得る配列と相補的である配列を包含する。本発明は、
本発明のヌクレオチド配列（本明細書中に示されたもの
の相補配列を含む）とハイブリダイズし得るヌクレオチ
ド配列にも関する。
【００４８】本発明は、本発明のヌクレオチド配列（本
明細書中に示されたものの相補配列を含む）とハイブリ
ダイズし得る配列と相補的であるヌクレオチド配列にも
関する。中間〜最大緊縮の条件下で本発明に示されたヌ
クレオチド配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチ
ド配列も、本発明の範囲内である。
【００４９】好ましい局面では、本発明は本発明のヌク
レオチド配列、またはその相補体と緊縮条件（例えば、
65℃および0.1 x SSC）下でハイブリダイズし得るヌク
レオチド配列を包含する。代表的な核酸は、PFI-011タ
ンパク質をコードし、そして配列番号１でしめされるＤ
ＮＡ配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として
二者択一的に特性化され得る。好ましいのは、高緊縮条
件下で配列番号１で示される配列またはその相補体とハ
イブリダイズするPFI-011をコードするような配列であ
る。
【００５０】本発明は、緊縮条件下で、配列番号１で示
される配列またはその相補体の断片とハイブリダイズし
得る核酸配列を提供するのが有益である。好ましくは、
断片は、15〜50塩基長である。それは約25塩基長である
と有益である。本発明の好ましいポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列に関して「変異体」、「相同
体」、「類似体」、「誘導体」または「断片」という用
語は、結果的に生じるヌクレオチド配列がPFI-011受容
体活性を有し、好ましくは、配列番号１で示された配列
によりコードされるポリペプチドと同様に少なくとも生
物学的に活性であるという条件で、その配列からのまた
は配列への１つ（またはそれ以上）の核酸のあらゆる置
換、変異、修飾、交替、欠失または付加を含む。特に、
「相同体」という用語は、結果的に生じるヌクレオチド
配列がPFI-011ＧＰＣＲと同様の活性を有するポリペプ
チドをコードし得るという条件で、構造および／または
機能に関する相同を包含する。配列相同性に関しては、
配列番号２で示された配列との少なくとも70％、好まし
くは少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも80
％、さらに好ましくは少なくとも85％、さらに好ましく
は少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％の
相同が認められる。最も好ましくは、配列番号２で示さ
れたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列との少
なくとも98％の相同が存在する。配列相同性に関して
は、配列番号１で示されたヌクレオチド配列との少なく
とも70％、好ましくは少なくとも75％、さらに好ましく
は少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも85％、
さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少
なくとも95％の相同が認められる。最も好ましくは、配
列番号１で示されたヌクレオチド配列との少なくとも98
％の相同が存在する。
【００５１】前記のように、本発明は、PFI-011をコー
ドするＤＮＡ配列（好ましくはｃＤＮＡ配列）に関す
る。特に、本発明はPFI-011をコードするｃＤＮＡ配列
に関する。本発明は、配列番号１で示されるＤＮＡ配列
またはその対立遺伝子変異を包含するＤＮＡセグメント
にも関する。
【００５２】本発明は、前記のＤＮＡ配列またはその対
立遺伝子変異を組み入れられた宿主細胞中での発現によ
り産生されるポリペプチドにも関する。本発明は、配列
番号１で示されるＤＮＡ配列またはその対立遺伝子変異
を包含するＤＮＡを提供することにも関する。本発明
は、配列番号１で示されるＤＮＡ配列またはその対立遺
伝子変異を包含する非ネイティブＤＮＡにも関する。
【００５３】本発明の非常に好ましい局面は、配列番号
１で示されるＤＮＡ配列またはその対立遺伝子変異を包
含する組換えＤＮＡに関する。本発明のポリヌクレオチ
ドは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含
む。一連の異なるポリヌクレオチドは遺伝暗号の縮重の
結果として所定のアミノ酸配列をコードする、と理解さ
れる。
【００５４】本明細書中に記述されたアミノ酸配列の知
識により、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
および／またはゲノムクローンのような部分および全長
核酸配列を考案し得る。例えば、本発明のポリヌクレオ
チドは、本明細書中に示されたアミノ酸配列をコードす
る配列を標的化するよう意図されたプライマーを用いる
縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得られ
る。プライマーは、典型的には、多縮重位置を含有す
る。しかしながら、縮重を最小限にするために、１つの
トリプレットだけによりコードされるメチオニンのよう
なアミノ酸を含有する本明細書中に示されたアミノ酸配
列の領域をコードする配列が選択される。さらに、その
核酸がＰＣＲ法のための鋳型ＤＮＡとして用いられる生
物体中でのコドン使用法を考慮するよう配列が選択され
る。ＰＣＲは、既知の配列に対する単一配列（非縮重）
プライマーを用いた配列のクローニングのために用いら
れるものより低い緊縮条件で用いられる。
【００５５】発明のポリペプチド断片をコードするＰＣ
Ｒにより得られる核酸配列は、次に、ハイブリダイゼー
ションライブラリースクリーニング技法を用いてより大
きい配列を得るために用いられ得る。例えば、ＰＣＲク
ローンは、放射性原子で比しされ、その他の種、好まし
くはその他の哺乳類種からのｃＤＮＡまたはゲノムライ
ブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。ハ
イブリダイゼーション条件は、典型的には、中〜高緊縮
（例えば、0.03 M塩化ナトリウムおよび0.03 Mクエン酸
ナトリウム、約50℃〜60℃）の条件である。
【００５６】全部または一部のアミノ酸配列をコードす
る縮重核酸プローブも、他の種、好ましくは他の哺乳類
種からのｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリーを
プローブするために用いられる。しかしながら、さらな
るスクリーニング操作で用いるための単一配列を最初に
得るためにＰＣＲ法を実行するのが好ましい。本発明に
よれば、PFI-011、ポリペプチドの断片、融合タンパク
質またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチ
ド配列を用いて、適切な宿主細胞中でのPFI-011の発現
を指図する組換えＤＮＡ分子を生成し得る。遺伝暗号の
固有の縮重のために、実質的に同一のまたは機能的に等
価のアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を用
いて、PFI-011をクローン化し、発現し得る。当業者に
理解されるように、非天然コドンを保有するPFI-011コ
ードヌクレオチド配列を産生するのが有益であり得る。
特定の原核生物または真核生物宿主に選ばれるコドン
（Murray E et al.（1989）Nuc Acids Res 17:477-50
8）は、例えばPFI-011発現の速度を増大するよう、また
は望ましい特性、例えば天然配列から産生される転写体
より長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写体を産生する
よう選択され得る。
【００５７】前記の技法を用いて得られる本発明のポリ
ヌクレオチド配列は、前記の技法を用いてさらに別の相
同配列および変異体を得るために用いられ得る。それら
はさらに、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定
の宿主細胞に関するコドン選択を最適化するために、種
々の宿主細胞系における本発明のポリペプチドの発現に
おいて用いるために修飾され得る。その他の配列変化
は、制限酵素認識部位を導入するために、またはポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチドの特性また
は機能を変えるために、望まれ得る。
【００５８】本発明に従って用いられ得るPFI-011ポリ
ヌクレオチド配列の変更としては、同一のまたは機能的
等価のPFI-011をコードするポリヌクレオチドを生じる
異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換が挙げ
られる。タンパク質は、サイレント変化を生じ、機能的
等価PFI-011をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入また
は置換も有する。意図的アミノ酸置換は、PFI-011の生
物学的活性が保持される限りは、残基の極性、電荷、溶
解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における
類似性を基礎にして成され得る。例えば、負荷電アミノ
酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げら
れ；正荷電アミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが
挙げられ；そして同様の親水性値を有する非荷電極性ヘ
ッド基を有するアミノ酸としてはロイシン、イソロイシ
ン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グル
タミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよび
チロシンが挙げられる。
【００５９】PFI-011の対立遺伝子は本発明の範囲内に
含まれる。本明細書中で用いる場合、「対立遺伝子」ま
たは「対立遺伝子配列」とは、PFI-011の代替的形態で
ある。対立遺伝子は、突然変異、即ち核酸配列における
変化に起因し、一般に、その構造または機能が変更され
ることもされないこともあるｍＲＮＡまたはポリペプチ
ドの変更を生じる。あらゆる所定の遺伝子は、全く対立
遺伝子形態を有さないか、１つまたは多数の対立遺伝子
形態を有し得る。対立遺伝子を生じる共通の突然変異的
変化は、一般に、アミノ酸の欠失、付加または置換の結
果である。これらの種類の変化の各々は、単独で、また
はその他のものと所定の配列内で１回またはそれ以上組
み合わされて、起こり得る。
【００６０】本発明のヌクレオチド配列は、種々の理
由、例えば遺伝子生成物のクローニング、プロセッシン
グおよび／または発現を修飾する変更（これらに限定さ
れない）のためにPFI-011コード配列を変えるために工
学処理され得る。例えば、突然変異は、当業界で周知の
技法、例えば新制限部位を挿入するための、グリコシル
化パターンを変更するための、またはコドン選択を変え
るための特定部位の突然変異誘発を用いて導入され得
る。
【００６１】本発明のポリヌクレオチドは、プライマ
ー、例えばＰＣＲプライマー、代替的増幅反応のための
プライマー、例えば放射性または非放射性標識を用いた
慣用的手段により明示標識を用いて標識されるプローブ
を製造するために用いられ得るか、あるいはポリヌクレ
オチドは、ベクター中でクローン化される。このような
プライマー、プローブまたはその他の断片は、少なくと
も15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくとも25、
30または40ヌクレオチド長であり、そして本明細書中で
用いられるような本発明のポリヌクレオチドという用語
によっても包含され得る。
【００６２】本発明のポリヌクレオチドまたはプライマ
ーは、明示標識を保有し得る。適切な標識としては、放
射性同位体、例えば32Ｐまたは35Ｓ、酵素標識、あるい
はその他のタンパク質、例えばビオチンが挙げられる。
このような標識は、本発明のポリヌクレオチドまたはプ
ライマーに付加され、そして当業界で既知の技法を用い
て検出され得る。
【００６３】本発明のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ
ポリヌクレオチドおよびプライマーは、組換え的に、合
成的にまたは当業者が利用可能なあらゆる手段により生
成され得る。それらは、標準技法によりクローン化もさ
れ得る。概して、プライマーは、一度に一ヌクレオチド
での所望の核酸配列の段階的製造を含めた合成的手段に
より産生される。自動技法を用いてこれを成し遂げるた
めの技術は、当業界で容易に利用可能である。
【００６４】組換え手段を用いて、例えばＰＣＲクロー
ニング技術を用いて、より長いポリヌクレオチドが一般
に生成される。これは、クローン化されるのが望ましい
ヌクレオチド配列の領域に対するプライマー対（例え
ば、約15〜30ヌクレオチドの）を作製して、プライマー
を真核生物または原核生物細胞から得られたｍＲＮＡま
たはｃＤＮＡと接触させて、所望の領域の増幅を成し遂
げる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実行し、増幅断片
を単離して（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を
精製することにより）、そして増幅ＤＮＡを回収する。
プライマーは、増幅ＤＮＡが適切なクローニングベクタ
ー中にクローン化され得るように、適切な制限酵素認識
部位を含有するよう設計され得る。
【００６５】ＤＮＡ分子は修飾されて、細胞内安定性お
よび半減期を増大し得る。考え得る修飾としては、分子
の５’および／または３’末端のフランキング配列の付
加、あるいは分子の主鎖内のホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの
使用が挙げられるが、これらに限定されない。前記のよ
うに、本発明は、配列番号１で示される配列の全部また
は一部、あるいはその対立遺伝子変異とハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列にも関する。これらのヌクレオ
チド配列は、PFI-011発現を修飾するためのアンチセン
ス技法に用いられ得る。あるいは、これらの配列（また
はその一部）は、プローブとして、あるいはＰＣＲプラ
イマーとして用いられる場合にはこのような配列の全部
または一部を増幅するために用いられ得る。
【００６６】組換えＤＮＡ配列の他に、ゲノム配列は、
薬剤発見の場面で有益でもある。その翻訳化タンパク質
を阻害するというよりむしろ、特定のアイソフォームの
ｍＲＮＡ転写を阻害することが有益であり得る。これ
は、スプライス変異体が存在する場合に、そしてそれら
の異なるスプライス変異体が異なるプロモーターから転
写され得る場合に、PFI-011に関して言える。
【００６７】本発明の別の実用性は、ＤＮＡ配列は、一
旦分かれば、アイソフォームまたはスプライス変異体を
特異的に検出するための検定を設計するのに必要な情報
を提供することである。アイソフォーム特異的ＰＣＲプ
ライマー対は、アイソフォームまたはスプライス変異体
の特定のＤＮＡ配列の知識に完全によっている検定の単
なる一例である。このような検定は、各アイソフォーム
の組織分布および生物学的関連性を特定の疾患状態にア
クセスするためのアイソフォームに関するｍＲＮＡの検
出を可能にする。特異的PFI-011アイソフォームが特定
の疾患状態と関連することが示された場合には、本発明
は、アイソフォームｍＲＮＡの存在を検出するための診
断検定の設計に有益である。
【００６８】生物学的標本中のPFI-011受容体をコード
するヌクレオチド配列の異常レベルは、染色体異常、例
えば核酸の欠失または突然変異を反映し得る。したがっ
て、PFI-011受容体をコードするヌクレオチド配列は、P
FI-011をコードする遺伝子における欠失、突然変異また
は染色体転座のような染色体異常を検出するために診断
的に用いられ得る。PFI-011遺伝子発現はこのような疾
患状態で変更され得るか、またはPFI-011をコードする
遺伝子の領域に存在する染色体異常が認められ得る。
【００６９】本発明の代替的実施態様では、PFI-011の
コード配列は、当業界で周知の化学的方法を用いて、全
体的にまたは部分的に、合成され得る（Caruthers MH e
t al（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T
et al（1980）Nuc Acids ResSymp Ser 225-232参照）。 天然 本明細書中で用いる場合、「天然」とは、天然に見出さ
れるアミノ酸配列を有するPFI-011を指す。
【００７０】単離／精製 本明細書中で用いる場合、「単離」および「精製」とい
う用語は、それらの天然環境から取り出され、そしてそ
れらが天然に会合される少なくとも１つのその他の構成
成分から単離または精製される核酸またはアミノ酸配列
を指す。 生物学的に活性 本明細書中で用いる場合、「生物学的に活性」とは、天
然PFI-011の同様の構造的機能（しかし必ずしも同程度
とは限らない）、および／または同様の調節機能（しか
し必ずしも同程度とは限らない）、および／または同様
の生化学的機能（しかし必ずしも同程度とは限らな
い）、および／または免疫学的活性（しかし必ずしも同
程度とは限らない）を有する本発明のPFI-011−例えば
組換えPFI-011−を指す。特に、本発明のPFI-011はＧＰ
ＣＲとして作用する能力を有し、これは本発明のPFI-01
1ポリペプチドの特徴的活性の１つである。
【００７１】免疫学的活性 本明細書中で用いる場合、「免疫学的活性」は、適切な
動物または細胞中での特異的免疫応答を誘導する、そし
て特異的抗体と結合する天然、組換えまたは合成PFI-01
1あるいはそのあらゆるオリゴペプチドの能力と定義さ
れる。 誘導体 「誘導体」という用語は、アミノ酸配列に関連して本明
細書中で用いられる場合、PFI-011の化学的修飾を含
む。このような修飾の例は、アルキル、アシルまたはア
ミノ基による水素の置換である。
【００７２】類似体 「類似体」という用語は、アミノ酸配列（またはそのコ
ード配列）と関連して本明細書中で用いられる場合、PF
I-011またはそのコード配列の化学的修飾を含む。この
ような修飾の例は、非天然アミノ酸残基（例えば、Ｄ−
アミノ酸、β−アラニン、ヒドロキシプロリン）または
非天然ヌクレオチド（例えば、イノシン、デメチル−シ
チジン）による天然アミノ酸残基または天然ヌクレオチ
ドの置換である。
【００７３】欠失 本明細書中で用いる場合、「欠失」は、それぞれ１つ又
はそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在し
ないヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化と定
義される。 挿入／付加 本明細書中で用いる場合、「挿入」または「付加」は、
天然PFI-011と比較した場合に、それぞれ１つ又はそれ
以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加を生じた
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化である。
【００７４】置換 本明細書中で用いる場合、「置換」は、それぞれ異なる
ヌクレオチドまたはアミノ酸による１つ又はそれ以上の
ヌクレオチドまたはアミノ酸の取り換えに起因する。 相同体 本発明のヌクレオチド配列および本発明のアミノ酸配列
に関する「相同体」という用語は、配列の対立遺伝子変
異と同義語であり得る。
【００７５】特に、「相同性」という用語は、本明細書
中で用いる場合、「同一性」という用語と同一とみな
す。ここで、本発明のヌクレオチド配列および本発明の
アミノ酸配列に関する配列相同性は、他の配列がヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列と少なくとも70％の同一性を
有するか否かを見るための、いずれか１つまたはそれ以
上の配列の別の配列との簡単な「眼球」比較（即ち厳密
な比較）により確定され得る。相対的配列相同性（即ち
配列同一性）は、２またはそれ以上の配列間の相同性パ
ーセンテージ（％）を算出し得る市販のコンピューター
プログラムによっても確定され得る。このようなコンピ
ュータープログラムの典型例は、FASTAまたはBLASTであ
る。
【００７６】相同性パーセンテージ（％）は、連続配列
全面に亘って算出され、即ち、ある配列は他の配列と一
列に並べられ、ある配列中の各アミノ酸が他の配列中の
対応するアミノ酸と、同時に一残基ずつ、直接比較され
る。これは、「非ギャップ化」アラインメントと呼ばれ
る。典型的には、このような非ギャップ化アラインメン
トは、相対的に短数の残基（例えば、50未満の連続アミ
ノ酸）全面のみで実行される。
【００７７】これは非常に簡単且つ着実な方法である
が、しかし例えば、そうでなければ同一対の配列におい
て、一挿入または欠失がその後のアミノ酸残基をアライ
ンメントから取り除かせ、したがって全体的アラインメ
ントが実行される場合に、相同性％の大きい低減を引き
起こす可能性がある、ということを考慮に入れることが
できない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体
的相同スコアを不当に不利な立場に置くことなく、考え
得る挿入および欠失を考慮に入れる最適アラインメント
を生成するよう意図される。これは、局所相同性を最大
にしようとして配列アラインメント中に「ギャップ」を
挿入することにより、成し遂げられる。
【００７８】しかしながら、これらのより複雑な方法
は、同一数の同一アミノ酸に関して、できるだけ少数の
ギャップを有する配列アラインメント−２つの比較配列
間のより高い関連性を反映する−が多数のギャップを有
するものより高いスコアを達成するように、アラインメ
ント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」
を割り当てる。ギャップの存在に関して相対的に高いコ
ストを、そしてギャップ中の各々のその後の残基に関し
てより小さいペナルティを負荷する「擬似ギャップコス
ト」が、典型的には、用いられる。高ギャップペナルテ
ィは、もちろん、より少数のギャップを有する最適化ア
ラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプ
ログラムは、ギャップペナルティを修正させる。しかし
ながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを用
いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例え
ば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（下記参照）を
用いる場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップ
ペナルティは、ギャップに関しては-12そして各延長に
関しては-4である。
【００７９】したがって、最大相同性％の算出は、先
ず、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アラインメ
ントの生成を要する。このようなアラインメントを実行
するための適切なコンピュータープログラムは、GCG Wi
sconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsi
n, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Re
search 12:387）である。配列比較を実施し得るその他
のソフトウェアの例としては、BLASTパッケージ（Ausub
el et al., 1999同書−第18章参照）、FASTA（Altschul
et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）および比較
道具のGENEWORKSセットが挙げられるが、これらに限定
されない。BLASTとFASTAはともに、オフラインおよびオ
ンライン探索として利用可能である（Ausubel et al.,
1999同書、pp7-58〜7-60参照）。しかしながら、いくつ
かの用途に関しては、GCG Bestfitプログラムを用いる
のが好ましい。
【００８０】最終相同性％は、いくつかの場合には、同
一性に換算して測定され得るが、しかしアラインメント
工程それ自体は、典型的には、オールオアナッシング対
比較を基礎にしているわけではない。その代わり、化学
的類似性または進化距離を基礎にした各対方式比較にス
コアを割り当てる基準化類似性スコアマトリックスが一
般に用いられる。一般的に用いられるこのようなマトリ
ックスの例は、BLOSUM62マトリックス−BLAST組のプロ
グラムに関するデフォルトマトリックス−である。GCG
Wiscnsinプログラムは一般に、公開デフォルト値、また
は供給される場合には慣習的記号比較のいずれかを用い
る（さらなる詳細に関しては、ユーザーマニュアル参
照）。GCGパッケージに関しては公開デフォルト値を用
いるのが、あるいは他のソフトウェアの場合には、BLOS
UM62のようなデフォルトマトリックスを用いるのが好ま
しい。
【００８１】ソフトウェアが最適アラインメントを生成
したならば、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出
できる。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部
としてこれをおこない、数値結果を生じる。前記のよう
に、いくつかの用途に関しては、配列相同性（または同
一性）は、あらゆる適切な相同性算法を用いて、例えば
デフォルトパラメーターを用いて、確定され得る。配列
データベースの類似性探索における基本的論点の考察に
