DE69822484T2

DE69822484T2 - Methoden zur bestimmung der rezeptoraktivität und dafür verwendbare konstrukte

Info

Publication number: DE69822484T2
Application number: DE1998622484
Authority: DE
Inventors: S. Lawrence BARAK; G. Marc CARON; S. Stephen FERGUSON; Jie Zhang
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: AU759347B2; DE69822484D1; AU7725598A; US20080261256A1; EP1015608B1; US20040101887A1; US20060188944A1; DE1015608T1; ES2182736T1; WO1998055635A1; EP1441032B1; EP1015608A1; DK1015608T3; US5891646A; ATE482276T1; ES2182736T3; PT1015608E; US7138240B2; DE69841908D1; ATE262040T1

Description

STAATLICH GEFÖRDERTE FORSCHUNG
Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Bewilligungsnummern HLO3422-02 und NS 19576 des National Institute of Health gemacht. Die Regierung besitzt an dieser Erfindung gewisse Rechte.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von G-Protein-gekoppelter Rezeptor-Aktivität (GPCR) in vivo und in vitro und stellt Verfahren zur Bewertung von GPCR-Aktivität und Verfahren zum Screenen auf GPCR-Liganden, G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase-Aktivität (GRK) und Verbindungen bereit, welche mit Komponenten des GPCR-Regulationsvorgangs wechselwirken. Diese Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in solchen Verfahren einsetzbar sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Wirkungen vieler extrazellulärer Signale werden durch die Wechselwirkungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und Guanin-Nukleotid-bindenden Regulatorproteinen (G-Proteine) vermittelt. G-Protein-vermittelte Signalsysteme sind in vielen divergenten Organismen, wie Säugetieren und Hefe, identifiziert worden. GPCRs antworten, neben anderen extrazellulären Signalen, auf Neurotransmitter, Hormone, Gerüche und Licht. GPCRs ähneln einander und besitzen eine Anzahl hoch konservierter Aminosäuren: Man glaubt, dass die GPCRs eine große 'Superfamilie' von Proteinen darstellen. Individuelle GPCR-Typen aktivieren einen speziellen Signaltransduktionsweg; bei wenigstens zehn verschiedenen Signaltransduktionswegen ist bekannt, dass sie über GPCRs aktiviert werden. Zum Beispiel ist der beta-2-adrenerge Rezeptor (βAR) ein Prototyp für einen Säugetier-GPCR. Als Antwort auf eine Agonist-Bindung aktivieren βAR-Rezeptoren ein G-Protein (G_S), welches wiederum Adenylatcyclase und die Produktion von zyklischem Adenosinmonophosphat in der Zelle stimuliert.
Es ist postuliert worden, dass Mitglieder der GPCR-Superfamilie über einen allgemeinen Mechanismus, welcher die G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase-Phosphorylierung (GRK), gefolgt von der Arrestin-Bindung einschließt, desensibilisieren. Gurevich et al., J. Biol. Chem. 270: 720 (1995); Ferguson et al., Can. J. Physiol. Pharmacol., 74: 1095 (1996). Jedoch war die Lokalisierung und die Quelle des Pools von Arrestin-Molekülen, die als Antwort auf Agonist-Aktivierung auf Rezeptoren gerichtet sind, unbekannt. Darüber hinaus wurde außer für eine begrenzte Zahl von Rezeptoren keine allgemeine Funktion für β-Arrestin in der GPCR-Densibilisierung ermittelt. Die Funktion von β-Arrestinen in der GPCR-Signaltransduktion wurde erstmals aufgrund biochemischer Beobachtungen postuliert.
Viele heute in Verwendung befindliche therapeutische Arzneimittel sind auf GPCRs gerichtet, weil diese vitale physiologische Antworten, einschließlich Vasodilation, Herzfrequenz, Bronchodilation, endokrine Sekretion und Darmperistaltik unterstützen. Siehe z. B. Lefkowitz et al., Ann. Rev. Biochem. 52: 159 (1983). GPCRs schließen die adrenergenen Rezeptoren (alpha und Beta) ein; Liganden von beta-ARs werden bei der Behandlung von Anaphylaxie, Schock, Hypertonie, Hypotonie, Asthma und anderen Zustände verwendet. Zusätzlich tritt die spontane Aktivierung von GPCRs dort auf, wo eine zelluläre GPCR-Antwort in Abwesenheit eines Liganden erzeugt wird. Erhöhte spontane Aktivität kann mittels Antagonisten des GPCR verringert werden (ein Verfahren, das als inverser Agonismus bekannt ist); solche Verfahren sind therapeutisch dort wichtig wo Krankheiten einen Anstieg der spontanen GPCR-Aktivität verursachen.
