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STAATLICH GEFÖRDERTE FORSCHUNG
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Diese
Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Bewilligungsnummern HLO3422-02
und NS 19576 des National Institute of Health gemacht. Die Regierung
besitzt an dieser Erfindung gewisse Rechte.
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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von G-Protein-gekoppelter
Rezeptor-Aktivität (GPCR)
in vivo und in vitro und stellt Verfahren zur Bewertung von GPCR-Aktivität und Verfahren
zum Screenen auf GPCR-Liganden, G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase-Aktivität (GRK)
und Verbindungen bereit, welche mit Komponenten des GPCR-Regulationsvorgangs
wechselwirken. Diese Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die
in solchen Verfahren einsetzbar sind.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Wirkungen vieler extrazellulärer
Signale werden durch die Wechselwirkungen von G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren (GPCRs) und Guanin-Nukleotid-bindenden Regulatorproteinen
(G-Proteine) vermittelt. G-Protein-vermittelte Signalsysteme sind in vielen
divergenten Organismen, wie Säugetieren
und Hefe, identifiziert worden. GPCRs antworten, neben anderen extrazellulären Signalen,
auf Neurotransmitter, Hormone, Gerüche und Licht. GPCRs ähneln einander
und besitzen eine Anzahl hoch konservierter Aminosäuren: Man
glaubt, dass die GPCRs eine große 'Superfamilie' von Proteinen darstellen.
Individuelle GPCR-Typen aktivieren einen speziellen Signaltransduktionsweg;
bei wenigstens zehn verschiedenen Signaltransduktionswegen ist bekannt,
dass sie über
GPCRs aktiviert werden. Zum Beispiel ist der beta-2-adrenerge Rezeptor
(βAR) ein Prototyp
für einen
Säugetier-GPCR.
Als Antwort auf eine Agonist-Bindung aktivieren βAR-Rezeptoren ein G-Protein (GS), welches wiederum Adenylatcyclase und
die Produktion von zyklischem Adenosinmonophosphat in der Zelle
stimuliert.
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Es
ist postuliert worden, dass Mitglieder der GPCR-Superfamilie über einen allgemeinen Mechanismus,
welcher die G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase-Phosphorylierung
(GRK), gefolgt von der Arrestin-Bindung einschließt, desensibilisieren.
Gurevich et al., J. Biol. Chem. 270: 720 (1995); Ferguson et al.,
Can. J. Physiol. Pharmacol., 74: 1095 (1996). Jedoch war die Lokalisierung
und die Quelle des Pools von Arrestin-Molekülen, die als Antwort auf Agonist-Aktivierung
auf Rezeptoren gerichtet sind, unbekannt. Darüber hinaus wurde außer für eine begrenzte
Zahl von Rezeptoren keine allgemeine Funktion für β-Arrestin in der GPCR-Densibilisierung
ermittelt. Die Funktion von β-Arrestinen
in der GPCR-Signaltransduktion wurde erstmals aufgrund biochemischer
Beobachtungen postuliert.
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Viele
heute in Verwendung befindliche therapeutische Arzneimittel sind
auf GPCRs gerichtet, weil diese vitale physiologische Antworten,
einschließlich Vasodilation,
Herzfrequenz, Bronchodilation, endokrine Sekretion und Darmperistaltik
unterstützen. Siehe
z. B. Lefkowitz et al., Ann. Rev. Biochem. 52: 159 (1983). GPCRs
schließen
die adrenergenen Rezeptoren (alpha und Beta) ein; Liganden von beta-ARs
werden bei der Behandlung von Anaphylaxie, Schock, Hypertonie, Hypotonie,
Asthma und anderen Zustände
verwendet. Zusätzlich
tritt die spontane Aktivierung von GPCRs dort auf, wo eine zelluläre GPCR-Antwort in Abwesenheit
eines Liganden erzeugt wird. Erhöhte
spontane Aktivität
kann mittels Antagonisten des GPCR verringert werden (ein Verfahren, das
als inverser Agonismus bekannt ist); solche Verfahren sind therapeutisch
dort wichtig wo Krankheiten einen Anstieg der spontanen GPCR-Aktivität verursachen.
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Bemühungen wie
das Human Genom Projekt identifizieren neue GPCRs ('Orphan'-Rezeptoren), deren
physiologische Funktionen und Liganden unbekannt sind. Es wird geschätzt, dass
im menschlichen Genom mehrere Tausend GPCRs existieren. Durch die
Sequenzierung von nur ungefähr
10% des menschlichen Genoms sind 250 GPCRs identifiziert worden;
weniger als 150 waren mit Liganden verbunden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein
und einem detektierbaren Molekül,
wobei das detektierbare Molekül
in der Lage ist, intrazelluläre
Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen.
Das detektierbare Molekül
kann ein optisch detektierbares Molekül wie grün fluoreszierendes Protein
sein. Das Konjugat kann ein Fusionsprotein sein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegende Erfindung ist ein Nukleinsäure-Konstrukt,
welches eine Expressions-Cassette umfasst. Das Konstrukt schließt von der
5'- zur 3'-Richtung einen Promotor und ein Nukleinsäuresegment
ein, das wirksam mit dem Promotor verbunden ist und das ein Nukleinsäuresegment,
das ein β-Arrestin-Protein
und ein detektierbares Molekül
kodiert, wobei das detektierbare Molekül imstande ist, intrazelluläre Translokation und/oder
Verteilung des β-Arrestin-Proteins
anzuzeigen. Das detektierbare Molekül kann ein optisch detektierbares
Molekül
wie grün
fluoreszierendes Protein sein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Wirts-Zelle,
welche ein Nukleinsäure-Molekül einschließt, welches
einen Promotor, der in der Wirts-Zelle wirksam ist, und eine Nukleinsäuresequenz
einschließt,
die ein β-Arrestin-Protein
und ein detektierbares Molekül
kodiert, wobei das detektierbare Molekül imstande ist, die intrazelluläre Translokation
und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins
anzuzeigen. Das detektierbare Molekül kann ein optisch detektierbares
Molekül,
wie grün fluoreszierendes
Protein sein. Die Zelle kann eine Säuge tier-, Bakterien-, Hefe-,
Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle sein und kann auf einem Substrat
aufgebracht sein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Bewertung von G-Protein-gekoppelter Rezeptor-Stoffwechsel-Aktivität (GPCR)
unter Versuchsbedingungen, durch Bereitstellung einer Testzelle,
welche einen GPCR exprimiert und welche ein Konjugat eines β-Arrestin-Proteins und
ein visuell detektierbares Molekül
enthält;
Exposition der Testzelle mit einem bekannten GPCR-Agonist unter
Versuchsbedingungen und dann detektieren der Translokation des detektierbaren
Moleküls vom
Zytosol der Testzelle zum Membranrand der Testzelle. Die Translokation
des detektierbaren Moleküls
in der Testzelle zeigt die Aktivierung des GPCR-Stoffwechsels an.
Beispielhafte Versuchsbedingungen schließen die Anwesenheit einer Test-Kinase und/oder
eines G-Test-Proteins in der Testzelle, die Exposition der Testzelle
mit einem Test-Liganden oder
die Co-Expression eines zweiten Rezeptors in der Testzelle ein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfahren ist ein Verfahren zum
Screenen eines β-Arrestin-Proteins
(oder eines Fragments eines β-Arrestin-Proteins)
auf die Befähigung
einen phosphorylierten GPCR zu binden. Es wird eine Zelle bereitgestellt,
die einen GPCR und ein Konjugat eines β-Arrestin-Test-Proteins und
ein visuell detektierbares Molekül
enthält.
Die Zelle wird einem bekannten GPCR-Agonisten ausgesetzt und dann
wird die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum
Zellrand detektiert. Die Translokation des detektierbaren Moleküls zeigt
an, dass das β-Arrestin-Molekül in der
Testzelle an phosphorylierten GPCR binden kann.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Screenen einer Testverbindung auf die Agonist-Aktivität von G-Protein-gekoppeltem
Rezeptor (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche einen
GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β- Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren
Molekül
enthält.
Die Zelle wird einer Testverbindung ausgesetzt und die Translokation des
detektierbaren Moleküls
vom Zytosol der Zelle zum Membranrand detektiert. Die Bewegung des
detektierbaren Moleküls
zum Membranrand nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung
zeigt GPCR-Agonist-Aktivität der Testverbindung
an. Die Testzelle kann einen bekannten GPCR oder eine Auswahl bekannter
GPCRs exprimieren oder einen unbekannten GPCR oder eine Auswahl
unbekannter GPCRs exprimieren. Der GPCR kann beispielsweise ein
Geruchs-GPCR oder ein β-adrenerger
GPCR sein. Die Testzelle kann eine Säugetier-, Bakterien-, Hefe-,
Pilz-, Pflanzen oder Tierzelle sein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Screenen einer Probelösung
auf die Anwesenheit eines Agonisten für G-Protein-gekoppelten Rezeptor
(GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche einen GPCR
exprimiert und ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem
visuell detektierbaren Molekül
enthält.
Die Testzelle wird einer Probelösung
ausgesetzt und die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol
der Zelle zum Membranrand der Zelle bestimmt. Die Bewegung des detektierbaren
Moleküls
zum Membranrand nach der Exposition der Probelösung zeigt an, dass die Probelösung einen
Agonist für
einen in der Zelle exprimierten GPCR enthält.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
screenen einer Testverbindung auf Antagonist-Aktivität von G-Protein-gekoppelten
Rezeptor (GPCR). Es wird eine Zelle bereitgestellt, welche einen
GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren
Molekül
enthält.
Die Zelle wird einer Testverbindung und einem GPCR-Agonisten ausgesetzt
und die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum
Membranrand der Zelle detektiert. Wenn die Exposition mit dem Agonisten zur
gleichen Zeit wie die Exposition mit der Testverbindung geschieht
oder auf diese folgt, zeigt die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol
zum Membranrand nach der Exposition mit der Testverbindung an, dass
die Testverbindung kein GPCR-Antagonist ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Screenen einer Testverbindung auf Antagonist-Aktivität von G-Protein-gekoppeltem
Rezeptor (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche einen
GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren
Molekül
enthält.
Die Zelle wird einem GPCR-Agonist ausgesetzt, so dass die Translokation
des detektierbaren Moleküls
vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle eintritt und die
Zelle wird dann einer Testverbindung ausgesetzt. Wenn die Exposition
des Agonisten vor der Exposition mit der Testverbindung stattfindet,
zeigt die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Membranrand der Zelle
zum Zytosol nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung
an, dass die Testverbindung GPCR-Antagonist-Aktivität besitzt.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Screenen einer Zelle auf die Anwesenheit eines G-Protein-gekoppelten
Rezeptors (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche
ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und
einem visuell detektierbaren Molekül enthält. Die Testzelle wird einer
Lösung
ausgesetzt, welche einen GPCR-Agonisten enthält. Jede Translokation des
detektierbaren Moleküls
vom Zytosol zum Membranrand wird detektiert; die Bewegung des detektierbaren
Molekül
vom Zytosol zum Membranrand nach der Exposition der Testzelle mit
einem GPCR-Agonist zeigt an, dass die Testzelle einen GPCR enthält.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Screenen einer Vielzahl von Zellen auf solche Zellen, welche einen
G-Protein-gekoppelten Rezep tor (GPCR) enthalten. Eine Vielzahl von
Testzellen, die ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem
visuell detektierbares Molekül
enthalten, werden bereitgestellt und die Testzellen werden einem
bekannten GPCR-Agonisten ausgesetzt.