関しては、Altschul et al.,（1994）Nature Genetics
6:119-129を参照していただきたい。いくつかの用途に
関しては、BLAST算法が、デフォルト値に対するパラメ
ーター組を用いて、使用される。BLAST算法は、http://
www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html.に詳細に説
明されている。「実質的相同性」は、BLASTにより査定
される場合には、少なくとも約e-7、好ましくは少なく
とも約e-9，最も好ましくはe-10またはそれ以下のEXPEC
T値と適合する配列と一致するのが有益である。BLAST探
索におけるEXPECTに関するデフォルト閾値は、通常は10
である。
【００８２】配列同一性を確定する場合にはギャップペ
ナルティが用いられるべきであり、その場合、好ましく
は以下のパラメーターが用いられる：
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】２つの配列間の同一性および類似性を確定
するためのその他のコンピュータープログラム法として
は、GCGプログラムパッケージ（Devereux et al., 198
4, Nucleic Acids Research 12:387）およびFASTA（Ats
chul et al., 1990, J MolecBiol, 403-410）が挙げら
れるが、これらに限定されない。 プロフィール・ヒドゥンＭＡＲＫＯＶモデル ヒドゥンＭａｒｋｏｖモデル（hidden Markov models
(HMMs))を使用して確率論的な方法で配列のファミリー
のプロフィールをモデル化することができる（Durbin,
R., Eddy, S., Krogh, A. and Mitchisow, G. (1998),
Biological Sequence Analysis : Probabilistic model
s of proteins and nucleic acids ; Cambridge Univer
sity Press, Cambridge, UK. ; Eddy, S.R. (1998), Pr
ofile hidden Markov models ; Bioinformatics, 14 :
755-763)。HMMsは会話認識における使用のために元々開
発され、そしてそれ以来、一定レンジの信号処理適用の
ために使用されてきた。信号は、有限セットからの要素
の配列としてモデル化される。会話認識においては、こ
のセットは、言語を作る音から成り、そしてその目的
は、それらの音がどの言葉を表すかを演澤する。特定の
ファミリーからのタンパク質配列は、同じ方法において
考えられることができる。上記配列は、２０アミノ酸の
セットからの一連の要素であり、そしてその要求は、上
記配列がどのタンパク質ファミリーを表すかを決定する
ことである。
【００８６】プロフィールHMMsは、既知のファミリー・
メンバーの多配列整列から行われることができる。この
整列における各位置は、“マッチ”、“挿入”又は“欠
失”である状態に対応する。それ故、全整列は、トラン
ジション確率に結び付けられる相互連結状態の線状鎖、
又は通路として考えられることができる。これらの状態
は、（置換データと共に上記整列内に見られる残基のレ
ンジ、及び上記開始整列内の制限されたデータに関して
正すための偽カウント（pseudo count)”法に基づい
て）異なる確率をもって、アミノ酸残基を“放出（emi
t）”する。上記モデルにマッチングする特定の配列の
確率は、状態間のトランジション確率と、上記アミノ酸
配列についての放出確率との組合せとして計算されるこ
とができる。
【００８７】一旦、既知のファミリー・メンバーの良好
な整列が得られれば、HMMsは、（プロフィールに比較し
て）僅かな手動介在をもって築されることができ、そし
て遠い同族体を検出するためのより敏感な方法である。
Ｐｆａｍデータベースは、多くのタンパク質ファミリー
のためのプロフィールMHHsのライブラリーである（Bate
man, A., Birney, E., Durbin, R., Eddy, S.R., Finn,
R.D. and Sonhammer,E.L.L. (1999), Pfam 3.1 : 1313
multiple alignments and profile HMMs match the ma
jority of proteins, Nucleic Acids Research, 27 : 2
60-262)。それは、注意深く編集された種整列と反復手
順により自動作製されたモデルから構築されたモデルを
含む。上記方法の完全な自動化は、作られるエラーが速
く増幅されるであろうという欠点をもつ。
【００８８】ポリペプチド変異体および誘導体 本発明のアミノ酸配列に関して「変異体」または「誘導
体」という用語は、結果的に生じるアミノ酸配列がPFI-
011活性を有し、好ましくは、配列番号２に示されたポ
リペプチドと少なくとも同一の活性を有するという条件
で、その配列からのまたは配列への１つ（またはそれ以
上）のアミノ酸のあらゆる置換、変異、修飾、交替、欠
失または付加を含む。
【００８９】本発明の配列は、本発明で用いるために修
飾され得る。典型的には、配列のPFI-011活性を保持す
る修飾が成される。アミノ酸置換は、例えば1、2または
3〜10、20または30置換から作製され得るが、但し、修
飾化配列はPFI-011活性を保持する。アミノ酸置換は、
例えば治療的投与ポリペプチドの血漿半減期を増大する
ための、非天然類似体の使用を含み得る。
【００９０】保存的置換は、例えば以下の表に従って成
され得る。第二列の、そして好ましくは第三列の同一行
における同一ブロック中のアミノ酸は、互いに置換され
得る：
【００９１】
【表３】
【００９２】前記のように、本発明のタンパク質は典型
的には、例えば前記のような組換え手段により、および
／または固相合成のような当業者に周知の技法を用いる
合成手段により、製造される。このような配列の変異体
および誘導体としては融合タンパク質が挙げられるが、
この場合、融合タンパク質は、別のアミノ酸配列に（直
接または間接的に）結合される本発明のアミノ酸配列を
少なくとも包含する。これらの他のアミノ酸配列−時と
して融合タンパク質相手と呼ばれる−は、典型的には有
利な機能−例えば本発明のアミノ酸配列の抽出および精
製を助けるための−を付与する。融合タンパク質相手の
例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）、6xHis、GAL4（ＤＮＡ結合および／または
転写活性ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げ
られる。融合タンパク質相手と本発明のタンパク質配列
との間に、後者の除去を可能にするために、タンパク質
分解的開裂部位を含有するのも便利である。好ましく
は、融合タンパク質相手は、本発明のタンパク質の機能
を妨げない。
【００９３】ポリヌクレオチド変異体および誘導体 本発明のヌクレオチド配列に関して「変異体」または
「誘導体」という用語は、結果的に生じるヌクレオチド
配列がPFI-011活性を有し、好ましくは、配列番号２に
示された配列と少なくとも同一の活性を有するポリペプ
チドをコードするという条件で、その配列からのまたは
配列への１つ（またはそれ以上）の核酸のあらゆる置
換、変異、修飾、交替、欠失または付加を含む。
【００９４】前記のように、配列相同性に関しては、配
列番号１に示されたヌクレオチド配列との少なくとも70
％、好ましくは少なくとも75％、さらに好ましくは少な
くとも80％、さらに好ましくは少なくとも85％、さらに
好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくと
も95％の相同が認められる。最も好ましくは、配列番号
１で示されたヌクレオチド配列との少なくとも98％の相
同が存在する。ヌクレオチド相同性比較は、前記と同様
に実行され得る。いくつかの用途に関しては、好ましい
配列比較プログラムは、前記のGCG Wiscnsin Bestfit
プログラムである。デフォルトスコアリングマトリック
スは、各同一ヌクレオチドに関しては10の適正値を、そ
して各不適正に関しては-9の値を有する。各ヌクレオチ
ドに関して、デフォルトギャップ作製ペナルティは-5
0、そしてデフォルトギャップ延長ペナルティは-3であ
る。
【００９５】本明細書中で用いる場合、「変異体」、
「相同体」、「断片」および「誘導体」という用語は、
配列の対立遺伝子変異を包含する。「変異体」という用
語は、本明細書中に示されたヌクレオチド配列とハイブ
リダイズし得る配列と相補的である配列も包含する。 ハイブリダイゼーション 「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書中
で用いる場合、「核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と連
結する方法」（Coombs J（1994）Dictionary of Biotec
hnology, Stockton Press, New York, NY, USA）、なら
びにDieffenbach CW and GS Dveksler（1995, PCR Prim
er, a Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Press,
Plainview, NY, USA）に記載されているようなＰＣＲ技
法で実行されるような増幅方法を含む。
【００９６】ハイブリダイゼーション条件は、Berger a
nd Kimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techni
ques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Pr
ess,San Diego, CA, USA）に教示されているような核酸
結合複合体の融点（Ｔｍ）を基礎にし、以下で説明され
るような限定「緊縮」を付与する。ハイブリダイゼーシ
ョンの緊縮は、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件
を示す。このような条件は、当業者には明らかである。
当業者には既知であるように、ハイブリッドの安定性
は、配列相同性の1％の低減につき約1〜1.5℃低減する
ハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。概して、ハ
イブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温
度の一関数である。典型的には、ハイブリダイゼーショ
ン反応は、より高い緊縮の条件下で実行され、その後種
々の緊縮の洗浄が成される。
【００９７】本明細書中で用いる場合、高緊縮とは、1
MＮａ+で65〜68℃で安定ハイブリッドを形成する核酸配
列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指
す。最大緊縮は、典型的には、約Ｔｍ−5℃（プローブ
のＴｍより5℃低い温度）で起こる。高緊縮は、プロー
ブのＴｍより約5℃〜10℃低い温度で起こる。高緊縮条
件は、例えば、6 x SSC、5 x Denhardt液、1％SDS（ド
デシル硫酸ナトリウム）、0.1Ｎａ+ピロリン酸塩および
非特異的競合物としての0.1 mg/ml変性サケ精子ＤＮＡ
を含有する水性溶液中でのハイブリダイゼーションによ
り提供され得る。ハイブリダイゼーション後、高緊縮洗
浄が数工程で成され、最終洗浄（約30分間）は0.2〜0.1
x SDS、0.1％ SDS中でハイブリダイゼーション温度で
成される。
【００９８】中等度または中間緊縮は、典型的には、プ
ローブのＴｍより約10℃〜20℃低い温度で起こる。低緊
縮は、典型的には、プローブのＴｍより約20℃〜25℃低
い温度で起こる。当業者に理解されるように、最大緊縮
ハイブリダイゼーションは同一ポリヌクレオチド配列を
同定または検出するために用いられ得るが、一方、中間
（または低）緊縮ハイブリダイゼーションは同様または
関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために
用いられ得る。
【００９９】中等度緊縮とは、前記の溶液中での、しか
し約60〜62℃でのハイブリダイゼーションと等価の条件
を指す。その場合、最終洗浄は、1 x SSC、0.1％ SDS中
でハイブリダイゼーション温度で実行される。低緊縮と
は、前記の溶液中での、しかし約50〜52℃でのハイブリ
ダイゼーションと等価の条件を指す。その場合、最終洗
浄は、2 x SSC、0.1％ SDS中でハイブリダイゼーション
温度で実行される。
【０１００】これらの条件は、種々の緩衝液、例えばホ
ルムアミドベースの緩衝液および温度を用いて適合され
そして繰り返される、と理解される。Denhardt溶液およ
びＳＳＣは、その他の適切なハイブリダイゼーション緩
衝液（例えば、Sambrook, etal., eds.（1989）Molecul
ar Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York, NY, USAまたはAusubel,
et al., eds,（1990）Current Protocols in Molecula
r Biology, John Wiley & Sond, Inc.参照）と同様に、
当業者には周知である。最適ハイブリダイゼーション条
件は、プローブの長さおよびＧＣ含量もある役割を演じ
るので、経験的に確定されねばならない。
【０１０１】本明細書中に示されたヌクレオチド配列ま
たはそれらの相補体と選択的にハイブリダイズし得る本
発明のポリヌクレオチドは、一般に、少なくとも20、好
ましくは少なくとも25または30、例えば少なくとも40、
60または100あるいはそれ以上の連続ヌクレオチドの領
域の全面において本明細書中に示された対応するヌクレ
オチド配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも75
％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましく
は少なくとも85％、さらに好ましくは少なくとも90％、
さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少な
くとも98％相同である。
【０１０２】「選択的にハイブリダイズ可能」という用
語は、プローブとして用いられるポリヌクレオチドが、
本発明の標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドより
有意に上のレベルでプローブとハイブリダイズすること
が見出される条件下で用いられることを意味する。バッ
クグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばスクリ
ーニング中のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー
中に存在する他のポリヌクレオチドのために起こり得
る。この場合、バックグラウンドは、標的ＤＮＡを用い
て観察される特異的相互作用の強度の10倍未満、好まし
くは100倍未満である、プローブとライブラリーの非特
異的ＤＮＡ成員との間の相互作用により生成される信号
のレベルを暗示する。相互作用の強度は、例えば、プロ
ーブを、例えば32Ｐで放射能標識することにより測定さ
れ得る。
【０１０３】好ましい局面では、本発明は、緊縮条件
（例えば、65℃および0.1 x SSC｛1 xSSC=0.15 MＮａＣ
ｌ、0.015 MＮａ3クエン酸塩、ｐＨ7.0｝）下で本発明
のヌクレオチド配列のいずれか１つまたはそれ以上とハ
イブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。本発
明のポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本の両方
の鎖は、別々に、または組合せて、本発明に包含され
る。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合には、そのポ
リヌクレオチドの相補的配列も本発明の範囲内に含まれ
ると理解されるべきである。
【０１０４】本発明の配列と100％相同であるというわ
けではないが、しかし本発明の範囲内であるポリヌクレ
オチドは、多数の方法で得られる。本明細書中に記載さ
れた配列のその他の変異体は、例えば一連の個体、例え
ば異なる集団からの個体から作製されるＤＮＡライブラ
リーをプロービングすることにより得られる。さらに、
その他のウイルス／細菌、または細胞相同体、特に哺乳
類細胞（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、齧歯類お
よび霊長類細胞）中に見出される細胞相同体が得られ、
このような相同体およびその断片は、概して、配列番号
１で示される配列と選択的にハイブリダイズし得る。こ
のような配列は、その他の動物種から作製されるｃＤＮ
Ａライブラリー、またはそれから得られるゲノムＤＮＡ
ライブラリーをプロービングし、そしてこのようなライ
ブラリーを、中〜高緊縮の条件下で配列番号１で示され
る配列の全部または一部を包含するプローブでプロービ
ングすることにより得られる。同様の考え方は、本発明
のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体およ
び対立遺伝子変異種を得るために適用する。
【０１０５】変異体および株／種相同体は、本発明の配
列ないの保存アミノ酸配列をコードする変異体および相
同体ないの配列を標的化するよう意図されたプライマー
を用いる縮重ＰＣＲを用いても得られる。保存配列は、
例えば、いくつかの変異体／相同体からのアミノ酸配列
を並べることにより予測され得る。配列アラインメント
は、当業界で既知のコンピューターソフトウェアを用い
て実行され得る。例えば、GCG Wisconsin PileUpプログ
ラムが広範に用いられる。
【０１０６】縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは１つ
又はそれ以上の縮重位置を含有し、既知の配列に対する
単一配列プライマーを有する配列をクローニングするた
めに用いられるものより低い緊縮条件で用いられる。あ
るいは、このようなポリヌクレオチドは、特性化配列の
特定部位の突然変異誘発により得られる。これは、例え
ばポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細
胞に関するコドン選択を最適化するための配列にサイレ
ントコドン変化が必要とされる場合に有用であり得る。
その他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するため
に、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドの特性または機能を変えるために、望まれ得る。
【０１０７】本発明のポリヌクレオチドは、プライマ
ー、例えば例えばＰＣＲプライマー、代替的増幅反応の
ためのプライマー、例えば放射性または非放射性標識を
用いた慣用的手段により明示標識を用いて標識されるプ
ローブを製造するために用いられ得るか、あるいはポリ
ヌクレオチドは、ベクター中でクローン化される。この
ようなプライマー、プローブまたはその他の断片は、少
なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくと
も25、30または40ヌクレオチド長であり、そして本明細
書中で用いられるような本発明のポリヌクレオチドとい
う用語によっても包含され得る。
【０１０８】本発明のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ
ポリヌクレオチドおよびプローブは、組換え的に、合成
的にまたは当業者が利用可能なあらゆる手段により生成
され得る。それらは、標準技法によりクローン化もされ
得る。概して、プライマーは、一度に一ヌクレオチドで
の所望の核酸配列の段階的製造を含めた合成的手段によ
り産生される。自動技法を用いてこれを成し遂げるため
の技術は、当業界で容易に利用可能である。
【０１０９】組換え手段を用いて、例えばＰＣＲクロー
ニング技術を用いて、より長いポリヌクレオチドが一般
に生成される。これは、クローン化されるのが望ましい
配列の領域に側面を接するプライマー対（例えば、約15
〜30ヌクレオチドの）を作製して、プライマーを動物ま
たはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接
触させて、所望の領域の増幅を成し遂げる条件下でポリ
メラーゼ連鎖反応を実行し、増幅断片を単離して（例え
ば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによ
り）、そして増幅ＤＮＡを回収する。プライマーは、増
幅ＤＮＡが適切なクローニングベクター中にクローン化
され得るように、適切な制限酵素認識部位を含有するよ
う設計され得る。
【０１１０】調節配列 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、例えば選定
宿主細胞によりコード配列の発現を提供し得る調節配列
と操作可能的に連結される。例として、本発明は、この
ような調節配列と操作可能的に連結される本発明のポリ
ヌクレオチドを包含するベクターを包含する。即ちベク
ターは発現ベクターである。
【０１１１】「操作可能的に連結される」という用語
は、記載された構成成分がそれらの意図された方法で機
能させられ得る関係である並置状態を指す。コード配列
と「操作可能的に連結される」調節配列は、コード配列
の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような
方法で結紮される。「調節配列」という用語は、プロモ
ーターおよびエンハンサーならびにその他の発現調節信
号を含む。
【０１１２】「プロモーター」という用語は、当業界で
普通の意味で、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位の意
味で用いられる。本発明のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの発現増強は、異種調節領域、例えば発
現を、そして所望により選定発現宿主からの当該タンパ
ク質の分泌レベルを増強するのに、および／または本発
明のポリペプチドの発現の誘導性制御を提供するのに役
立つプロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター
領域の選択によっても成し遂げられ得る。
【０１１３】好ましくは、本発明のヌクレオチド配列
は、少なくとも１つのプロモーターと操作可能的に連結
され得る。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子由
来のプロモーターの他に、他のプロモーターを用いて、
本発明のポリペプチドの発現を指図し得る。プロモータ
ーは、所望の発現宿主中での本発明のポリペプチドの発
現を指図する場合にその有効性に関して選択され得る。
【０１１４】別の実施態様では、構成的プロモーター
は、本発明の所望のポリペプチドの発現を指図するため
に選択され得る。このような発現構築物は、それが誘導
基質を含有する培地上の発現宿主を培養する必要性をな
くするため、付加的利点を提供し得る。適切なプロモー
ターの例は、哺乳類計におけるLTR、SV40およびCMV；細
菌系における大腸菌lacまたはtrp；昆虫系におけるバキ
ュウロウイルスポリヘドロンプロモーター（polh）なら
びに真核生物および原核生物細胞またはそれレアのウイ
ルスにおける発現を制御することが知られているその他
のプロモーターである。
【０１１５】真菌発現宿主中で用いるために好ましい強
力な構成性および／または誘導性プロモーターの例は、
キシラナーゼ（xlnA）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンセタ
ーゼ、サブユニット９（oliC）、トリオースホスフェー
トイソメラーゼ（tpi）、アルコールデヒドロゲナーゼ
（AdhA）、α−アミラーゼ（amy）、アミログルコシダ
ーゼ（AG−glaA遺伝子から）、アセトアミダーゼ（amd
S）およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（gpd）プロモーターに関する真菌遺伝子
から得られるものである。
【０１１６】強力な酵母菌プロモーターの例は、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセ
レートキナーゼおよびトリオースホスフェートイソメラ
ーゼに関する遺伝子から得られるものである。強力な細
菌プロモーターの例は、α−アミラーゼおよびSP02プロ
モーターならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロ
モーターである。
【０１１７】ハイブリッドプロモーターも、発現構築物
の誘導性調節を改良するために用いられ得る。プロモー
ターは、適切な宿主中での発現を保証し、または増大す
るための特徴を付加的に含み得る。例えば、特徴は、Pr
ibnowボックスまたはTATAボックスのような保存領域で
あり得る。プロモーターは、本発明のヌクレオチド配列
の発現のレベルに影響を及ぼすために（例えば、保持
し、増強し、または低減するために）他の配列を含有す
ることさえある。例えば、適切なその他の配列として
は、Sh1−イントロンまたはADHイントロンが挙げられ
る。その他の配列としては、誘導性素子−例えば温度、
化学物質、光またはストレス誘導性素子が挙げられる。
さらに、転写または翻訳を増強するための適切な素子が
存在し得る。後者の素子の例は、TMV５’シグナル配列
（Sleat, Gene 217 [1987]217-225;およびDawson,Plant
Mol. Biol.23 [1993]97参照）である。
【０１１８】発現ベクターは、発現を増幅するためにプ
ロモーターに作用する配列も含有する。例えば、SV40、
