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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Hoch-Durchsatz-Screening-Verfahren
und eine ebensolche Vorrichtung für die Diagnose und Dosierung
eines Agonisten und/oder eines Antagonisten für einen Calcium-gekoppelten
Rezeptor und/oder den Antagonisten dieses Calcium-gekoppelten Rezeptors,
der mittels dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung identifiziert
worden ist.
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Eine
Reihe von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) lösen nach
Bindung an einen Agonisten einen vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration
aus. Diese Veränderung
wirkt als ein interner sekundärer
Bote und ist ein wichtiger Modulator von vielen physiologischen
Mechanismen (Übersichtsartikel
von Rink (1990), Tsunoda (1993) und Santella & Carafoli (1997)). Die Messung der
intrazellulären
Calcium-Konzentration in Zellen, die einen GPCR exprimieren, kann
somit verwendet werden, um die Wirksamkeit der Aktivierung eines
GPCR durch verschiedene Verbindungen, von denen bekannt ist oder
angenommen wird, dass sie ein Ligand für diesen GPCR sind, zu überwachen.
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Die
Aktivierung von anderen Rezeptoren wie Innenkanälen kann ebenfalls eine intrazelluläre Calcium-Konzentration
induzieren.
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Veränderungen
in der Calcium-Konzentration können
auf mehrere Weisen und mittels mehrerer Methoden wie die Verwendung
von fluoreszierenden Farbstoffen (zum Beispiel: Fura-2, Fluo-3,
Fluo-4 und Indo-1) nachgewiesen werden.
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Ca++-sensitive Farbstoffe haben jedoch ihre Beschränkungen.
Die Aktivierung der Farbstoffe mit einem Anregungsstrahl erfordert
komplizierte und teure Instrumente und begrenzt die Verwendung von Plastikmaterial
im Labor wie den Mikrotiter-Platten
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Ein
anderes Verfahren zur Messung der intrazellulären Calcium-Konzentration besteht
in der Verwendung von Zelllinien, die einen GPCR und Apoäquorin überexprimieren,
wie es von Sheu et al. (1993) beschrieben worden ist. In diesem
System werden Zellen, die Apoäquorin
exprimieren, mit Coelenteracin, dem Co-Faktor von Äquorin,
inkubiert. Während
dieser Inkubation gelangt das Coelenteracin in die Zelle und konjugiert
mit Apoäquorin
unter Bildung von Äquorin,
das die aktive Form des Enzyms ist. Nach Inkubation der Zellen mit
einem Agonisten des GPCR steigt die intrazelluläre Calcium-Konzentration. Dieser
Anstieg führt
zur Aktivierung der katalytischen Aktivität von Äquorin, das Coelenteracin oxidiert
und Apoäquorin,
Coelenteramid, CO2 und Licht ergibt. Nachdem
das Photon einmal emittiert worden ist, muss der Komplex dissoziieren und
das Apoäquorin
mit einem neuen Molekül
Coelenteracin rekombinieren, um nochmals in der Lage zu sein, Licht
zu emittieren. Somit reflektiert die Messung der Lichtemission nach
der Zugabe des Agonisten in diesem System die Fähigkeit, den GPCR zu aktivieren
und so die intrazelluläre
Calcium-Konzentration zu erhöhen.
Da Licht nur während
eines Zeitraums von 20 bis 30 Sekunden nach der Aktivierung des
GPCR emittiert wird, muss das Aufzeichnen des emittierten Lichtes
während
der wenigen Sekunden nach Zugabe des Agonisten zu den Zellen erfolgen. Dieses
Signal nach Art eines Blitzes beruht auf der Tatsache, dass (1)
der intrazelluläre
Anstieg der Calcium-Konzentration, ausgelöst durch den GPCR, nur vorübergehend
auftritt, und (2) wie vorher erwähnt, Apoäquorin nach
der Oxidation von Coelenteracin mit Coelenteracin rekombinieren
muss, um befähigt zu
sein, wiederum Licht zu emittieren.
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Die
europäische Patentanmeldung 0 341 477 lehrt
die Expression des Photoproteins Äquorin aus der Qualle in einem
Säugetier-Zellsystem
durch Klonierung von Gen pAQ440, das für die Biosynthese des Äquorin verantwortlich
ist, in einen Expressionsvektor eines Säugetier-Zellsystems. Die Anmeldung lehrt weiterhin,
dass das resultierende Plasmid einer Transfektion unterzogen wird
und das Photoprotein Äquorin
in den Säugetierzellen
produziert wird.
