DE102006038942A1 - Verfahren zur Identifizierung von Stickstoffmonoxid Modulatoren - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) aus NO-produzierenden Zellen modulieren und mittels einer NO-sensitisierten Reportergen-Zelllinie in Kokultur mit einer NO-produzierenden Zelle identifiziert werden können. Besonders vorteilhaft können die Verfahren im Bereich der biomedizinischen Forschung, einschließlich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, eingesetzt werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) aus NO-produzierenden Zellen modulieren, und mittels einer NO-sensitisierten Reportergen-Zelllinie in Kokultur mit einer NO-produzierenden Zelle identifiziert werden können. NO-freisetzende Zellen sind beispielsweise Zellen, welche die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase eNOS (z.B. Endothelzellen), die induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase iNOS (z.B. Macrophagen) oder welche die neuronale Stickstoffmonoxidsynthase nNOS exprimieren. Die neuen Verfahren zeichnen sich durch hohe Sensitivität und geringe Störanfälligkeit aus und lassen sich leicht automatisieren und miniaturisieren. Besonders vorteilhaft können die Verfahren im Bereich der medizinischen Diagnostik und der biomedizinischen Forschung, einschließlich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, eingesetzt werden.
  • Stickstoffmonoxid (NO) ist ein Metabolit der enzymatischen Reaktion von L-Arginin mit Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS; EC 1.14.13.39), wobei außer Stickstoffmonoxid auch L-Citrullin gebildet wird. Da Stickstoffmonoxid durch biologische Membranen diffundieren kann, gelangt es aus der synthetisierenden Zelle in direkt benachbarte Zellen. Stickstoffmonoxid kann allerdings nur lokal begrenzt wirken, da es im extrazellulären Raum sofort über Sauerstoff und Wasser in Nitrate bzw. Nitrite umgewandelt wird und daher eine äußerst kurze Halbwertzeit von 5-10 s aufweist. Die Aktivität einer Stickstoffmonoxid-Synthase wird durch viele biologische Regelmechanismen kontrolliert; zum Beispiel wird die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter anderem Rezeptor-induziert über Kalzium-Ionen moduliert, welche eine Translokations- und Aktivierungsschritt beinhaltet. An der Regulation der Stickstoffmonoxid-Synthasen sind eine Vielzahl weiterer Enzyme und biologischer Signalschritte involviert, die Gegenstand der biomedizinischen Forschung sind und als Ansatzpunkte einer therapeutischen Intervention zur Behandlung Stickstoffmonoxid-vermittelter Erkrankungen dienen können. Ziel der Arzneimittelentwicklung ist es deshalb auch, selektive Induktoren der jeweiligen NOS zu finden.
  • Gängige Therapieansätze verwenden zurzeit Stickstoffmonoxid-Gas oder Stickstoffmonoxidfreisetzende organische Verbindungen wie Glyceronitrat. Zum Beispiel spielt die Therapie mit NO-liefernden Substanzen eine tragende Rolle in der Behandlung von Herzkrankheiten. Nitroglycerin und andere organische Nitrate, die im Körper Stickstoffmonoxid freisetzen, sind unentbehrliche Langzeit-Therapeutika bei der Behandlung von Angina pectoris und Herzinsuffienz, aber auch zur lebenserhaltenden Soforttherapie bei akutem Infarkt. Stickstoffmonoxid agiert als peripherer Neurotransmitter, z.B. bei der Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten bei neurodegenerativen Erkrankungen.
  • Toxische Effekte von NO, infolge von pathologischen Aktivierung von NO-Synthasen, finden ihren Ausdruck in Infektionen und Entzündungen (septischer Schock, rheumatoide Arthritis usw.). Ziel der Arzneimittelentwicklung ist es deshalb auch, selektive Inhibitoren der induzierbaren NOS zu finden. Therapeutische Interventionen sind derzeit hauptsächlich durch NOS-unspezifsiche Substratinhibitoren möglich, z.B. N6-Methyl-L-arginin oder L-6-Thiocitrullin-Derivate. Therapeutische Ansatzpunkte, die die selektiv die pathologisch veränderte endogene NO-Produktion modulieren, würden eine gezieltere Therapie ermöglichen.
  • Die physiologische Funktionen des Stickstoffmonoxid reichen von der Regulation des Blutdrucks, der Hemmung der Blutplättchenaggregation, der Wundheilung, der neuronalen Signalübertragung (Gehirn u. periphere autonome Nerven) bis hin zur Inaktivierung von Bakterien, Parasiten und Tumorzellen. Pathologisch veränderte Konzentrationen von Stickstoffmonoxid werden für eine Reihe von Krankheiten mitverantwortlich gemacht, z.B. endotheliale Dysfunktion, septischer Schock, Schlaganfall, Arthritis, Migräne, neurodegenerative Erkrankungen (z.B. Alzheimer, Multiple Sklerose) oder chronische Entzündungen. Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Stickstoffmonoxid können daher in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden, von besonderem Interesse ist die Verwendung im Bereich der medizinischen Diagnostik und der biomedizinischen Diagnostik, insbesondere der Wirkstoffforschung und der Arzneimittelforschung. Im Bereich der biomedizinischen Forschung, insbesondere der pharmazeutischen Wirkstoffforschung werden zur Auffindung neuer Wirkstoffe regelmäßig große Substanzbibliotheken mit teilweise mehr als einer Million Substanzen mit Hilfe automatisierter Verfahren durchgemustert (Hochdurchsatz Screening, High Throughput Screening). Dabei richtet sich das Screening typischerweise auf die Identifizierung von Modulatoren einer biologischen Aktivität, beispielsweise einer Enzym- oder Rezeptoraktivität, welche das Ziel einer medizinischen Therapie sein könnte. Biologische Aktivitäten, welche Stickstoffmonoxid als Botenstoff verwenden, sind zum Beispiel Endothel-vermittelte Gefäßrelaxation, Makrophagen-induziertes abtöten eingedrungener Mikroorganismen, neuronale Signalübertragung im Gehirn und peripheren autonomen Nerven, Blutplättchenaggregation, Tumorprogression und Metastasierung oder der Wundheilung.