CMVおよびポリオーマシス作用素子（エンハンサー）な
らびに選択可能マーカーは、選択のための表現型特質
（例えば、哺乳類細胞に関してはジヒドロフォレートレ
ダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌に関
してはアンピシリン／テトラサイクリン耐性）を提供し
得る。適切なプロモーターおよび選択マーカーを含有す
る適切なベクターの選択は、当業者のレベル内で十分で
ある。
【０１１９】構築物 「構築物」−例えば「接合体」、「カセット」および
「ハイブリッド」という用語と同義語である−という用
語は、プロモーターと直接または間接的に結合した本発
明のヌクレオチド配列を含む。間接結合の例は、本発明
のプロモーターおよびヌクレオチド配列に介在する適切
なスペーサー基、例えばイントロン配列、例えばSh1−
イントロンまたはADHイントロンの提供である。同じこ
とは、直接または間接的結合を含む本発明に関して「融
合化」という用語に対しても言える。各々の場合、用語
は、それらがその天然環境にともに存在する場合、普通
では野生型遺伝子プロモーターと会合するタンパク質を
コードするヌクレオチド配列の天然の組合せを包含しな
い。
【０１２０】構築物は、例えば哺乳類、酵母菌、昆虫、
真菌または細菌細胞中での遺伝子構築物の選択を可能に
するマーカーを含有または発現することさえある。例え
ば、G418，ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイ
シンおよびゲンタマイシンに対する抗生物質耐性を提供
するもののような、用いられ得る種々のマーカーが存在
する。
【０１２１】好ましくは、本発明の構築物は、プロモー
ターと操作可能的に連結される本発明のヌクレオチド配
列を少なくとも包含する。 ベクター 「ベクター」という用語は、発現ベクターおよび形質転
換ベクターならびにシャトルベクターを含む。
【０１２２】「発現ベクター」という用語は、in vivo
またはin vitro発現が可能な構築物を意味する。「形質
転換ベクター」という用語は、ある実体から別の実体に
移入され得る構築物を意味する−これは同一種であるか
または異なる種であり得る。構築物がある種から別の種
に−例えばウイルスベクター、例えばMMLVまたはFIVか
らヒトまたは哺乳類一次細胞または細胞系統に移入され
得る場合には、形質転換ベクターは時として「シャトル
ベクター」と呼ばれる。
【０１２３】非常に種々の発現系が、異なる宿主中で用
いられ得る。例えば、エピソーム、染色体およびウイル
ス由来系（例えば細菌プラスミド、バクテリオファー
ジ、パポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルスおよびレトロウイルス由来のベクタ
ー）。ＤＮＡ配列は、種々の技法によりベクター中に挿
入され得る。概して、ＤＮＡ配列は、当業界で既知の手
法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入さ
れ、当業者の範囲内であるとみなされる。発現ベクター
中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指図する適切な制御
配列（即ち、プロモーター）と操作可能的に連結され
る。
【０１２４】本発明のベクターは、下記のように適切な
宿主中に形質転換されて、本発明のポリペプチドの発現
を提供し得る。したがって、さらに別の局面では、本発
明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、ポリ
ペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現
を提供するための条件下で前記のように発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養
し、そして発現ポリペプチドを回収する方法を提供す
る。
【０１２５】ベクターは、例えば複製の起源を、任意に
ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターを、そし
て任意にプロモーターのレギュレーターを備えたプラス
ミド、ウイルスまたはバクテリオファージ（ファージ）
ベクターであり得る。本発明のベクターは、１つ又はそ
れ以上の選択可能マーカー遺伝子を含有し得る。工業微
生物のための最も適切な選択系は、宿主生物中での突然
変異を必要としない選択マーカーの群により構成される
ものである。真菌選択マーカーの例は、アセトアミダー
ゼ（amdS）、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９
（oliC）、オロチジン−５’−ホスフェート−デカルボ
キシラーゼ（pvrA）、フレオマイシンおよびベノミル耐
性（benA）に関する遺伝子である。非真菌選択マーカー
の例は、細菌G418耐性遺伝子（これは哺乳類細胞、酵母
菌でも用いられ得るが、しかし糸状真菌では用いられな
い）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、ネオマイシ
ン耐性遺伝子（哺乳類細胞）ならびにβ−グルクロニダ
ーゼ（GUS）をコードする大腸菌uidA遺伝子である。
【０１２６】ベクターは、例えばＲＮＡの産生のために
in vitroで用いられ得るし、または宿主細胞をトランス
フェクトまたは形質転換するために用いられ得る。した
がって、本発明のポリヌクレオチドは、組換えベクター
（典型的には、複製可能ベクター）、例えばクローニン
グまたは発現ベクター中に組み入れられ得る。ベクター
は、適合性宿主細胞中で核酸を複製するために用いられ
得る。したがって、さらに別の実施態様では、本発明
は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクター中に
導入し、ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、そして
ベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖さ
せることによる本発明のポリヌクレオチドの製造方法を
提供する。ベクターは、宿主細胞から回収され得る。適
切な宿主細胞は、発現ベクターとともに、以下に記載さ
れる。
【０１２７】本発明は、PFI-011のモジュレーター（例
えば、拮抗薬または作動薬）の同定のためのスクリーニ
ング方法におけるPFI-011ポリペプチドあるいはその変
異体、相同体、断片、類似体または誘導体を発現する遺
伝子工学処理宿主細胞の使用にも関する。このような遺
伝子工学処理宿主細胞は、PFI-011活性を調整し得るペ
プチドライブラリーまたは有機分子をスクリーニングす
るために用いられ得る。抗体、ペプチドまたは小有機分
子のようなPFI-011ポリペプチドのモジュレーター（例
えば拮抗薬）は、例えばPFI-011に関連した疾患の治療
のための製剤組成物のための基礎を提供する。このよう
なモジュレーター（例えば、拮抗薬）は、このような疾
患の治療のために、単独で、またはその他の療法と組合
せて投与され得る。
【０１２８】本発明は、PFI-011タンパク質のin vivoま
たはin vitro産生のための、あるいはPFI-011発現また
は活性に影響を及ぼし得る作用物質に関してスクリーニ
ングするためのPFI-011をコードするポリヌクレオチド
配列、あるいはその変異体、相同体、断片、類似体また
は誘導体を包含する発現ベクターおよび宿主細胞にも関
する。
【０１２９】組織 「組織」という用語は、本明細書中で用いる場合、組織
それ自体および器官を含む。 宿主細胞 「宿主細胞」−本発明に関して−という用語は、本発明
の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列およ
び／またはそれから得られる生成物を包含し得るが、こ
の場合、プロモーターは、宿主細胞中に存在する場合に
は、本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にする。
【０１３０】したがって、本発明のさらに別の実施態様
は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換またはトラン
スフェクトされる宿主細胞を提供する。好ましくは、前
記のポリヌクレオチドは、前記のポリヌクレオチドの複
製および発現のためにベクター中に保有される。細胞
は、前記のベクターと適合性であるよう選択され、そし
て、例えば原核細胞（例えば、細菌細胞）または真核細
胞（即ち、哺乳類、真菌、昆虫および酵母菌細胞）であ
り得る。
【０１３１】宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入
は、Sambrook, et al., eds.（1989）Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York, NY, USAに記載されたような方法
により実行され得る。これらの方法としては、リン酸カ
ルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒
介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トラ
ンスフェクション、電気穿孔、トランスベクション、マ
イクロインジェクション、形質導入、切傷負荷および弾
道導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】代表的宿主の例としては、細菌細胞（例え
ば大腸菌、ストレプトミセス属）；真菌細胞、例えば酵
母菌細胞およびアスペルギルス属；昆虫細胞、例えばシ
ョウジョウバエS2およびSpodoptera SF9細胞；動物細
胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＨｅＬａおよび３
Ｔ３細胞が挙げられる。適切な宿主の選択は、当業者の
範囲内とみなされる。
【０１３３】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの性質、および／または発現タンパク質のさ
らなるプロセッシングの望ましさによって、真核生物宿
主、例えば酵母菌またはその他の真菌が選ばれ得る。概
して、酵母菌細胞が、それらの操作容易性のために、真
菌細胞の中で選ばれる。しかしながら、いくつかのタン
パク質は、酵母菌からは不十分に発現または分泌され、
あるいはいくつかの場合には、適正にプロセッシングさ
れない（例えば、酵母菌における高グリコシル化）。こ
れらの場合、異なる真菌宿主生物が選択されるべきであ
る。
【０１３４】本発明の範囲内の適切な発現宿主の例は、
真菌、例えばアスペルギルス種（例えば、欧州特許出願
第0184438号および第0284603号に記載されているもの）
およびトリコデルマ種；細菌、例えば大腸菌種、ストレ
プトミセス種およびシュードモナス種；ならびに酵母
菌、例えばKluyveromyces種（例えば、欧州特許出願第0
096430号および第0301670号に記載されているもの）お
よびサッカロミセス種である。例として、典型的発現宿
主は、黒色アスペルギルスAspergillus niger、Aspergi
llus niger var. tubigenis、Aspergillus niger var.
awamori、Aspergillus aculeatis、Aspergillus nidula
ns、Aspergillus orvzae、トリコデルマ属のTrichoderm
a reesei、クルイベロミセス属のKluyveromyces lacti
s、シゾサッカロミセス属のShizosaccharomyces pomb
e、Pichia pastorisおよびビール酵母菌Saccharomyces
cerevisiaeから選択され得る。
【０１３５】適切な宿主細胞−例えば哺乳類、酵母菌、
昆虫および真菌宿主細胞−の使用は、本発明の組換え発
現生成物に最適生物活性を付与する必要がある場合に、
翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、
切頭化、lapidation、ならびにチロシン、セリンまたは
トレオニンリン酸化）を提供し得る。 生物体 「生物体」という用語は、本発明に関しては、本発明の
組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列および
／またはそれから得られる生成物を包含し得る、ヒト以
外のあらゆる生物を含み、この場合、プロモーターは、
生物体中に存在する場合、本発明のヌクレオチド配列の
発現を可能にし得る。生物体の例としては、真菌、酵母
菌または原生動物が挙げられ得る。
【０１３６】「トランスジェニック生物」という用語
は、本発明に関しては、本発明のタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列および／またはそれから得られる生
成物を包含し得る、ヒト以外のあらゆる生物を含み、こ
の場合、プロモーターは、生物体内の本発明のヌクレオ
チド配列の発現を可能にし得る。好ましくは、ヌクレオ
チド配列は生物体のゲノム中に組み入れられる。
【０１３７】「トランスジェニック生物」という用語
は、それが同じくその天然環境にあるそのネイティブプ
ロモーターの制御下にある場合にその天然環境中で本発
明のネイティブヌクレオチドコード配列を包含しない。
さらに、本発明は、それがその天然環境中にある場合、
そしてそれが同じくその天然環境中にあるそのネイティ
ブヌクレオチドコード配列により発現されている場合、
そしてそれが同じくその天然環境にあるそのネイティブ
プロモーターの制御下にそのヌクレオチド配列がある場
合に、本発明のネイティブタンパク質を包含しない。
【０１３８】したがって、本発明のトランスジェニック
生物は、本発明のアミノ酸をコードするヌクレオチド配
列、本発明の構築物（それらの組合せを含む）、本発明
のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞および
本発明の組織またはそれらの生成物のいずれか１つまた
はその組合せを包含する生物を含む。形質転換細胞また
は生物は、細胞または生物から容易に回収可能である許
容可能量の所望の化合物を調製し得る。
【０１３９】宿主細胞／宿主生物の形質転換 前記のように、宿主生物は原核生物または真核生物であ
り得る。適切な原核生物宿主の例は大腸菌である。原核
生物宿主の形質転換に関する教示は、当業界で十分実証
されている（例えば、Sambrook et al.（Molecular Clo
ning:A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, NewYork, NY, USA）
およびAusubel et al.（Current Protocols in Molecul
ar Biology（1995）,John Wiley & Sons, Inc.）参
照）。
【０１４０】好ましい実施態様では、形質転換宿主は哺
乳類細胞または、例えば昆虫細胞であり、この場合、前
記の宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、例え
ば、 Sambrook et al.（Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor L
aboratory Press, New York, NY, USA）に記載されたよ
うな方法により実行され得る。これらの方法としては、
リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキス
トラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒
介性トランスフェクション、電気穿孔、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、形質導入、切傷負荷
および弾道導入が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０１４１】別の実施態様では、トランスジェニック生
物は酵母菌であり得る。この点で、酵母菌は、異種遺伝
子発現のためのビヒクルとしても広範に用いられ得る。
ビール酵母菌種は、異種遺伝子発現のための使用を含め
た、工業的使用の長い歴史を有する。ビール酵母菌中で
の異種遺伝子の発現は、Goodey等（1987, Yeast Biotec
hnology, D R Berry et al, eds, pp401-429, Allen an
d Unwin, London）およびKing等（1989, Molecular and
Cell Biology of Yeasts, E F Walton and GT Yarront
on, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow）により再検
討されている。
【０１４２】いくつかの理由のために、ビール酵母菌は
異種遺伝子発現に十分適している。第一に、それはヒト
に対して非病原性であり、ある種の内毒素を生成できな
い。第二に、それは、種々の目的のための何百年もの商
業的開発後の安全使用の長い歴史を有する。これは、広
範な公共的許容可能性をもたらした。第三に、広範な商
業的使用および生物体に向けられた探究は、ビール酵母
菌の遺伝学および生理学ならびに大規模発酵特徴につい
ての多くの知識をもたらした。
【０１４３】ビール酵母菌における異種遺伝子発現およ
び遺伝子生成物の分泌の原理の再検討は、E Hinchcliff
eとE Kenny（“Yeast as a vehicle for the expressio
n ofheterologous genes", 1993, Yeasts, Vol 5, Anth
ony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2ng editio
n, Academic Press Ltd.）により示されている。それら
の保持のために宿主ゲノムによる組換えを必要とする組
込みベクターおよび自己複製プラスミドベクターを含め
た、いくつかの種類の酵母菌ベクターが利用可能であ
る。
【０１４４】トランスジェニックサッカロミセスを調製
するために、発現構築物は、酵母菌中での発現を意図さ
れた構築物中に本発明のヌクレオチド配列を挿入するこ
とにより調製される。異種発現のために用いられる数種
類の構築物が開発されてきた。構築物は、本発明のヌク
レオチド配列と融合された酵母菌中で活性なプロモータ
ーを含有し、通常は、酵母菌起源のプロモーター、例え
ばGAL1プロモーターが用いられる。普通は、酵母菌起源
のシグナル配列、例えばSUC2シグナルペプチドをコード
する配列が用いられる。酵母菌中で活性なターミネータ
ーが発現系を終了する。
【０１４５】酵母菌の形質転換のために、いくつかの形
質転換プロトコールが開発されてきた。例えば、本発明
のトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen等（19
78,Proceedings of the National Acacemy of Sciences
of the USA, 75:1929）；Beggs, J D（1978, Nature,
London, 275:104）およびIto, H等（1983, J. Bacterio
logy 153:163-168）の教示にしたがって調製され得る。
【０１４６】形質転換酵母菌細胞は、種々の選択マーカ
ーを用いて選択される。形質転換のために用いられるマ
ーカーの中でもとりわけ、多数の栄養要求性マーカー、
例えばLEU2、HIS4およびTRP1、そして優勢な抗生物質耐
性マーカー、例えばアミノグリコシド抗生物質マーカ
ー、例えばG418である。したがって、本発明は、配列番
号１で示されるヌクレオチド配列、あるいはそれらの誘
導体、相同体、変異体、類似体または断片を用いて宿主
細胞を形質転換する方法も提供する。
【０１４７】PFI-011ヌクレオチドコード配列で形質転
換される宿主細胞は、細胞培養からコード化タンパク質
（細胞膜中）の発現および回収に適した条件下で培養さ
れ得る。組換え細胞により産生されるタンパク質は、用
いられる配列および／またはベクターによって、細胞表
面で発現され、分泌され、あるいは細胞内に含有され得
る。当業者に理解されるように、PFI-011コード配列を
含有する発現ベクターは一般に、細胞膜内での発現を可
能にする。その他の組換え構築は、タンパク質精製／同
定を促すポリペプチドドメインをコードするヌクレオチ
ド配列にPFI-011コード配列を接合し得る（Kroll DJ et
al.（1993）DNA Cell Biol Vol 12 P441-53,前記の融
合タンパク質を含有するベクターの考察も参照）。
【０１４８】遺伝子工学処理または遺伝子修飾 「遺伝子修飾」される細胞、好ましくは動物細胞は、遺
伝子工学により細胞中に、または前駆細胞中に導入され
る修飾に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である。
修飾を導入するために利用可能な遺伝子工学の標準的方
法としては、相同組換え、ウイルスベクター遺伝子トラ
ッピング、放射線照射、化学的突然変異誘発、およびア
ンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の単独
でのまたは触媒リボザイムと組合せたトランスジェニッ
ク発現が挙げられる。遺伝子修飾のための好ましい方法
は、相同的組換えおよびウイルスベクター遺伝子トラッ
ピングであって、これらはともに、遺伝子座に外来核酸
配列を挿入することにより、内因性遺伝子を修飾する。
遺伝子に対して外来性である核酸配列は、遺伝子中で非
天然である外因性配列である。外来ＤＮＡのこの挿入
は、PFI-011遺伝子のあらゆる領域で、例えばエンハン
サー、プロモーター、レギュレーター領域、非コード領
域、コード領域、イントロンまたはエキソンで起こり得
る。遺伝子工学の最も好ましい方法は、外来核酸配列が
標的化方式で、単独で、または内因性遺伝子配列の一部
の欠失と組合せて挿入される相同的組換えである。
【０１４９】機能的崩壊 「機能的に崩壊される」PFI-011遺伝子とは、崩壊化遺
伝子によりコードされるPFI-011ポリペプチドの細胞活
性が、通常では野生型バージョンのPFI-011遺伝子を発
現する細胞中で低減されるように、遺伝子修飾されるPF
I-011遺伝子を意味する。遺伝子修飾が細胞中のPFI-011
遺伝子のすべての野生型コピーを有効に排除する場合に
は（例えば、遺伝子修飾細胞、好ましくは動物細胞がPF
I-011遺伝子崩壊に関してホモ接合性であり、または元
々存在するPFI-011遺伝子の野生型コピーだけが直ちに
崩壊される）、遺伝子修飾は、野生型PFI-011遺伝子を
発現する適切な対照細胞と比較した場合、PFI-011ポリ
ペプチド活性の低減（即ち、受容体発現の低減）を引き
起こす。PFI-011ポリペプチド活性のこの低減（即ち、
受容体発現の低減）は、PFI-011遺伝子発現の低減（即
ち、PFI-011ｍＲＮＡレベルが有効に低減され、PFI-011
ポリペプチドのレベル低下を生じる）に、および／また
は、野生型ポリペプチドと比較した場合に、機能または
安定性低減を伴う突然変異化ポリペプチドを崩壊PFI-01
1遺伝子がコードすることに起因する。好ましくは、遺
伝子修飾細胞中のPFI-011ポリペプチドの活性（即ち受
容体発現の低下）は、野生型レベルの50％またはそれ以
下に、さらに好ましくは25％またはそれ以下に、さらに
好ましくは10％またはそれ以下に低減される。最も好ま
しくは、PFI-011遺伝子崩壊は、ゼロ突然変異をもたら
す。
【０１５０】遺伝子修飾化動物細胞 機能的崩壊PFI-011遺伝子を含有する「遺伝子修飾動物
細胞」とは、機能的崩壊化PFI-011遺伝子を含有するた
めに遺伝子工学処理により作製されるヒト細胞を含めた
動物細胞、ならびに崩壊化PFI-011遺伝子を受け継ぐ娘
細胞を意味する。これらの細胞は、当業界で既知のあら
ゆる標準的方法にしたがって培養中で遺伝子修飾され得
る。培養中の細胞を遺伝子修飾するための代替物とし
て、PFI-011遺伝子崩壊を含有する遺伝子修飾化非ヒト
哺乳類から、非ヒト哺乳類細胞が単離され得る。本発明
の動物細胞は、一次細胞または組織調製物、ならびに培
養適合化、腫瘍形成性、または形質転換化細胞株から得
られる。これらの細胞および細胞株は、例えば、内皮細
胞、上皮細胞、島細胞、ニューロンおよびその他の神経
組織由来細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細
胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例え
ば、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓および皮膚）の細
胞、筋細胞（骨格筋、平滑筋および真菌からの細胞を含
む）、外分泌または内分泌細胞、繊維芽細胞ならびに胚
およびその他の分化全能性または多能性幹細胞（例え
ば、胚幹（ＥＳ）細胞、ＥＳ様細胞および胚原基系列
（ＥＧ）細胞、ならびにその他の幹細胞、例えば前駆細
胞および組織由来幹細胞）から得られる。好ましい遺伝
子修飾化細胞は、ＥＳ細胞であり、さらに好ましくはマ
ウスまたはラットＥＳ細胞、最も好ましくはヒトＥＳ細
胞である。
【０１５１】PFI-011遺伝子を用いた相同組換えのため
に標的化ベクターにおいて用いられる「相同領域」と
は、PFI-011遺伝子の一部、または当業界で既知の標準
低緊縮条件下で相同領域とPFI-011遺伝子配列との間に
ハイブリダイゼーションを起こさせるのに十分な程度に
PFI-011遺伝子と側面を接する配列に関する（即ち相補
的）（例えば、Current Protocols in Human Genetics,
unit 4.1, John Wiley& Sons, New York, NY, 2000に
記載されている）。
【０１５２】「ＥＳ細胞」または「ＥＳ様細胞」とは、
無限自己再生を、ならびに３つの胚原基層のすべてを代
表する細胞型への分化を可能にする胚から、始原幹細胞
からまたは奇形癌から得られる多能性幹細胞を意味す
る。「低減」とは、統計学的有意の減少（即ち、p<0.