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US-Patent 5,422,266 beschreibt
ein Gen, das für
das Apoäquorin-Protein
kodiert und in einem Vektor enthalten ist, der zur Expression von
Apoäquorin
in E. coli in der Lage ist.
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US-Patent 5,714,666 beschreibt
Säugetier-Zelllinien
oder transgene Tiere, die Apoäquorin und
einen Rezeptor, der bei der Modulation der intrazellulären Calcium-Konzentration beteiligt
ist, exprimieren. Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren,
die intrazelluläre
Calcium-Konzentration zu bestimmen, wobei das Verfahren die Schritte
umfasst, den Säugetierzellen,
die Apoäquorin
exprimieren, Coelenteracin-Co-Faktoren zuzusetzen und die Photoemission
zu messen, wobei die Emission von Photonen die intrazelluläre Calcium-Konzentration anzeigt.
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Die
Verfahren des Standes der Technik erfordern jedoch zunächst das
Ausbreiten von Zellen einer Saugetier-Zelllinie, die Apoäquorin exprimiert, auf
einem festen Träger
(zum Beispiel einer 96-Loch-Platte), zweitens die Zugabe des Coelenteracin-Co-Faktors
auf die Zellen und die Inkubation, um funktionelles Äquorin zu
rekonstituieren, drittens die Herstellung eines Agens, das auf einen
Rezeptor wirkt, der bei der Modulation der intrazellulären Calcium-Konzentration involviert
ist, und seine Zugabe zu den hergestellten Zellen, und schließlich die
Messung der Lichtemission.
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Außerdem wird
Licht, wie oben erwähnt,
nur während
des Zeitraums von 20 bis 30 Sekunden nach der Aktivierung des GPCR
emittiert. Daher muss die Aufzeichnung des emittierten Lichts während der
wenigen Sekunden, nachdem der Agonist den Zellen zugefügt worden
ist, erfolgen.
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Boie
und Mitarbeiter (Boie et al., Eur. J. Pharmacol. 340:227–241, 1997)
verwendeten einen Aequorin-Lumineszenz-Assay in HEK 293-Zellen,
die den Prostanoid-EP1-Rezeptor (einen GPCR) der Ratte exprimieren.
Die transfizierten Zellen werden mittels Inkubation mit Coelenteracin
beladen, und die Lichtemission wurde unter Verwendung eines Luminometers
30 Sekunden lang gemessen, woraufhin Triton X-100 zur Solubilisierung
der Zellen zugegeben und die Lichtemission erneut für weitere
10 Sekunden gemessen wurden. Das Verfahren gestattet es jedoch nicht,
die Zellen solange zu erhalten, wie es nötig ist, um ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren durchzuführen.
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Daher
sind die Verfahren, die im Stand der Technik verwendet werden, nicht
geeignet für
einen Nachweis basierend auf einem Hoch-Durchsatz-Screening-Niveau,
das normalerweise Luminometer und die Verwendung von Mikrotiter-Platten zum
Testen von Tausenden von Verbindungen erforderlich macht.
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Die
vorliegende Erfindung zielt darauf, ein Verfahren und Mittel, das/die
die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen, zum Nachweis
von biologisch aktiven Substanzen, speziell Agonisten und/oder Antagonisten,
für Calcium-gekoppelte
Rezeptoren, zur Verfügung
zu stellen.
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Ein
wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein
solches Verfahren und Mittel, die den Nachweis von biologisch aktiven
Substanzen in einem Hoch-Durchsatz- Maßstab
erlauben, und die an spezielle Träger wie Mikrotiter-Platten
adaptiert werden können,
ohne dass eine Modifikation der Vorrichtung für den Hoch-Durchsatz-Screening-Prozess erforderlich
ist, bereitzustellen.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einfaches
und preiswertes Verfahren bereitzustellen, das einfach automatisiert
werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Hoch-Durchsatz-Screening-Verfahren
und eine ebensolche Vorrichtung für die Diagnose und Dosierung
eines Agonisten und/oder eines Antagonisten für einen „Calcium-gekoppelten" Rezeptor, wobei
das Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:
- – einen
Agonisten und/oder einen Antagonisten (vorzugsweise von einem Molekül) des Rezeptors auf
einen festen Träger
aufzubringen,
- – mindestens
eine Zelle, die Apoäquorin
und den „Calcium-gekoppelten" Rezeptor exprimiert,
mit Coelenteracin zu inkubieren, um durch diese Zelle(n) ein aktives Äquorin zu
rekonstituieren,
- – dem
festen Träger
mindestens eine Zelle zuzufügen,
wobei diese mindestens eine Zelle in einer homogenen Suspension
vorliegt und gehalten wird, und
- – die
Messung des von dieser/n Zelle(n) emittierten Lichts vorzunehmen.