  • Bekannte Stimulatoren der Stickstoffmonoxidbildung in endothelialen Zellen sind zum Beispiel das Peptid Bradykinin oder der Botenstoff Histamin. Diese Stoffe bewirken durch die Aktivierung eines Zelloberflächenrezeptors nachfolgend die schnelle Aktivierung einer intrazellulären Signalkaskade, welche letztendlich zur Aktivierung der eNOS und somit zur Stickstoffmonoxidbildung führt [R. Govers und T.J. Rabelink; Am J Physiol Renal Physiol. 2001; 280(2):F193-206]. Diese Prozesse sind schnell.
  • Bekannte Stimulatoren der Stickstoffmonoxidbildung in Immunzellen sind zum Beispiel das Lipopolysaccharid LPS. Diese Stoffe bewirken durch die Aktivierung eines Zelloberflächenrezeptors nachfolgend die transkriptionelle Aktivierung der iNOS und somit die Stickstoffmonoxidbildung [Kleinert et al.; Biol Chem. 2003;384(10-11):1343].
  • Ein bekannter Inhibitor der Stickstoffmonoxidbildung in Immunzellen ist zum Beispiel Interleukin10. Dieser Stoff bewirkt durch die Aktivierung eines Zelloberflächenrezeptors nachfolgend die Ihibition der iNOS Aktivität und somit eine Reduktion der Stickstoffmonoxidbildung in Immunzellen [Dugas N et al., Cytokine. 1998;10(9):680].
  • Verfahren zur Messung der NO-Freisetzung aus Zellen im pharmazeutischen Hochdurchsatz Screening sollen sich leicht automatisieren und zur Begrenzung der Kosten für Reagenzien und Testsubstanzen auch miniaturisieren lassen. Darüber hinaus ist zum Nachweis auch geringer NO-Mengen eine möglichst hohe Sensitivität und zur Erreichung einer hohen Datenqualität eine möglichst geringe Störanfälligkeit wünschenswert.
  • Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Stickstoffmonoxid oder der NOS-Aktivität bekannt.
  • Bredt, D.S., and Snyder, S.H. 1994. Annu. Rev. Biochem. 63, 175. Bredt, D.S., and Snyder, S.H. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 689. Bredt, D.S., and Snyder, S.H. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9030 beschreiben indirekte Nachweisverfahren für Stickstoffmonoxid mittels Quantifizierung der NO-Synthase Aktivität. Bei den beschriebenen Verfahren wird die NO-Synthase katalysierte Konversion von radioaktiv markiertem L-Arginin zu L-Citrullin bestimmt. Das entstehende radioaktive L-Citrullin ist ein Maß für Stickstoffmonoxid und wird von nicht umgesetztem radioaktivem L-Arginin über einen Ionenaustauscher abgetrennt und quantifiziert. Die Verfahren umfassen mehrere aufwendige Arbeitsschritte und lassen sich daher nur schwer automatisieren. Darüber hinaus sind die hohen Reagenzienkosten von Nachteil.
  • Nims, R.W., et al. 1996. Methods Enzymol. 268, 93 und Amano F, 1995. FERS Letters 368(3),425 beschreiben gekoppelte chemische Nachweisverfahren für Stickstoffmonoxid. Die Verfahren beruhen auf der Griess-Ilosvay-Reaktion zur Bestimmung von Nitriten. Bei Verfahren beruhen darauf, dass das kurzlebige Stickstoffmonoxid der zu untersuchenden Testprobe durch Sauerstoff zu Nitraten und Nitriten oxidiert wird. Zur quantitativen Bestimmung von Stickstoffmonoxid muss das auch entstandene Nitrat mittels Nitratredukatse zu Nitrit reduziert werden. Der Nachweis für Nitrite erfolgt durch eine Reaktion mit Sulfanilsäure und 1-Naphthylamin welche zu einem Azofarbstoff führt, welcher colorimetrisch bestimmt werden kann. Problematisch sind die geringe Sensitivität und die Störanfälligkeit dieser Nachweisverfahren, insbesondere durch Nitrite und Nitrate, welche es zum Beispiel nicht erlaubt, dieses Verfahren in Kombination mit gebräuchlichen Gewebekultur-Medien zu verwenden.
  • US 6,306,609 (B1) und US 5,358,703(A) beschreiben Verfahren zur Detektion von Stickstoffmonoxid basierend auf paramagnetischer Resonanzspektroskopie. Diese sind typischerweise nicht für das Hochdurchsatz Screening geeignet. Nachteilig bei diesen Verfahren sind die hohen Reagenzienkosten oder die apparativen Aufwendungen, was die Verwendung im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, einschließlich des pharmazeutischen Hochdurchsatz Screenings, erheblich einschränkt.
  • US 5,248,616(A, X6) beschreibt Verfahren zur Detektion von Stickstoffmonoxid basierend einer permeablen Membran und einem Gasanalysator. Erheblich Einschränkungen der Verwendung dieser Verfahren im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, einschließlich des pharmazeutischen Hochdurchsatz Screenings, entstehen durch die hohen apparativen Aufwendungen und Probleme bei der Miniaturisierung.
  • US 6,636,652(B1) , US 6,900,891(B2) , US 6,002,817(A) und US 2004/0190813(A1) beschreiben Verfahren zur Detektion von Stickstoffmonoxid basierend auf Metallkolloiden und mikroskopischen Techniken. Diese sind typischerweise nicht für das Hochdurchsatz Screening geeignet.