1）を意味する。本発明の遺伝子修飾化動物細胞、例え
ばヒト細胞は、PFI-011遺伝子を機能的に崩壊する修飾
に関してヘテロ接合またはホモ接合性である。動物細胞
は、培養中の遺伝子工学処理により誘導され、あるいは
非ヒト哺乳類細胞の場合には、細胞は遺伝子修飾化非ヒ
ト哺乳類から単離され得る。
【０１５３】PFI-011遺伝子座は、当業界で既知の遺伝
子修飾のためのいくつかの技法の一つにより機能的に崩
壊され、その例としては、化学的突然変異誘発（Rinchi
k, Trends in Genetics 7:15-21, 1991, Russell, Envi
ronmental & Molecular Mutagenesis 23（Suppl. 24）2
3-29, 1994）、放射線照射（Russell, 同上）、PFI-011
遺伝子アンチセンスＲＮＡの、単独での、または触媒的
ＲＮＡリボザイム配列と組合せたトランスジェニック発
現（Luyckx et al., Proc. Natl. Acad. Sci.96:12174-
79, 1999; Sokol et al., Transgenic Research 5:363-
71, 1996; Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:2051-55, 1994; Larsson et al.,Nucleic Acids Re
search 22:2242-48, 1994）、ならびに下記でさらに考
察されるように、PFI-011遺伝子座への外来核酸配列の
挿入によるPFI-011遺伝子の崩壊が挙げられる。好まし
くは、外来配列は、相同的組換えにより、またはウイル
スベクターの挿入により挿入される。最も好ましくは、
PFI-011遺伝子崩壊の方法は、相同的組換えであり、内
因性PFI-011遺伝子配列の一部の欠失を含む。
【０１５４】外来配列の組込みは、１つ又はそれ以上の
以下のメカニズムによりPFI-011遺伝子を機能的に崩壊
する：PFI-011遺伝子転写または翻訳工程をさまたげる
ことにより（例えば、プロモーター認識を妨げることに
より、または転写終止部位または翻訳終止コドンをPFI-
011遺伝子に導入することにより）；あるいは正常受容
体機能を有するPFI-011ポリペプチドをもはやコードし
ないようにPFI-011遺伝子コード配列をゆがめることに
よる（例えば、PFI-011遺伝子コード配列中に外来コー
ド配列を挿入することにより、フレームシフト突然変異
またはアミノ酸（単数または複数）置換を導入すること
により、あるいは二重交差事象の場合には、機能性受容
体タンパク質の発現に必要なPFI-011遺伝子コード配列
の一部を欠失することによる）。
【０１５５】細胞のゲノム中のPFI-011遺伝子座に外来
配列を挿入するために、当業界で既知の標準的方法、例
えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈降法、レトロウイル
ス感染、マイクロインジェクション、biolistics、リポ
ソームトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
トランスフェクションまたはトランスフェリンフェクシ
ョンにより、外来ＤＮＡ配列が細胞中に導入される（例
えば、Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982; Pot
ter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161-65,
1984; Chu et al., Nucleic Acids Res. 15: 1311-26,
1987; Thomasand Capecchi, Cell 51:503-12, 1987; B
aum et al., Biotechniques 17:1058-62, 1994; Biewen
ga et al., J. Neuroscience Methods 71:67-75, 1997;
Zhanget al., Biotechniques 15: 868-72, 1993; Ray
and Gage, Biotechniques 13:598-603, 1992; Linney e
t al., Dev. Biol.（Orlando）213:207-16, 1999; Zimm
er and Gruss, Nature 338:150-153, 1989; およびRobe
rtson et al., Nature323:445-48, 1986参照）。細胞中
への外来ＤＮＡの導入のための好ましい方法は、電気穿
孔である。
【０１５６】相同的組換え 相同的組換えの方法は、PFI-011遺伝子を含有する細胞
中にPFI-011遺伝子ターゲッティングベクターを導入す
ることにより崩壊のためにPFI-011遺伝子を標的化す
る。崩壊のためにPFI-011遺伝子を標的化するベクター
の能力は、PFI-011遺伝子と相同であるベクター中のヌ
クレオチド配列を用いることに起因する。この相同領域
は、ベクターとPFI-011遺伝子の内因性配列との間のハ
イブリダイゼーションを促す。ハイブリダイゼーション
時に、ターゲッティングベクターとゲノム配列との間の
交差事象の確率は、大いに増大する。この交差事象は、
PFI-011遺伝子座へのベクター配列の組込みおよびPFI-0
11遺伝子の機能的崩壊を引き起こす。
【０１５７】ターゲッティングのために用いられるベク
ターの構築に関する一般原理は、Bradley等（Biotechno
l. 10:534, 1992）に再検討されている。２つの異なる
例示的型のベクター：挿入ベクターまたは組換えベクタ
ーを用いて、相同的組換えによりＤＮＡを挿入し得る。
挿入ベクターは、二本鎖化切れ目とのPFI-011遺伝子相
同性の領域を含有する環状ＤＮＡである。相同領域と内
因性PFI-011遺伝子との間のハイブリダイゼーション
後、二本鎖化切れ目での１回交差事象が、交差の部位で
の内因性遺伝子中への全ベクター配列の挿入を生じる。
【０１５８】相同的組換えに用いるためのさらに好まし
いベクターは交替ベクターであり、これは環状というよ
りむしろ共線的である。PFI-011遺伝子への交替ベクタ
ー組込みは、二重交差事象、即ちターゲッティングベク
ターとPFI-011遺伝子との間のハイブリダイゼーション
の２つの部位での交差を必要とする。この二重交差事象
は、PFI-011遺伝子中への交差の２つの部位間に挟まれ
るベクター配列の組込、ならびに交差の２つの部位の間
に元々またがって存在した対応する内因性PFI-011遺伝
子配列の欠失を引き起こす（例えば、Thomas and Capec
chi et al., Cell 51:503-12, 1987; Mansour et al.,
Nature 336:348-52, 1988; Mansour et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 87:7688-7692, 1990; およびMansou
r, GATA 7: 219-227, 1990参照）。
【０１５９】ターゲッティングベクター中の相同の領域
は、一般に少なくとも100ヌクレオチド長である。最も
好ましくは、相同領域は、少なくとも1〜5キロベース
（Kb）長である。相同領域に必要とされる最小長または
最小度の関連性は実証されていないけれども、相同的組
換えのためのターゲッティング効率は、一般に、ターゲ
ッティングベクターとPFI-011遺伝子座との間の関連性
の長さおよび程度に対応する。交替ベクターが用いられ
る場合には、そして内因性PFI-011遺伝子の一部が相同
的組換え時に欠失される場合には、付加的に考えられる
ことは、内因性PFI-011遺伝子の欠失部分のサイズであ
る。内因性PFI-011遺伝子のこの部分が1 Kb長より長い
場合には、組換えの効率を増強することが推奨される。
相同的組換えに有効な配列の選択および使用に関するさ
らなる指針は、文献に記載されている（例えば、Deng a
nd Capecchi, Mol. Cell. Biol. 12: 3365-3371, 1992;
Bollag et al., Annu. Rev. Genet. 23:199-225, 198
9;およびWaldman and Liskay, Mol. Cell. Biol. 8:535
0-5357, 1988参照）。
【０１６０】広範な種々のクローニングベクターは、PF
I-011遺伝子ターゲッティングベクターの構築における
ベクター主鎖として用いられ得る。それらの例として
は、pBluescript関連プラスミド（例えば、Bluescript
KS+11）、pQE70、pQE60、pQE-9、Pd10、ファージスクリ
プト、phiPFI-002174、pBKファジミド、pNH8A、 pNH16
a、pNH18Z、Pnh46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pD
R540およびpRIT5、PWLNEO、PsV2CAT、pPFI-002T1、pSG
（Strataene）、pSVK3、PBPV、PMSGおよびpSVL、pBR322
およびpBR322−ベースのベクター、pBM9、pBR325、pKH4
7、pBR328、pHC79、ファージCharon 28、pKB11、pKSV-1
0、pK19関連プラスミド、pUCプラスミドおよびpGEMシリ
ーズのプラスミドが挙げられる。これらのベクターは、
種々の商業的供給元（例えば、Boehringer Mannheim Bi
ochemicals, Indianapolis, IN; Qiagen, Valencia, C
A; Stratagene, La Jolla, CA; Promega, Madison, WI;
およびNew England Biolabs, Beverly, MA）から入手可
能である。しかしながら、あらゆるその他のベクター、
例えばプラスミド、ウイルスまたはその一部は、それら
が所望の宿主中で複製可能且つ生存可能である限り、用
いられ得る。ベクターは、そのゲノムが修飾される宿主
中でそれを複製させ得る配列も包含する。このようなベ
クターの使用は、組換えが起こり、ターゲッティングの
効率を増大する間の相互作用期間を延長し得る（Molecu
lar Biology, ed. Ausubel et al., Unit9. 16, 図9.1
6.1参照）。
【０１６１】前記のターゲッティングベクターを増殖さ
せるために用いられる特定の宿主は重要ではない。例と
しては、大腸菌K12 RR1（Bolivar et al., Gene 2:95,
1977）、大腸菌K12 HB101（ATCC No. 33694）、大腸菌M
M21（ATCC No. 336780）、大腸菌DH1（ATCC No. 3384
9）、大腸菌DH5α株および大腸菌STBL2株が挙げられ
る。あるいは、C. cerevisiaeのような宿主が用いられ
得る。前記の宿主は市販されている（例えば、Stratage
ne, La Jolla, CA;およびLife Technologies, Rockvill
e, MD）。
【０１６２】ターゲッティングベクターを作製するため
に、PFI-011遺伝子ターゲッティング構築物が前記のベ
クター主鎖に付加される。前記のPFI-011遺伝子ターゲ
ッティング構築物は、少なくとも１つのPFI-011遺伝子
相同領域を有する。PFI-011遺伝子相同領域を作製する
ために、PFI-011遺伝子関連配列がポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）プライマーを生成するための基礎として用
いられる。これらのプライマーは、高忠実度ＰＣＲ増幅
によりPFI-011配列の所望の領域を増幅するために用い
られる（Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 496
7, 1991; Eckertand Kunkel 1:17, 1991;および米国特
許第4,683,202号）。ゲノム配列は、ゲノムクローンラ
イブラリーから、またはゲノムＤＮＡの調製から、好ま
しくはPFI-011遺伝子崩壊のために標的化されるべき動
物種から得られる。
【０１６３】好ましくは、前記のターゲッティング構築
物は、陽性マーカータンパク質をコードする外因性ヌク
レオチド配列も含む。ベクター組込後の陽性マーカーの
安定発現は、細胞生存可能性を危うくすることなく、細
胞に同定可能特性を付与する。したがって、交替ベクタ
ーの場合、マーカー遺伝子は、二重交差事象後にPFI-01
1遺伝子中に組み込まれるように、２つのフランキング
相同領域間に置かれる。
【０１６４】陽性マーカータンパク質は選択可能タンパ
ク質であるのが好ましい。細胞中でのこのようなタンパ
ク質の安定発現は、選択可能発現型特徴を付与し、即
ち、その特徴はそうでなければ致死的な条件下での細胞
の生存を増強する。したがって、選択可能条件を課する
ことにより、生存可能性に基づいて、ベクター配列をう
まく組み込んでいなかったその他の細胞からの陽性選択
可能マーカーを安定的に発現する細胞の単離が可能にな
る。陽性選択可能マーカータンパク質（および選択性を
有するそれらの作用物質）の例としては、Neo（G418ま
たはカノマイシン）、Hyg（ヒグロマイシン）、HisD
（ヒスチジノール）、Gpt（キサンチン）、Ble（ブレオ
マイシン）およびHprt（ヒポキサンチン）が挙げられる
（例えば、Capecchi and Thomas,米国特許第5,464,764
号およびCapecchi, Science 244:1288-92, 1989参
照）。選択可能マーカーの代替物としても用いられ得る
その他の陽性マーカーとしては、レポータータンパク
質、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラー
ゼまたはグリーン蛍光タンパク質（例えば、Current Po
rtocolsin Cytometry, Unit 9.5 およびCurrent Protoc
ols in Molecular Biology, Unit 9.6, John Wiley & S
ons, New York, NY, 2000）が挙げられる。
【０１６５】前記の陽性選択計画は、PFI-011遺伝子座
での標的化相同的組換えによりベクターを組込んだ細胞
と、任意の染色体位置へのベクター配列の無作為非相同
的組込とを識別しない。したがって、相同的組換えのた
めに交替ベクターを用いる場合、陰性選択可能マーカー
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことも
好ましい。陰性選択可能マーカーの発現は、ある種の作
用物質にされされた場合に、マーカーを発現する細胞に
生存可能性を失わせる（即ち、マーカータンパク質はあ
る種の選択可能条件下では細胞に対して致死的にな
る）。陰性選択可能マーカー（および致死性を有するそ
れらの作用物質）の例としては、単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ（ガンシクロビルまたは１，２−デオ
キシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフランシル−５
−ヨードウラシル）、Hprt（６−チオグアニンまたは６
−チオキサンチン）、ならびにジフテリア毒素、リシン
毒素およびシトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシ
ン）が挙げられる。
【０１６６】陰性選択可能マーカーをコードするヌクレ
オチド配列は、交替ベクターの２つの相同領域の外側に
置かれる。この位置決定が示されたとすると、組込が無
作為非相同的組換えにより起こる場合、細胞は陰性選択
可能マーカーを組み込み、そして安定的に発現するだけ
である。ターゲッティング構築物中のPFI-011遺伝子と
相同性を有する２つの領域との間の相同的組換えは、組
込みから陰性選択可能マーカーをコードする配列を排除
する。したがって、陰性条件を課することにより、無作
為非相同的組換えによりターゲッティングベクターを組
み込んだ細胞は生存可能性を失う。
【０１６７】一連の陽性および陰性選択工程は、相同的
組換えによりベクター組込を受けた、したがって潜在的
崩壊化PFI-011遺伝子を有する細胞だけをより効率よく
選択するよう意図され得るため、陽性および陰性選択可
能マーカーの前記の組合せが好ましい。陽性−陰性選択
計画、選択可能マーカーおよびターゲッティング構築物
のさらに別の例は、例えば、米国特許第5,464,764号、W
O94/06908、ならびにValancius and Smithies, Mol. Ce
ll. Biol. 11: 1402, 1991に記載されている。
【０１６８】マーカータンパク質がベクター組込時に安
定的に発現されるために、ターゲッティングベクター
は、マーカーコード配列がベクター組込時に操作可能的
に内因性PFI-011遺伝子プロモーターに連結されるよう
設計され得る。次に、マーカーの発現は、通常はPFI-01
1遺伝子を発現する細胞中のPFI-011遺伝子プロモーター
により駆動される。あるいは、ベクターのターゲッティ
ング構築物中の各マーカーは、PFI-011遺伝子プロモー
ターとは無関係に発現を駆動するそれ自身のプロモータ
ーを含有し得る。この後者の計画は、典型的にはPFI-01
1遺伝子を発現しない細胞中でのマーカーの発現を可能
にするという利点を有する（Smith and Berg, Cold Spr
ing Harbor Symp. Quant. Biol. 49:171, 1984; Sedivy
and Sharp, Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）86:227, 1
989; Thomas and Capecchi, Cell 51:503, 1987）。
【０１６９】マーカー遺伝子発現を駆動するために用い
られ得る外因性プロモーターとしては、細胞特異性また
は段階特異性プロモーター、構成性プロモーターおよび
誘導性または調節性プロモーターが挙げられる。これら
のプロモーターの例としては、単純ヘルペスチミジンキ
ナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
プロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、PGK
プロモーター、PMC1−ネオ、メタロチオネインプロモー
ター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウ
イルス7.5Kプロモーター、鳥βグロビンプロモーター、
ヒストンプロモーター（例えば、マウスヒストンH3-61
4）、βアクチンプロモーター、ニューロン特異的エノ
ラーゼ、筋肉アクチンプロモーターおよびカリフラワー
モザイクウイルス35Sプロモーターが挙げられるが、こ
れらに限定されない（一般に、 Sambrook, et al.,Mole
cular Cloning, Vols I-III, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989およびCur
rent Protocols in MolecularBiology, John Wiley & S
ons, New York, NY, 2000; Stratagene, La Jolla, CA
参照）。
【０１７０】細胞が標的化PFI-011遺伝子座にベクター
配列を組み込んだか否かを確証するために、所望のベク
ター組込事象に特異的なプライマーまたはゲノムプロー
ブをＰＣＲまたはサザンブロットと組合せて用いて、PF
I-011遺伝子座への所望のベクター組込の存在を同定し
得る（Erlich et al., Science 252:1643-51, 1991;Zim
mer and Gruss, Nature 338:150, 1989; Mouellic et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）87:4712, 1990;お
よびShesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）8
8:4294, 1991）。
【０１７１】遺伝子トラッピング PFI-011遺伝子を機能的に崩壊するためにPFI-011遺伝子
座に外来核酸配列を挿入するために利用可能なもう一つ
の方法は、遺伝子トラッピングである。この方法は、無
作為方式で遺伝子中に遺伝子トラップベクターコード配
列を挿入するためにｍＲＮＡにエキソンをスプライスす
るすべての哺乳類細胞中に存在する細胞機構を利用す
る。一旦挿入されれば、遺伝子トラップベクターは、ト
ラップ化PFI-011遺伝子を機能的に崩壊し得る突然変異
を生じる。相同的組換えに対比して、突然変異誘発のた
めのこの系は、非常に無作為な突然変異を作り出す。し
たがって、機能的崩壊化PFI-011遺伝子を含有する遺伝
子修飾化細胞を得るためには、この特定の突然変異を含
有する細胞は、種々の遺伝子における無作為突然変異を
含有する細胞のプールから同定され、そして選択されね
ばならない。
【０１７２】遺伝子トラッピング系およびベクターは、
遺伝子修飾ネズミ細胞およびその他の種類の細胞での使
用に関して記載されている（例えば、Allen et al., Na
ture333:852-55, 1988; Bellen et al., Genes Dev. 3:
1288-1300, 1989; Bier etal., Genes Dev. 3: 1273-1
287, 1989; Bonnerot et al., J. Virol. 66:4982-91,
1992; Brenner et al., Proc. Nat. Acad. Sci.USA 86:
5517-21, 1989; Chang et al., Virology 193:737-47,
1993; Friedrich and Soriano, Methods Enzymol. 225:
681-701, 1993; Friedrich and Soriano, Genes Dev.