Zellen, in welchen das detektierbare Molekül vom Zytosol zum Membranrand
translokalisiert ist, werden identifiziert oder detektiert. Die
Bewegung des detektierbaren Moleküls zum Membranrand nach Exposition
mit einem GPCR-Agonist zeigt an, dass die Zelle einen GPCR enthält, welcher
auf diesen GPCR-Agonisten anspricht. Die Vielzahl von Testzellen
können
in einem Gewebe, einem Organ oder einem intakten Tier enthalten
sein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Substrat, auf
welches eine Vielzahl von Zellen aufgebracht ist, die einen GPCR
exprimieren und die ein markiertes β-Arrestin-Protein enthalten, wobei
die Markierung geeignet ist, die intrazelluläre Translokation und/oder die
Verteilung des Arrestins anzuzeigen. Solche Substrate können aus
Glas, Kunststoff, Keramik, Halbleitern, Silizium, Glasfaser, Diamant,
biokompatiblen Monomer- oder biokompatiblen polymeren Materialien
hergestellt werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist ein lineares Model
des Konjugats aus β- Arrestin-2/S65T-grün-fluoreszierendes-Protein
(GFP).
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2A stellt die Ergebnisse
eines Western-Blots von Homogenaten von HEK-293-Zellen bereit, welche
das βarr2-GFP-Konjugat
wie auch endogenes β-Arrestin-2
exprimieren. βarr2
kennzeichnet endogenes zelluläres β-Arrestin-2; βarr2-GFP kennzeichnet β-Arrestin-2-GFP-Konjugat; die ungefähren Molekulargewichte
werden auf der rechten Seite des Gels angezeigt. Bahn 1 wurde mit
anti-β-Arrestin-Antikörper behandelt;
Bahn 2 mit anti-GFP-Antikörper.
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2B zeigt die Komplexbildung
von β2AR in
COS-Zellen mit und
ohne überexprimiertes β-Arrestin-2
(die beiden linken Balken) und mit und ohne überexprimiertes βarr2-GFP
(die beiden rechten Balken). Wildtyp-β-Arrestin und βarr2-GFP
erhöhen
gleichermaßen
die Komplexbildung von β2AR über das Niveau
der Kontrolle, wobei sie einen 2,5- beziehungsweise 2,4-fachen Abstieg
hervorrufen.
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3A: Die Mikroaufnahmen eines
konfokalen Mikroskops zeigen die βarr2-GFP-Translokation vom
Zytosol (Feld 1, links) zur Membran (Feld 2, rechts) in HEK-293-Zellen, welche das β2AR, aufgrund
der Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol enthalten.
Maßstab
= 10 Mikron.
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3B: Die Mikroaufnahmen eines
konfokalen Mikroskops zeigen βarr2-GFP-Translokation
vom Zytosol (Feld 1, links) zur Membran (Feld 2, rechts) in COS-Zellen,
welche das β2AR
aufgrund der Zugabe des βAR2-Agonisten
Isoproterenol enthalten. Maßstab
= 10 Mikron.
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4 stellt eine HEK-293-Zelle
dar, welche mit 12CA5(HA) markiertes β2AR enthält (Mikroaufnahmen eines konfokalen
Mikroskops). Zeile A zeigt eine Zelle nach der Reorganisation von β2AR in Plasmamembran-Cluster.
Zeile B stellt drei Bilder der gleichen Zelle bei 0, 3 und 10 Minuten
(von links nach rechts) nach der Zugabe von Agonist bereit. Die
Weiterverteilung von βarr2-GFP
zu der Zellmembran ist durch die Erhöhung der Membran-Fluoreszenz
mit einem begleitenden Verlust an zytosolischer Fluoreszenz gezeigt.
Pfeile kennzeichnen Bereiche von Colokalisation; Maßstab =
10 Mikron.
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5 zeigt den Einfuß von überexprimiertem
GRK auf die Weiterverteilung von βarr2-GFP
in HEK-293-Zellen, welche das durch Y326A in der Phosphorylierung
verminderte β2AR
exprimieren. Zellen ohne (Reihe A) und mit (Reihe B) überexprimierten
GRKs wurden einem Agonist ausgesetzt und die Echtzeit-Weiterverteilung
von βarr2-GFP
wurde beobachtet. Die βarr2-GFP-Translokation
in Zellen, welche einen überexprimierten
GRK (Reihe B) enthalten, waren stabiler, wodurch eine erhöhte Affinität von βarr2-GFP
auf einen Rezeptor angezeigt wird. Maßstab = 10 Mikron.
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6A stellt die Agonist-induzierte,
zeitabhängige
Translokation von βarr2-GFP
zu beta2-adrenergenen Rezeptoren in einer repräsentativen HEK-293-Zelle dar.
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Die
Graphen der 6B zeigen
den Zeitverlauf der Agonist-induzierten Translokation von βarr2-GFP
zu beta2-adrenergenen
Rezeptoren in HEK-293-Zellen; dieser Graph ist quantitativ und basiert
auf der Antwort einer Vielzahl von Zellen.
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6C stellt die Agonist-induzierte
Translokation von βarr2-GFP
zu beta-2-adrenergenen Rezeptoren in repräsentativen HEK-293-Zellen,
bei variierenden Agonist-Dosen,
dar.
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Die
Graphen der 6D stellen
die dosiabhängige,
Agonist-induzierte Translokation von βarr2-GFP zu beta-2-adrenergenen Rezeptoren
in HEK-293-Zellen dar; Dieser Graph ist quantitativ und basiert
auf der Antwort einer Vielzahl von Zellen.
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6E evaluiert die Translokation
von βarr2-GFP
vom Zytosol der Zelle zur Zellemembran als Antwort auf die Exposition
mit Rezeptor-Agonist (mittleres Feld) und im Anschluss an die Exposition mit
Rezeptor-Antagonist (rechtes Feld).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben ermittelt, dass die β-Arrestin-Weiterverteilung vom Zytosol zur Plasmamembran
als Antwort auf die Agonist-Aktivierung von GPCRs eintritt. Die
Erfinder haben eine allgemeine Funktion des β-Arrestins in der Agonist-vermittelten Signaltransduktions-Termination, gefolgt
von Agonist-Aktivierung von Rezeptoren demonstriert. Die Erfinder
haben geeignete Verfahren zur Untersuchung von Agonist-Stimulation
von GPCRs in vivo und in vitro in Echtzeit entwickelt. Obwohl sich
die Pharmakologie der Mitglieder der GPCR-Superfamilie unter scheidet,
nutzen die erfindungsgemäßen Verfahren
die β-Arrestin-Translokation
um eine Einzelschritt-, Echtzeit-Bewertung
der GPCR-Funktion für
mehrere, verschiedene Mitglieder der GPCR-Superfamilie. Die vorliegenden
Verfahren können
zusätzlich
bei der Untersuchung und zum Verständnis der Wirkmechanismen verschiedener
therapeutischer Mittel eingesetzt werden. Die Erfinder haben ermittelt,
dass ein Protein-Konjugat oder eine Chimäre, welche ein Arrestin-Molekül und ein
detektierbares Molekül
(wie grün
fluoreszierendes Protein) umfassen, in solchen Verfahren der Bewertung
von In-vivo-GPCR-Aktivität
nutzbar sind.
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Aufgrund
der therapeutischen Bedeutung von GPCRs sind Verfahren zum schnellen
Screenen von Verbindungen auf GPCR-Ligand-Aktivität wünschenswert.
Zusätzlich
unterstützen
Verfahren zum Screenen von Orphan-GPCRs auf Wechselwirkungen mit
bekannten und putativen GPCR-Liganden die Charakterisierung solcher
Rezeptoren. Es sind optische Verfahren zur Untersuchung der Dynamik markierter
Proteine intakten Zellen verfügbar,
einschließlich
Video-Mikroskopie,
Fluoreszenzerholung nach Photobleichung und Resonanzenergietransfer. Jedoch
besitzen solche Verfahren aufgrund der relativ niedrigen Niveaus
der GPCR-Expression
und der Änderung
der Rezeptor-Funktion, die nach dem Tagging oder Markieren des Rezeptor-Proteins
eintritt, begrentzte Nützlichkeit
bei der Markierung von GPCRs für
Untersuchungen. Beim Screenen auf GPCR-Liganden sind auch radioaktive
Markierungen oder Fluoreszenzmarkierungen von Test-Liganden eingesetzt
worden. Siehe z. B. Atlas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:
5490 (1977); US-Patent Nr. 5576436 von McCabe et al. (alle zitierten
Patente werden hierin in ihrer Gesamtheit einbezogen). Die Einführung fremder
Epitope in Rezeptor-cDNA, um Hybrid-GPCRs zu erzeugen, ist heute
eine Standard-Technik
und erhöht
die Detektion von GPCRs durch die Technologie monoklonaler Antikörper. Jedoch
sind solche Techniken ihrer Anwendbarkeit bei lebenden Zellen eingeschränkt. Das
US-Patent Nr. 5284746 von Sledziewski beschreibt Hefe-Säugetier-Hybrid-GPCRs
und Verfahren zum Screenen auf GPCR-Liganden unter Verwendung solcher
Hybrid-Rezeptoren. Das US-Patent Nr. 5482835 von King et al. beschreibt
Verfahren zum Untersuchen auf Liganden von Säugetier-GPCRs in Hefezellen.
Jedoch erfordert die Anwendung dieser Techniken der Untersuchung
oder Identifizierung von Orphan-GPCRs vorheriges Wissen über die
Liganden oder die Signaltransduktions-Ereignisse und sie sind deshalb nicht
allgemein oder universell einsetzbar.
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Die
Phosphorylierung von GPCRs ist ein Mechanismus, der zur Desensibilisierung
der Rezeptoren führt;
Rezeptoren, die kontinuierlich oder wiederholt stimuliert worden
sind, verlieren ihre Reaktionsfähigkeit,
wohingegen die Reaktionsfähigkeit
anderer Rezeptoren intakt bleibt. Siehe Harden, Pharmacol. Rev.
35: 5 (1983); Benovic et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 4: 405 (1988).
Bei einer Auswahl von Zellen haben sich spezifische Kinasen für spezifische
GPCRs entwickelt. Die Desensibilisierung geschieht auf folgendem
Weg: die Agonist-Besetzung des Rezeptors transformiert den Rezeptor
in ein entsprechendes Substrat für
eine assoziierte Kinase; β-Arrestin
bindet an den phosphorylierten Kinase-Rezeptor und verhindert die
nachfolgende Wechselwirkung mit dem entsprechende G-Protein wie
auch die Einleitung sowohl des Internalisierungs- als auch des Resensibilisierungsprozesses.
Ferguson et al., Science, 271: 363 (1996); Lohse et al., Science
248: 1547 (1990). Die β-Arrestin-abhängige Desensibilisierung
wird nur induziert, wenn der GPCR durch Ligand-Bindung aktiviert
ist und ist ein Beispiel homologer Desensibilisierung (d. h. der
Ligand desensibilisiert nur seine Ziel-Rezeptoren). Lohse et al. (1990) und
Attramadal et al., J. Biol. Chem. 267: 17882 (1992) stellen cDNA- und
Aminosäuresequenzen
von β-Arrestin
bereit. Es sind verschiedene Isoformen von β-Arrestin bekannt; wie hierin
verwendet bezieht sich β-Arrestin
auf alle diese Isoformen von β-Arrestin, Proteine,
welche im Wesentlichen eine mit diesem übereinstimmende Sequenz haben
und welche funktionale β-Arrestine
sind und dessen funktionale Fragmente. Funktionale Fragmente von β-Arrestin,
dessen Isoformen und Analoge können
unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren ermittelt
werden.
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Mittels
spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunochemischer,
elektrischer und optischer Mittel detektierbare Moleküle sind
bekannt. Optisch detektierbare Moleküle schließen Fluoreszenzmarker wie kommerziell
erhältliches
Fluorescein und Texas Rot ein. Detektierbare Moleküle, die
erfindungsgemäß geeignet
sind, schließen
jedes biologisch kompatible Molekül ein, welches mit einem β-Arrestin-Protein
konjugiert sein kann, ohne die Befähigung von β-Arrestin zu beeinträchtigen,
mit dem GPCR-System zu wechselwirken und ohne die Befähigung des
detektierbaren Moleküls,
detektiert zu werden, zu beeinträchtigen.
Konjugierte Moleküle (oder
Konjugate) aus β-Arrestin
und detektierbaren Molekülen
(die auch als 'detektierbar
markierte β-Arrestine' bezeichnet werden
können)
sind deshalb erfindungsgemäß geeignet.