  • Im Stand der Technik sind außerdem Stickstoffmonoxid Nachweise mittels Fluoreszenzfarbstoffen bekannt; bei diesen Verfahren reagiert Stickstoffmonoxid mit einem fluorogenen Farbstoff, welcher nach erfolgter Reaktion seine spektralen Eigenschaften ändert. Die Quantifizierung der Fluoreszenz dient als Maß der Stickstoffmonoxid-Konzentration [beschrieben zum Beispiel in US 6,201,134(B1, X6) , US 6,469,051(B2, X6) , US 6,756,231(B1) , US 2004/0147035(A1) , US 2001/0001800(A1) und EP1000941(B1) ]. Ein solches Verfahren wird zum Beispiel von Berkels, R., et al. 2000. Cell Calcium 27, 281. Kojima, H., et al. 1998. Anal. Chem. 70, 2446. Kojima, H., et al. 1998. Chem. Pharm. Bull. 46, 373. Nakatsubo, N., et al. 1998. FERS Lett. 427, 263 beschrieben; dabei wird 4,5-Diaminofluorescein (DAF-2) als Stickstoffmonoxid-sensitiver Farbstoff verwendet. Der Farbstoff wird dabei in bildgebenden mikroskopischen Verfahren verwendet, welche eine zeitliche und räumliche Auflösung der Stickstoffmonoxid-Freisetzung ermöglicht. Ähnliche Verfahren verwenden modifizierte Farbstoffe, wie zum Beispiel 3-Amino, 4-aminomethyl-2',7'-Difluorofluorescein (DAF-FM) nach Kojima, H., et al. 2001. J. Neurochem. 76, 1404. Park. J.M., et al. 2001. Br. J. Pharmacol. 132, 1876. Itoh, Y., et al. 2000. Anal. Biochem. 287, 203. Kojima, H., et al. 1999. Angew. Chem. Int. Ed. 38, 3209 oder membrangängige Farbstoffe wie 4,5-Diaminofluorescein Diacetat (DAF-2 DA) nach Berkels, R., et al. 2000 Cell Calcium 27, 281, Kojima, H., et al. 1998. Anal. Chem. 70, 2446, Kojima, H., et al. 1998. Chem. Pharm. Bull. 46, 373, und Nakatsubo, N., et al. 1998. FERS Lett. 427, 263.
  • Diese Verfahren sind mit dem Nachteil behaftet, dass die erforderlichen Farbstoffe teuer sind und die Fluoreszenz störanfällig unter anderem gegenüber pH-Änderungen ist. Des Weiteren ist die Störanfälligkeit dieser Verfahren gegenüber fluoreszierender Testsubstanzen von Nachteil, was die Verwendung im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, einschließlich des pharmazeutischen Hochdurchsatz Screenings, erheblich einschränkt.
  • Weiterhin sind Verfahren bekannt, die eine indirekte Detektion von Stickstoffmonoxid mittels zyklischem 3'-5'-Guanosinmonophosphat (cGMP) erlauben. Dazu wird die Guanylylzyklase (E.C: 4.6.1.2) verwendet, die die Umsetzung von Guanosintriphosphat zu cGMP und Pyrrophosphat katalysiert. Da Stickstoffmonoxid ein Aktivator der löslichen Guanylylzyklase ist, kann die Menge an gebildetem cGMP als Maß für das kurzlebige Stickstoffmonoxid verwendet werden [ US 2005/0112717(A1) und WO 2005/052185(A1) ]. In einem weiteren auf Guanylylzyklase basierendem Verfahren wird eine Zellkultur aus Guanylylzyklase-überexprimierender RFL-6 Zellen verwendet [Ishii et al, Am J Physiol. 1991; 261 11598-603]. Dazu muss eine auf Stickstoffmonoxid zu untersuchende Testprobe schnellstmöglich in ein Probengefäß überführt werden, in dem eine Kultur mit RFL-6 Zellen herangezogen wurde. Als Maß für Stickstoffmonoxid wird die Menge an gebildetem cGMP verwendet. Zur Bestimmung von cGMP sind verschiedene Immunoassays unter Verwendung von cGMP spezifischen Antikörpern bekannt. Der Nachweis des gebildetem cGMP erfolgt indirekt über die Verdrängung und Quantifizierung einer an den Antikörper gebundenen Sonde, wie zum Beispiel mit Iod Isotopen radioaktiv markiertes cGMP (Kompetitiver Immunoassay). Nachteilig bei diesem Verfahren sind die hohen Reagenzienkosten oder die präparativen Aufwendungen zur Bereitstellung der erforderlichen Antikörper. Weiterhin umfassen die Verfahren aufwendige Arbeitsschritte, insbesondere zeitkritische Transferschritte und aufwendige Waschprozeduren, welche eine effiziente Automatisierung erheblich erschweren; dies schränkt die Verwendung dieser Verfahren in Hochdurchsatzexperimenten, wie beispielsweise dem pharmazeutischen Hochdurchsatz Screening erheblich ein.
  • Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zu Grunde, die aufgeführten Nachteile und Einschränkungen des Standes der Technik zu überwinden und ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, bereitzustellen, welches sich durch hohe Sensitivität und geringe Störanfälligkeit auszeichnen und sich zudem leicht automatisieren und miniaturisieren lassen und sich insbesonders für das Hochdurchsatz-Screening (HTS) eignen.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, mittels eines zellulären Reportergen-Assays gelöst.
  • Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welche folgende Stufen umfassen:
    • (a) Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle, und
    • (b) Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
    • (c) in Kontakt bringen der Zellen aus (a) und (b), und
    • (d) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zu testenden Substanz, und
    • (e) Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (e) gemessenen Detektionsignals.
  • Substanzen, welche die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, sind Inhibitoren, Aktivatoren oder Substanzen, die synergistisch mit Aktivatoren oder Inhibitoren, auf die NO-Freisetzung einwirken.
  • Die in Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Zusammensetzung ist in einer bevorzugten Ausgestaltung die Verwendung von nicht-rekombinanten und rekombinanten Zellen, die sich dadurch auszeichnen, dass sie Stickstoffmonoxid produzieren und freisetzen, zum Beispiel ausgewählt, aber nicht eingeschränkt durch, aus endothelialen Zellen, Gliazellen, Macrophagen, Neutrophilen oder daraus abgeleiteten immortalisierten Zellen.