5:1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol. 152:469-8
1, 1987; Gossler et al., Science 244:463-65, 1989;
Hope, Develop. 113:399-408, 1991; Kerr et al., Co
ld Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2: 767-776, 198
9; Reddy et al., J. Virol. 65:1507-1515, 1991; Red
dy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6721-2
5,1992; Skarnes et al., Genes Dev. 6:903-918, 199
2; von Melchner and Ruley, J. Virol. 63:3227-3233,
1989;およびYoshida et al., Transgen, Res. 4:277-8
7, 1995参照）。
【０１７３】プロモータートラップ（５’トラップ）ベ
クターは、５’〜３’の順序で、スプライス受容体そし
てその後にエクソンを含有するが、これは、典型的には
翻訳開始コドンおよび開放読み取り枠（ＯＲＦ）および
／または内部リボソーム侵入部位により特性化される。
概して、これらのプロモータートラップベクターはプロ
モーターまたは操作可能的連結スプライス供与配列を含
有しない。その結果、宿主細胞の細胞ゲノム中への組込
後、プロモータートラップベクター配列は、上流遺伝子
の正常スプライシングを妨げ、末端エキソンとして作用
する。ベクターコード配列の発現は、適正な読み取り枠
内の崩壊遺伝子のイントロン中に組み込まれるベクター
によっている。このような場合、細胞スプライシング機
構は、ベクターコード配列の上流のトラップ化遺伝子か
らエキソンをスプライスする（Zambrowicz et al., WO9
9/50426）。
【０１７４】前記のプロモータートラップベクターと同
様の効果を生じるための代替的方法は、プロモータート
ラップベクターのスプライス受容体と翻訳開始コドンま
たはポリアデニル化配列との間の領域に存在するか、そ
うでなければそこに工学処理される入れ子式の一組の終
止コドンを組み入れるベクターである。コード配列は、
宿主細胞ゲノム内の組込の部位とは大いに無関係な方式
で発現されるように、別々のリボソーム侵入部位（ＩＲ
ＥＳ）を含有するよう工学処理され得る。典型的には、
ＩＲＥＳは入れ子式の一組の終止コドンとともに用いら
れるが、しかし必ずというわけではない。
【０１７５】別の種類の遺伝子トラッピング計画は、
３’遺伝子トラップベクターを用いる。この種類のベク
ターは、有効な組合せで、隣接コード配列の発現を媒介
するプロモーター領域、コード領域、およびコード配列
エキソンの３’末端を限定するスプライス供与配列を含
有する。宿主細胞ゲノムへの組込後、ベクタープロモー
ターにより発現される転写体は、組込遺伝子トラップベ
クター配列の下流に位置するトラップ遺伝子からスプラ
イス受容配列にスプライスされる。したがって、ベクタ
ーの組込は、３’遺伝子トラップカセットのコード配列
およびあらゆる下流細胞エキソン、例えば末端エキソン
およびそのポリアデニル化信号を包含する融合転写体の
発現を生じる。このようなベクターが遺伝子に組み込ま
れた場合、細胞スプライシング機構は、トラップ化遺伝
子の３’エキソンの上流のベクターコード配列をスプラ
イスする。このようなベクターの一利点は、３’遺伝子
トラップベクターの発現が遺伝子トラップカセット内の
プロモーターにより駆動され、宿主細胞中で通常は発現
される遺伝子への組込を必要としないことである（Zamb
rowicz et al., WO99/50426）。３’遺伝子トラップベ
クター中に組み入れられ得る転写プロモーターおよびエ
ンハンサーの例としては、ターゲッティングベクターに
関して前記したものが挙げられる。
【０１７６】プロモーターまたは３’遺伝子トラップベ
クターのための構造的構成成分として用いられるウイル
スベクター主鎖は、標的細胞のゲノムに挿入され得る広
範囲のベクターから選択され得る。適切な種鎖ベクター
としては、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウ
イルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病
ウイルス、α−ヘルペスウイルスベクター等が挙げられ
るが、これらに限定されない。ウイルスベクター、特に
非複製性細胞を修飾するのに適したウイルスベクターの
徹底的再検討、ならびに外因性ポリヌクレオチド配列の
発現を伴うこのようなベクターの使用方法は、Viral Ve
ctors: Gene Therapy and Neuroscience Applications,
Eds. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Dieg
o, 1995に見出される。
【０１７７】好ましくは、レトロウイルスベクターは、
遺伝子トラッピングのために用いられる。これらのベク
ターは、米国特許第5,449,614号に記載されているもの
と同様のレトロウイルスパッケージング細胞株とともに
用いられ得る。遺伝子修飾のための標的細胞として非ネ
ズミ哺乳類細胞が用いられる場合、適切なベクターをパ
ッケージするために両親和性または汎親和性パッケージ
ング細胞株が用いられ得る（Ory et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 93:11400-11406, 1996）。前記の３’
遺伝子トラップベクターを作製するために適合され得る
代表的レトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第
5,521,076号に記載されている。
【０１７８】遺伝子トラッピングベクターは、相同的組
換えに用いられるターゲッティングベクターに関して前
記で考察した１つ又はそれ以上の陽性マーカー遺伝子を
含有し得る。ターゲッティングベクターにおけるそれら
の使用と同様に、これらの陽性マーカーは、細胞ゲノム
にベクターを組み込まれた細胞を同定し、選択するため
に遺伝子トラッピングベクターに用いられる。マーカー
遺伝子は、ベクターが標的細胞ゲノムに組み込まれた場
所とは無関係な方式でマーカーが発現されるように、別
々のリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するよう工
学処理され得る。
【０１７９】遺伝子トラップベクターがかなり無作為的
方式で感染宿主細胞のゲノム中に組み込むとすると、崩
壊PFI-011遺伝子を有する遺伝子修飾化細胞は、無作為
ベクター組込を受けた細胞の集団から同定されねばなら
ない。好ましくは、細胞の集団における遺伝子修飾は、
細胞のゲノム中に見出される本質的にすべての遺伝子に
おける突然変異を集団が示すよう、十分な無作為性およ
び頻度を有して、崩壊PFI-011遺伝子を有する細胞が集
団から同定されるようにする（Zambrowicz et al., WO9
9/50426; Sands et al., WO98/14614参照）。
【０１８０】崩壊PFI-011遺伝子を含有する個々の突然
変異体細胞株は、例えば、PFI-011遺伝子配列中の集団
を同定するための逆転写およびＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
を用いて、突然変異化細胞の集団中で同定される。この
方法は、プールクローンにより能率的にされ得る。例え
ば、崩壊PFI-011遺伝子を含有する個々のクローンを見
出すために、遺伝子トラップベクター中でアンカー化さ
れたプライマーとPFI-011遺伝子配列中に置かれた他方
のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲが実行される。陽
性ＲＴ−ＰＣＲ結果は、ベクター配列がPFI-011遺伝子
転写体中でコード化されることを示すが、これは、PFI-
011遺伝子が遺伝子トラップ組込事象により崩壊されて
いたことを示す（例えば、Sands et al. WO98/14614参
照）。
【０１８１】時間的、空間的および誘導性遺伝子崩壊 内因性PFI-011遺伝子の機能的崩壊は、特定の発生また
は細胞周期段階（時間的）で、または特定の細胞型（空
間的）で起こり得る。PFI-011遺伝子崩壊は、ある条件
が存在する場合には、誘導性でもあり得る。組換え酵素
切り出し系、例えばCre-Lox系を用いて、特定の発生段
階で、特定の組織または細胞型において、あるいは特定
の環境条件下で、PFI-011遺伝子を活性化または不活性
化し得る。一般に、Cre-Lox技法を用いる方法は、Torre
s and Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional G
ene Targeting, Oxford University Press, 1997に記載
されているようにして実行される。Cre-Lox系に関して
記載されたのと同様の方法は、FLP-FRT系を利用して
も、用いられ得る。相同的組換えまたはウイルス挿入に
より遺伝子を条件付きで崩壊するための組換え酵素切り
出し系の使用に関する別の指針は、例えば米国特許第5,
626,159号、米国特許第5,527,695号、米国特許第5,434,
066号、WO98/29533、Orban et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 89:6861-65, 1992; O'Gorman et al., Scienc
e 251:1351-55, 1991;ならびにAkagi etal.,Nucleic Ac
ids Res. 25:1766-73, 1997に提示されている。１つよ
り多い組換え酵素系を用いて、動物細胞を遺伝子修飾し
得る。
【０１８２】時間的、空間的または誘導性方式で、組換
え酵素系、例えばCre-Lox系を用いてPFI-011遺伝子を崩
壊するために相同的組換えを用いる場合、PFI-011遺伝
子コード領域の一部は、loxP部位が側面に接するPFI-01
1遺伝子コード領域を包含するターゲッティング構築物
に置き換えられる。この遺伝子修飾を保有する動物細胞
は、機能的loxPフランク化PFI-011遺伝子を含有する。P
FI-011遺伝子崩壊の時間的、空間的または誘導性局面
は、それぞれ所望の空間的調節化、時間的調節化または
誘導性プロモーターの制御下で動物細胞中で発現される
付加的トランスジーン、Cre組換酵素えトランスジーン
の発現パターンにより引き起こされる。Cre組換え酵素
は、組換えのためのloxP部位を標的にする。したがっ
て、Cre発現が活性化されると、LoxP部位は、サンドイ
ッチ化PFI-011遺伝子コード配列を切り出すために組換
えを施されて、PFI-011遺伝子の機能的崩壊を生じる（R
ajewskiet al., J. Clin. Invest. 98:600-03, 1996; S
t.-Onge et al., Nucleic AcidsRes. 24:3875-77, 199
6; Agah et al., J. Clin. Invest. 100:169-79, 1997;
Brocard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1455
9-63, 1997; Feil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 93:10887-90, 1996; およびKuehn et al., Science 2
69:1427-29, 1995）。
【０１８３】Cre組換え酵素トランスジーンおよびloxｐ
−フランク化PFI-011遺伝子の両方を含有する細胞は、
標準トランスジェニック技法により生成され得る。PFI-
011遺伝子を時間的、空間的または条件付きに崩壊する
ための組換え酵素系特異的プロモーターの使用に関する
さらに別の指針は、例えば、Sauer, Meth. Enz. 225:89
0-900, 1993; Gu et al., Science 265:103-06, 1994;
Araki et al., J. Biochem. 122:977-82, 1997; Dymeck
i, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:6191-96, 1996およびMe
yers et al., Nature Genetics 18: 136-41, 1998に見
出される。
【０１８４】PFI-011遺伝子の誘導性崩壊は、テトラサ
イクリン応答性バイナリー系を用いることによっても成
し遂げられ得る（Gossen and Bujard, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 89:5547-51, 1992）。この系は、内因性PF
I-011遺伝子調節素子、ならびにテトラサイクリン制御
可能レプレッサー（TetR）を発現するトランスジーン中
にTetプロモーターを導入するために細胞を遺伝子修飾
することを包含する。このような細胞では、テトラサイ
クリンの投与はTetRを活性化し、これが順次、PFI-011
遺伝子発現を阻害し、したがってPFI-011遺伝子を機能
的に崩壊する（St.-Onge et al., Nucleic Acids Res.
24:3875-77, 1996、米国特許第5,922,927号）。
【０１８５】PFI-011遺伝子の時間的、空間的および誘
導性崩壊のための前記の系は、例えば、WO98/29533に記
載されているような遺伝子修飾の方法として遺伝子トラ
ッピングを用いる場合にも適合され得る。 遺伝子修飾動物細胞の作製 遺伝子修飾のための前記の方法を用いて、動物から得ら
れる事実上あらゆる種類の体細胞または幹細胞中のPFI-
011遺伝子を機能的に崩壊し得る。本発明の遺伝子修飾
化動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばヒト細胞およ
びトリ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。こ
れらの細胞は、あらゆる動物細胞株、例えば培養適合
化、腫瘍形成性、または形質転換化細胞株を遺伝子工学
処理することから得られるか、またはそれらは所望のPF
I-011遺伝子修飾を保有する遺伝子修飾化非ヒト哺乳類
から単離され得る。
【０１８６】細胞は、崩壊化PFI-011遺伝子に関してヘ
テロ接合性またはホモ接合性であり得る。PFI-011遺伝
子崩壊に関してホモ接合性である細胞（PFI-011-/-）を
得るためには、両方の対立遺伝子の直接連続ターゲッテ
ィングが実行され得る。この方法は、陽性選択可能マー
カーを再循環することにより促進され得る。この計画に
よれば、陽性選択可能マーカーをコードするヌクレオチ
ド配列は、Cre-Lox P系を用いて、一方の対立遺伝子の
崩壊後に除去される。したがって、その後の回のターゲ
ッティングに同一ベクターを用いて、２回目のPFI-011
遺伝子の対立遺伝子を崩壊し得る（Abuin and Bradley,
Mol. Cell. Biol. 16: 1851-56, 1996;Sedivy et al.,
T.I.G. 15:88-90, 1990; Cruz et al., Proc. Natl. A
cad. Sci.（USA）88: 7170-74, 1991; Mortensen et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）88:7036-40, 1991;
te Riele et al., Nature（London）348:649-651, 199
0）。
【０１８７】PFI-011-/-であるＥＳ細胞を得るための代
替的戦略は、PFI-011遺伝子崩壊に関してヘテロ接合性
である細胞（PFI-011+/-）の集団からの細胞のホモ接合
体化である。その方法は、選択可能薬剤耐性マーカーを
発現するPFI-011+/-標的化クローンが非常に高濃度に対
して選択される計画を用いる。この選択は、薬剤耐性マ
ーカーをコードする配列の２つのコピーを発現する細胞
を好のみ、したがってPFI-011遺伝子崩壊に関してホモ
接合性である（Mortensen et al., Mol. Cell.Bio. 12:
2391-95, 1992）。
【０１８８】所望の細胞または細胞株の遺伝子修飾後、
PFI-011遺伝子座は、当業界で既知の標準ＰＣＲによる
ＰＣＲ分析またはサザンブロッティング法により修飾の
部位として確証され得る（例えば、米国特許第4,683,20
2号およびErlich et al., Science 252:1643, 1991参
照）。PFI-011遺伝子の機能的崩壊のさらなる立証は、P
FI-011遺伝子メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベル
および／またはPFI-011ポリペプチドレベルがPFI-011遺
伝子を正常に発現する細胞中で低減される場合にも、成
され得る。PFI-011遺伝子ｍＲＮＡレベルの測定値は、
逆転写酵素媒介性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）、サザンブロット分析、またはin-situハイブリダ
イゼーションにより得られる。細胞により生成されるPF
I-011ポリペプチドレベルの定量は、例えば当業界で既
知の標準イムノアッセイ法により成され得る。このよう
なイムノアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、Ｅ
ＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定）、「サンド
イッチ」イムノアッセイ、免疫放射能測定検定、ゲル拡
散沈降反応、免疫拡散検定、in-situイムノアッセイ
（コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使
用）、ウエスタンブロット、二次元ゲル分析、沈降反
応、免疫蛍光検定、プロテインＡ検定および免疫電気泳
動検定といった技術を用いる競合的および非競合的検定
系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】好ましい遺伝子修飾化動物細胞は、胚幹
（ＥＳ）細胞およびＥＳ様細胞である。これらの細胞
は、種々の種、例えばマウス（Evans et al., Nature 1
29:154-156, 1981; Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 78:7634-7638, 1981）、ブタおよびヒツジ（Notani
anni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 43:255-260,
1991; Campbell et al., Nature 380:64-68, 1996）な
らびにヒトを含めた霊長類（Thomson et al.、米国特許
第5,843,780号、Thomson et al., Science 282:1145-11
47, 1995;およびThomson et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 92:7844-7848, 1995）の予備移植胚および芽細
胞から得られる。
【０１９０】これらの種類の細胞は、多能性である。即
ち、適正条件下では、それらは、３つの胚原基層：外胚
葉、中胚葉および内胚葉のすべてから得られる広範な種
々の細胞型に分化する。培養条件により、ＥＳ細胞の標
本は、幹細胞として無限に培養され、単一標本内の広範
な種々の異なる細胞型への分化を可能にし、あるいは特
定の細胞型、例えばマクロファージ様細胞、ニューロン
細胞、心筋細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨
格筋細胞、ケラチノサイトおよび造血細胞、例えば好酸
球、マスト細胞、赤芽球前駆細胞または巨核細胞への分
化を指図される。分化指図は、例えば以下に記載されて
いるような培養条件に特定の増殖因子またはマトリック
ス構成成分を含めることにより成し遂げられる：Keller
et al.,Curr. Opin. Cell Biol. 7:862-69, 1995; Li
et al., Curr. Biol. 8:971, 1998; Klug et al., J. C
lin. Invest. 98:216-24, 1996; Lieschke et al., Ex
p.Hematol. 23:328-34, 1995; Yamane et al.,Blood 9
0:3516-23, 1997; 及びびHirashima et al., Blood 93:
1253-63, 1999。
【０１９１】遺伝子修飾のために用いられる特定の胚幹
細胞株は、重要ではない。ネズミＥＳ細胞株の例として
は、ＡＢ−１（McMahon and Bradley, Cell 62:1073-8
5, 1990）、Ｅ１４（Hooper et al., Nature 326:292-9
5, 1987）、Ｄ３（Doetschmanet al., J. Embriol. Ex
p. Morph. 87:27-45, 1985）、ＣＣＥ（Robertson eta
l., Nature 323:445-48, 1986）、ＲＷ４（Genome Syst
ems, St. Louis, MO）およびＤＢＡ／１ＩａｃＪ（Roac
h et al., Exp. Cell Res. 221:520-25, 1995）が挙げ
られる。
【０１９２】ポリペプチドの産生 本発明によれば、本発明のポリペプチドの産生は、本発
明の１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドで形質転換さ
れた真核生物または原核生物発現宿主の慣用的栄養発酵
培地中での培養により実行され得る。適切な培地の選択
は、発現宿主の選定を基礎にし、および／または発現構
築物の調節要件を基礎にし得る。このような培地は、当
業者には周知である。培地は、所望により、汚染してい
る可能性のある他微生物より形質転換化発現宿主を好む
付加的構成成分を含有し得る。
【０１９３】したがって、本発明は、PFI-011活性を有
するポリペプチドの製造方法であって、（ａ）配列番号
１で示されるヌクレオチド配列、あるいはその誘導体、
相同体、変異体、類似体または断片で宿主細胞を形質転
換し、そして（ｂ）前記ポリペプチドの発現に適した条
件下で形質転換化宿主細胞を培養する工程から成る方法
も提供する。
【０１９４】本発明は、PFI-011活性を有するポリペプ
チドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発
現に適した条件下で、配列番号１で示されるヌクレオチ
ド配列、あるいはその誘導体、相同体、変異体、類似体
または断片で形質転換された宿主細胞を培養し、そして
（ｂ）宿主細胞培養から前記のポリペプチドを回収する
工程から成る方法にも関する。
【０１９５】本発明は、PFI-011活性を有するポリペプ
チドの製造方法であって、（ａ）配列番号１で示される
ヌクレオチド配列、あるいはその誘導体、相同体、変異
体、類似体または断片で宿主細胞を形質転換し、（ｂ）
前記のポリペプチドの発現に適した条件下で形質転換化
宿主細胞を培養し、そして（ｃ）宿主細胞培養から前記
のポリペプチドを回収する工程から成る方法にも関す
る。
【０１９６】リボザイム リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒し得る酵素性
ＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズムは、相
補的標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブ
リダイゼーションと、その後の核酸分子内分解性切断を
包含する。PFI-011ＲＮＡ配列の核酸分子内分解性切断
を特異的且つ有効に触媒する工学処理化ハンマーヘッド
モチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内である。
【０１９７】考え得るあらゆるＲＮＡ標的内の特異的リ
ボザイム切断部位は、以下の配列：GUA、GUUおよびGUC
を含むリボザイム切断部位に関して標的分子を走査する
ことにより、最初に同定される。一旦同定されれば、切
断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する15〜20リ
ボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチ
ド配列を操作不可能にさせ得る二次構造特徴に関して評
価され得る。候補標的の適切性は、リボヌクレアーゼ防
御検定を用いた相補的オリゴヌクレオチドによるハイブ
リダイゼーションに対する許容可能性を検査することに
よっても評価され得る。
【０１９８】本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ
分子ならびにリボザイムはともに、ＲＮＡ分子の合成に
関して当業界で既知のあらゆる方法により調製され得
る。これらの例としては、オリゴヌクレオチドを化学的
に合成するための技術、例えば固相ホスホラミダイト化
学合成が挙げられる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチ
センスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroま
たはin vivo転写により生成され得る。このようなＤＮ
Ａ配列は、T7またはSP6のような適切なＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーターを有する広範な種々のベクター中に組