Bevorzugt sind detektierbare Moleküle, die in der zu untersuchenden
Zelle synthetisiert werden können
(z. B. dort, wo die Zelle mit heterologer DNA transformiert werden
kann, so dass das Chimäre
aus β-Arrestin
und detektierbarem Molekül
innerhalb der Zelle erzeugt wird). Insbesondere bevorzugt sind solche
detektierbaren Moleküle, die
in vivo inhärent
fluoreszieren. Geeignete detektierbare Moleküle müssen in der Lage sein, mit
ausreichender Auflösung
innerhalb einer Zelle detektierbar zu sein, so dass die Translokation
von β-Arrestin vom
Zytosol zur Zellmembran als Antwort auf die Agonist-Bindung an einen
GPCR qualitativ oder quantitativ festgestellt werden kann. Mittels
optischer Mittel detektierbare Moleküle sind gegenwärtig bevorzugt.
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Fusionsproteine
mit kodierenden Sequenzen für
Beta-Galactosidase,
Firefly-Luciferase und bakterielle Luciferase sind in Verfahren
zur Detektion von Genexpression und Protein-Wechselwirkungen in Zellen
verwendet worden. Diese Verfahren erfordern jedoch exogen hinzugefügte Substrate
oder Cofaktoren. In den erfindungsgemäßen Verfahren ist ein inhärent fluoreszierendes
Marker-Molekül,
wie GFP, bevorzugt, weil die intrazelluläre Detektion eines solchen
Markers nur die Bestrahlung mit Licht entsprechender Wellenlänge erfordert
und nicht Substrat-limitiert
ist.
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Grün fluoreszierendes
Protein (GFP) wurde zuerst aus der Qualle Aequorea victoria isoliert
und besitzt eine inhärente
grüne Biolumineszenz,
die optisch mittels blauem Licht oder nicht-strahlendem Energie-Transfer
angeregt werden kann. Die Sequenzen von GFP-kodierender cDNA und
GFP-Proteinen sind bekannt; siehe z. B. Prasher et al., Gene, 111: 229
(1992). Die kristalline Struktur von GFP ist in Ormo et al., Science
273: 1392 (1996) beschrieben worden. Gereinigtes natürliches
GFP absorbiert blaues Licht (maximal bei 395 nm mit einem Nebenmaximum
bei 470 nm) und emittiert grünes
Licht (Emissionsmaximum bei 509 nm) (Morise et al., Biochemistry,
13: 2656 (1974); Ward et al., Photochem. Photobiol., 31: 611 (1980)).
Es wurde gezeigt, dass in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen
exprimiertes GFP eine starke grüne
Fluoreszenz entwickelt, wenn es mittels nahem UV- oder blauem Licht angeregt
wird (siehe US-Patent Nr. 5491084 von Chalfie und Prasher); da diese
Fluoreszenz keine zusätzlichen
Genprodukte von A. victoria erfordert, ist die Chromophor-Bildung nicht speziesspezifisch
und geschieht entweder durch den Einsatz ubiquitärer zellulärer Komponenten oder mittels
Autokatalyse. Die Expression von GFP in Eschericha coli resultiert in
einer leicht zu detektierenden grünen Fluoreszenz, die in Kontroll-Bakterien
nicht gesehen wird. Siehe Chalfie et al., Science 263: 802 (1994); US-Patent
Nr. 5491084. Zellen, welche grün-fluoreszierende
Proteine exprimieren, können
mittels eines fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierers bequem von
jenen abgetrennt werden, die das Protein nicht exprimieren.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich grün
fluoreszierendes Protein auf die verschiedenen, natürlich vorkommenden
Formen von GFP, welche aus natürlichen
Quellen isoliert werden können,
wie auch künstlich
modifizierte GFPs, welche die Fluoreszenzeigenschaften von natürlichem
GFP beibehalten. Wie in Ormo et al., Science 273: 1392 (1996), diskutiert,
sind verschiedene Mutanten von GFP, mit veränderten Anregungs- und Emissionsmaxima
erzeugt worden. Zwei Eigenschaften von Wild-Typ-GFP, welche dessen
Verwendbarkeit in Säugetier-Zell-Linien beeinflussen,
sind die Notwendigkeit dieses bei UV-Wellenlängen anzuregen, um ein maximales
Fluoreszenzsignal zu erhalten und die verminderte Fluoreszenz bei
Temperaturen über
23°C. Jedoch überwindet
der S65T/GFP-Mutant diese Beschränkungen.
Heim et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 12501 (1994). Zusätzliche
Veränderungen
in der GFP-Proteinsequenz, welche inhärent fluoreszierende, biologisch
kompatible Moleküle
bereitstellen, werden dem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein;
es können Änderungen
der Sequenz durchgeführt
werden, um die Löslichkeitseigenschaften
des Proteins, seine Anregungswellenlänge oder andere Eigenschaften zu
verändern,
während
die nützlichen
Fluoreszenzeigenschaften erhalten bleiben. Siehe z. B. US-Patent 5625048
von Tsien und Heim; WO 9711091 (Bjorn, Poulsen, Thastrup und Tullin);
WO 9627675 (Haseloff, Hodge, Prasher und Siemering); WO 9627027 (Ward);
WO 9623898 (Bjorn et al.); WO 9623810 (Heim und Tsien); WO 9521191
(Chalfie und Ward).
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Zellen,
die in den erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet sind, schließen
eukaryotische und prokaryotische Zellen ein, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf, Bakte rienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Insektenzellen,
Nematodenzellen, Pflanzen- oder Tierzellen. Geeignete Tierzellen
schließen
ein, sind aber nicht begrenzt auf, HEK-Zellen, HeLa-Zellen, COS-Zellen und
verschiedene primäre
Säugetierzellen.
Zellen, die in intakten Tieren enthalten sind, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf, Nematoden, Zebrafisch (und andere transparente
oder semi-transparente Tiere) und Fruchtfliegen, können auch
in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden. Ein Tier-Modell,
welches ein Fusionsprotein aus β-Arrestin
und einem detektierbaren Molekül überall in
seinen Geweben oder innerhalb eines bestimmten Organs oder Gewebe-Typ
exprimiert, wird bei der Untersuchung zellulärer Targets bekannter oder
unbekannter GPCR-Liganden, von Nutzen sein.
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Zellen,
die in den vorliegenden Verfahren nützlich sind, schließen jene
ein, welche einen bekannten GPCR oder eine Auswahl bekannter GPCRs exprimieren
oder welche einen unbekannten GPCR oder eine Auswahl unbekannter
GPCRs exprimieren. Wie hierin verwendet, ist eine Zelle, welche
einen GPCR exprimiert, eine Zelle, welche diesen GPCR als einen
funktionalen Rezeptor in ihrer Membran enthält; die Zellen können den
beziehungsweise die interessierenden GPCR(s) natürlich exprimieren oder können gentechnisch
hergestellt sein, um den beziehungsweise die interessierenden GPCR(s)
zu exprimieren. Wie hierin verwendet ist ein 'unbekannter' oder 'Orphan'-Rezeptor einer, dessen Funktion unbekannt
ist und/oder dessen Liganden unbekannt sind.
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Die vorliegenden Versuche
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Grün fluoreszierendes
Protein (GFP) ist verwendet worden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen
in lebenden Zellen zu untersuchen. Siehe Kaether & Gerdes, FEBS
Lett. 369: 267 (1995); Olson et al., J. Cell. Biol. 130: 639 (1995).
Grün fluoreszierendes
Protein (GFP) ist aufgrund seiner inhärenten Fluoreszent und seiner
Faltung, welche es offensichtlich von seinen konjugierten Partnern
isoliert, als Reporter-Molekül
für Fusionsproteine
geeignet. Prasher et al., Gene 111: 229 (1992); Ormo et al., Science
273: 1392 (1996). Beispielsweise zeigt ein Sieben-Transmembran-Protein,
das so komplex ist wie das β2AR, welches
dreimal so groß ist
wie GFP, nach der GFP-Konjugation
an seinen C-Terminus normale Biochemie. Barak et al., Mol. Pharmacol.
51: 177 (1997).
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Die
Erfinder haben festgestellt, dass ein Fusionsprotein, welches aus
einem β-Arrestin-Molekül (β-Arrestin-2)
besteht, das an seinem C-Terminus mit einem GFP konjugiert ist (βarr2-GFP, 1), in Zellen exprimiert
wird und biologisch aktiv ist. Das βarr2-GFP-Fusionsprotein ist
ungefähr
um 50% größer als β-Arrestin-2
und diese Erhöhung
der Größe wird
durch seine langsamere Migration auf SDS-Page (2A) widergespiegelt. Die linke Bahn von 2A, die einem Antikörper gegen β-Arrestin
ausgesetzt wurde, zeigt, dass βarr2-GFP
langsamer läuft
als endogenes β-Arrestin-2
(hervorgehobenes mittlere Bande). Die rechte Bahn von 2A, die mit einem monoklonalen
anti-GFP-Antikörper
behandelt wurde, zeigt, dass die langsamere Bande tatsächlich GFP
enthält.
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Gewöhnlich komplexiert β2AR schlecht
in COS-Zellen und das wurde mit der relativ schwachen Expression
von endogenem β-Arrestinen
in COS-Zellen in Zusammenhang gebracht. Menard et al., Mol. Pharmacol.
51: 800 (1997); Zhang et al., J. Biol. Chem. 271: 18302 (1996).
Die Überexpression von
exogenem β-Arrestin
erhöht
die β2AR-Komplexierung in
diesen Zellen; ähnlich
wie hierin gezeigt, steigert die βarr2-GFP-Überexprimierung
in COS-Zellen die β2AR-Internalisierung
(2B), wodurch nachgewiesen
wird, dass βarr2-GFP
biologisch aktiv und äquivalent
zu nativem β-Arrestin
ist.
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Biochemische
Beweise zeigen, dass β-Arrestine
vorwiegend zytosolische Proteine sind. Ferguson et al., Can. J. Physiol.
Pharmacol. 74: 1095 (1996). Die Erfinder haben unter Verwendung
von konfokaler Mikroskopie an βarr2-GFP
in HEK-293-Zellen (3A,
linkes Feld) bestätigt,
dass βarr2-GFP
im gesamten Zytosol verteilt ist und vom Kern ausgeschlossen ist.
Die vorliegenden Daten weisen zum ersten mal auch nach, dass β-Arrestin
in Abwesenheit von einem Agonisten nicht vorwiegend an der Plasmamembran
verteilt ist, aber dass in Abwesenheit eines Agonisten, durch die
Zugabe von Sättigungskonzentrationen
eines Agonisten zum Zellmedium β-Arrestin
vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran translokalisiert wird. Dort
wo β-Arrestin, wie hierin
gezeigt, mit einem optisch detektierbaren Molekül wie GFP konjugiert ist, tritt
eine schnelle, leicht beobachtbare optische Verstärkung der
Membran und ein damit einhergehender Verlust zytosolischer optischer
Signale auf (siehe die 3A und 3B, worin aufgrund der Translokation
des β-Arrestin-GFP-Chimären die
Membran-Fluoreszenz erhöht
ist und die Zytosol-Fluoreszenz erniedrigt ist).
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Um
zu untersuchen, ob die intrazelluläre Translokation von β-Arrestin
auf andere Bindungsstellen als β2AR
in der Plasmamembran gerichtet ist, haben die Erfinder zuerst die
Rezeptoren unter Verwendung monoklonaler Antikörper vernetzt. Wie hierin berichtet
und in 4 gezeigt imitierte
die Geometrie der Agonist-induzierten zeitabhängigen Translokation von β-Arrestin
zur Plasmamembran die Verteilung von preaggregierten β2ARs, wodurch
angezeigt wird, dass die Stelle von β-Arrestin, auf die abgezielt wird,
tatsächlich β2AR oder
eine assoziierte Komponente ist.