  • Weitere Beispiele für Stickstoffmonoxid produzierende Zellen sind eukaryontische oder prokaryontische Zellen, die mit einer eukaryontischen NOS, zum Beispiel mit eNOS, iNOS oder nNOS, stabil oder transient transfiziert wurden.
  • Endotheliale Zellen sind zum Beispiel ausgewählt aus, aber nicht eingeschränkt durch, HUVEC, BAEC, HMVEC-dLyAd (Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells, Adult), HMVEC-dLyNeo (Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells, Neonatal), HMVEC-LB1 (Lung Blood Microvascular Endothelial Cells), HMVEC-LLY (Lung Lymphatic Microvascular Endothelial Cells), bAEC (Bovine Aortic Endothelial Cells), bAEC (Bovine Aortic Endothelial Cells, pooled), bCAEC (Bovine Coronary Artery Endothelial Cells), bPAEC (Bovine Pulmonary Endothelial Cells), HAEC (Aortic Endothelial Cells), HCAEC (Coronary Artery Endothelial Cells), HIAEC (Illiac Artery Endothelial Cells), HMVEC-Bd (Human Microvascular Endothelial Cells-Bladder), HMVEC-C (Human Microvascular Endothelial Cells-Cardiac), HMVEC-d (Dermal Microvascular Endothelial Cells, Adult), HMVEC-d (Dermal Microvascular Endothelial Cells, Neonatal), HMVEC-d (Dermal Microvascular Endothelial Cells, Neonatal, pooled), HMVEC-L (Lung Microvascular Endothelial Cells), HPAEC (Pulmonary Artery Endothelial Cells), HUAEC (Umbilical Artery Endothelial Cells), HUVEC (Umbilical Vein Endothelial Cells), (HUVEC (Umbilical Vein Endothelial Cells, Pooled), UtMVEC (Uterine Microvascular Endothelial Cells) und Endothelzellen isoliert aus Nagern, Schweinen und Hunden.
  • Die in Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Zusammensetzung ist in einer bevorzugten Ausgestaltung die Verwendung einer rekombinanten Zelle, die sich dadurch auszeichnet, dass sie Stickstoffmonoxid detektieren kann, zum Beispiel ausgewählt, aber nicht eingeschränkt, durch das Einführen einer mutierten Variante der Guanylylzyklase, welche in Abhängigkeit von Stickstoffmonoxid an Stelle von cGMP cyclisches Adenosinmonophosphat (CAMP) aus Adenosintriphosphat (ATP) synthetisiert [Sunahara et al, J Biol. Chem., 1998, 237, 16332]. Zum Beispiel kann bei Verwendung der löslichen Guanylylzyklase aus Ratte die Aminosäure Arginin 592 der alpha-Untereinheit durch Glutamin, die Aminosäuren Glutamat 473 der beta-Untereinheit durch Lysin und Cystein 541 der beta-Untereinheit durch Aspartat ausgetauscht werden, um das Reaktionsprodukt von cGMP auf cAMP zu ändern. Das gebildete cAMP wird mit Hilfe eines cAMP-sensitiven Reportergenkonstruktes bestimmt, bestehend aus einem Reportergen, welches funktionell mit einem cAMP-responsiblen Promoterelement verknüpft ist und sensitiv für intrazelluläres cAMP ist. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das cAMP-responsible Promoterelement ein CRE (cAMP Responsive Element, Fink, J.S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85(18):6662) induzierbarer Promoter, welcher ein oder mehrere CRE Elemente enthält. Bevorzugterweise kann auch eine Kombination aus ein oder mehreren CRE Elementen und einem oder mehreren MREs (Multiple Respone Element, Ray A, et al. Mol Cell Biol. 1989; 9(12):5537) als cAMP-responsibles Promoterelement verwendet werden. Das Reporterkonstrukt kann zusätzlich weitere Transkriptionskontrollelemente, wie zum Beispiel Fragmente aus viralen Promotoren, und auch selektierbare Marker zur Erzeugung stabiler Zelllinien. Das Einführen der zur Detektion von Stickstoffmonoxid benötigten mutierten Guanylylzyklase und des Reportergenkonstruktes in eine zu verwendende Zelle kann mit handelsüblichen Transfektionagenzien durchgeführt werden. Die Detektorzelle kann diese Komponenten transient exprimieren oder eine Detektorzelle kann so hergestellt werden, daß sie beide Komponenten bevorzugterweise stabil exprimiert. Eine stabil transfizierte Zelle kann mit handlesüblichen Selektionsmarkern generieret werden. Reportergene, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind zum Beispiel ausgewählt aus, aber nicht eingeschränkt durch, Firefly Luciferase aus Photinus pyralis, beta-Galactosidase, Green Fluorescent Protein (GFP), beta-Lactamase, Aequrin aus Aequorea victoria, CAT (Chloramphenicoltransferase) und Renilla Luciferase und weitere Gene und deren Genprodukte, die lumineszente oder fluoreszente Reaktionen katalysieren können. Eine solche Zelle ist zum Beispiel in Corazza et al., Assay Drug Dev Technol. 2006;4(2):165 oder in WO 2006/007937 beschrieben. Als Wirtszelle kann zum Beispiel eine CHO, HELA, MDCK oder HEK293 Zelle verwendet werden; sie sind zum Beispiel bei der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA) erhältlich.
  • Das in Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Kontakt bringen ist in einer bevorzugten Ausgestaltung die gemeinsame Ausbringung und Kultivierung der NO-produzierenden Zelle und der Detektorzelle in einem Probengefäß in einem Mischungsverhältnis von 10-fachem Überschuss bis zu 10-fachem Unterschuss der Detektorzelle zur NO-produzierenden Zelle, wobei der Bereich von 5-fachem Überschuss bis zu 5-fachem Unterschuss mehr bevorzugt und der Bereich von 2-fachem Überschuss bis zu 2-fachem Unterschuss der Detektorzelle am meisten bevorzugt ist. In Kontakt bringen bedeutet, dass die Zellen zusammen kultiviert werden können (Co-Kultur), wobei erst die eine und anschließend die zweite Zelle im selben Testgefäß ausgebracht werden, oder dass vor dem Ausbringen die Zellen gemischt werden, oder dass die Zellen über eine semipermeable Membran in Kontakt gebracht werden.