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Der
Begriff „Calcium-gekoppelter" Rezeptor steht für irgendeinen
Rezeptor (wie einen G-gekoppelten Rezeptor oder einen Innenkanal),
dessen Aktivierung (mittels eines Ions, eines bekannten oder unbekannten
Agonisten oder Antagonisten) die intrazelluläre Calcium-Konzentration in der Zelle, die den Rezeptor
enthält,
vorzugsweise in ihrer cytoplasmatischen Membran, erhöhen kann.
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Der
Begriff „...auf
einen festen Träger
aufzubringen" bedeutet
den Schritt, die Verbindung auf einen Träger wie eine Mikrotiter-Platte
oder irgendeinen anderen festen Träger aufzubringen, ohne dass die
Fixierung (kovalent oder anderweitig) der Verbindung auf dem festen
Träger
nötig wäre.
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Vorteilhafter
Weise ist der feste Träger
eine Mikrotiter-Platte, vorzugsweise eine Mikrotiter-Platte mit
96 Vertiefungenn.
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Vorzugsweise
ist die Zelle, die Apoäquorin und
den Calcium-gekoppelten Rezeptor exprimiert, eine Zelle, die einen
G-gekoppelten Rezeptor und möglicherweise
mindestens ein Protein, wie es benötigt wird, um eine Kopplung
des Rezeptors an den Calcium-Signalweg zu gewährleisten, exprimiert.
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Vorzugsweise
ist das Protein ausgewählt aus
einem natürlichen
G-α16- oder
G-α15-Protein, einem chimären G-Protein,
das resultiert aus einer Fusion zwischen zwei verschiedenen G-Proteinen, oder
ein Phospholipase-Cβ2-Protein.
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Die
Messung des emittierten Lichtes erfolgt vorteilhafter Weise mit
einem oder mit mehreren Luminometern, möglicherweise ausgerüstet mit
mehreren Dispensern und Messköpfen.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele, die
nicht beschränkend sind,
und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher beschrieben.
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1 zeigt
eine Reihe von Kurven, die die Intensität des von Zellen emittierten
Lichts als Funktion der Zeit für
jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte, die mit Zellen versehen ist,
die den CCR5-Rezeptor, Apoäquorin
und G-α16
exprimieren, darstellen. Der Maßstab
ist für
allen Graphen derselbe. Die Aufzeichnung des Signals erfolgte über einen
Zeitraum von 30 Sekunden. Von Spalte 1 nach Spalte 12 steigen die
Konzentrationen des Liganden. Alle Messungen wurden zweifach durchgeführt. Zeilen
A und B: Ligand ist RANTES; Zeilen C und D: Ligand ist MIP-1α; Zeilen
E und F: Ligand ist MIP-1β;
Zeilen G und H: Ligand ist Derivat A von RANTES.
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2 stellt
die Dosis-Wirkung-Kurve von verschiedenen Agonisten des CCR5-Rezeptors dar, wobei
die RLEen (Integration des emittierten Lichts auf 30 Sekunden) gegen
die Endkonzentration des Liganden in logarithmischer Darstellung
aufgezeichnet sind.
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3 stellt
die Dosis-Wirkung-Kurve von verschiedenen Agonisten des 5HT-2B-Rezeptors dar.
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4 stellt
die Dosis-Wirkung-Kurve des aus K562-Zellen, die CCR3 und Äquorin als
Reaktion auf die Aktivierung des Rezeptors mittels Eotaxin exprimieren,
emittierten Lichts dar.
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5 stellt die Dosis-Wirkung-Kurven für Zellen
dar, die Äquorin
und Gα16
und (5A) den Orexin-1-Rezeptor oder (5B)
den Orexin-2-Rezeptor exprimieren.
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6 stellt
die Dosis-Wirkung-Kurve für
verschiedene Antagonisten des 5HT-2B-Rezeptors dar.