み入れられ得る。
【０１９９】検出 PFI-011ポリヌクレオチドコード配列の存在は、配列番
号１で示される配列のプローブ、一部または断片を用い
たＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼ
ーションまたは増幅により検出され得る。核酸増幅ベー
スの検定は、PFI-011ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する形
質転換体を検出するためのPFI-011コード配列をベース
にしたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を包
含する。本明細書中で用いる場合、「オリゴヌクレオチ
ド」または「オリゴマー」とは、プローブまたはアンプ
リマーとして用いられ得る、少なくとも約10ヌクレオチ
ド、そして60ヌクレオチドという多くの、好ましくは約
15〜30ヌクレオチドの、さらに好ましくは約20〜25ヌク
レオチドの核酸配列を指す。好ましくは、オリゴヌクレ
オチドは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の
３’領域から得られる。
【０２００】例えば、タンパク質に特異的なポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体を用いることによりPFI-
011ポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々
のプロトコールは、当業界で既知である。例としては、
酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞分類
（ＦＡＣＳ）が挙げられる。PFI-011ポリペプチド上の
２つの非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗
体を用いる二部位モノクローナルベースイムノアッセイ
が好ましいが、しかし競合的結合検定も用いられ得る。
これらのおよびその他の検定は、特に、Hampton R et a
l.（1990, Serological Methods, A Laboratory Manua
l, APS Press, St Paul, MN, USA）およびMaddox DE et
al.（1983,J. Exp. Med. 15, 8:1211）に記載されてい
る。
【０２０１】広範な種々の標識および接合技術は当業者
には既知であって、種々の核酸およびアミノ酸検定に用
いられ得る。PFI-011ポリヌクレオチド配列を検定する
ための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプロ
ーブを生成するための手段としては、標識化ヌクレオチ
ドを用いたオリゴラベリング、ニックトランスレーショ
ン、末端ラベリングまたはＰＣＲ増幅が挙げられる。あ
るいは、PFI-011コード配列またはそのあらゆる部分
は、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクター中にクロ
ーン化され得る。このようなベクターは当業界で既知で
あり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラー
ゼ、例えばT7、T3またはSP6および標識化ヌクレオチド
の付加により、ＲＮＡプローブをin vitroで合成するた
めに用いられ得る。
【０２０２】多数の会社、例えば、Pharmacia Biotech
（Piscataway, NJ, USA）、Promega（Madison, WI, US
A）およびUS Biochemical Corporation（Cleveland, O
H, USA）が、これらの手法のための市販キットおよびプ
ロトコールを供給する。適切なレポーター分子または標
識としては、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物
質または色原性作用物質、ならびに基質、補助因子、阻
害剤、磁気粒子などが挙げられる。このような標識の使
用を教示する特許としては、米国特許出願第3817837
号、米国特許出願第3850752号、米国特許出願第3939350
号、米国特許出願第3996345号、米国特許出願第4277437
号、米国特許出願第4275149号および米国特許出願第436
6241号が挙げられる。組換え免疫グロブリンも、米国特
許出願第4816567号に示されているようにして産生され
得る。
【０２０３】特定の分子の発現を定量するためのもう一
つの方法としては、放射能標識（Melby PC et al., 199
3, J. Immunol. Methods Vol.159 P235-44）またはビオ
チニル化（Duplaa C et al., 1993, Aanl. Biochem. Vo
l.229 P36）ヌクレオチド、対照核酸の同時増幅、なら
びに実験結果が挿入される標準曲線が挙げられる。多標
本の定量は、当該オリゴマーが種々の稀釈液中に存在
し、分光測光的または熱量測定的応答が迅速な定量を提
供するＥＬＩＳＡフォーマットで検定を実行することに
より、スピードアップされ得る。
【０２０４】マーカー遺伝子発現の存在／非存在は当該
遺伝子が存在することも示唆するが、しかし、その存在
および発現は、確証される必要がある。例えば、PFI-01
1コード配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場
合、PFI-011コード領域を含有する組換え細胞は、マー
カー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるい
は、マーカー遺伝子は、単一プロモーターの制御下でPF
I-011コード配列と並列に置かれ得る。誘導または選択
に応答するマーカー遺伝子の発現は、通常は、同様にPF
I-011の発現を示す。
【０２０５】あるいは、PFI-011に関するコード配列を
含有し、PFI-011コード領域を発現する宿主細胞は、当
業者に既知の種々の手法により同定され得る。これらの
手法としては、核酸またはタンパク質の検出および／ま
たは定量のための膜ベースの、溶液ベースの、またはチ
ップベースの技法を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ
−ＲＮＡハイブリダイゼーション、およびタンパク質バ
イオアッセイまたはイムノアッセイ技術が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０２０６】抗体 本発明のアミノ酸配列は、アミノ酸配列に対する抗体を
生成する−例えば、標準技法の使用により−ためにも用
いられ得る。当業界で周知の手法が、PFI-011ポリペプ
チドに対する抗体の産生のために用いられ得る。このよ
うな抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、
キメラ、一本鎖、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生さ
れる単数または複数のＦａｂ断片が挙げられるが、これ
らに限定されない。中和抗体、すなわち、PFI-011ポリ
ペプチドの生物学的活性に拮抗する抗体が診断及び治療
のために特に好ましい。
【０２０７】抗体産生のためには、種々の宿主、例えば
ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等が、PFI-011ポリペプ
チドまたはそのあらゆる部分、変異体、相同体、断片、
類似体または誘導体、あるいは免疫原特性を保持するオ
リゴペプチドを用いた注射により免疫感作され得る。宿
主種によって、免疫応答を増大するために種々のアジュ
バントが用いられ得る。このようなアジュバントとして
は、フロイントアジュバント、無機ゲル、例えば水酸化
アルミニウム、ならびに界面活性物質、例えばリソレシ
チン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチ
ド、油エマルション、カギアナカサガイヘモシアニンお
よびジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定
されない。ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）および
コリネバクテリウム属のCorynebacterium parvumも用い
得るおそらくは有用なヒトアジュバントである。
【０２０８】アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体
は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供す
るあらゆる技法を用いて調製され得る。これらの例とし
ては、KoehlerとMilstein（1975, Nature Vol.256 P495
-497）により初めて記載されたハイブリドーマ技法、ヒ
トＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kosbor et al.（1983）I
mmunol. Today Vol.4 p72; Cote et al.（1983）Procee
dings of the National Academy of Science（USA）Vo
l.80 p2026-2030）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法
（Cole et al.（1985）Monoclonal Antibodies and Can
cer Therapy, Alan R Liss Inc. pp.77-96）が挙げられ
るが、これらに限定されない。さらに、「キメラ抗体」
の産生のために開発された技法、適切な抗原特異性およ
び生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝
子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングが用いられ得
る（Morrison et al.（1984）Proceedings of the Nati
onal Academy of Sciences（USA）Vol 81 p6851-6855;
Neuberger et al.（1984）Nature Vol312 p604-608; Ta
keda et al.（1985）Nature Vol 314 p452-454）。ある
いは、一本鎖抗体の製造に関して記載された技法（米国
特許出願第4946779号）は、ポリペプチド特異的一本鎖
抗体を製造するために適合され得る。
【０２０９】抗体は、Orlandi et al.（1989, Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences（USA）Vol.
86 p3833-3837）およびWinter G and Milstein C（199
1; Nature Vol349 p293-299）に開示されているよう
に、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導すること
により、またはの高特異的結合試薬の組換え免疫グロブ
リンライブラリーまたはパネルのスクリーニングよって
も産生され得る。
【０２１０】PFI-011に関する特異的結合部位を含有す
る抗体断片も生成され得る。例えば、このような断片と
しては、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ
（ａｂ’）2断片、およびＦ（ａｂ’）2断片のジスルフ
ィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ断片
が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆ
ａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノク
ローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定を可能にする
ために構築され得る（Huse WD et al.,（1989）Science
Vol 256 p1275-1281）。
【０２１１】代替的技法は、例えばファージが非常に種
々の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するその被膜上にｓ
ｃＦｖ断片を発現するファージ表示ライブラリーのスク
リーニングを包含する。この技法は、当業界で周知であ
る。PFI-011特異的抗体は、PFI-011受容体の発現に関連
した症状および疾患の診断に有用である。競合的結合の
ための種々のプロトコールまたは確立された特異性を有
するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた
イムノラジオメトリックアッセイは、当業界で周知であ
る。このようなイムノアッセイは、典型的には、PFI-01
1ポリペプチドとその特異的抗体（または同様のPFI-011
結合分子）との間の複合体の形成、ならびに複合体形成
の測定を包含する。特定のPFI-011タンパク質上の２つ
の非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗体を
用いた二部位モノクローナルベースイムノアッセイが好
ましいが、しかし競合的結合検定も用いられ得る。これ
らの検定は、Maddox DE et al.（1983, Journal of Exp
erimental Medicine Vol 158 P1211）に記載されてい
る。
【０２１２】抗PFI-011抗体は、異常信号伝達を含めた
障害、またはPFI-011受容体の異常発現を特徴とするそ
の他の障害または疾患の診断に有用である。PFI-011に
関する診断検定としては、ヒト体液、細胞、組織、ある
いはこのような組織の切片または抽出物中のPFI-011ポ
リペプチドを検出するために抗体および標識を用いる方
法が挙げられる。本発明のポリペプチドおよび抗体は、
修飾を伴って、または伴わずに用いられ得る。しばし
ば、ポリペプチドおよび抗体は、受容体分子を用いて、
共有的にまたは非共有的に、それらを接合することによ
り標識される。広範な種々の受容体分子は、当業者に既
知である。
【０２１３】抗体は、以下の（ａ）本発明の抗体を提供
し、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下
で前記の抗体とともに生物学的標本をインキュベート
し、そして（ｃ）前記の抗体を包含する抗体−抗原複合
体が形成されたか否かを確定する工程を包含する方法に
より、生物学的標本中に存在する本発明のポリペプチド
を検出する方法に用いられ得る。
【０２１４】本発明の抗体は、固体支持体に結合される
か、および／または適切な試薬、対照、使用説明書等と
ともに適切な容器中のキットに包装され得る。 検定／同定方法 本発明は、細胞（例えばヒト細胞）中のPFI-011の存在
を検出するための検定方法であって、（ａ）配列番号１
で示されるＤＮＡ配列またはその対立遺伝子変異から確
定されるようなPFI-011特異的であるＰＣＲプライマー
対を用いて、このような細胞からのＲＮＡ（例えば総Ｒ
ＮＡ）で逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）を実施し、そして（ｂ）例えばアガロースゲル電
気泳動により適切にサイジングされたＰＣＲ断片の出現
を検定する工程からなる方法にも関する。
【０２１５】本発明のポリペプチドを用いてポリペプチ
ドのモジュレーター（拮抗薬または作動薬）に関してス
クリーニングし得る多数の検定がある。このような検定
の例としては、以下のものが挙げられる： 機能検定−その拮抗薬を同定するための受容体のスクリ
ーニング方法の一例は、ｃＡＭＰまたはアデニレートシ
クラーゼ蓄積に及ぼす抑制または刺激作用をモニタリン
グすることである。このような検定は、細胞表面発現の
ために本発明の受容体で哺乳類細胞をトランスフェクト
することを包含する。次に細胞は、推定上の拮抗薬に曝
露され、ｃＡＭＰ蓄積の量が測定される。推定拮抗薬が
受容体と結合すると、受容体媒介性ｃＡＭＰまたはアデ
ニレートシクラーゼ活性のレベルは増大または低減す
る。
【０２１６】蛍光測光的画像形成平板読取器（Ｆｌｉｐ
Ｒ）を用いた機能検定−スクリーニングのために用いら
れる技法は、受容体活性化により引き起こされる細胞内
カルシウムまたは細胞外ｐＨ変化を測定する系における
本発明の受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェ
クト化HEK293細胞）の使用を含む。この技法では、本発
明の受容体を発現する細胞は、二次メッセンジャー応
答、例えば信号伝達、カルシウムレベルの変化またはｐ
Ｈ変化を引き起こす化合物（例えば、小分子、ペプチ
ド、脂質、ヌクレオチドまたは糖タンパク質）と接触さ
れ得る。これらの変化は、考え得る化合物が受容体を活
性化するかまたは阻害するかを確定するために用いられ
る。
【０２１７】配位子結合検定−この種類の検定は、酵母
化合物の結合を検査し得るが、この場合、本発明の受容
体を含有する細胞との付着が、候補化合物と直接または
間接的に会合した標識により、または標識化競合物との
競合を包含する検定で検出される。化合物が受容体を活
性化するかまたは阻害するかを確定するスクリーニング
を実行するための標準検定は、当業者には十分理解され
る。
【０２１８】したがって、本発明は、PFI-011の活性お
よび／またはその発現に影響を及ぼす（例えば拮抗し、
作動しまたはそうでなければ修飾する）作用物質（例え
ば、化合物、その他の物質またはそれを包含する組成
物）を同定する方法であって、PFI-011またはそれをコ
ードするヌクレオチド配列を作用物質と接触させて、次
にPFI-011の活性および／またはその発現を測定する工
程を包含する方法にも関する。
【０２１９】本発明は、PFI-011の活性および／または
その発現に選択的に影響を及ぼす（例えば拮抗し、作動
しまたはそうでなければ修飾する）作用物質（例えば、
化合物、その他の物質またはそれを包含する組成物）を
同定する方法であって、PFI-011またはそれをコードす
るヌクレオチド配列を作用物質と接触させて、次にPFI-
011の活性および／またはその発現を測定する工程を包
含する方法にも関する。
【０２２０】本発明は、PFI-011の活性および／または
その発現に影響を及ぼす（例えば拮抗し、作動しまたは
そうでなければ修飾する）作用物質（例えば、化合物、
その他の物質またはそれを包含する組成物）を同定する
方法であって、（ａ）配列番号１で示されるＤＮＡ配列
またはその対立遺伝子変異を包含する組換えＤＮＡを組
み入れられた細胞系、あるいは（ｂ）天然に選択的にPF
I-011を発現する細胞集団または細胞株中で、作用物質
の存在下で、または作用物質の付加後に、PFI-011の活
性および／またはその発現を測定する工程を包含する方
法にも関する。好ましくは、PFI-011の活性は、前記の
検定方法により確定される。
【０２２１】本発明は、PFI-011の活性および／または
その発現に選択的に影響を及ぼす（例えば拮抗し、作動
しまたはそうでなければ修飾する）作用物質（例えば、
化合物、その他の物質またはそれを包含する組成物）を
同定する方法であって、（ａ）配列番号１で示されるＤ
ＮＡ配列またはその対立遺伝子変異を包含する組換えＤ
ＮＡを組み入れられた細胞系、あるいは（ｂ）天然に選
択的にPFI-011を発現する細胞集団または細胞株中で、
作用物質の存在下で、または作用物質の付加後に、PFI-
011の活性および／またはその発現を測定する工程を包
含する方法にも関する。好ましくは、PFI-011の活性
は、前記の検定方法により確定される。
【０２２２】本発明は、PFI-011（あるいはその誘導
体、相同体、変異体、類似体または断片）活性またはそ
れをコードするヌクレオチド配列（あるいはその誘導
体、相同体、変異体、類似体または断片）の発現の調整
（好ましくは特異的調整）のための作用物質のスクリー
ニング方法であって、（ａ）候補作用物質を提供し、
（ｂ）適切な条件下で調整を可能にするのに十分な時
間、PFI-011（あるいはその誘導体、相同体、変異体、
類似体または断片）またはそれをコードするヌクレオチ
ド配列（あるいはその誘導体、相同体、変異体、類似体
または断片）を候補作用物質と併合し、そして（ｃ）候
補作用物質がPFI-011（あるいはその誘導体、相同体、
変異体、類似体または断片）活性またはそれをコードす
るヌクレオチド配列（あるいはその誘導体、相同体、変
異体、類似体または断片）の発現を調整したか否かを確
証するために、PFI-011（あるいはその誘導体、相同
体、変異体、類似体または断片）またはそれをコードす
るヌクレオチド配列（あるいはその誘導体、相同体、変
異体、類似体または断片）に対する候補作用物質の調整
を検出する工程を包含する方法にも関する。
【０２２３】本発明は、PFI-011（あるいはその誘導
体、相同体、変異体、類似体または断片）またはそれを
コードするヌクレオチド配列（あるいはその誘導体、相
同体、変異体、類似体または断片）との特異的結合親和
性に関して作用物質をスクリーニングする方法であっ
て、（ａ）候補作用物質を提供し、（ｂ）適切な条件下
で結合を可能にするのに十分な時間、PFI-011（あるい
はその誘導体、相同体、変異体、類似体または断片）ま
たはそれをコードするヌクレオチド配列（あるいはその
誘導体、相同体、変異体、類似体または断片）を候補作
用物質と併合し、そして（ｃ）候補作用物質がPFI-011
（あるいはその誘導体、相同体、変異体、類似体または
断片）活性またはそれをコードするヌクレオチド配列
（あるいはその誘導体、相同体、変異体、類似体または
断片）と結合したか否かを確証するために、PFI-011
（あるいはその誘導体、相同体、変異体、類似体または
断片）またはそれをコードするヌクレオチド配列（ある
いはその誘導体、相同体、変異体、類似体または断片）
との候補作用物質の結合を検出する工程を包含する方法
にも関する。
【０２２４】したがって、本発明のある種の実施態様で
は、PFI-011あるいはその変異体、相同体、断片、類似
体または誘導体、および／またはPFI-011あるいはその
変異体、相同体、断片、類似体または誘導体を発現する
細胞株を用いて、PFI-011活性のモジュレーター（例え
ば、拮抗薬または作動薬）として作用する抗体、ペプチ
ドまたはその他の作用物質、例えば有機または無機分子
に関して、あるいはその発現に関してスクリーニング
し、それにより受容体を調整し得る治療薬を同定し得
る。あるいは、組換え的に発現されたPFI-011あるいは
その変異体、相同体、断片、類似体または誘導体、もし
くはPFI-011あるいはその変異体、相同体、断片、類似
体または誘導体を発現する細胞株を用いた組合せ化学に
より作製されるペプチドライブラリーまたは有機ライブ
ラリーのスクリーニングは、受容体を調整することによ
り機能する治療薬の同定に有用である。合成化合物、天
然生成物、ならびに考え得る生物学的に活性な物質のそ
の他の供給源は、当業者にはルーチンであると思われる
多数の方法で、スクリーニングされ得る。例えば、PFI-
011のＮ−末端領域をコードするヌクレオチド配列は、P
FI-011活性のアロステリックモジュレーター（作動薬ま
たは拮抗薬）のスクリーニングのために用いられ得る細
胞株中で発現され得る。
【０２２５】PFI-011ポリペプチド、その免疫原性断片
またはそのオリゴペプチドは、種々の薬剤スクリーニン
グ技法のいずれかにおいて、治療化合物をスクリーニン
グするために用いられ得る。このような検定に用いられ
るポリペプチドは、溶液中に遊離され、固体支持体に添
付され、細胞表面に保持され、または細胞内に置かれ
る。PFI-011ポリペプチドと検査される作用物質との間
の結合複合体の形成は、測定され得る。
【０２２６】したがって、本発明は、PFI-011のまたはP
FI-011の、あるいはその一部の、あるいはその変異体、
相同体、断片、類似体または誘導体の発現の調整（好ま
しくは特異的調整、例えば特異的結合親和性）のための
１つまたは複数の化合物のスクリーニング方法であっ
て、１つ又は複数の化合物を提供し；適切な条件下で調
整を可能にするのに十分な時間、PFI-011またはそれを
コードするヌクレオチド配列、あるいはその一部、ある
いはその変異体、相同体、断片、類似体または誘導体を
１つまたは複数の各々の化合物と併合し；そしてPFI-01
1あるいはその一部、あるいはその変異体、相同体、断
片、類似体または誘導体の、複数の各々の化合物との結
合を検出して、それによりPFI-011またはそれをコード
するヌクレオチド配列を調整する単数または複数の化合
物を同定する方法に関する。このような検定において
は、複数の化合物は、当業者に既知の組合せ化学技法に
より製造され得る。
【０２２７】薬剤スクリーニングのための別の技法は、
PFI-011ポリペプチドとの適切な結合親和性を有する化
合物の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を提供
し、Geysen, WO 84/03564（1984年9月13日公開）に詳細
に記載されている方法を基礎にする。要するに、多数の
異なる小ペプチド被験化合物が固体基質、例えばプラス
チックピンまたは何らかのその他の表面に合成される。
ペプチド被験化合物をPFI-011断片と反応させ、洗浄す
る。次に、例えば、当業界で周知の方法を適切に適合さ
せることにより、結合PFI-011を検出する。精製PFI-011
は、前記の薬剤スクリーニング法に用いるために、プレ
ート上に直接被覆され得る。あるいは、非中和抗体を用
いてペプチドを捕獲し、それを固体支持体上に固定化し
得る。
【０２２８】本発明は、 PFI-011ポリペプチドを結合し
得る中和抗体が、PFI-011を結合するために被験化合物
と特異的に競合する競合的薬剤スクリーニング検定の使
用も意図する。このようにして、抗体を用いて、１つ又
はそれ以上の抗原決定基をPFI-011と共有する任意のペ