  • Das in Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Zusammensetzung kann zusätzliche Komponenten enthalten beispielsweise Reduktionsmittel, insbesondere solche, die Superoxid-Anionen und Hyperoxid-Anionen abfangen, Proteine, insbesondere solche, die Superoxid-Anionen und Hyperoxid-Anionen abfangen, oder weitere Substanzen, die das Signal des Reportergens verstärken können, insbesondere solche, die cAMP stabilisieren können.
  • Beispiele für Reduktionsmittel sind Ascorbat oder chemische Superoxid-Dismutase Mimetika wie zum Beispiel Mangan(III) tetrakis (4-benzoic acid)porphyrin chlorid (MnTBAP Chlorid).
  • Beispiele für Proteine sind Cu/Zn-abhängige Superoxid-Dismutase oder Mn-abhängige Superoxid-Dismutase.
  • Beispiele für Substanzen, die cAMP stabilisieren können, sind Phosphodiesteraseinhibitoren, wie zum Beispiel 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX).
  • Die zu testende Substanz in Stufe (d) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein.
  • Nachdem die zu testende Substanz in Stufe (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Zellen in Konatkt gebracht wurde, bildet sich das resultierende Stickstoffmonoxid schnell, typischerweise in innerhalb von Sekunden oder Minuten. Das gebildete Stickstoffmonoxid hat gewöhnlich eine sehr kurze Halbwertszeit, typischerweise eine Halbwertszeit von mehreren Sekunden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch die Kokultivierung von Stickstoffmonoxidfreisetzender Zelle und Detektor-Zelle eine besonders effiziente und verlustfreie Detektion des Stickstoffmonoxids und somit auch eine geringe Störanfälligkeit. Die nachfolgende Induktion des Reportergens beansprucht einen längeren Zeitraum, typischerweise mehrere Stunden. Die Verwendung einer funktionellen Kopplung des Stickstoffmonoxids an ein Reportergen-Detektionssystem
    hat mehrfache Vorteile, zum einen erleichtert die zeitliche Trennung der Substanzzugabe in Stufe (d) bzw. die Generierung des Stickstoffmonoxids und der Detektion des Reportergens in Stufe (e) die Automatisierung des Verfahrens und vermindert die Komplexität der zu verwendeten Apparate. Zum anderen bewirkt die Verwendung eines Reportergens eine Integration über das gesamte freigesetzte Stickstoffmonoxid und Amplifizierung des Signals, erhöht somit die Sensitivität des Verfahrens.
  • Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung inhibieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (d) hinzugegeben werden. Eine die NO-Freisetzung inhibierende Substanz kann zum Beispiel eine NOS direkt inhibieren oder durch Inhibierung eines eine NOS aktivierenden Schrittes wirken.
  • Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung nur indirekt stimulieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (d) hinzugegeben werden. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel durch die Inhibierung eines negativen Rückkopplungsmechanismus einer NOS wirken. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel auch durch die Induktion der Transkription und oder Translation einer NOS wirken.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welche folgende Stufen umfassen:
    • a) Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle
    • b) in Kontakt bringen der Zelle aus (a) mit einer zu testenden Substanz, und
    • c) Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
    • d) in Kontakt bringen der Zellen aus (b) und (c), und
    • e) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zweiten zu testenden Substanz, und
    • f) Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und
    • g) Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (f) gemessenen Detektionsignals.
  • Die zu testende Substanz in Stufe (b) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein.
  • Die zu testende zweite Substanz in Stufe (e) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein und ist typischerweise ein bekannter Modulator einer NOS.
  • Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung nur indirekt stimulieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel durch die Inhibierung eines negativen Rückkopplungsmechanismus einer NOS wirken. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel auch durch die Induktion der Transkription und oder Translation einer NOS wirken.
  • Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung inhibieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine die NO-Freisetzung inhibierende Substanz kann zum Beispiel eine NOS direkt inhibieren oder durch Inhibierung eines eine NOS aktivierenden Schrittes wirken.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welche folgende Stufen umfassen:
    • (a) Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle, und
    • (b) Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
    • (c) in Kontakt bringen der Zellen aus (a) und (b), und
    • (d) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zu testenden Substanz, und
    • (e) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (d) mit einer zweiten zu testenden Substanz, und
    • (f) Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und
    • (g) Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (f) gemessenen Detektionsignals.
  • Die zu testende Substanz in Stufe (d) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein.
  • Die zu testende zweite Substanz in Stufe (e) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein und ist typischerweise ein bekannter Modulator einer NOS.
  • Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung nur indirekt stimulieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel durch die Inhibierung eines negativen Rückkopplungsmechanismus einer NOS wirken. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel auch durch die Induktion der Transkription und oder Translation einer NOS wirken.
  • Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung inhibieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine die NO-Freisetzung inhibierende Substanz kann zum Beispiel eine NOS direkt inhibieren oder durch Inhibierung eines eine NOS aktivierenden Schrittes wirken.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das erfindungsgemäße Verfahren in homogener Phase durchgeführt. In dieser Ausgestaltung lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders leicht automatisieren und miniaturisieren. Dafür wird die zu testende Substanz in wässriger Lösung zu den Zellen gegeben, zur Erhöhung der Löslichkeit der Substanzen können Löslichkeitsvermittler wie DMSO zugesetzt werden. Zur Transfektion mit Nukleinsäuren können handelsübliche Transfektionsagenzien verwendet werden.
  • Die Kombination der Zellen und die Kombination der Zellen mit den zu testenden Substanzen kann mit handelsüblichen Vorrichtung zur Handhabung von Flüssigkeiten (Liquid Handling Systems) durchgeführt werden. Beispiele für geeignete Vorrichtungen sind Pipettiervorrichtungen, einschließlich Mikropipettierer und Parallelpipettierer, Dispensvorrichtungen, einschließlich Piezo-Effekt basierender Systeme, Bubble-Jet Systeme sowie Dispensiergeräte mit Ventilsteuerung und Übertragungsvorrichtungen, einschließlich Pin-Tool basierender Systeme.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können in handelsüblichen Reaktionsgefäßen, vorzugsweise Mikrotiterplatten mit 96, 384 oder 1536 Vertiefungen, ausgeführt werden.