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Der
Nachweis von agonistischen Aktivitäten mittels Säugetier-Zelllinien,
die Apoäquorin
und einen GPCR exprimieren, erfordert die Messung des emittierten
Lichts, wobei die Messung erfolgen muss, unmittelbar nachdem die
Zellen mit dem potentiellen Agonisten in Berührung gebracht worden sind.
Dies kann bei einem geringen Durchsatz unter Verwendung eines Einzelröhrchen-Luminometers
auf einfache Weise erfolgen. Bisher konnte dieses biologische System
jedoch nicht im Hoch-Durchsatz-Maßstab angewendet werden. In
der Tat,
- (1) zwingt einen die Notwendigkeit,
das Licht zu messen, unmittelbar nachdem die Zellen mit dem Agonisten
in Berührung
gebracht worden sind, ein Luminometer zu verwenden, das mit einem
eingebauten Dispenser ausgestattet ist. Aufgrund der Kürze der
Lichtemission ist es beispielsweise unmöglich, die zu testenden Wirkstoffe
auf die Zellen in den 96 Vertiefungenn zu geben, während die Platte
außerhalb
des Luminometers ist, und anschließend das emittierte Licht aufzeichnen,
während
die Platte im Luminometer ist. Selbst wenn die Platte schnell (d.
h. in weniger als 15 Sekunden) in das Luminometer gesetzt werden
könnte, nachdem
die zu testenden Wirkstoffe auf die Zellen gegeben worden sind,
ermöglicht
die gegenwärtige
Apparatur keine Messung von Licht aus den 96 Vertiefungenn vor der
Extinktion des Blitzsignals von Äquorin,
da diese Luminometer nicht mit 96 Detektoren ausgerüstet sind.
- (2) erlauben Luminometer, die mit einem eingebauten Dispenser
ausgestattet sind, nur die Injektion einer einzigen Lösung in
die 96 Vertiefungen, was die Injektion von verschiedenen Wirkstoffen in
jede Vertiefung unmöglich
macht. Darüber
hinaus ist der Waschvorgang des Dispensers vor jeder Messung für die Injektion
eines anderen Wirkstoffes in die nächste Vertiefung zeitaufwendig und
somit für
einen Hoch-Durchsatz-Maßstab ungeeignet.
Dasselbe Problem tritt mit Vorrichtungen auf, die mit 6 Dispenser
(z. B. "Microbeta® Jet" von EG&G Wallac) ausgestattet
sind, da die 6 Dispenser nur eine einzige Lösung zuführen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, um
ein Screening mit hohem Durchsatz auf Wirkstoffe, die an GPCRen
binden, mittels Säugetier-Zelllinien,
die Apoäquorin
und einen GPCR exprimieren, und mittels eines konventionellen Luminometers
durchzuführen.
Nach diesem Verfahren werden die Lösungen, die auf (ant)agonistische
Aktivitäten
zu testen sind, in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte gegeben.
Zellen, die Apoäquorin
und einen GPCR exprimieren, werden von der Kulturplatte abgelöst (oder
aus Suspensionskulturen gesammelt) und mit Coelenteracin inkubiert,
um aktives Äquorin
zu rekonstituieren. Diese werden dann mit einem Magnetrührer in
Suspension gehalten. Diese Zellsuspension wird dann, Vertiefung
für Vertiefung,
auf die Lösungen
des potenziellen Agonisten, der getestet werden soll, injiziert.
Dann wird die Lichtemission 1 Sekunde lang aufgezeichnet (alternativ
bis zu 30 oder mehr Sekunden). Dieses Verfahren, dieselbe Zellsuspension
in jedes der 96 Vertiefungen zu injizieren, vermeidet die Notwendigkeit, den
Dispenser zwischen jeder Messung zu waschen und erlaubt 96 Messungen
von Agonistinduzierter Äquorin-Lichtemission
in 15 Minuten oder weniger mit einem einzigen Dispenser-Luminometer. Alternativ
ermöglicht
es 96 Messungen der Agonist-induzierten Äquorin-Lichtemission in 2 Minuten oder weniger mit
einem Luminometer, das mit 6 Dispenser und Meßköpfen (z. B. "Microbeta® Jet" von EG&G Wallac) ausgestattet
ist.