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Es
ist postuliert worden, dass die Phosphorylierung von GPCRs mittels
GRKs die Desensibilisierung durch die Erhöhung ihrer Affinität für β-Arrestine erleichtert.
Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 16879 (1993); Gurevich et al.,
J. Biol. Chem. 268: 11628 (1993). Wenn sie in HEK-293-Zellen exprimiert
werden und einem Agonisten ausge setzt werden, werden mutante Y326A-β2ARs durch
endogene GRKs nicht wesentlich phosphoryliert (Ferguson et al.,
J. Biol. Chem., 270: 24782 (1995). Deshalb nutzten die Erfinder
diesen Mutant-Rezeptor, um die obige Frage der β-Arrestin-Affinität in vivo zu untersuchen. Y326A-β2AR wurde
mit βarr2-GFP
in HEK-Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von cotransfizierter GRK
cotransfiziert. Wenn die obige Hypothese wahr wäre, würde die Umkehrung der Phosphorylierungs-Verminderung
durch überexprimierte
GRKs in einem merklichen Unterschied in der βarr2-GFP-Translokation resultieren. Wie hierin
berichtet schreitet ohne hinzugefügte GRK die βarr2-GFP-Translokation
als Antwort auf einen Agonisten schwach voran; mit der Zugabe von
GRK war die βarr2-GFP-Translokation
zur Plasmamembran viel stärker
(5), wodurch die Bedeutung
der Phosphorylierung für
die β-Arrestin-Aktivität angezeigt
wird.
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Die
Erfinder ermittelten, dass die Translokation von β-Arrestin
vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran ein Indikator für die Agonist-Stimulation
der GPCR-Aktivität
ist und dass ein chimäres
Protein, welches β-Arrestin
und das detektierbare Molekül GFP
umfasst, in der Lage ist, detektierbar die Echtzeit-Translokation
von β-Arrestin
als Antwort auf Agonist-Aktivierung von GPCRs anzuzeigen.
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Die
hierin dargestellten Ergebnisse etablieren, dass β-Arrestin
auf GPCRs oder ein assoziertes Molekül gerichtet ist, gefolgt von
der Agonist-Bindung und der Rezeptor-Phosphorylierung. Diese Daten belegen
ein biologisches Verhalten für β-Arrestin, dass
nur aus biochemischen Untersuchungen postuliert worden ist und sie
beschreiben zum ersten mal, wie sich die β-Arrestin-Kompartimentierung nach der Einleitung
der Rezeptor-Signal-Transduktion
verändert.
Die Agonist-Aktivierung eines GPCR gipfelt schließlich in
der Assoziierung von β-Arrestinen mit GPCRs
und folglich stellt die Visualisie rung der Agonist-vermittelten β-Arrestin-Translokation
einen universellen Indikator für
GPCR-Aktivierung bereit.
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Die
Erfinder haben belegt, dass die GPCR-Signal-Transduktion einen schnellen, wesentlichen
Anstieg der relativen und absoluten Menge an Plasmamembran-gebundenem β-Arrestin
induziert. Die Agonist-vermittelte Umverteilung von β-Arrestin, das
an ein detektierbares Molekül
gekoppelt ist, stellt eine optische Amplifikation der extrazellulären Signale,
transduziert durch GPCRs, bereit und diese tritt gleichzeitig mit
oder innerhalb des gleichen Zeitfensters auf wie die chemische Amplifikation,
die gewöhnlich
durch Second-Messenger-Kaskaden, bereitgestellt wird. Chimäre aus β-Arrestin
und einem detektierbaren Molekül
sind zur Untersuchung von β-Arrestin-Kinetiken und mit
GPCR in Beziehung stehendem Verhalten, wie Endozytose, geeignet.
Zusätzlich sind
solche Chimäre
als Biosensoren zur Anzeige, dass GPCRs aktiviert werden, geeignet
und stellen Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf GPCR-Aktivität und zum
Screenen von Orphan-GPCRs auf
Liganden-Responsivität
bereit. Zusätzlich
zeigt die Befähigung
der cotransfizierten GRKs, sowohl die Geschwindigkeit als auch das
Ausmaß der β-Arrestin-Translokation zu
erhöhen,
an, dass die vorliegenden Verfahren und Konstrukte auch zur Überwachung
von GRK-Aktivität wie auch
zum Überwachen von
Arzneimitteln, Proteinen und Verbindungen zur Aktivierung oder Hemmung
des GRK/β-Arrestin-Prozesses
verwendet werden können.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen
auf GPCR-Agonist-Aktivität
bereit, umfassend: a) Bereitstellung einer Zelle, welche einen bekannten
oder unbekannten GPCR exprimiert und ein chimäres Protein enthält, das
ein β-Arrestin-Protein
und ein visuell detektierbares Protein umfasst; b) Exposition der
Zelle mit einer Testverbindung und c) Detektion der Translokation
des detektierbaren Moleküls
vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Translokation des
detektierbaren Moleküls
vom Zytosol zum Membranrand der Zelle die Aktivierung des GPCR anzeigt
und dementsprechend den GPCR-Aktivierungseffekt der Testverbindung.
Die Translokation des chimären
Proteins wird mittels eines Anstiegs der Intensität des detektierbaren
Signals am Membranrand (und/oder eine Verminderung im Zytosol) nachgewiesen,
wobei die Änderung
nach der Exposition der Testverbindung auftritt. Die Translokation kann
deshalb durch einen Vergleich der zeitlichen Änderungen des detektierbaren
Signals in der gleichen Zelle (d. h. vor und nach der Exposition
mit der Testverbindung) detektiert werden. Alternativ kann eine
Testzelle mit einer Kontrollzelle (keine Exposition mit der Testverbindung)
verglichen werden oder eine Testzelle kann mit einem bereits eingeführten Standard
verglichen werden. Wenn ein bekannter Agonist verfügbar ist,
kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um auf einen GPCR-Antagonisten
zu screenen und diesen zu untersuchen. Zusätzlich sollte die Membran-Assoziation
des β-Arrestins
durch Expression eines Überschusses
an Rezeptor oder mittels eines grundlegend aktiven GPCR, welcher
sogar in Abwesenheit eines Agonisten durch GRKs Phosphorylierung
erfährt,
erhöht
werden. Deshalb kann das vorliegende Verfahren verwendet werden,
um auf inverse Agonisten von GPCRs zu prüfen.
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Verfahren
zur Detektion der intrazellulären Translokation
des chimären
Proteins werden von dem eingesetzten speziellen, detektierbar Protein abhängen; ein
Durchschnittsfachmann wird aufgrund der Lehren der vorliegenden
Beschreibung und dem Fachwissen leicht Detektionsverfahren entwerfen, die
für spezielle,
detektierbare Moleküle
geeignet sind. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das visuell
detektierbare Protein ein grün
fluoreszierendes Protein (GFP), wie hierin unten diskutiert wird.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
stellen leicht detektierbare Ergebnisse bereit. Die Translokation
des β- Arrestins, das an
ein detektierbares Molekül
wie GFP gekoppelt ist, als Antwort auf GPCR-Aktivierung, resultiert
in einer relativen Erhöhung
des detektierbaren Signals am Zellrand (d. h. an der Zellemembran).
Zusätzlich
bedeutet die begleitende Verminderung des detektierbaren Signals
im Zytosol der Zelle, dass das 'Hintergrundrauschen' (detektierbare Signale,
welche sich nicht als Antwort auf GPCR-Aktivierung ändern) minimiert
ist. In bestimmten Zellen wird die Aktivierung von GPCRs in einem
essentiellen Bleichen des detektierbaren Signals aus dem Zytosol
und einem 100-fachen Anstieg (oder mehr) des detektierbaren Signals
an der Zellemembran resultieren. In den vorliegenden Verfahren ist
es bevorzugt, dass das detektierbare Signal am Membranrand nach
GPCR-Aktivierung wenigstens auf das doppelte, stärker bevorzugt wenigstens auf
das 3-fache und stärker
bevorzugt wenigstens auf das 5-fache
oder wenigstens auf das zehnfache ansteigt.
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Wie
hierin verwendet kann die Einführung
eines chimären
Proteins in eine Zelle durch Einführung einer Nukleinsäuresequenz
oder eines Konstrukt (z. B. DNA oder RNA), welche das chimäre Protein
kodiert, in die Zelle (oder in den Vorläufer der Zelle), und Kultivieren
der Zelle in einer Umgebung, welche die Expression des chimären Proteins
gestattet, durchgeführt
werden. Die Einführung
von Nukleinsäuren,
welche das chimäre
Protein kodieren oder die Einführung
des Proteins selbst in eine Zelle kann mittels jedes der vielen
geeigneten Verfahren durchgeführt
werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich Transfektion,
Elektroporation, Mikroinjektion und Liposom-Transport.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Konstrukt bereit, das einen
Promotor, DNA, welche ein β-Arrestin-Protein kodiert,
das mit diesem wirksam verbunden ist und DNA umfasst, welche ein visuell
detektierbares Marker-Protein
kodiert, welches damit wirksam verbunden ist. Der Promotor ist wirksam
mit der kodierenden DNA verbunden: DNA, welche β-Arrestin kodiert, kann sich
5' von der DNA befinden,
welche den visuell detektierbaren Marker kodiert, oder umgekehrt.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kodiert die DNA, welche einen visuell detektierbaren Marker kodiert,
ein grün
fluoreszierendes Protein (GFP). Vektoren, welche solche DNA-Konstrukte
umfassen, sind ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Konjugate bereit (wie chimäre Proteine
oder Fusionsproteine), welche ein β-Arrestin-Protein und ein visuell
detektierbares Protein enthalten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das visuell detektierbare Protein ein grün fluoreszierendes Protein (GFP).
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Zelle bereit, die ein
DNA-Molekül
umfasst, wobei dieses DNA-Molekül in der
5'- zu 3'-Richtung einen Promotor,
DNA, welche ein damit wirksam verbundenes β-Arrestin-Protein kodiert und
DNA umfasst, welche ein visuell detektierbares Marker-Protein kodiert, das
damit wirksam verbunden ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kodiert die DNA, welche einen visuell detektierbaren Marker kodiert,
ein grün fluoreszierendes
Protein (GFP).
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Die
erfindungsgemäßen Zellen
können
verwendet werden, um die Anwesenheit spezifischer Moleküle in verschiedenen
Arten von Proben zu detektieren, wie z. B. wässrige Proben, biologische
Proben (zum Beispiel Blut, Urin oder Speichel), Proben aus der Umwelt
oder industrielle Proben. Bei solchen Verwendungen enthalten die
Zellen einen GPCR, dessen Agonisten bekannt sind. Die Aktivierung
des GPCR und die begleitende Translokation des detektierbaren Signals
vom Zytosol zum Membranrand zeigt die Anwesenheit eines Agonisten
für den
GPCR an. Eine Zelle, die in einem solchen Verfahren verwendet wird,
kann nur einen einzelnen Typ eines bekannten GPCR oder eine Auswahl
bekannter GPCRs enthalten. Eine solche Detektion wird für medizinische
und tierärztliche
diagnostische Zwecke, industrielle Zwecke und für das Screenen auf den Missbrauch
von Arzneimitteln oder Chemikalien oder auf biologische Toxine,
welche die GPCR-vermittelte Signal-Transduktion beeinflussen, nützlich sein.