プチドの存在を検出し得る。本発明の検定方法は、高ス
ループットスクリーン（ＨＴＳ）であり得る。この点
で、WO84/03564の教示は、本発明のPFI-011に関して適
合され得る。
【０２２９】米国特許出願第5738985号の教示も、本発
明の検定方法に適合され得る。 作用物質 本発明は、本発明の検定方法および同定方法により同定
される１つ又はそれ以上の作用物質も提供する。本発明
の作用物質は、例えば有機化合物または無機化合物であ
り得る。作用物質は、例えば配列番号１で示される配列
の全部または一部に対するアンチセンスであるヌクレオ
チド配列であり得る。
【０２３０】本発明はさらに、薬剤として用いるため
の、本発明の作用物質（あるいは製薬上許容可能なその
塩、または製薬上許容可能なその溶媒和物）または前記
のいずれかを含有する製剤組成物を提供する。本発明
は、PFI-011活性に影響を及ぼす（例えば、そのＧＰＣ
Ｒ活性を拮抗し、調整し、または作動する）作用物質の
使用にも関する。
【０２３１】診断用 本発明は、PFI-011ポリヌクレオチド配列の検出のため
の診断用組成物も提供する。診断用組成物は、配列番号
１で示される配列、あるいはその変異体、相同体、断
片、類似体またはその誘導体、あるいは配列番号１で示
されるヌクレオチド配列の全部または一部、あるいはそ
の対立遺伝子変異とハイブリダイズし得る配列を包含し
得る。
【０２３２】疾患の診断のための基礎を提供するため
に、PFI-011ポリペプチド発現からの正常または標準値
が確定される必要がある。これは、動物またはヒトの正
常被験者から採取した体液または細胞抽出物を、当業界
で周知の複合体形成に適した条件下でPFI-011ポリペプ
チドに対する抗体と併合することにより成し遂げられ
る。標準複合体形成の量は、それを陽性対照の稀釈シリ
ーズと比較することにより定量され得るが、この場合、
既知量の抗体が既知濃度の精製PFI-011ポリペプチドと
併合される。次に、正常標本から得られた標準値を、PF
I-011ポリペプチド発現に関連する障害または疾患に罹
患した可能性のある被験者からの標本から得られた値と
比較する。標準値と被験者基との間の偏差は、疾患状態
の存在を確定する。
【０２３３】PFI-011ポリヌクレオチド、あるいはその
任意の一部は、診断および／または治療用化合物に関す
る基礎を提供し得る。診断目的のために、PFI-011ポリ
ヌクレオチド配列を用いて、PFI-011活性が関連し得る
症状、障害または疾患における遺伝子発現を検出し、定
量し得る。PFI-011コードポリヌクレオチド配列は、PFI
-011の発現に起因する疾患の診断のために用い得る。例
えば、PFI-011をコードするポリヌクレオチド配列は、P
FI-011発現における異常を検出するために、生検または
剖検からの組織、あるいは生物学的流体、例えば血清、
滑液または腫瘍剖検のハイブリダイゼーションまたはＰ
ＣＲ検定に用いられ得る。このような定性的または定量
的方法の形態賭しては、サザンまたはノーザン分析、ド
ットブロットまたはその他の膜ベースの技法；ＰＣＲ技
法；浸漬、ピンまたはチップ技法；ならびにＥＬＩＳＡ
またはその他の多標本フォーマット技法が挙げられる。
これらの技法はすべて、当業界で周知であって、実際、
多数の市販の診断キットの基礎である。
【０２３４】このような検定は、特定の療法的治療レジ
メの効力を評価するために適合させ得るし、動物試験
に、臨床試験にまたは個々の患者の治療のモニタリング
に用いられ得る。疾患の診断のための基礎を提供するた
めに、PFI-011発現に関する正常または標準値が確定さ
れる必要がある。これは、動物またはヒトの正常被験者
から採取した体液または細胞抽出物を、ハイブリダイゼ
ーションまたは増幅に適した条件下でPFI-011またはそ
の一部と併合することにより成し遂げられる。標準ハイ
ブリダイゼーションは、正常被験者に関して得られた値
を、既知量の精製PFI-011が用いられる同一実験で実行
された陽性対照の稀釈シリーズと比較することにより定
量され得る。正常標本から得られた標準値を、PFI-011
コード配列の発現に関連する障害または疾患に罹患した
可能性のある被験者からの標本から得られた値と比較す
る。標準値と被験者基との間の偏差は、疾患状態の存在
を確定する。疾患が確定された場合、既存の治療薬が投
与され、治療プロフィールまたは値が生成される。最後
に、定期的ベースで検定を反復して、その値が正常また
は標準パターンに向かって進行するか逆戻りするかを評
価し得る。成功例の治療プロフィールを用いて、数日間
または数ヶ月間の治療効果を示し得る。
【０２３５】したがって、本発明は、例えば、疾患状態
におけるPFI-011レベルを検出し、定量するために診断
的に用いられる抗PFI-011抗体を産生するための、PFI-0
11ポリペプチド、あるいはその変異体、相同体、断片、
類似体または誘導体の使用に関する。本発明はさらに、
陽性対照および抗PFI-011抗体として用いられ得る精製P
FI-011を包含する細胞および組織中のPFI-011の検出の
ための診断検定およびキットに関する。このような抗体
は、PFI-011タンパク質の発現または欠失、あるいはそ
の変異体、相同体、断片、類似体または誘導体の発現に
関連したあらゆる疾患状態または症状を検出するため
に、溶液ベース、膜ベースまたは組織ベースの技法に用
いられ得る。
【０２３６】プローブ 本発明の別の局面は、PFI-011コード領域をコードす
る、ゲノム配列を含めたポリヌクレオチド配列、または
密接に関連した分子、例えば対立遺伝子を検出し得る核
酸ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブの提供
である。プローブの特異性、即ち、それが高保存、保存
または非保存領域またはドメインのいずれから得られる
か、そしてハイブリダイゼーションまたは増幅の緊縮度
（高、中または低）は、プローブが天然PFI-011コード
配列だけを同定するか、あるいは関連配列を同定するか
を確定する。関連核酸配列の欠失に関するプローブは、
PFI-011ポリヌクレオチドの保存または高保存ヌクレオ
チド領域、例えば３’領域から選択され、このようなプ
ローブは、縮重プローブのプール中で用いられる。同一
核酸配列の検出のためには、あるいは最大特異性が望ま
しい場合には、核酸プローブは非保存ヌクレオチド領域
またはPFI-011ポリヌクレオチドの独特の領域から選択
される。本明細書中で用いる場合、「非保存ヌクレオチ
ド領域」とは、本明細書中に開示されたPFI-011コード
配列に独特であり、そして関連配列では生じないヌクレ
オチド領域を指す。
【０２３７】米国特許出願第4683195号、米国特許出願
第4800195号および米国特許出願第4965188号に記載され
ているようなＰＣＲは、PFI-011配列を基礎にしたオリ
ゴヌクレオチドに関する付加的用途を提供する。このよ
うなオリゴマーは一般に、キメラ合成されるが、しかし
それらは酵素的に生成され、または組換え体供給源から
生成され得る。オリゴマーは一般に、特定の遺伝子また
は条件の同定のために最適化された条件下で用いられ
る、一方はセンス配向（５’→３’）を有し、もう一方
はアンチセンス配向（３’←５’）である２つのヌクレ
オチド配列を包含する。入れ子式の組のオリゴマーかあ
るいはオリゴマーの縮重プールでもある、同一の２つの
オリゴマーは、密接に関連したＤＮＡまたはＲＮＡ配列
の検出および／または定量のために、低緊縮条件で用い
られ得る。
【０２３８】PFI-011に関する核酸配列は、内因性ゲノ
ム配列をマッピングするために、前記と同様のハイブリ
ダイゼーションプローブを生成するためにも用いられ得
る。配列は、周知の技法を用いて、特定の染色体に、ま
たは染色体の特定の領域にマッピングされ得る。これら
の例としては、染色体スプレッドとのin-situハイブリ
ダイゼーション（Verma et al.（1988）Human Chromoso
mes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press,
New York City, USA）、フローソーテッド染色体調
製、または人工染色体構築、例えば、酵母菌人工染色体
（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌ＰＩ構
築、または単一染色体ｃＤＮＡライブラリーの構築が挙
げられる。
【０２３９】染色体調製物のin-situハイブリダイゼー
ションおよび物理的マッピング技法、例えば確立された
染色体マーカーを用いた連鎖分析は、遺伝子地図を拡張
するには有益でない。遺伝子地図の例は、Science（199
5; 270:410f and 1994; 265:1981f）に見出され得る。
しばしば、別の哺乳類種の染色体上の遺伝子の配置は、
特定のヒト染色体の数または腕が分からない場合でも、
関連マーカーを明示し得る。新規の配列は、物理的マッ
ピングにより、染色体腕またはその一部に割り当てられ
得る。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子
発見技術を用いて疾患遺伝子を探索している研究者に有
益な情報を提供する。疾病または症候、例えば毛細血管
拡張性運動失調（ＡＴ）が遺伝子連鎖により特定のゲノ
ム領域、例えばＡＴ−１lq22-23（Gatti et al（1988）
Nature 336:577-580）に大まかに局限されると、その領
域に対するあらゆる配列マッピングはさらなる研究のた
めの関連または調節遺伝子を示し得る。本発明のヌクレ
オチド配列は、正常、キャリアまたは罹患個体間の翻
訳、逆位等による染色体位置の差を検出するために用い
られ得る。
【０２４０】製剤 本発明は、PFI-011活性のためにそれを必要とする個体
を治療するための製剤組成物であって、前記の活性を調
整する（例えば拮抗するかまたは作動する）治療的有効
量の作用物質、ならびに製薬上許容可能な担体、希釈
剤、賦形剤またはアジュバントを包含する組成物も提供
する。
【０２４１】したがって、本発明は、本発明の作用物質
（本発明のヌクレオチド配列の発現パターンまたはその
発現生成物の活性を調整し得る作用物質、および／また
は本発明の検定により同定される作用物質）を包含する
製剤組成物も包含する。これに関して、そして特にヒト
治療に関しては、本発明の薬剤が単独で投与され得る場
合でも、それらは一般に、意図された投与経路および標
準製薬実施に関して選択される製剤担体、アジュバン
ト、賦形剤または希釈剤との混和物で投与される。
【０２４２】例として、本発明の製剤組成物中では、本
発明の作用物質は、あらゆる適切な単数または複数の結
合剤、滑剤、沈澱防止剤、コーティング剤または可溶化
剤と混和され得る。概して、本発明の作用物質の治療的
に有効な毎日の経口または静脈内用量は、治療される被
験者の体重１kg当たり0.01〜50 mg、好ましくは0.1〜20
mg/kgの範囲であると思われる。本発明の作用物質は、
0.001〜10 mg/kg/時間の範囲であると思われる用量で、
静脈内注入によっても投与され得る。
【０２４３】したがって、本発明は、PFI-011活性によ
る、それを必要とする個体を治療するための方法であっ
て、有効量の本発明の製剤組成物を前記の個体に投与す
ることを包含する方法も提供する。典型的には、医者
は、個々の患者に最も適した実際投与量を確定する。そ
れは、特定の患者の年齢、体重、性別および応答に伴っ
て変わる。前記の投与量は、平均的な場合の例である。
もちろん、より高い用量がよい、あるいはより低い用量
がよいといった個々の場合があり得るが、これらは本発
明の範囲内である。
【０２４４】適切な場合には、製剤組成物は、吸入によ
り、座薬またはペッサリーの形態で、皮膚パッチの使用
により、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散粉
の形態で局所的に、賦形剤、例えばデンプンまたはラク
トースを含有する錠剤の形態で、あるいは単独でまたは
賦形剤との混和物でカプセルまたは小卵中に、あるいは
風味剤または着色剤を含有するエリキシル、溶液または
懸濁液の形態で経口的に、投与され得るし、あるいはそ
れらは非経口的に、例えば洞内、静脈内、筋内、または
皮下的に注入され得る。非経口投与に関しては、組成物
は、多の物質、例えば血液と等張の溶液を作るのに十分
な塩または単糖を含有し得る滅菌水性溶液の形態で最良
に用いられ得る。頬または舌下投与のためには、組成物
は、慣用的頬で処方され得る錠剤または舐剤の形態で投
与され得る。
【０２４５】被験者（例えば患者）への経口、非経口、
頬および舌下投与のためには、本発明の作用物質の１日
投与レベルは、典型的には10〜500 mg（1回または何回
かに分けた用量）であり得る。したがって、そして例と
して、錠剤またはカプセルは、5〜100 mgの、単一であ
るいは適切な場合には２つまたはそれ以上を同時に投与
するための作用物質を含有し得る。持放性処方物で本発
明の作用物質を投与することもできる。
【０２４６】いくつかの用途においては、一般にヒトで
は、本発明の作用物質の経口投与が好ましい経路であ
り、最も便利であり、そしていくつかの場合には、他の
投与経路、例えば洞内（i.c.）投与に関連した欠点を回
避し得る。受容者が経口投与後の嚥下障害または薬剤吸
収障害に罹患している状況では、薬剤は、非経口的、舌
下または頬に投与し得る。
【０２４７】獣医学的使用のためには、本発明の作用物
質は、典型的には、通常獣医学業務にしたがって適切に
許容可能な処方物として投与され、獣医師は、特定の動
物に最も適した投与レジメンおよび経路を確定する。し
かしながら、ヒト治療の場合と同様に、獣医学的処置の
ために作用物質単独で投与することができる。典型的に
は、製剤組成物−ヒトまたは動物用途のためであり得る
−製薬上許容可能な稀釈剤、担体、賦形剤またはアジュ
バントのいずれか１つまたはそれ以上を包含する。製薬
上許容可能な担体、賦形剤、アジュバントまたは稀釈剤
の選定は、意図される投与経路および標準製薬実施に関
して選択され得る。前記のように、製剤組成物は、担
体、賦形剤、アジュバントまたは稀釈剤として、または
その他に、あらゆる適切な単数または複数の結合剤、滑
剤、沈澱防止剤、コーティング剤または可溶化剤と混和
され得る。
【０２４８】本発明のいくつかの実施態様では、製剤組
成物は、１つ又はそれ以上の：本発明の検定によりスク
リーニングされた作用物質；その誘導体、断片、相同
体、類似体または変異体、あるいは配列番号１で示され
るヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る配列を含め
た配列番号１または配列番号２と相互作用し得る作用物
質を包含する。
【０２４９】PFI-011ｍＲＮＡを脱安定化し、またはPFI
-011の翻訳を阻害するよう機能する、オリゴヌクレオチ
ド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ならび
にリボザイムは、本発明の範囲内に含まれる。PFI-011
アンチセンス分子は、例えばPFI-011活性の増大に関連
した種々の異常症状の治療のための基礎を提供し得る。
【０２５０】レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペ
スまたはワクシニアウイルスから、あるいは種々の細菌
プラスミドから得られる発現ベクターは、標的化細胞集
団への組換えPFI-011センスまたはアンチセンス分子の
デリバリーのために用いられ得る。当業者に周知の方法
を用いて、PFI-011を含有する組換えベクターを構築し
得る。あるいは、組換えPFI-011は、リポソーム中で標
的細胞にデリバリーされ得る。
【０２５１】全長ｃＤＮＡおよび／またはその調節要素
は、遺伝子機能のセンス（Youssoufian H and HF Lodis
h（1993）Mol Cell Biol. 13:98-104）またはアンチセ
ンス（Eguchi et al（1991）Annu Rev Biochem. 60:631
-652）研究における道具としてPFI-011を研究者が用い
得るようにする。ｃＤＮＡから設計されたオリゴヌクレ
オチド、またはゲノムＤＮＡから得られた制御配列は、
発現を阻害するためにin vitroまたはin vivoで用いら
れ得る。このような技法は、目下当業界で周知であり、
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそ
れより大きい断片は、コードまたは制御領域に沿った種
々の位置から設計され得る。20ヌクレオチド長であり得
る適切なオリゴヌクレオチドは、ヒトライブラリーから
PFI-011配列または密接に関連した分子を単離するため
に用いられ得る。
【０２５２】さらに、PFI-011発現は、PFI-011活性を遮
断するのが好ましい条件で高レベルのPFI-011断片を発
現する発現ベクターを用いて細胞または組織をトランス
フェクトすることにより、調整され得る。このような構
築物は、非翻訳可能センスまたはアンチセンス配列で細
胞を見たし得る。ＤＮＡ中への組込の非存在下でも、こ
のようなベクターは、ベクターのすべてのコピーが内因
性ヌクレアーゼにより無力化されるまで、ＲＮＡ分子を
転写し続け得る。このような一過性発現は、非複製ベク
ターにより１ヶ月またはそれ以上存続し、そして適切な
複製要素がベクター系の一部である場合には、それより
長いことさえある。
【０２５３】遺伝子発現の修飾は、PFI-011遺伝子の制
御領域、例えばプロモーター、エンハンサーおよびイン
トロンに対するアンチセンス配列を設計することにより
得られ得る。転写開始部位、例えばリーダー配列の-10
〜+10領域から得られるオリゴヌクレオチドが好まし
い。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、転写体が
リボソームと結合できないようにすることにより、ｍＲ
ＮＡの翻訳を遮断するよう設計され得る。同様に、「三
重らせん」塩基対合としても知られているHogeboom塩基
対合を用いて、阻害は成し遂げられ得る。三重らせん対
合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合の
ために十分に開く二重らせんの能力を危うくする。
【０２５４】したがって、本発明は、本発明の作用物質
（または製薬上許容可能なその塩、または製薬上許容可
能なその溶媒和物）を、製薬上許容可能な稀釈剤、アジ
ュバント、賦形剤または担体とともに包含する製剤組成
物を提供する。製剤組成物は、獣医学的（即ち動物）用
途のためまたはヒト用途のためであり得る。
【０２５５】したがって、本発明は、製薬上許容可能な
希釈剤、担体、賦形剤またはアジュバント（その組合せ
を含む）との混和物中のPFI-011タンパク質（アンチセ
ンス核酸配列を含む）の有効量のモジュレーター（例え
ば、拮抗薬または作動薬）を包含する製剤組成物にも関
する。本発明は、PFI-011ポリヌクレオチド配列の全部
または一部、PFI-011アンチセンス分子、PFI-011生物活
性を有するPFI-011ポリペプチド、タンパク質、ペプチ
ドまたは有機モジュレーター、例えば拮抗薬（抗体を含
む）または作動薬、を単独で、または少なくとも１つの
その他の作用物質、例えば安定化化合物と組合せて包含
し得る、そしてあらゆる滅菌性、生物適合性の製剤担
体、例えば食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび
水（これらに限定されない）中で投与され得る製剤組成
物に関する。
【０２５６】一般的方法参照 概して、本明細書で述べた技法は、当業界で周知であ
り、Sambrook, et al.,Molecular Cloning:A Laborator
y Manual（1989）およびAusubel, et al., Short Proto
cols in Molecular Biology（1999）4th Ed,John Wiley
& Sond, Inc.に対して特に参照が成される。ＰＣＲ
は、米国特許出願第4683195号、米国特許出願第4800195
号および米国特許出願第4965188号に記載されている。
【０２５７】寄託 ブダペスト条約にしたがって、認可保管所であるNation
al Collections of Industrial and Marine Bacteria L
imited（NCIMB）（23 St. Machar Drive, Aberdeen, Sc
otland, AB2 1RY, United Kingdom）に、2000年8月23日
に、以下の標本を寄託した。
【０２５８】ＮＣＩＭＢ番号NCIMB 41072は、大腸菌PFI
-011である。寄託者は、Pfizer Central Research, Pfi
zer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9
NJ, United Kingdomであった。当業者は、アンピシリン
を含有するルリアブロス中で、前記の大腸菌クローン
（NCIMB 41072）を容易に増殖し、そしてSambrook, et
al., eds.（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yor
k, NY, USAに記載されたアルカリ溶解法を用いてクロー
ンのプラスミドＤＮＡを単離し得る。Sanger等（Procee
dings of the National Academy of Sciences（USA）
（Dec. 1977）, 74（12）:5463-5467）により記載さ
れ、蛍光検出に関してApplied Biosystems（Applied Bi
osystems社の文献参照）により修正されたたチェインタ
ーミネーター法を次に用いてＤＮＡをシーケンシング
し、PFI-011を同定し得た。
【０２５９】本発明は、寄託物から誘導可能および／ま
たは発現可能な配列、ならびにそれを包含する実施態様
も包含する。本発明は、寄託物から誘導可能および／ま
たは発現可能な部分配列、ならびにそれを包含する実施
態様も包含するが、この場合、その部分配列は活性ポリ
ペプチドをコードする。本発明は、寄託物から誘導可能
および／または発現可能な配列を包含するタンパク質、
ならびにそれを包含する実施態様も包含する。寄託物か
ら誘導可能および／または発現可能な部分配列を包含す
るタンパク質、ならびにそれを包含する実施態様も包含
するが、この場合、それらの部分配列は、活性ポリペプ
チドをコードする。
【０２６０】実施例への序論、ならびに図面および配列
表 ここでは、添付の図面および配列表を参照しながら、実
施例のみにより、本発明を説明する。図１は、PFI-011
の生物情報分析に関する模式図を示す（db＝データベー
ス）。
【０２６１】図２は、SW|P79177|FML1 GORGO FMLP-REL
ATED RECEPTOR I (FMLP-R-1) (FRAGMENT)とのPFI-011の
Clustal W整列を示す。配列番号１は、PFI-011をコード
するヌクレオチド配列を示す。配列番号１に示す配列
中、最初のＡＴＧ翻訳開始コドン（下線）を使用したＰ
ＣＲ産物が単離されることができなかったという点で、
(NCIMB 41072における）クローン化配列は、配列番号１
と相違する。しかしながら、１３位の塩基から始まる、
第２のＡＴＧ（下線）を使用したＰＣＲ−由来ヌクレオ
チド配列を単離した。NCIMB 41072においてクローン化
されたものは、このより短い、ヌクレオチド配列であ
る。終止コドンを最後の３文字により示す。
【０２６２】配列番号２は、PFI-011をコードする対応
のアミノ酸配列を示す。配列番号３と４は実施例全体で
用いられるＰＣＲプライマーを示す。本発明のＧＰＣＲ
をコードするポリヌクレオチドをクローン化し、種々の
生物情報道具を用いて、ＤＮＡおよびアミノ酸配列を分
析した。本明細書中に記載した配列によりコードされる
ＧＰＣＲは、PFI-011と呼ばれた。
【０２６３】実施例 PFI-011の同定 BLAST算法を用いて、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰ
ＣＲ）ファミリーの既知の成員を用いて配列を探索する
ことにより、Genome Sequensing Centerにより放出され
た非注釈付ゲノム配列中で、PFI-011を同定した。
【０２６４】生物情報的試験 PFI-011がＧＰＣＲファミリーの一成員である、という
ことを確証するために、多数の生物情報的アプローチを
実施した。 （ａ）Swissprotに対するBLAST探索 BLAST算法（Basic Local Alignment Search Tool（Alts
hul SF（1993）J. Mol. Evol.36:290-300; Altshul, SF
et al（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410））を用い
て、 Swissprotに対してPFI-011を探索し、最も近いタ
ンパク質適合を同定した。この場合、トップヒットは以
下の通りであった：SW｜P79177｜FML1 GORGO FMLP-REL
ATED RECEPTOR I (FMLP-R-I) (FRAGMENT)。
【０２６５】これらの結果は、PFI-011がＧＰＣＲファ
ミリーのメンバーであることを示す。 （ｂ）SW｜P79177｜FML1 GORGO FMLP-RELATED RECEPTO
R I (FMLP-R-I) (FRAGMENT)とのPFI-011のClustal W整
列 これらの結果を図２に示す。
【０２６６】（ｃ）非冗長性ヒトＧＰＣＲデータベース
に対するBLAST探索 この受容体に対する作動薬の種類を同定するために、Ge
nbankおよびGeneseq Patentデータベースからの配列を
主に包含する非冗長性ヒトＧＰＣＲデータベースに対し
て、PFI-011を探索した。トップテンヒットは以下の通