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Dieses
Verfahren erlaubt somit die Durchführung eines Hoch-Durchsatz-Screenens
(10.000 Proben/Tag) mit Säugetier-Zelllinien,
die Apoäquorin
und einen GPCR expremieren, mittels Verwendung eines konventionellen
Luminometers. Dies reduziert die Zeit fürs Screenen und die Menge an
Wirkstoffen, die für
jede Messung benötigt
wird.
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Dieses
System erlaubt auch die Durchführung
eines funktionellen Screenings mit sehr wenigen Zellen pro Messung
(herunter bis 5.000 oder weniger).
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Die
Injektion der Zellen in die Vertiefungen, die die Agonisten enthalten,
erhöhten
den Hintergrund der Messung (der beispielsweise seinen Ursprung
haben könnte
im Aufbrechen von Zellen, im Freisetzen von Äquorin-Molekülen aus
den Zellen in das Kulturmedium, wo die Calcium-Konzentration die Emission
von Licht aus Äquorin
ausgelöst
hätte) nicht.
Ein Signal-Rausch-Verhältnis von über 50 wurde
mit diesem System der Zellinjektion üblicherweise erhalten.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet für die Durchführung von
Hoch-Durchsatz-Analysen
der Stimulation von GPCR oder anderen Calcium-gekoppelten Rezeptoren
durch bekannte oder potenzielle Agonisten mittels Zellen, die den Rezeptor
und Apoäquorin
exprimieren. Diese Zellen können
Apoäquorin
im Cytoplasma exprimieren, wie beschrieben von Sheu et al. (1993)
oder Button und Brownstein (1993). Apoäquorin kann aber auch mittels
Anfügen
einer auf Mitochondrien zielgerichteten Sequenz an Äquorin,
wie sie von Stables et al. (1997) verwendet wird, in Mitochondrien
exprimiert werden. Schließlich
kann Apoäquorin
aber auch in irgendeinem anderen Teil der Zelle exprimiert werden.
Diese Zellen können
auch Proteine exprimieren, die die Kopplung des überexprimierten Rezeptors an
den Calcium-Signalweg
sicherstellen sollen. Dies können die
natürlichen
Proteine Gα16
oder Gα15
(Milligan et al., 1996), chimäre
G-Proteine, die aus einer Fusion zwischen zwei verschiedenen G-Proteinen
resultieren (Komatsuzaki et al., 1997), Phospholipase C-β2 (Park et
al., 1992) oder irgendein anderes "universelles Kupplungs"-Protein sein. Wenn
die Zellen erst einmal hergestellt und mit Coelenteracin beladen worden
sind, können
sie für
mehrere Stunden (wenigstens 9 Stunden) verwendet werden. Die Beladung
mit Coelenteracin und die Intensität des Lichts, das von den Zellen
nach Stimulierung durch den Agonisten emittiert wird, ist für diese
Zeitspanne stabil.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Es
wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Chemokin-CCR-5-Rezeptor,
das Kopplungsprotein Gα16
und Apoäquorin
exprimiert. Zellen wurden als Monolager in HAMs F12-Medium mit 10%
fötalem Rinderserum
(FBS) gezüchtet.
Am Tag des Experiments wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden
5 Minuten bei Raumtemperatur in PBS-EDTA (Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne
Calcium, ergänzt
mit 5 mM EDTA) inkubiert. Die Zellen wurden durch Schütteln der
Kulturplatte mit der Hand und durch Auf- und Abpipettieren von dem
Kulturgefäß abgelöst. Die
Zellen wurden zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt, um
das EDTA zu eliminieren; der Bodensatz wurde in HAMs F12-Kulturmedium
ohne FBS und mit 0,1% BSA resuspendiert. Die Zellen wurden mittels
einer Thomas-Zelle gezählt, wieder
zentrifugiert und in HAMs F12-Kulturmedium ohne FBS und mit 0,1%
BSA in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml
resuspendiert. Coelenteracin (oder ein Derivat von diesem, z. B.
Coelenteracin f, h, n, cp oder hcp, von Molecular Probes Inc.) in
einer Konzentration von 500 μM
in Methanol wurde der Zellsuspension zu einer Endkonzentration von
5 μM zugegeben.
Die Zellsuspension wurde dann bei Raumtemperatur 3 bis 5 Stunden
lang im Dunklen gelagert, wobei alle 15 bis 30 Minuten geschüttelt wurde,
um die Zellen in Suspension zu halten.