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Die
erfindungsgemäßen Zellen
können
aufgebracht sein auf oder befestigt sein an, gehalten werden von
oder immobilisiert sein auf einem Substrat. Das Substrat kann aus
jedem geeigneten Material bestehen, das nicht schädlich oder
nachteilig für darauf
aufgebrachte lebende Zellen ist, das heißt, dass es biokompatibel mit
den darauf aufgebrachten lebenden Material ist. Das Substrat kann
steif, halb-steif oder flexibel sein und kann blickdicht, transparent,
oder semi-transparent sein. Die Größe, Geometrie und andere physikalische
Eigenschaften des Substrats werden durch die beabsichtigte Verwendung
vorgegeben werden, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich
sein wird. Geeignete Substrate schließen ein, sind aber nicht begrenzt
auf, Kunststoffe, Glas, Keramik, Silizium, biokompatible Monomer-
und Polymer-Zusammensetzungen, Halbleitermaterialien, Glasfaser-Materialien,
Polystyrole, Membrane, Sephadex und bioorganische Materialien. Beispiele
biokompatibler Materialien werden auch in den US-Patenten Nr. 5578079,
5575997 und 5582834 von Leung und Clark und 5522896 von Prescott
bereitgestellt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen auf
die Anwesenheit eines GPCR-Agonisten in einer Lösung bereit, welches umfasst:
a) Bereitstellung einer Zelle, welche einen bekannten oder unbekannten
GPCR exprimiert und ein chimäres
Protein enthält,
welches ein β-Arrestin-Protein
und ein visuell detektierbares Protein umfasst; b) Exposition der
Zelle mit einer Testlösung und
c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol
der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Translokation des
detektierbaren Moleküls
vom Zytosol zum Membranrand der Zelle die Aktivierung des GPCR und
dementsprechend den GPCR-Agonist-Effekt der Testlösung anzeigt.
Die Translokation des chimären
Proteins wird nachgewiesen, wie es oben diskutiert wurde.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen auf
die Anwesenheit eines GPCR-Antagonisten in einer Lösung bereit,
welches umfasst: a) Bereitstellung einer Zelle, welche einen GPCR
exprimiert und ein chimäres
Protein enthält, welches
ein β-Arrestin-Protein
und ein visuell detektierbares Protein umfasst; h) Exposition der
Zelle mit einer Testverbindung, dann c) Exposition der Zelle mit
einem Agonisten für
den in der Zelle exprimierten GPCR und d) Detektion der Translokation
des detektierbaren Moleküls
vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle. Wenn die Testverbindung
einen Antagonisten enthält,
wird die Translokation des detektierbaren Moleküls für einen Zeitraum verzögert, welcher
der Dauer der Antagonist-Wirkung auf den Rezeptor entspricht (wobei
der Zeitraum variieren wird, in Abhängigkeit vom Antagonisten und/oder
Rezeptor). Die Translokation des detektierbaren Molekül vom Zytosol
zum Membranrand der Zelle zeigt die Aktivierung des GPCR mittels
des Agonisten an. Wenn die Translokation nicht eintritt oder verzögert ist
(verglichen mit der, die in Abwesenheit der Testverbindung auftreten
würde),
enthält
die Testverbindung dementsprechend einen Antagonisten für den GPCR.
Abwesenheit oder Verzögerung
der Translokation kann durch den Vergleich mit einer Kontrollzelle
(die nicht der Testverbindung ausgesetzt wurde) oder mit einem vorher
festgelegten Standard bewertet werden. Die Translokation des chimären Proteins wird
nachgewiesen, wie es oben beschrieben wurde. Die Exposition mit
der Testverbindung und dem bekannten Agonisten kann zur im Wesentlichen
gleichen Zeit geschehen oder die Exposition mit dem Agonisten kann
im Anschluss an die Exposition mit der Testverbindung erfolgen.
Wie hierin verwendet, bedeutet Exposition im Anschluss die Exposition
innerhalb eines Zeitraums, während welchem
man von einem potentiellen Antagonisten erwarten würde, dass
er mit dem GPCR wechselwirkt (d. h. Bindung des GPCR oder gebunden
sein an den GPCR).
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen einer
Zelle auf die Anwesenheit eines GPCR bereit, umfassend: a) Bereitstellung
einer Testzelle; b) Einführung
eines chimären Proteins,
welches ein β-Arrestin-Protein
und ein visuell detektierbares Protein umfasst, in die Testzelle und
dann c) Exposition der Zelle mit einer Testlösung, welche einen bekannten
Agonisten für
den GPCR enthält
und d) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol
der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Translokation des
detektierbaren Moleküls
vom Zytosol zum Membranrand der Zelle die Aktivierung eines GPCR
anzeigt und dementsprechend dass die Testzelle einen solchen GPCR
enthält.
Die Translokation des chimären Proteins
wird nachgewiesen, wie es oben diskutiert wurde.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen einer
Zellpopulation auf die Anwesenheit von Zellen bereit, welche GPCRs
enthalten, umfassend: a) Bereitstellung einer Population von Testzellen,
wobei diese Testzellen chimäre
Proteine umfassen, welche ein β-Arrestin-Protein
und ein visuell detektierbares Protein umfassen und dann b) Exposition
der Zellenpopulation mit einer Testlösung, welche einen Agonisten
für einen
GPCR enthält
und d) Detektion jener Zellen, in welchen die Translokation des
detektierbaren Moleküls
vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle eintritt, wobei
die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand
einer Zelle die Aktivierung eines GPCR anzeigt und dementsprechend anzeigt,
dass die fragliche Zelle einen GPCR enthält. Die Translokation des chimären Proteins
wird nachgewiesen, wie es oben diskutiert wurde. Zu screenede Zellpopulationen
schließen
eine Sammlung individueller Zellen, ein Gewebe, welches eine Vielzahl gleichartiger
Zellen umfasst, ein Organ, welches eine Vielzahl verwandter Zellen
umfasst oder einen Organismus ein, der eine Vielzahl von Geweben
oder Organen umfasst.
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Wie
hierin verwendet bedeutet, 'Exposition' einer Zelle mit
einer Testverbindung oder Lösung, dass
das Äußere der
Zelle in Kontakt mit der Testverbindung oder Lösung gebracht wird. Wenn die
Testverbindung oder Lösung
auf GPCR-Ligand-Aktivität gescreent
wird, wird die Exposition unter Bedingungen durchgeführt, welche
die Bindung eines GCPR-Liganden an einen in der Zelle exprimierten Rezeptor
gestatten würden.
Wie hierin verwendet bezieht sich 'Translokation' von β-Arrestin
auf die Bewegung des β-Arrestin-Moleküls von einem
Bereich der Zelle zu einem anderen.
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Die
vorliegenden Verfahren können
weiterhin verwendet werden, um den Effekt eines jeden Moleküls im GPCR-Stoffwechsel zu bewerten
oder zu untersuchen, welches seinen Effekt stromaufwärts der β-Arrestin-Bindung
(d. h. vor der β-Arrestin-Bindung
an den phosphorylierten GPCR) ausübt. Folglich stellt die vorliegende
Erfindung Verfahren zur Bewertung von GPCR-Stoffwechselfunktionen
im allgemeinen bereit. Wie hierin verwendet, bezieht sich GPCR-Stoffwechsel auf
eine Reihe von Ereignissen, welche mit der Agonist-Aktivierung eines
GPCR beginnen, gefolgt von der Desensibilisierung des Rezeptors über G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase-Phosphorylierung
(GRK) und β-Arrestin-Bindung.
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Im
weitesten Sinn stellt die vorliegende Erfindung demnach ein Verfahren
zum Screenen von Testverbindungen und Testbedingungen auf die Befähigung einen
GPCR-Stoffwechsel
zu beeinflussen (aktivieren oder hemmen, verstärken oder unterdrücken) bereit
und stellt Verfahren zur allgemeinen Bewertung von GPCR-Stoffwechselfunktion
in einer Zelle bereit. In den vorliegenden Verfahren wird das Ausmaß der Translokation
des β-Arrestins
mittels des Grads an detektierbaren Veränderungen in der Zelle angezeigt;
das Ausmaß der β-Arrestin-Translokation
ist ein Indikator des Umfangs der Vollendung des GPCR-Stoffwechsels. Es
kann das relative Ausmaß der
Translokation unter veränderten
Testbedingungen verglichen werden oder eine Testbedingung kann mit
einer Kontrollbedingung oder einem vorher bestimmten Standard verglichen
werden.
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Beispielsweise
können
die Spezifität
und die Effekte verschiedener Kinasen (einschließlich jener, für die bekannt
ist, dass sie mit dem GPCR-Stoffwechsel wechselwirken und jener,
von denen bisher nicht bekannt war, dass sie mit GPCRs wechselwirken)
für einen
spezifischen GPCR oder eine Gruppe von GPCRs durch die Bereitstellung
einer Testkinase für
eine Testzelle, die einen GPCR exprimiert und ein detektierbares β-Arrestin
Molekül
enthält,
Exposition der Zelle mit einem GPCR-Agonisten und Bewertung der
Translokation des detektierbaren β-Arrestins
vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran, bewertet werden (siehe das
hierin aufgeführte
Beispiel 7). Die Translokation des β-Arrestins zur Zellmembran zeigt
an, dass die Testkinase, als Antwort auf die Agonist-Belegung des
Rezeptors, in der Lage ist, den Rezeptor zu binden und zu phosphorylieren,
so dass das β-Arrestin
dann an den durch die Kinase phosphorylierten Rezeptor binden wird
und eine anschließende
Wechselwirkung mit dem geeigneten G-Protein verhindern wird. Auf ähnlichem
Weg kann die Funktion veränderter,
rekombinanter oder mutanter Kinasen bewertet werden; es können Verbindungen
auf ihre Befähigung
den GPCR-Stoffwechsel, G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinasen oder β-Arrestin-Bindung
zu aktivieren oder zu hemmen gescreent werden und es kann die Funktion
von G-Proteinen bewertet werden. Zum Beispiel können die folgenden Testbedingungen unter
Verwendung von Verfahren, wie sie hierin beschrieben wurden, bewertet
werden: Die Effekte von G-Proteinen (einschließlich natürlicher, heterologer oder künstlich
veränderter
G-Proteine) innerhalb der Testzel le; Exposition der Testzelle mit
bekannten oder putativen GPCR-Liganden und Coexpression eine zweiten
Rezeptors in der Testzelle, die einen GPCR exprimiert.
-
Weiterhin
erlauben die vorliegenden Verfahren das Screenen von β-Arrestinen
(natürlich
vorkommende, künstlich
eingeführte
oder veränderte, mutante
oder rekombinante) auf die Befähigung
einen phosphorylierten GPCR zu binden. In solchen Verfahren ist
das Test-β-Arrestin
mit einem detektierbaren Molekül
wie GFP konjugiert und wird in einer Zelle platziert, die einen
GPCR enthält.
Die Zelle wird einem bekannten Agonisten für den GPCR ausgesetzt und die
Translokation des detektierbaren Moleküls om Zytosol der Zelle zum
Membranrand der Zelle wird detektiert. Die Translokation des detektierbaren
Moleküls
zeigt an, dass das Test-β-Arrestin-Protein
in der Lage ist, an den phosphorylierten GPCR zu binden. Wie in
anderen erfindungsgemäßen Verfahren
kann die Translokation mit einer Kontrollzelle verglichen werden,
welche ein bekanntes β-Arrestin oder
einen vorher bestimmten Standard enthält.
-
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
-
GPCRs,
die zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignet sind,
sind jene, bei welchen die Agonist-Bindung eine Kinase-Phosphorylierung
(GRK) des G-Protein-gekoppelten
Rezeptors induziert; die Translokation des Arrestins vom Zytosol der
Zelle zur Zellmembran tritt im Anschluss ein. Es wird angenommen,
dass nahezu alle Mitglieder der GPCR-Superfamilie über diesen
gemeinsamen Mechanismus sensibilisieren, wobei die Beispiele geeigneter
GPCR-Typen einschließen,
aber nicht begrenzt sind auf, beta- und alpha-adrenergene Rezeptoren, GPCRs,
die Neurotransmitter (wie Dopamin) binden, GPCRs die Hormone binden,
die Klasse der Geruchsrezeptoren (Geschmacks-, Geruch- und chemotaktischer
Rezeptoren, wie sie in der Naschenschleimhaut und der Zunge und
im Sperma, Ei, Zellen des Immunsystems und Blutzellen gefunden werden);
die Klasse der Typ-II-GPCRs, einschließlich Secretin, Glucagon und
anderer Rezeptoren des Verdauungstrakts; licht-aktivierte GPCRs (wie Rhodopsin) und
Mitglieder der Typ-III-Familie
der GPCRs, welche metabotopische Glutamat-Rezeptoren und GABAB-Rezeptoren
einschließen,
aber nicht auf diese begrenzt sind. Zusätzlich zu natürlich vorkommenden
GPCRs können
GPCRs spezifisch gentechnisch hergestellt werden oder mittels Zufallsmutagenese erzeugt
werden. Solche nicht natürlich
vorkommenden GPCRs können
auch in den vorliegenden Verfahren eingesetzt werden und mittels
dieser gescreent werden. Die vorliegenden Verfahren können bei
jedem Membran-Rezeptor-Protein eingesetzt werden, in welchem die
Agonist-Bindung in der Translokation von β-Arrestin resultiert. Solche
Rezeptoren schließen
Wachstumsfaktoren ein, welche durch G-Proteine Signale übermitteln.