  • Die Messung des Detektionssignals in Stufe (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit handelsüblichen Messgeräten durchgeführt werden.
  • Beispiele für luminogene Reportergene sind die Luciferasen aus Photinus pyralis bzw. aus Renilla. Je nach der Wahl des luminogenen Substrates kann es notwendig sein, die Zellen vor Beginn der Messung zu lysieren, um eine Substratsättigung des Reportergenproduktes zu gewährleisten. Beispiele für fluoresente Reportergene ist GFP. Es besteht aber auch die Möglichkeit handelsübliche fluorogene Substrate für Reportergene zu verwenden. Wird ein auf Lumineszenz basierendes Reportergen verwendet, kann das Verfahren mit handelsüblichen Lumineszenzmessgeräten durchgeführt werden. Wird ein auf Fluoreszenz basierendes Reportergen verwendet, kann das Verfahren mit handelsüblichen Fluoreszenzmessgeräten durchgeführt werden.
  • Für eine quantitative Bestimmung der freigesetzten Stickstoffmonoxidkonzentrationen in einer Testprobe werden zusätzlich Referenzproben mit bekannter NO-Konzentration in gleicher Weise behandelt und vermessen wie die Testproben. Aus dieser zusätzlichen Untersuchung wird eine Korrelation von Detektionsignal und NO-Konzentration unter den gegebenen experimentellen Bedingungen abgeleitet, wobei die Messdaten zum Beispiel graphisch interpoliert oder durch einen mathematischen Algorithmus und elektronische Prozessierung angenähert werden können. Aus der abgeleiteten Korrelation lässt sich dem für eine Testprobe gemessenen Detektionsignal direkt eine NO-Konzentration zuordnen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können in verschiedenen Bereichen vorteilhaft eingesetzt werden; von besonderem Interesse ist der Einsatz im Bereich der biomedizinischen Forschung, insbesondere der Wirkstoffforschung und der Arzneimittelforschung. Die erfindungsgemäßen Verfahren können, wie oben bereits erläutert, in homogener Phase und in wenigen einfachen Prozessierungsstufen durchgeführt werden; dadurch eignen sie sich ausgezeichnet zur Automatisierung und Miniaturisierung.
  • Der automatisierte Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren kann im Bereich der biomedizinischen Forschung, insbesondere der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, von Bedeutung sein; dort werden zur Auffindung neuer Wirkstoffkandidaten regelmäßig große Substanzbibliotheken mit teilweise mehr als einer Million Substanzen mit Hilfe automatisierter Verfahren durchgemustert (Hochdurchsatz Screening; High Throughput Screening); neben der leichten Automatisierbarkeit der Verfahren ist bei dieser Anwendung vor allem die Miniaturisierbarkeit, die hohe Sensitivität und die geringe Störanfälligkeit von Vorteil. Die Miniaturisierung der Testformate und die hohe Sensitivität reduzieren die Aufwendungen für die Herstellung oder Beschaffung von Reagenzien sowie den Verbrauch von Testsubstanzen. Geringe Störanfälligkeit führt üblicherweise zu hoher Datenqualität und guter Reproduzierbarkeit der Testergebnisse.
  • Dabei richtet sich das Screening typischerweise auf die Identifizierung von Modulatoren einer biologischen Aktivität, welche das Ziel einer medizinischen Therapie sein könnte. Biologische Aktivitäten, welche Stickstoffmonoxid als Botenstoff verwenden, sind zum Beispiel Endothelvermittelte Gefäßrelaxation, Makrophagen-induziertes abtöten eingedrungener Mikroorganismen, neuronale Signalübertragung im Gehirn und peripheren autonomen Nerven, Blutplättchenaggregation, Tumorprogression und Metastasierung oder der Wundheilung. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich ausgezeichnet für einen solchen Einsatz im pharmazeutischen Hochdurchsatz Screening, speziell zur Auffindung von Modulatoren von Enzymen und Rezeptoren, die die Stickstoffmonoxidbildung regulieren; von besonderem Interesse sind dabei zum Beispiel Modulatoren der Enzymaktivität von NOS oder deren direkte oder indirekten Regulatoren. Dafür wird die Stickstoffmonoxidbildung einer zu testenden Zelle nach einem der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in Gegenwart einer oder mehrerer geeigneter Konzentrationen einer Testsubstanz bestimmt, mit der Stickstoffmonoxidbildung in Abwesenheit der Testsubstanz verglichen und daraus die modulierenden Eigenschaften der Testsubstanz in bekannter Weise abgeleitet. Üblicherweise abgeleitete Eigenschaften einer Testsubstanz sind die aktivierende oder inhibierende Wirkung auf die untersuchte Aktivität.
  • Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verfahren auch zur weiteren Charakterisierung des Signalweges, der zur Stickstoffmonoxidbildung führt, verwendet werden, beispielsweise zur Auffindung eines neuen Modulators mittels der siRNA oder cDNA Technologie oder der Kombination dieser Methoden mit chemischen Substanzen.
  • Figuren:
  • 1: Prinzip des Kokultur-Assays
  • Assaysprinzip, bestehend aus einer NO-produzierenden Zelle und einer Detektorzelle. Freigesetztes NO diffundiert in Detektorzelle und reguliert die Expression eines Reportergens. sGCmut ist eine modifizierte lösliche Guanylylzyklase, welche die Reaktion von ATP in cAMP katalysieren kann. CRE Luci ist Reportergenkonstrukt, welches cAMP-abhängig die Expression der Luciferase steuert.