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Verdünnungsreihen
bekannter Liganden wurden in HAMs F12-Kulturmedium ohne FBS und mit
0,1% BSA hergestellt. Jeweils 50 μl
dieser Lösung
wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte gegeben. Die Zellsuspension
wurde fünffach
mit HAMs F12-Medium ohne FBS und mit 0,1% BSA verdünnt und
in einem Glas- oder Plastikcontainer gegeben, der dadurch vor Licht
geschützt
war, dass er mit Aluminiumfolie eingepackt wurde. Ein Magnet-Rührfisch
wurde der Suspension zugeben und ein magnetischer Rührer wurde
bei langsamer Geschwindigkeit (1 bis 5 Umdrehungen/sec) verwendet,
um die Zellen in einer homogenen Suspension zu halten. Der Magnet-Rührfisch
wurde mit einem Ring versehen, um Verletzungen der Zellen und nachfolgende
Freisetzung von Äquorin
in das Kulturmedium zu vermeiden. Alternativ kann ein Kulturgefäß, das ausgerüstet ist für die Kultur
von Zellen in Suspension, verwendet werden.
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Man
verwendet das EG&G
Wallacs MicroLumatPlus Mikroplatten-Luminometer, das die Injektion und
direkt nachfolgende Aufzeichnung des emittierten Lichts aus jeder
Vertiefung einer 96-Loch-Platte erlaubt. Das Ende des Eintrittsröhrchens
des Dispensers wurde auf den Boden der Zellsuspension gegeben. Der
Dispenser wurde mit dem dreifachen Totvolumen der Apparatur gewaschen,
so dass das gesamte Volumen des Röhrchens und der Pumpen mit der
Zellsuspension gefüllt
war. Die 96-Loch-Platte, die Lösungen
der Agonisten enthielt, wurde dann in das Luminometer eingeführt. Dann
wurden jeweils 50 μl
der Zellsuspension (d. h. 100.000 Zellen) in jede Vertiefung gegeben
(bei der niedrigsten Injektionsgeschwindigkeit: 0,4 sec), um das
Aufbrechen von Zellen zu verhindern, das die Freisetzung von Äquorin in das
Kulturmedium bedingen würde.
Das emittierte Licht wurde über
einen Zeitraum von 30 sec sofort aufgezeichnet. Nach dem Ablesen
der ersten Vertiefung wurden Zellen in die nächste Vertiefung injiziert und
das emittierte Licht aufgezeichnet, etc. Für jede Platte wurde eine Reihe
von Kurven, die die Intensität des
emittierten Lichts als Funktion der Zeit für jede Vertiefung darstellen,
dargestellt (1). Die Intensität des emittierten
Lichts wurde unter Verwendung der Winglow-Software, die mit dem
Luminometer bereitgestellt wurde, über einen Zeitraum von 30 sec
integriert. Es ergab sich für
jede Vertiefung ein Wert, der repräsentativ ist für das emittierte
Licht und deshalb für
die Stimulation des CCR-5-Rezeptors durch den in der Vertiefung
vorhandenen Agonisten. Diese Werte können gegen den Logarithmus
der Liganden- Konzentration
aufgetragen werden, um die Dosis-Wirkung-Kurve zu erzeugen, wie
sie in 2 dargestellt ist. Diese erlauben die Bestimmung
der Dosis für
halbmaximale Antwort (EC50) für jeden
Liganden. Für
die Erzeugung dieser Daten wurden 288 Messungen in weniger als 3
Stunden durchgeführt.
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Beispiel 2
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Es
wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Serotonin-5HT-2B-Rezeptor,
das Kopplungsprotein Gα16
und Apoäquorin
exprimiert. Die Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt
und nach ihrer Verdünnung
(100 μl/Loch,
entsprechend 50.000 Zellen) zu je 100 μl Lösung eines für diesen Rezeptor
bekannten Agonisten gegeben. Das emittierte Licht wurde für jede Vertiefung über einen
Zeitraum von 20 sec aufgezeichnet. Dosis-Wirkung-Kurven, die für verschiedene Agonisten erhalten
wurden, sind in 3 dargestellt. Für die Erzeugung
dieser Daten wurden 144 Messungen in weniger als 1 Stunde durchgeführt.