-
Automatisierte Screening-Verfahren
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können automatisiert
werden um zweckmäßige Echtzeitverfahren
mit hohen Volumina zum Screenen von Verbindungen auf GPCR-Ligand-Aktivität oder zum Screenen
auf die Anwesenheit eines GPCR-Liganden in einer Testprobe bereitzustellen.
Automatisierte Verfahren werden derart gestaltet, dass sie die Änderung
der Konzentration von markiertem β-Arrestin
an der Zellemembran und/oder im Zytosol nach der Exposition mit
einem GPCR-Agonisten detektieren. Die Änderung der β-Arrestin-Verteilung
kann im Zeitverlauf (d. h. durch den Vergleich derselben Zelle vor und
nach der Exposition mit der Testprobe) oder mittels Vergleich mit
einer Kontrollzelle, die nicht der Testprobe ausgesetzt wird, oder
mittels Vergleich mit vorher festgelegten Indikatoren detektiert
werden. Sowohl die qualitativen Bewertungen (positiv/negativ) als
auch die quantitativen Bewertungen (ver gleichender Grad der Translokation)
können
mittels des vorliegenden, automatisierten Verfahrens bereitgestellt
werden, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird.
-
Es
ist demnach ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung,
Verfahren zum automatisierten Screenen auf GPCR-Aktivität mittels
Detektion der Translokation des detektierbar markierten β-Arrestins
vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran, als Antwort auf die Agonist-Aktivierung
von GPCRs, bereitzustellen. Die Translokation kann mittels der Veränderung
der Verteilung eines detektierbaren Signals innerhalb einer Zelle
im zeitlichen Verlauf, zwischen einer Testzelle und einer Kontrollzelle
oder mittels Vergleich mit vorher festgelegten Parametern, detektiert
werden. Insbesondere werden gemäß einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von Zellen, welche GPCRs
exprimieren und chimäre
Proteine enthalten, welche ein detektierbares Molekül und ein β-Arrestin-Molekül umfassen, bereitgestellt.
Es werden dann, unter Verwendung konventioneller Techniken, Indikatoren
für die
Verteilung der detektierbaren Moleküle gemessen. In verschiedenen
Ausführungsbeispielen
(a) erfolgt die Messung der optischen Indikatoren vor und nach der Zugabe
einer Testprobe zu einer Zelle und es werden die Zeitpunktsmessungen
verglichen; (b) werden die optischen Indikatoren in einer Testzelle,
die einer Testprobe ausgesetzt wurde, und in einer Kontrollzelle
gemessen, die dieser nicht ausgesetzt wurde und werden diese Messungen
verglichen und (c) die Messung einer Testzelle nach Addition einer
Testprobe wird mit vorher festgelegten Parametern verglichen. Die
gemessenen optischen Indikatoren können Fluoreszenzsignale (z.
B. Fluoreszenzintensitäten)
sein, wenn das detektierbare Molekül des chimären β-Arrestin-Proteins ein Fluoreszenzindikator
wie GFP ist. Andere optische Indikatoren, die für Echtzeit messungen geeignet
sind, können
auch verwendet werden, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein
wird.
-
Es
kann ein Gerät
zur Bestimmung der GPCR-Antwort auf eine Testprobe verwendet werden. Dieses
Gerät umfasst
Mittel wie Instrumente zur Fluoreszenzmessung, zur Messung von Indikatoren
der intrazellulären
Verteilung detektierbarer β-Arrestin-Proteine
in wenigstens einer Testzelle und optional auch in einer Kontroll-
oder Kalibrierungszelle. Die Messpunkte können über die Zeit oder zwischen Test-
und Kontrollzellen genommen werden. Ein Comuterprogramm-Produkt
kontrolliert die Funktion der Messvorrichtungen und führt numerische
Operationen durch, welche die oben beschrieben Schritte betreffen.
Das bevorzugte Computerprogramm-Produkt umfasst ein computerlesbares
Speichermedium, welches eine computerlesbare Programmcode-Vorrichtung
besitzt, die im Medium enthalten ist. Hardware, die zur Verwendung
in solchen automatisierten Geräten
geeignet ist, wird einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein
und kann Computer-Controller,
automatisierte Probenhandhabungsvorrichtungen, Geräte zur Fluoreszenzmessung,
Drucker und optische Displays einschließen. Die Messvorrichtung kann
einen Photodetektor oder mehre Photodetektoren zur Messung des Fluoreszenzsignals
von Proben enthalten, in denen Moleküle in dem detektierbare β-Arrestin-Konstrukt
eingesetzt werden, die mittels Fluoreszenz detektierbar sind. Die
Messvorrichtung kann auch einen computergesteuerten Schrittmotor
enthalten, so dass jede Kontroll- und/oder Testprobe als eine Anordnung
von Proben aufgestellt sein kann und automatisch und wiederholt
während
des Schritts der Messung der Fluoreszenzintensität einem Photodetektor gegenüberliegend
angeordnet werden kann.
-
Die
Messvorrichtung ist bevorzugt operativ an einen Allzweck- oder anwendungsspezifischen Computer-Controller
gekoppelt. Der Controller umfasst bevorzugt ein Computerprogramm-Produkt
zur Steuerung der Funktion der Messvor richtung und zur Durchführung numerischer
Operationen, welche die oben beschriebenen Schritte betreffen. Der
Controller kann Setup-Daten und andere verwandte Daten über Datei,
Disketten-Input oder Datenbus annehmen. Ein Display und ein Drucker
können
auch bereitgestellt werden, um die durch den Controller vorgenommenen
Operationen visuell anzuzeigen. Ein Durchschnittsfachmann wird verstehen,
dass die mittels des Controllers durchgeführten Abläufe insgesamt oder teilweise
als Software-Module realisiert werden können, die auf einem Allzweck-Computersystem ablaufen.
Alternativ kann ein fest zugeordnetes, allein operierendes System
mit anwendungsspezifischen, integrierten Schaltkreisen zur Durchführung der
oben beschriebenen Abläufe
und Operationen bereitgestellt werden.
-
Wie
oben vorgesehen, können
die Indikatoren der β-Arrestin-Verteilung
die Form von Fluoreszenz-Signalen haben können, obwohl für den Durchschnittsfachmann
offensichtlich sein wird, dass noch andere Indikatoren bekannt sind
und bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wie vielleicht jene,
die mittels Markierungen bereitgestellt werden, welche Signale erzeugen, die
mittels Fluoreszenz, Radioaktivität, Colorimetrie, Röntgenbeugung
oder Absorption oder Magnetismus detektierbar sind. Solche Markierungen
schließen zum
Beispiel Fluorophore, Chromophore, radioaktive Isotope (z. B. 32P oder 125I) und
Elektronendichte-Reagenzien ein.
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Definitionen
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Wie
hierin verwendet bezieht sich exogene oder heterologe DNA (oder
RNA) auf DNA (oder RNA), welche mittels menschlicher Bemühungen in eine
Zelle (oder den Vorläufer
einer Zelle) eingeführt wurde.
Solche heterologe DNA kann eine Kopie einer Sequenz sein, die in
der transformierten Zelle natürlich
vorkommt oder sie kann eine Sequenz oder Fragmente von dieser Sequenz
sein, welche naturgemäß nicht
in der transformierten Zelle gefunden wird.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff 'Gen' auf
eine DNA-Sequenz, welche (1) stromaufwärts (5') Regulationssignale einschließlich eines Promotors,
(2) eine kodierende Region, welche das Produkt, Protein oder die
RNA des Gens spezifiziert, (3) stromabwärts (3') Regionen, welche Transkriptionstermination
und Polyadenylierungssignale einschließen und (4) assoziierte Sequenzen
inkorporiert, die für
die effiziente und spezifische Expression erforderlich sind.
-
Die
Verwendung des Ausdrucks "im
Wesentlichen Sequenz-Ähnlichkeit" bezieht sich in
der vorliegenden Beschreibung auf DNA-, RNA- oder Aminosäuresequenzen,
welche leichte und nicht-konsequente Sequenzvariationen einer interessierenden Sequenz
besitzen und als äquivalent
mit der interessierenden Sequenz angesehen werden. Diesbezüglich bedeutet "leichte und nicht-konsequente
Sequenzvariationen",
dass "ähnliche" Sequenzen (d. h. Sequenzen,
welche im Wesentlichen Sequenz-Ähnlichkeit
besitzen), funktionell äquivalent
sein werden. Funktionell äquivalente
Sequenzen werden im Wesentlichen in gleicher Weise arbeiten um im
Wesentlichen die gleichen Zusammensetzungen zu erzeugen.
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Wie
hierin verwendet bedeutet eine "native DNA-Sequenz" oder "natürliche DNA-Sequenz" eine DNA-Sequenz,
welche aus nicht-transgenen Zellen oder Gewebe isoliert werden kann.
Native DNA-Sequenzen sind solche, die nicht künstlich, wie durch ortsspezifische
Mutagenese, verändert
wurden. Sobald native DNA-Sequenzen identifiziert sind, können DNA-Moleküle, welche
native DNA-Sequenzen besitzen, chemisch synthetisiert werden und
unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren, wie im Stand der Technik
bekannt, erzeugt werden.
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Wie
hierin verwendet ist "ein
regulatorisches Element" eines
Gens die DNA-Sequenz, wie beispielsweise ein Promotor, die zur Expression
des Gens erforderlich ist. In dieser Erfindung bedeutet der Begriff "wirksam verbunden", dass einer solchen Verknüpfung folgend
ein regulatorisches Element die Expression einer gebundenen DNA-Sequenz regeln kann.
-
Der
Begriff 'Promotor' bezieht sich auf
eine Region einer DNA-Sequenz, welche die für die effiziente Expression
einer kodierenden Sequenz erforderlichen Signale inkorporiert. Das
kann Sequenzen einschließen,
an welche eine RNA-Polymerase bindet, ist jedoch nicht auf solche
Sequenzen beschränkt
und kann Regionen, an welche andere Regulatorproteine binden, zusammen
mit Regionen einschließen,
die an der Kontrolle der Proteintranslation beteiligt sind und kann
kodierende Sequenzen einschließen.
Geeignete Promotoren werden einem Durchschnittfachmann offensichtlich
sein und werden in Abhängigkeit
von der Zelle, in welcher die DNA exprimiert werden soll, variieren.
Ein Promotor, der zur Verwendung in DNA-Konstrukten geeignet ist, die ein β-Arrestin/detektierbares
Molekülkonstrukt kodieren,
kann ein Promotor sein, der natürlich
in der Zelle vorkommt, in welcher die Expression gewünscht ist;
optional kann der Promotor des β-Arrestins innerhalb
des Konstrukts benutzt werden. Sowohl induzierbare als auch konstitutive
Promotoren werden für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
-
DNA-Konstrukte
-
Erfindungsgemäße DNA-Konstruke
oder "Expressions-Cassetten" schließen in der
5'- zur 3'-Richtung der Transkription
einen Promotor, eine DNA-Sequenz, die wirksam mit the Promotor verbunden
ist, und optional eine Terminatorsequenz einschließlich Stopsignal
für RNA-Polymerase und ein Polyadenylierungssignal
für Polyadenylase
ein. Alle diese Regulatorregionen sollten in der Lage sein in der
zu transformierenden Zelle wirksam zu sein. Geeignete Terminatorsignale
für ein
vorgebenes DNA-Konstrukt
werden einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein.