  • 2: NO-Freisetzung einer HUVEC gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
  • Signal der durch verschiedene Substanzen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Verwendete Substanzen wurden mit den angegebenen Konzentrationen verwendet. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) den NOS-Inhibitor L-NAME inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
  • 3: NO-Freisetzung einer HUVEC Zelle gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
  • Signal der durch verschiedene Substanzen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Verwendete Substanzen wurden mit den angegebenen Konzentrationen verwendet. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) den sGC-Inhibitor ODQ inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
  • 4: NO-Freisetzung einer BPAEC Zelle gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
  • Dosis-Wirkungsbeziehung (DRC) der NO-Freisetzung einer BPAEC Zelle durch den Stimulator ATP beziehungsweise Bradykinin mittels einer Detektorzelle mit sGCmut und CRE-Luciferase. RLU (Relative Lichteinheiten).
  • 5: NO-Freisetzung einer HUVEC Zelle moduliert durch einen synergistischen Stimulator gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
  • Signal der durch A23187 in den angegebenen Konzentrationen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) den NOS Inhibitor L-NAME (10 μM) kombiniert mit der Inkubation ohne (weisse Balken) bzw. mit 10 μM Sepiapterin (graue Balken) inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
  • 6: NO-Freisetzung einer HUVEC Zelle moduliert durch einen synergistischen Stimulator gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
  • Signal der durch verschiedene Substanzen in den angegebenen Konzentrationen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) Superoxid-Dismutase (10 U/ml) inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Charakterisierung des zellbasierten Kokulturassays zur Detektion von Stickstoffmonoxid
  • Das Prinzip des Kokultur-basierten Zellassays mittels einer Reportergen-Detektorzelle zur Detektion von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid modulieren ist in 1 beschrieben.
  • Zur Herstellung der Reportergen-Detektorzelle CHOsGCmut wurde analog nach WO 2006/007937(A1) bzw. Corazza et al., Assay Drug Dev Technol. 2006;4(2):165 vorgegangen.
  • Zur Charakterisierung des Assaysystems wurde die Detektorzelle CHOsGCmut mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) im Verhältnis 2:1 gemischt und 15000 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in 100 μl Kulturmedium (EGM-2 mit 2% FBS) ausgesät. Nach 48 Stunden unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 50 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in 2 und 3 illustriert entweder keine Zusätze oder wurde mit dem eNOS-Inhibitor L-NAME mit einer Endkonzentration von 10 μM (2) bzw. dem sGC Inhibitor ODQ mit einer Endkonzentration von 10 μM (3) versetzt. Nach 30 Minuten Inkubation wurden 50 μl einer Testsubstanz gelöst in Tyrode zugegeben, wie in 2 und 3 illustriert wurden die NO-freisetzenden Substanzen ATP, Histamin und A23187 verwendet. Zur Lösungsverbesserung wurde eine Endkonzentration von 0,25% DMSO v/v verwendet. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase-Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
  • Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzenden Substanzen ATP, Histamin und A23187 eine signifikante Signalerhöhung des Reportergens bezüglich der Kontrollprobe, bei der nur Tyrode mit 0,25% DMSO zugegeben wurde, bewirken. Des weiteren zeigen die Beispiele in 2 und 3, dass bei Vorinkubation der Zellmischung mit L-NAME oder ODQ keine signifikante Erhöhung des Reportergensignals resultiert. L-NAME inhibiert eNOS und ODQ inhibiert die sGC. Die Ergebnisse zeigen, dass das Assyayformat selektiv freigesetztes NO detektiert. Als weitere Kontrolle wurde Forskolin bzw. BAY 41-2272 verwendet. Die Beispiele zeigen darüber hinaus, dass mit diesem Verfahren Inhibitoren und Aktivatoren der NO-Freisetzung identifiziert werden können.
  • Beispiel 2
  • Nachweis der Dosisabhängigkeit der NO-Freisetzung durch Stimulation primärer boviner pulmonararterieller Endothelzellen mit ATP oder Bradykinin
  • Die Detektorzelle CHOsGCmut wurde mit primären bovinen pulmonararteriellen-Endothelzellen (BPAEC) im Verhältnis 2:1 gemischt und 7500 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in 100 μl Kulturmedium (EGM-2 MV mit 5% FBS) ausgesät. Nach 48 Stunden unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 100 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in 4 illustriert aufsteigende Konzentrationen der NO-freisetzenden Substanzen ATP oder Bradykinin. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase-Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
  • Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzenden Substanzen ATP und Bradykinin eine signifikante und stabile Signalerhöhung des Reportergens bewirken und der Assay zur Identifizierung und Charakterisierung verwendet werden kann.
  • Beispiel 3
  • Nachweis der erhöhten NO-Freisetzung durch synergistisch stimulierende Substanzen an primären humanen HUVEC Zellen
  • Die Detektorzelle CHOsGCmut wurde mit HUVEC Zellen im Verhältnis 2:1 gemischt und 15000 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in 100 μl Kulturmedium (EGM-2 mit 2% FBS) ausgesät. Nach 24 Stunden unter Standartkulturbedingungen wurde der Hälfte der Kulturen die Substanz Sepiapterin (Sigma, Bestell-Nr. S154) in einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben (5 graue Balken). Nach weiteren 24 h unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 50 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in 5 illustriert entweder keine Zusätze oder wurde mit dem eNOS-Inhibitor L-NAME mit einer Endkonzentration von 10 μM versetzt (5 schraffierte Balken). Nach 30 Minuten Inkubation wurden 50 μl einer Testsubstanz gelöst in Tyrode zugegeben, wie in 5 illustriert wurden die NO-freisetzende Substanz A23187 verwendet. Zur Lösungsverbesserung wurde eine Endkonzentration von 0,25% DMSO v/v verwendet. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase-Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
  • Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzende Substanz A23187 signifikante und stabile Signalerhöhung des Reportergens bewirken und die NO-Freisetzung durch Sepiapterin gesteigert werden kann. Die Kontrolle mit dem eNOS Inhibitor L-NAME zeigt, dass Sepiapterin spezifisch das durch NO erzeugte Signal erhöht und nicht auf eine anderweitige Art das Reportergensignal erhöht. Der Assay kann zur Identifizierung und Charakterisierung von direkten und synergistisch wirkenden Substanzen verwendet werden kann.