りであった： FML1 HUMAN GPC :e値＝2e-28，％同一性＝27％ FMLR HUMAN GPC :e値＝3e-26，％同一性＝27％ AF055917 GPCR0 :e値＝7e-25，％同一性＝30％ AB008535 GPCR0 :e値＝6e-24，％同一性＝29％ AF118265 GPCR0 :e値＝6e-24，％同一性＝29％ FML2 HUMAN GPC :e値＝2e-22，％同一性＝24％ CML1 HUMAN GPC :e値＝2e-22，％同一性＝27％ PFI-005 GPCR035 :e値＝2e-22，％同一性＝30％ W93169 GPCR026 :e値＝1e-21，％同一性＝25％ GPR1 HUMAN GPC :e値＝2e-21，％同一性＝25％。
【０２６７】（e値＝チャンスによるヒット発生の統計
学的可能性） これらの結果は、PFI-011がFMLP-関連受容体１に最も似
ているということを実証し、それらは、PFI-011がその
配位子がペプチドであるようである新規のＧＰＣＲをコ
ードすることを示唆する。 PFI-011の単離 PFI-011の全長コーティング配列を、ＰＣＲを使用して
ヒト・ゲノムＤＮＡ（Promega)からクローン化した。
【０２６８】ＰＣＲ反応：ＰＣＲ反応を以下のように設
定した：dNTPs (10mM)-1μｌ, Forward Primer (10μ
Ｍ）-1μｌ, Reverse Primer (10μＭ）-1μｌ，５×反
応バッファー−１０μｌ，Elongase (Life Technologie
s, Inc.)-1μｌ, Genomic DNA-1μｇ；水で50μｌに調
製した。 ＰＣＲプライマー： Forward Primer（＝Pfill-1B (前進）＋ＡＴＧ付近のKo
zak配列）： 5'-ACCATGGAAGCTGACCTGG-3'（配列番号３） Reverse Primer（＝Pfill-2（逆行））： 5'-CCTGTCTGACTGGCTGGTTCC-3'（配列番号４） ＰＣＲ条件：94℃−３分間、次に30サイクルの、94℃−
１分間、58℃−１分間、72℃−２分間。最終サイクル＝
72℃−10分間。
【０２６９】PFI-011 ＰＣＲ産物を、製造者の指示に
従ってQIAgenゲル抽出キットを使用してゲル抽出した。
得られた産物を製造者の指示に従って、ベクターpcＤＮ
Ａ3.1/V5-His-TOPO（Invitrogen）内にＴＡクローン化
した（Invitrogen TAクローニング法）。前記は例とし
てのみ示したものであって、詳細の修正は、本発明の範
囲を逸脱しない限り成され得る。
【０２７０】
【表４】
【０２７１】
【表５】
【０２７２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Limited (EP (GB) only), Pfizer Inc. (EP except GB / US / JP ) <120> Novel Polypeptide <130> PCS10366APME <140> B007014 <141> 2000-10-20 <150> 9924960.9 <151> 1999-10-21 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggacacta ccatggaagc tgacctgggt gccactggcc acaggccccg cacagagctt 60 gatgatgagg actcctaccc ccaaggtggc tgggacacgg tcttcctggt ggccctgctg 120 ctccttgggc tgccagccaa tgggttgatg gcgtggctgg ccggctccca ggcccggcat 180 ggagctggca cgcgtctggc gctgctcctg ctcagcctgg ccctctctga cttcttgttc 240 ctggcagcag cggccttcca gatcctagag atccggcatg ggggacactg gccgctgggg 300 acagctgcct gccgcttcta ctacttccta tggggcgtgt cctactcctc cggcctcttc 360 ctgctggccg ccctcagcct cgaccgctgc ctgctggcgc tgtgcccaca ctggtaccct 420 gggcaccgcc cagtccgcct gcccctctgg gtctgcgccg gtgtctgggt gctggccaca 480 ctcttcagcg tgccctggct ggtcttcccc gaggctgccg tctggtggta cgacctggtc 540 atctgcctgg acttctggga cagcgaggag ctgtcgctga ggatgctgga ggtcctgggg 600 ggcttcctgc ctttcctcct gctgctcgtc tgccacgtgc tcacccaggc cacagcctgt 660 cgcacctgcc accgccaaca gcagcccgca gcctgccggg gcttcgcccg tgtggccagg 720 accattctgt cagcctatgt ggtcctgagg ctgccctacc agctggccca gctgctctac 780 ctggccttcc tgtgggacgt ctactctggc tacctgctct gggaggccct ggtctactcc 840 gactacctga tcctactcaa cagctgcctc agccccttcc tctgcctcat ggccagtgcc 900 gacctccgga ccctgctgcg ctccgtgctc tcgtccttcg cggcagctct ctgcgaggag 960 cggccgggca gcttcacgcc cactgagcca cagacccagc tagattctga gggtccaact 1020 ctgccagagc cgatggcaga ggcccagtca cagatggatc ctgtggccca gcctcaggtg 1080 aaccccacac tccagccacg atcggatccc acagctcagc cacagctgaa ccctacggcc 1140 cagccacagt cggatcccac agcccagcca cagctgaacc tcatggccca gccacagtca 1200 gattctgtgg cccagccaca ggcagacact aacgtccaga cccctgcacc tgctgccagt 1260 tctgtgccca gtccctgtga tgaagcttcc ccaaccccat cctcgcatcc taccccaggg 1320 gcccttgagg acccagccac acctcctgcc tctgaaggag aaagccccag cagcaccccg 1380 ccagaggcgg ccccgggcgc aggccccacg tga 1413 <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Thr Thr Met Glu Ala Asp Leu Gly Ala Thr Gly His Arg Pro 1 5 10 15 Arg Thr Glu Leu Asp Asp Glu Asp Ser Tyr Pro Gln Gly Gly Trp Asp 20 25 30 Thr Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Pro Ala Asn Gly 35 40 45 Leu Met Ala Trp Leu Ala Gly Ser Gln Ala Arg His Gly Ala Gly Thr 50 55 60 Arg Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Ser Asp Phe Leu Phe 65 70 75 80 Leu Ala Ala Ala Ala Phe Gln Ile Leu Glu Ile Arg His Gly Gly His 85 90 95 Trp Pro Leu Gly Thr Ala Ala Cys Arg Phe Tyr Tyr Phe Leu Trp Gly 100 105 110 Val Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ser Leu Asp 115 120 125 Arg Cys Leu Leu Ala Leu Cys Pro His Trp Tyr Pro Gly His Arg Pro 130 135 140 Val Arg Leu Pro Leu Trp Val Cys Ala Gly Val Trp Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Leu Phe Ser Val Pro Trp Leu Val Phe Pro Glu Ala Ala Val Trp Trp 165 170 175 Tyr Asp Leu Val Ile Cys Leu Asp Phe Trp Asp Ser Glu Glu Leu Ser 180 185 190 Leu Arg Met Leu Glu Val Leu Gly Gly Phe Leu Pro Phe Leu Leu Leu 195 200 205 Leu Val Cys His Val Leu Thr Gln Ala Thr Ala Cys Arg Thr Cys His 210 215 220 Arg Gln Gln Gln Pro Ala Ala Cys Arg Gly Phe Ala Arg Val Ala Arg 225 230 235 240 Thr Ile Leu Ser Ala Tyr Val Val Leu Arg Leu Pro Tyr Gln Leu Ala 245 250 255 Gln Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Trp Asp Val Tyr Ser Gly Tyr Leu 260 265 270 Leu Trp Glu Ala Leu Val Tyr Ser Asp Tyr Leu Ile Leu Leu Asn Ser 275 280 285 Cys Leu Ser Pro Phe Leu Cys Leu Met Ala Ser Ala Asp Leu Arg Thr 290 295 300 Leu Leu Arg Ser Val Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Leu Cys Glu Glu 305 310 315 320 Arg Pro Gly Ser Phe Thr Pro Thr Glu Pro Gln Thr Gln Leu Asp Ser 325 330 335 Glu Gly Pro Thr Leu Pro Glu Pro Met Ala Glu Ala Gln Ser Gln Met 340 345 350 Asp Pro Val Ala Gln Pro Gln Val Asn Pro Thr Leu Gln Pro Arg Ser 355 360 365 Asp Pro Thr Ala Gln Pro Gln Leu Asn Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ser 370 375 380 Asp Pro Thr Ala Gln Pro Gln Leu Asn Leu Met Ala Gln Pro Gln Ser 385 390 395 400 Asp Ser Val Ala Gln Pro Gln Ala Asp Thr Asn Val Gln Thr Pro Ala 405 410 415 Pro Ala Ala Ser Ser Val Pro Ser Pro Cys Asp Glu Ala Ser Pro Thr 420 425 430 Pro Ser Ser His Pro Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asp Pro Ala Thr Pro 435 440 445 Pro Ala Ser Glu Gly Glu Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro Glu Ala Ala 450 455 460 Pro Gly Ala Gly Pro Thr 465 470 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 accatggaag ctgacctgg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cctgtctgac tggctggttc c 21
【図面の簡単な説明】
【図１】PFI-011の生物情報分析に関する模式図を示す
（ｄｂ＝データベース）。
【図２】SW|P79177／FML1 GORGO FMLP-RELATED RECEPT
OR I (FMLP-R-1) (FRAGMENT)とのPFI-011のClustal W整
列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 48/00 3/00 Ａ６１Ｐ 1/00 9/00 3/00 11/00 9/00 13/00 11/00 15/00 13/00 17/00 15/00 17/14 17/00 17/16 17/14 19/00 17/16 25/00 19/00 25/20 25/00 27/00 25/20 29/00 27/00 31/00 29/00 35/00 31/00 37/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/00 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 9/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １つ又はそれ以上の以下の： （ａ）配列番号２で記述されるようなポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を包含するポリヌ
    クレオチド； （ｃ）NCIMB 41072中に含入されるＤＮＡにより発現さ
    れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドと
    少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を包
    含するポリヌクレオチド； （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと
    ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含するポリ
    ヌクレオチド； （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドに
    対する相補体；あるいは （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドの
    ポリヌクレオチド断片を包含する単離および／または精
    製ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 （ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレ
    オチドと少なくとも75％の同一性を有するヌクレオチド
    配列を包含する請求項１のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 （ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレ
    オチドと少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド
    配列を包含する請求項１のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 （ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレ
    オチドと少なくとも85％の同一性を有するヌクレオチド
    配列を包含する請求項１のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 （ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレ
    オチドと少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド
    配列を包含する請求項１のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 （ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレ
    オチドと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド
    配列を包含する請求項１のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）
    をコードする前記請求項のいずれかのポリヌクレオチ
    ド。
  8. 【請求項８】 前記請求項のいずれかのポリヌクレオチ
    ドの少なくとも15連続ヌクレオチドを包含するポリヌク
    レオチドプローブまたはプライマー。
  9. 【請求項９】 前記請求項のいずれかのポリヌクレオチ
    ドを包含するベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項９のベクターで形質転換または
    トランスフェクトされる宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 哺乳類、昆虫、真菌、細菌または酵母
    菌細胞である請求項１０の形質転換化／トランスフェク
    ト化宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれかのポリヌクレ
    オチドの転写ＲＮＡ生成物。
  13. 【請求項１３】 請求項１２のＲＮＡ生成物に関してア
    ンチセンスであり、それとハイブリダイズし得るＲＮＡ
    分子またはその断片。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜８のいずれかのポリヌクレ
    オチドと結合し得るリボザイムまたはジンクフィンガー
    タンパク質。
  15. 【請求項１５】 前記ポリペプチドまたは断片の発現に
    十分な条件下で請求項１０または請求項１１の形質転換
    化／トランスフェクト化宿主細胞を培養することを包含
    するポリペプチドまたはその断片の産生方法。
  16. 【請求項１６】 前記ポリペプチドまたは断片が前記細
    胞の表面で発現される請求項１５の方法。
  17. 【請求項１７】 培養からポリペプチドまたは断片を回
    収することをさらに含む請求項１５または請求項１６の
    方法。
  18. 【請求項１８】 ポリペプチドまたはその断片を発現し
    得る細胞の産生方法であって、請求項９のベクターで細
    胞を形質転換またはトランスフェクトすることを包含す
    る方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１８の方法により産生される細
    胞。
  20. 【請求項２０】 請求項１９の細胞の膜調製物。
  21. 【請求項２１】 請求項１５〜１８のいずれかの方法に
    より産生されるポリペプチドまたはその断片。
  22. 【請求項２２】 以下の： （ａ）配列番号１におけるポリヌクレオチド配列から翻
    訳される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、なら
    びにその変異体、断片、相同体、類似体および誘導体； （ｂ）配列番号２のポリペプチド、ならびにその変異
    体、断片、相同体、類似体および誘導体；または （ｃ）NCIMB 41072のｃＤＮＡによりコードされるポリ
    ペプチド、ならびにその変異体、断片、相同体、類似体
    および誘導体を包含するポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 請求項２２のポリペプチドに対する抗
    体。
  24. 【請求項２４】 請求項２２のポリペプチドを調節する
    化合物。
  25. 【請求項２５】 請求項２２のポリペプチドに拮抗する
    かまたは選択的に拮抗する請求項２４の化合物。
  26. 【請求項２６】 請求項２２のポリペプチドを作動する
    請求項２４の化合物。
  27. 【請求項２７】 請求項２３の抗体または請求項２４〜
    ２６のいずれかの化合物、および１つ又はそれ以上の製
    薬上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントまたは賦形
    剤を包含する製剤組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項２２のポリペプチドと結合し、
    それを調節する化合物の同定方法であって、前記ポリペ
    プチドを候補化合物と接触させて、調節が生じたか否か
    を確定することを包含する方法。
  29. 【請求項２９】 以下の： （ａ）化合物を、それらの表面で請求項２２のポリペプ
    チドを発現する細胞と接触させ、前記ポリペプチドが化
    合物の前記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能信
    号を提供し得る二次構成成分に会合され、前記接触がポ
    リペプチドの化合物との結合を可能にするのに十分な条
    件下で生じ；そして（ｂ）前記二次構成成分により生成
    される信号を検出することによりポリペプチド結合し得
    る化合物を同定する工程を包含する請求項２８の方法。
  30. 【請求項３０】 以下の： （ａ）（ｉ）請求項２２のポリペプチドと結合すること
    が知られている検出可能一次構成成分および（ｉｉ）化
    合物を、それらの表面で請求項２２のポリペプチドを発
    現する細胞と接触させ、前記ポリペプチドが化合物の前
    記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能信号を提供
    し得る二次構成成分に会合され、前記接触がポリペプチ
    ドの化合物との結合を可能にするのに十分な条件下で生
    じ；そして（ｂ）一次構成成分のポリペプチドとの相互
    作用から生成される信号の非存在または存在を検出する
    ことにより一次構成成分がポリペプチドと結合するか否
    かを確定する工程を包含する請求項２９の方法。
  31. 【請求項３１】 前記化合物が請求項２２のポリペプチ
    ドと結合し、そして拮抗するかまたは選択的に拮抗する
    請求項２８〜３０のいずれかの方法。
  32. 【請求項３２】 前記化合物が請求項２２のポリペプチ
    ドと結合し、そして作動する請求項２８〜３０のいずれ
    かの方法。
  33. 【請求項３３】 製剤として用いるための請求項２３の
    抗体、請求項２４〜２６のいずれかの化合物、または請
    求項２７の組成物。
  34. 【請求項３４】 請求項２２のポリペプチドの調整の必
    要性を有する患者の治療のための薬剤の製造における請
    求項２４〜２６のいずれかの化合物の使用。
  35. 【請求項３５】 請求項２２のポリペプチドを拮抗しま
    たは選択的に拮抗する必要性を有する患者の治療のため
    の薬剤の製造における請求項３４の使用。
  36. 【請求項３６】 請求項２２のポリペプチドを作動する
    必要性を有する患者の治療のための薬剤の製造における
    請求項３４の使用。
  37. 【請求項３７】 治療的有効量の請求項２４〜２６のい
    ずれかの化合物を包含する請求項２２のポリペプチドを
    調節する必要性を有する患者の治療のための医薬組成
    物。
  38. 【請求項３８】 請求項２２のポリペプチドを拮抗しま
    たは選択的に拮抗する必要性を有する患者の治療のため
    である請求項３７の医薬組成物。
  39. 【請求項３９】 請求項２２のポリペプチドを作動する
    必要性を有する患者の治療のためである請求項３７の医
    薬組成物。
  40. 【請求項４０】 前記化合物がポリペプチドであり、そ
    して治療的有効量の化合物が前記の化合物をコードする
    ＤＮＡを患者に提供し、前記化合物をin vivoで発現す
    ることにより投与される請求項３７〜３９のいずれかの
    医薬組成物。
  41. 【請求項４１】 請求項２２のポリペプチドを調整する
    必要性を有する患者の治療のための薬剤の製造における
    請求項２３の抗体の使用。
  42. 【請求項４２】 請求項２２のポリペプチドを拮抗しま
    たは選択的に拮抗する必要性を有する患者の治療のため
    の薬剤の製造における請求項４１の使用。
  43. 【請求項４３】 請求項２２のポリペプチドを作動する
    必要性を有する患者の治療のための薬剤の製造における
    請求項４１の使用。
  44. 【請求項４４】 治療的有効量の請求項２３の抗体を包
    含する請求項２２のポリペプチドを調節する必要性を有
    する患者の治療のための医薬組成物。
  45. 【請求項４５】 請求項２２のポリペプチドを拮抗しま
    たは選択的に拮抗する必要性を有する患者の治療のため
    である請求項４４の医薬組成物。
  46. 【請求項４６】 請求項２２のポリペプチドを作動する
    必要性を有する患者の治療のためである請求項４４の医
    薬組成物。
  47. 【請求項４７】 請求項２２のポリペプチドを発現、過
    剰発現、不十分発現し、あるいはその標的化挿入または
    欠失を示すようex vivoまたはin vivoで遺伝子工学処理
    される細胞。
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