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Der
Begriff "wirksam
verbunden", wie
er hierin verwendet wird, betrifft DNA-Sequenzen in einem einzelnen
DNA-Molekül,
die derart verbunden sind, dass die Funktion der einen durch die
andere beeinflusst wird. Demnach ist ein Promotor wirksam mit einer
DNA verbunden, wenn er in der Lage ist, die Transkription dieser
DNA zu beeinflussen (d. h. die DNA steht unter der Transkriptionskontrolle
des Promotors). Der Promotor wird als "stromaufwärts" von der DNA bezeichnet, welche wiederum
als "stromabwärts" vom Promotor bezeichnet
wird.
-
Die
Expressions- oder Transkriptionskontrolle kann in einem DNA-Konstrukt
bereitgestellt werden, welches auch wenigstens ein Replikationssystem
besitzt. Der Einfachheit halber ist es gängig ein Replikationssystem
zu haben, dass in Escherichia coli, wie ColE1, pSC101, pACYC184
oder dergleichen wirksam ist. Auf diese Weise kann auf jeder Stufe
nach jeder Manipulation das resultierende Konstrukt kloniert, sequenziert
und die Richtigkeit der Manipulation bestimmt werden. Zusätzlich oder
an Stelle des E. coli Replikationssystems kann ein Replikationssystem
mit einem breiten Wirtsspektrum, wie die Replikationssysteme der
P-1-Inkompatibilitäts-Plasmide,
z. B. pRK290, eingesetzt werden. Zusätzlich zum Replikationssystem
wird häufig
wenigstens ein Marker, der in einem Wirt oder in weiteren Wirten
verwendbar ist oder werden verschiedene Marker für individuelle Wirte anwesend
sein. Das heißt,
dass ein Marker zur Selektion in einem prokaryotischen Wirt eingesetzt
werden kann, währen
ein anderer Marker zur Selektion in einem eukaryotischen Wirt eingesetzt
werden kann. Die Marker können
ein Schutz gegen Biozide wie Antibiotika, Toxine, Schwermetalle
oder dergleichen sein; sie können
für Komplementation
sorgen, indem sie einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleihen oder
sie können durch
die Produktion einer neuen Verbindung in der Pflanze einen sichtbaren
Phenotyp erzeugen.
-
Die
verschiedenen Fragmente, welche die verschiedenen Konstrukte, Expressions-Cassetten, Marker
und dergleichen umfassen, können
konsekutiv mittels Restriktionsenzym-Spaltung eines geeigneten Replikationssystems
und Insertion des entsprechenden Konstrukts oder Fragments in die
verfügbare
Stelle eingeführt
werden.
-
Nach
Ligation und Klonierung kann das DNA-Konstrukt für weitere Manipulation isoliert
werden. Alle diese Techniken werden in der Literatur, wie von J.
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed.
1989) (Gold Spring Harbor Laboratory), ausführlich erläutert.
-
Die
folgenden Beispiele werden dargelegt um die vorliegende Erfindung
zu veranschaulichen und sollen nicht als deren Begrenzung betrachtet werden.
Wie hierin verwendet bedeuten βarr2-GFP
= β-Arrestin-grün-fluoreszierendes-Protein;
GFP = grün
fluoreszierendes Protein; GPCR = G-Protein-gekoppelter Rezeptor; βARK = beta-adrenergene Rezeptor-Kinase;
GRK = G-Protein-gekoppelte
Rezeptor-Kinase; β2AR
= beta-2-adrenergener Rezeptor; HEK-293 = menschliche embryonale
Nieren-Zellen; DMEM = Dulbecco's
modified Eagle medium und MEM = Minimal Essential Medium.
-
BEISPIEL 1
-
Materialien und Verfahren
-
Materialien:
Isoproterenol wurde von Sigma RBI bezogen. Anti-Maus-Antikörper wurde
von Sigma Chemicals oder Molecular Probes bezogen. Monoklonaler
Maus-Antikörper
gegen das 12CA5-Epitop wurde von Boehringer Mannheim bezogen. Zellkultur-Medien
wurden von Mediatech und fetales Rinderserum wurde von Atlanta Biologicals
bezogen. Physiologische Puffer wurden von Gibco-Life Technologies
Inc., Restriktionsenzyme wurden von Promega oder New England Biolabs,
T4-Ligase wurde von Promega und Hot-Tub- DNA-Polymerase wurde von Amersham bezogen.
Kommerziell erhältliche Plasmide,
welche Varianten von grün
fluoreszierendem Protein enthalten, wurden von Clontech bezogen.
-
Zellkultur
und Transfektion: HEX-293- und COS-Zellen wurden erhalten und wie
von Barak et al., Mol. Pharm. 51: 177 (1997), beschrieben, transfiziert.
Zellen, welche sowohl beta-2-adrenergenen Rezeptor als auch β-Arrestin-Konstrukte enthalten, wurden
mit zwischen 5–10 μg Rezeptor-cDNA
in pcDNA1/AMP und 0,5–1 μg Barr2-GFP-cDNA
pro 100 mm Schale transfiziert. GRKs wurden unter Verwendung von
5 μg transfizierter
cDNA in pcDNA1/AMP pro Schale exprimiert.
-
Konfokale
Mikroskopie: HEK-293-Zellen, die transfiziert wurden wie es oben
beschrieben worden ist, wurden auf 35 mm Schalen plattiert, die
einen zentrierten, 1 cm Well enthielten, der aus einem Loch im Kunststoff
gebildet wird, das mit einem Glasdeckel verschlossen wurde. Primäre und sekundäre Antikörpermarkierung
von Lebendzellen wurde bei 37°C
30 Minuten lang in Medien ohne Serum in einem 5%-CO2 Inkubator
durchgeführt.
Die Zellen wurden zwischen den Anwendungen dreimal gewaschen. Zellen,
die wie oben beschrieben in MEM oder DMEM, gepuffert mit 20 mM Hepes,
plattiert wurden, wurden mit einem konfokalen Zeiss Laser-Scan-Mikroskop
betrachtet.
-
Komplexbildung:
Durchflusszytometrie-Analyse wurde unter Anwendung von im Stand
der Technik bekannten Verfahren, wie sie in Barak et al., J. Biol.
Chem. 269: 2790 (1994) beschrieben werden, durchgeführt.
-
BEISPIEL 2
-
Konstruktion von β-Arrestin-2-GFP-Plasmid
-
β-Arrestin-2-cDNA
in dem Plasmid pCMVS wurde als Templat verwendet. Oligonukleotid-Primer, welche
eine distale XhoI-Restriktionsstelle und das C-terminale Stopcodon
von β-Arrestin-2
umgeben, wurden verwendet, um das Stopcodon durch eine in-frame-BamHI-Restriktiosstelle mittels
ortsspezifischer Mutagenese zu ersetzen (Valette et al., Nucleic Acids
Res. 17: 723 (1989); Attramadal et al., J. Biol. Chem. 267: 17882
(1992); Lohse et al., Science 248: 1547 (1990)). Das XhoI, BamHI-Segment
wurde isoliert. Dieses Segment wurde an den N-terminalen Teil von β-Arrestin-cDNA
(aus pCMV5 mittels SacI und XhoI geschnitten) in den Polylinker
eines Plasmids ligiert, das vorher mit SacI und BamHI verdaut wurde und
das S65T-grün-fluoreszierendes-Protein
distal und in-frame zu der Stelle der β-Arrestin-cDNA-Insertion enthielt.
Lohse et al., Science 248: 1547 (1990). Das resultierende β-Arrestin-GFP-Konstrukt
wurde nach Insertion und Vermehrung in E. coli. isoliert. Die Konstrukte
wurden mittels Sequenzierung verifiziert.
-
Ein
lineares Modell des β-Arrestin-2/S65T-GFP-Konjugats ist in 1 bereitgestellt.
-
BEISPIEL 3
-
Charakterisierung von βarr2-GFP,
das mittels HEK-293-Zellen
exprimiert wird
-
Homogenate
von HEK-293-Zellen, die mit dem Plasmid aus Beispiel 2 transformiert
sind, wurden unter Verwendung bekannter Western-Blot-Techniken untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass HEK-293-Zellen sowohl β-Arrestin
als auch das βarr2-GFP-Konjugat
endogen exprimieren.
-
Es
wurden Western-Blots von Homogenaten von HEK-293-Zellen, die mit dem Plasmid aus Beispiel
2 transfiziert wurden und βarr2-GFP
exprimieren, durchgeführt.
Eine äquivalente
Menge des Homogenatmaterials wurde auf jede von zwei Bahnen übertragen
(2A). Die linke Bahn
wurde anti-β-Arrestin-Antikörper ausgesetzt
(Menard et al., Mol. Pharm. 51: 800 (1997)), wohingegen die rechte
Bahn einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen GFP ausgesetzt wurde.
Das βarr2-GFP-Fusionsprotein
ist ungefähr
um 50% größer als β-Arrestin-2
und man würde
deshalb erwar ten, dass es auf SDS-Page langsamer wandert als β-Arrestin.
-
Die
Exposition mit anti-β-Arrestin-Antikörper lässt mehrere
Banden erkennen (linke Bahn); die Exposition mit monoklonalem anti-GFP-Antikörper lässt eine
einzelne Bande erkennen (rechte Bahn). Die Position von endogenem
zellulärem β-Arrestin-2
wird durch die mittlere Bande in der linken Bahn (βarr2) angezeigt.
Die schwere Bande direkt unter 71000 auf der linken Bahn (βarr2-GFP)
wird durch ein ähnliche Bande
auf der linken Bahn gespiegelt. Im Gegensatz dazu wird bei der Exposition
mit anti-GFP-Antikörper keine
Bande beobachtet, die mit dem endogenen zellulären β-Arrestin-2 korrespondiert.
Die Behandlung der rechten Bahn mit anti-GFP-Antikörper zeigte, dass
die langsamere Bande, die mittels anti-β-Arrestin-Antikörper markiert
wurde, GFP enthielt.
-
BEISPIEL 4
-
Biologische Aktivität von β-Arrestin-GFP-Konjugat
-
Die β-Arrestin-Aktivität kann indirekt
mittels Messung seines Effekts auf die Rezeptor-Komplexierung bewertet
werden (siehe Menard et al., Mol. Pharm. 51: 800 (1997); Ferguson
et al., Science 271: 363 (1996)). Das β2AR komplexiert gewöhnlich in COS-Zellen
nur schlecht und das wurde mit der relativ schwachen Expression
von endogenen β-Arrestinen
in Zusammenhang gebracht (siehe Menard et al. Mol. Pharmacol. 51:
800 (1997); Ferguson et al. Science 271: 363 (1996)). Die Überexpression
von exogenem β-Arrestin
erhöht
die β2AR-Komplexierung
in diesen Zellen. Um zu zeigen, dass das βarr2-GFP-Konjugat ein biologisch
aktives β-Arrestin ist,
wurden COS-Zellen, welche βarr2-GFP überexprimieren,
auf die Steigerung der β2AR-Internalisierung,
im Vergleich zur Steigerung von βAR2,
die bei der Überexpression
von β-Arrestin-2
beo bachtet wird, untersucht. Die Ergebnisse sind in 2B gezeigt.
-
Unter
Verwendung epitopmarkierter βAR2-Rezeptoren
wurde die Komplexierung von βAR2
in COS-Zellen, die entweder (1) exogenes β-Arrestin-2 noch (2) das βarr2-GFP-Konjugat überexprimieren,
untersucht. 2B zeigt
die Komplexierung von β2AR
in COS-Zellen mit und ohne überexprimiertes β-Arrestin-2
(die beiden linken Banden) und mit und überexprimiertem βarr2-GFP
(die beiden rechten Banden). Die Agonist-vermittelte β2AR-Komplexierung
stieg in Anwesenheit von überexprimiertem β-Arrestin-2
von 15 ± 7%
auf 39 ± 5%
an; die Überexpression
von βarr2-GFP
erhöhte
auf gleiche Weise die Agonist-vermittelte β2AR-Komplexierung von 25 ± 4% auf
58 ± 1%.