  • Beispiel 4
  • Nachweis der erhöhten NO-Freisetzung durch Zugabe von Superoxiddismutase
  • Die Detektorzelle CHOsGCmut wurde mit HUVEC Zellen im Verhältnis 2:1 gemischt und 15000 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in 100 μl Kulturmedium (EGM-2 mit 2% FBS) ausgesät. Nach 48 h unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 50 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in 6 illustriert entweder keine Zusätze oder wurde mit Superoxiddismutase (SOD) (Sigma, Bestell-Nr. S5395) mit einer Endkonzentration von 10 U/ml versetzt (6 schraffierte Balken). Nach 30 Minuten Inkubation wurden 50 μl einer Testsubstanz gelöst in Tyrode zugegeben, wie in 6 illustriert wurden die NO-freisetzenden Substanzen ATP, Histamin und A23187 verwendet. Zur Lösungsverbesserung wurde eine Endkonzentration von 0,25% DMSO v/v verwendet. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase-Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
  • Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzenden Substanzen signifikante und stabile Signalerhöhung des Reportergens bewirken und die NO-Freisetzung durch SOD gesteigert werden kann. Der Assay kann zur Identifizierung und Charakterisierung von direkten und synergistisch wirkenden Substanzen verwendet werden kann.
  • Material und Methoden:
  • Zellkultur: CHOsGCmut wurde in DMEM/F12 (Invitrogen, Bestell-Nr. 21331-020), 2% Glutamax (Invitrogen, Bestell-Nr. 35050-087), 10% FBS (Invitrogen, Bestell-Nr. 10082-147), 1% Pen./Strep (Invitrogen, Bestell-Nr. 15070-063), 2% HEPES (Invitrogen, Bestell-Nr. 15630-122), Natrium-Pyruvat (Invitrogen, Bestell-Nr. 11360-039) und 2% Natrium-Bicarbonat (Invitrogen, Bestell-Nr. 25080-102) kultiviert (alle Angaben in v/v). Die Zellen wurden geerntet und für die Experimente verwendet, wenn sie 70-80% Konfluenz erreichten. Die Zellen wurden unter normalen Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO2-Atmosphäre) gehalten und zweimal die Woche passagiert.
  • HUVEC Zellen (Cambrex, Bestell-Nr. CC-2519) wurden in EGM-2 (Cambrex, Bestell-Nr. CC-3162) nach Angaben des Herstellers kultiviert. BPAEC Zellen (Cambrex, Betsell-Nr. BW-6004) wurden in EGM-MV (Cambrex, Bestell-Nr. CC-3125) nach Angaben des Herstellers kultiviert.
  • Verwendete Substanzen und Puffer: ODQ (Sigma, Bestell-Nr. O3636), Bay41-2272 (Alexis, Bestell-Nr. ALX-420-030), Histamin (Fuka, Bestell-Nr. 53290), ATP (Sigma, Bestell-Nr. A6419), A23187 (Calbiochem, Bestell-Nr. 100105), Forskolin (Sigma, Bestell-Nr. F3917), Bradykinin (Sigma, Bestell-Nr. B3259) Tyrode Puffer (1 mM Mg Cl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3 und 20 mM HEPES, pH 7,4), Luciferin/Triton Lösung (530 μM ATP, 470 μM Luciferin, 270 μM Coenzym A, 20 mM Tricine, 2,67 mM MgSO4, 33,3 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 15 Triton, 10% Glycerin, 25 mM Na2HPO4, 25 mM TRIS-HCL, pH 7,8) Luciferin (Sigma, Bestell-Nr. L9504), Coenzym A (Sigma, Bestell-Nr. C4282), L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methylesterhydrochlorid, Sigma, Bestell-Nr. N5751).

Claims (11)

  1. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welches folgende Stufen umfasst: a. Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle, und b. Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und c. in Kontakt bringen der Zellen aus (a) und (b), und d. in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zu testenden Substanz, und e. Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und f. Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (f) gemessenen Detektionsignals.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt (d) und (e) in Anspruch 1 ein weiterer Schritt eingeführt wird, der das in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus Anspruch 1(d) mit einer zweiten zu testenden Substanz umfasst, wenn dies für die Identifizierung von Inhibitoren oder synergistischen Modulatoren notwendig ist.
  3. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Stickstoffmonoxid produzierende Zelle zuerst mit einer zu testenden Substanz in Kontakt gebracht und dann erst mit der Detektorzelle in Kontakt gebracht wird.
  4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die NO-produzierende Zelle eine nicht-rekombinante oder rekombinante Zelle ist.
  5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die NO-produzierende Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus eNOS, iNOS oder nNOS exprimierenden Zellen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die NO-produzierende Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus endothelialen Zellen, Gliazellen, Macrophagen, Neutrophilen oder daraus abgeleiteten immortalisierten Zellen.
  7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorzelle a. ein Reportergen enthält, welches funktional an einen cAMP-induzierbaren Promoter gekoppelt ist, und b. eine modifizierte lösliche Guanylylzyklase enthält, welche die Reaktion von ATP in cAMP katalysieren kann.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die lösliche Guanylylzyklase aus Ratte verwendet wird und worin die Aminosäure Arginin 592 der alpha-Untereinheit durch Glutamin, die Aminosäuren Glutamat 473 der beta-Untereinheit durch Lysin und Cystein 541 der beta-Untereinheit durch Aspartat ausgetauscht wurde.
  9. Verfahren nach Ansprüchen 7-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorzelle ein Reportergen enthält, welches funktional an einen durch CRE oder MRE/CRE-Elemente gesteuerten Promoter gekoppelt ist.
  10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen und deren Genprodukte, die lumineszente oder fluoreszente Reaktionen katalysieren können.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Firefly Luciferase aus Photinus pyralis, beta-Galactosidase, Green Fluorescent Protein (GFP), beta-Lactamase, Aequorin aus Aequorea victoria, CAT (Chloramphenicoltransferase) oder Renilla Luciferase.
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