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Beispiel 3
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K562-Zellen,
die den Chemokin-CCR3-Rezeptor exprimieren, wurden durch ein Plasmid
für die Expression
von Äquorin
und das Gα16-Kupplungsprotein
transfiziert. Auf stabil transfizierte Zellen wurde über einen
Zeitraum von 2 Wochen mit dem Antibiotikum Zeocin selektiert. Diese
Zellen wurden in DMEM-Kulturmedium, enthaltend 10% FBS, in Suspension
kultiviert. Sie wurden zentrifugiert, der Bodensatz wurde verwendet,
wie in Beispiel 1 beschrieben, um Äquorin-Messungen vorzunehmen.
Eine Dosis-Wirkung-Kurve mit Eotaxin und MCP-4, wie sie durch dieses
Verfahren erzeugt wurde, wird in 4 beschrieben.
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Beispiel 4
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Es
wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Orexin 1- oder Orexin
2-Rezeptor, das Kopplungsprotein Gα16 und Apoäquorin exprimiert. Die Zellen
wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt und nach ihrer
Verdünnung
(100 μl/Loch,
entsprechend 25.000 Zellen) zu je 50 μl Lösung eines bekannten Agonisten
für diese
Rezeptoren bekannten Agonisten gegeben. Das emittierte Licht wurde für jede Vertiefung über einen
Zeitraum von 20 sec aufgezeichnet. Eine Dosis-Wirkung-Kurve, die
für verschiedene
Agonisten erhalten wurde, ist in 5A dargestellt.
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Beispiel 5
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Es
wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Kanabinoid-CB1-Rezeptor,
das Kopplungsprotein Gα16
und Apoäquorin
exprimiert. Die Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt
und nach ihrer Verdünnung
(100 μl/Loch,
entsprechend 50.000 Zellen) zu je 100 μl Lösung eines bekannten Agonisten
für diesen
Rezeptor gegeben. Das emittierte Licht wurde für jede Vertiefung über einen
Zeitraum von 20 sec aufgezeichnet. Die Dosis-Wirkung-Kurve, die für dieses Verfahren erhalten
wurde, ist in 5B dargestellt.
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Für die Messung
von antagonistischen Aktivitäten
wurden Zellen auf Verdünnungsreihen
von Antagonisten gegeben. In diesem Stadium wurde das emittierte
Licht aufgezeichnet, um zu überprüfen, dass
die potenziellen Antagonisten keine agonistische Aktivität aufwiesen.
Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit den Antagonisten inkubiert.
Eine Lösung des
Agonisten (Alpha-Methyl-5HT) des 5HT-2B-Rezeptors wurde dann auf
die Zellen injiziert und das emittierte Licht sofort für jede Vertiefung
aufgezeichnet. Das emittierte Licht wurde als Funktion der logarithmischen
Konzentration des Antagonisten aufgetragen und ergab die gezeigte
Kurve. Steigende Konzentrationen des Antagonisten resultieren in
der Abnahme der Lichtemission nach Zugabe des Agonisten. Ein Agonist
eines anderen Rezeptors, der von den Zellen exprimiert wurde (gewöhnlicher
Weise ATP, das an P2-Rezeptoren wirkt), kann dann auf das Gemisch
des Antagonisten mit den Zellen und auf den Agonisten als Kontrolle
gegeben werden, um zu überprüfen, ob
die Zellen immer noch aktives Äquorin bis
zu diesem Moment des Experiments haben. Zum Beispiel können cytotoxische
Verbindungen, die die intrazelluläre Calcium-Konzentration erhöhen, dazu führen, das das Äquorin sämtliches
Coelenteracin, das in der Zelle vorliegt, aufbraucht. Eine derartige cytotoxische
Verbindung wird durch die Abwesenheit des Signals nach ATP-Injektion
(6) nachgewiesen.
-
LITERATUR
-
- – Button,
D. & Brownstein,
M., Cell Calcium 14, pp. 663–671
(1993)
- – Komatsuzaki,
K. et al., FEBS Lett. 406, pp. 165–170 (1997)
- – Milligan,
G. et al., TIPS 17, pp. 235–237
(1996)
- – Park,
D. et al., J. Biol. Chem. 267, pp. 16048–16055 (1992)
- – Rink,
T. J., FEBS Lett. 268, pp. 381–385
(1990)
- – Santella,
L. & Carafoli,
FASEB J. 11, 1091–1109 (1997)
- – Sheu,
Y.-A. et al., Analytical Biochemistry 209, pp. 343–347 (1993)
- – Stables,
J. et al., Analytical Biochemistry 252, pp. 115–126 (1997)
- – Tsunoda,
Y., Biochem. Biophys. Acta 1154, pp. 105–156 (1993)