Wild-Typ-β-Arrestin-2 und βarr2-GFP
erhöhten
die β2AR-Komplexierung
gleichermaßen
gut über
die Kontroll-Niveaus, wobei ein 2,5- beziehungsweise 2,4-facher
Anstieg der β2AR-Komplexierung hervorgerufen
wurde.
-
Die
obigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass das βarr2-GFP-Konjugat wie ein biologisch
aktives Arrestin wirkt.
-
BEISPIEL 5
-
Agonist-vermittelte Translokation
von βarr2-GFP
-
Die
Agonist-vermittelte Translokation des βarr2-GFP-Chimären
vom Zytosol der Zelle zur Membran wurde unter Verwendung von HEK-293- und
COS-Zellen untersucht, die mit Plasmiden transfiziert waren, welche
cDNA für
den β2AR-Rezeptor und
für das βarr2-GFP-Konjugat
enthielten.
-
HEK-293-
und COS-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, welche 10 μg cDNA für β2AR und 0,5–1,0 μg für βarr2-GFP
enthielten. Die Zellen wurden unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie bewertet,
um die inhärente
intrazelluläre
Fluoreszenz von GFP zu detektieren. Transfizierte HEK-293-Zellen
sind in 3A gezeigt,
wobei Feld 1 Zellen vor der Zugabe von βAR2-Agonist bild lich darstellt
und Feld 2 Zellen im Anschluss an die Zugabe von Agonist bildlich
darstellt. Transfizierte COS-Zellen
sind in 3B gezeigt,
wobei Feld 1 die Zellen kurz vor der Zugabe von βAR2-Agonist bildlich darstellt
und Feld 2 die Zellen zehn Minuten nach der Zugabe von Agonist bildlich
darstellt.
-
Wie
in 3A gezeigt, war die βarr2-GFP-Verteilung
in HEK-239-Zellen anfänglich zytosolisch
(Feld 1). Es war keine signifikante Verstärkung im Kern oder in der Membran
sichtbar. Im Anschluss an die Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol zum Zellmedium
wurde die Agonist-vermittelte
Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP
unter Verwendung konfokaler Mikroskopie beobachtet. Zehn Minuten
nach der Zugabe von Isoproterenol (Sättigungskonzentrationen) wurde
der Anstieg der Membran-Fluoreszenz mit einem gleichzeitigen Verlust
an zytosolischer Fluoreszenz beobachtet, wodurch angezeigt wird,
dass sich die βarr2-GFP-Verteilung zur
Membran verschoben hat (Feld 2). Diese Ergebnisse beweisen, dass
in HEK-293-Zellen, welche das β2AR
enthalten, das durch die Zelle exprimierte βarr2-GFP im Anschluss an die
Zugabe eines βAR2-Agonisten
vom Zytosol zur Membran translokalisiert wird. Die Exposition der
Testzellen mit GPCR-Agonist erhöht
die membrangebundene Fluoreszenz zehnfach über die, welche vor der Agonist-Exposition beobachtet
wurde.
-
Wie
in 3A gezeigt war die βarr2-GFP-Verteilung
in COS-Zellen anfänglich
zytosolisch (Feld 1). Es war keine signifikante Verstärkung im
Kern oder in der Membran sichtbar. Im Anschluss an die Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol
zum Zellmedium wurde die Agonist-vermittelte
Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP
unter Verwendung konfokaler Mikroskopie beobachtet. Zehn Minuten
nach der Zugabe von Isoproterenol (Sättigungskonzentrationen) wurde
der Anstieg der Membran-Fluoreszenz mit einem gleichzeitigen Verlust
an zytosolischer Fluoreszenz beobachtet, wodurch angezeigt wird,
dass sich die βarr2- GFP-Verteilung zur
Membran verschoben hat (Feld 2). Diese Ergebnisse beweisen, dass
in COS-Zellen, welche das β2AR
enthalten, das durch die Zelle exprimierte βarr2-GFP im Anschluss an die
Zugabe eines βAR2-Agonisten
vom Zytosol zur Membran translokalisiert wird.
-
Ein
Vergleich der 3A und 3B zeigt, dass das Fluoreszenzsignal
in COS-Zellen im Vergleich zu HEK-Zellen reduziert ist, wodurch die geringere
Effizienz der Komplexierung von β2AR
in COS-Zellen widergespiegelt wird. Jedoch ist sogar in COS-Zellen die
Verschiebung von βarr2-GFP
vom Zytosol zur Membran in Anschluss an die Zugabe von βAR2-Agonist
aufgrund der Fluoreszenz der GFP-Komponente
erkennbar.
-
Die
obigen Versuche mit COS- und HEK-239 Zellen wurden reproduziert,
mit der Ausnahme dass der βAR2-Antagonist Propranolol
zu dem Zellmedium hinzugefügt
wurde. Die Verwendung konfokaler Mikroskopie, um das βarr2-GFP wie oben in der
Zelle in Echtzeit zu verfolgen, zeigte an, dass keine Verschiebung
von βarr2-GFP
vom Zytosol zur Membran als Antwort auf einen βAR2-Antagonisten erfolgt ist. Wie
in 6E gezeigt resultierte
die Zugabe eines Agonisten (mittleres Feld) in der Translokation
von βarr2-GFF
vom Zytosol zur Membran; nachfolgende Zugabe eines Antagonisten
(rechtes Feld) kehrte die Translokation um (vergleiche dazu die
Kontrolle, linkes Feld).
-
Der
biochemische Beweis zeigt an, dass β-Arrestine vorwiegend zytosolische
Proteine sind. Ferguson et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74:
1095 (1996). Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen, dass βarr2-GFP
im gesamten Zytosol verteilt ist und vom Kern ausgeschlossen ist.
Diese Daten belegen auch, dass βarr2-GFP
in Abwesenheit eines Agonisten nicht vorwiegend in der Plasmamembran
kompartimentiert ist, sondern dass das zelluläre βarr2-GFP durch die Exposition mit einem Agonisten zur
Membran verschoben wird. Die vorliegenden Ergebnisse weisen außerdem darauf
hin, dass die Verschiebung des βarr2-GFP- Konjugats als Antwort
auf die Zugabe eines G-Protein-gekoppelten
Rezeptor-Agonisten optisch als Verstärkung der Membranfluoreszenz
und/oder einem begleitenden Verlust an zytosolischer Fluoreszenz
detektiert werden kann und dass diese Antwort schnell beobachtet
wird.
-
BEISPIEL 6
-
Intrazelluläres βarr2-GFP
richtet sich auf Membran-Rezeptoren
-
4 zeigt den Zeitverlauf
der βarr2-GFP-Weiterverteilung
zur Plasmamembran von mit 12CA5(HA) markiertem β2AR in HEK-293-Zellen, wie mittels
konfokaler Mikroskopie gezeigt wird.
-
Das
vorliegende Beispiel zeigt, dass die β2ARs das Ziel der intrazellulären βarr2-GFP-Konjugat-Proteine
sind. HEK-239-Zellen, welche mit 12CA5(HA) markierte β2AR-Rezeptoren
enthalten, wurden untersucht. Die Rezeptoren der HEK-293-Zellen
waren durch Vernetzung mit einem monoklonalen Maus-Antikörper, der
auf ein N-terminales Epitop gerichtet war, gefolgt von einem mit
Texas Rot konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper, reorganisiert. In 4 zeigen die drei Felder
von Zeile A die gleiche HEK-293-Zelle mit βAR2-Rezeptoren, die in Plasmamembran-Clustern reorganisiert
sind.
-
HEK-239-Zellen
wurden dann einem Agonisten (Isoproterenol, das wie oben dem Zellmedium
zugefügt
wurde); die drei Felder von Zeile B in 4 wurden nach der Agonist-Zugabe nacheinander
aufgenommen (von links nach rechts bei 0, 3 und 10 Minuten nach
der Agonist-Zugabe). Die Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP
auf die Rezeptoren über einen
Zeitraum von zehn Minuten ist dadurch mittels Vergleich der Felder
der Zeile A und der Zeile B von 4 gezeigt.
In 4 zeigen Pfeile Bereiche
von Colokalisation an und der Maßstab = 10 Mikron.
-
4 veranschaulicht, dass
die Geometrie der Agonist-induzierten, zeitabhängigen Translokation von βarr2- GFP zur Plasmamembran
die Weiterverteilung von voraggregierten β2ARs imitiert. Dadurch wird
angezeigt, dass die primäre
Stelle, auf die β-Arrestin
gerichtet ist, β2AR
oder eine damit nahe verbundene Komponente ist.
-
BEISPIEL 7
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Intrazelluläres βarr2-GFP
ist auf Membran-Rezeptoren gerichtet
-
Es
ist postuliert worden, dass die Phosphorylierung von GPCRs mittels
GRKs die Desensibilisierung durch Erhöhung ihrer Affinität für β-Arrestine
erleichtert. Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 16879 (1993);
Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 11628–11638 (1993); Ferguson et
al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: 1095 (1996). Wenn sie in HEK-293-Zellen
exprimiert werden und einem Agonist ausgesetzt werden, werden mutante Y326A-β2ARs durch
endogene GRKs nicht signifikant phosphoryliert. Barak et al., Biochem.
34: 15407 (1995); Ferguson et al., J. Biol. Chem. 270: 24782 (1995).
Diese Phosphorylierungs-Abschwächung
in Y326A-βAR2s
wird durch die Überexpression
von GRKs in der gleichen Zelle umgekehrt. Menard et al., Biochem.
35: 4155 (1996). Der mutante Y326A-Rezeptor wurde verwendet, um
die β-Arrestin-Affinität in vivo
zu untersuchen; der Effekt von überexprimiertem GRK
auf die Y326A-β2AR-Wechselwirkung mit βarr2-GFP
wurde gezeigt.
-
Y326A-β2AR und βarr2-GFP
wurden in HEK-239-Zellen, in Abwesenheit und Anwesenheit von cotransfiziertem
GRK, cotransfiziert. Wenn die Phosphorylierung von GPCRs durch GRKs
die Desensibilisierung durch die Erhöhung ihrer Affinität für β-Arrestine
erleichtert, dann würde
die Überexprimierung
GRK in einem merklichen Unterschied der βarr2-GFP Translokation resultieren.
-
5 zeigt den Einfuß von überexprimiertem
GRK auf die Wiederverteilung von βarr2-GFP
in HEK-293-Zellen, welche das durch Y326A phosphorylierungsabgeschwächte β2AR enthalten.
Zellen ohne (Zeile A) und mit (Zeile B) überexprimierten GRKs wurden
einem Agonisten ausgesetzt und es wurde die Echtzeit-Wiederverteilung
von βarr2-GFP beobachtet.
Ohne hinzugefügten
GRK, schritt, wie es in Zeile A von 5 gezeigt
wird, die βarr2-GFP-Translokation als
Antwort auf den Agonisten schlecht voran. Die βarr2-GFP-Translokation in Zellen,
welche überexprimierten
GRK (Zeile B) enthielten, war stabiler, was eine erhöhte Rezeptor-Affinität von βarr2-GFP
und den Zusammenhang zwischen Phosphorylierung und β-Arrestin-Aktivität anzeigt.
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BEISPIEL 8
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Untersuchung zusätzlicher
Rezeptoren in der β2AR/Rhodopsin-Unterfamilie
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Es
sind zwölf
verschiedene Mitglieder der β2AR/Rhodopsin-Unterfamilie
von GPCRs untersucht worden. Zellen, welche einen speziellen GPCR exprimieren
und chimäre β-Arrestin-GFP-Proteine enthalten,
wurden einem bekannten Agonisten ausgesetzt um den GPCR zu untersuchen.
In allen Fällen
wurde innerhalb von Minuten nach der Zugabe des GPCR-Agonisten eine
sichtbare Translokation der chimären β-Arrestin-GFP-Proteine
vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran hervorgerufen (die Daten werden
nicht gezeigt).