Bemühungen wie das Human Genom Projekt identifizieren neue GPCRs ('Orphan'-Rezeptoren), deren physiologische Funktionen und Liganden unbekannt sind. Es wird geschätzt, dass im menschlichen Genom mehrere Tausend GPCRs existieren. Durch die Sequenzierung von nur ungefähr 10% des menschlichen Genoms sind 250 GPCRs identifiziert worden; weniger als 150 waren mit Liganden verbunden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem detektierbaren Molekül, wobei das detektierbare Molekül in der Lage ist, intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen. Das detektierbare Molekül kann ein optisch detektierbares Molekül wie grün fluoreszierendes Protein sein. Das Konjugat kann ein Fusionsprotein sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegende Erfindung ist ein Nukleinsäure-Konstrukt, welches eine Expressions-Cassette umfasst. Das Konstrukt schließt von der 5'- zur 3'-Richtung einen Promotor und ein Nukleinsäuresegment ein, das wirksam mit dem Promotor verbunden ist und das ein Nukleinsäuresegment, das ein β-Arrestin-Protein und ein detektierbares Molekül kodiert, wobei das detektierbare Molekül imstande ist, intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen. Das detektierbare Molekül kann ein optisch detektierbares Molekül wie grün fluoreszierendes Protein sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Wirts-Zelle, welche ein Nukleinsäure-Molekül einschließt, welches einen Promotor, der in der Wirts-Zelle wirksam ist, und eine Nukleinsäuresequenz einschließt, die ein β-Arrestin-Protein und ein detektierbares Molekül kodiert, wobei das detektierbare Molekül imstande ist, die intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen. Das detektierbare Molekül kann ein optisch detektierbares Molekül, wie grün fluoreszierendes Protein sein. Die Zelle kann eine Säuge tier-, Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle sein und kann auf einem Substrat aufgebracht sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bewertung von G-Protein-gekoppelter Rezeptor-Stoffwechsel-Aktivität (GPCR) unter Versuchsbedingungen, durch Bereitstellung einer Testzelle, welche einen GPCR exprimiert und welche ein Konjugat eines β-Arrestin-Proteins und ein visuell detektierbares Molekül enthält; Exposition der Testzelle mit einem bekannten GPCR-Agonist unter Versuchsbedingungen und dann detektieren der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Testzelle zum Membranrand der Testzelle. Die Translokation des detektierbaren Moleküls in der Testzelle zeigt die Aktivierung des GPCR-Stoffwechsels an. Beispielhafte Versuchsbedingungen schließen die Anwesenheit einer Test-Kinase und/oder eines G-Test-Proteins in der Testzelle, die Exposition der Testzelle mit einem Test-Liganden oder die Co-Expression eines zweiten Rezeptors in der Testzelle ein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfahren ist ein Verfahren zum Screenen eines β-Arrestin-Proteins (oder eines Fragments eines β-Arrestin-Proteins) auf die Befähigung einen phosphorylierten GPCR zu binden. Es wird eine Zelle bereitgestellt, die einen GPCR und ein Konjugat eines β-Arrestin-Test-Proteins und ein visuell detektierbares Molekül enthält. Die Zelle wird einem bekannten GPCR-Agonisten ausgesetzt und dann wird die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Zellrand detektiert. Die Translokation des detektierbaren Moleküls zeigt an, dass das β-Arrestin-Molekül in der Testzelle an phosphorylierten GPCR binden kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf die Agonist-Aktivität von G-Protein-gekoppeltem Rezeptor (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche einen GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β- Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren Molekül enthält. Die Zelle wird einer Testverbindung ausgesetzt und die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand detektiert. Die Bewegung des detektierbaren Moleküls zum Membranrand nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung zeigt GPCR-Agonist-Aktivität der Testverbindung an. Die Testzelle kann einen bekannten GPCR oder eine Auswahl bekannter GPCRs exprimieren oder einen unbekannten GPCR oder eine Auswahl unbekannter GPCRs exprimieren. Der GPCR kann beispielsweise ein Geruchs-GPCR oder ein β-adrenerger GPCR sein. Die Testzelle kann eine Säugetier-, Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Pflanzen oder Tierzelle sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen einer Probelösung auf die Anwesenheit eines Agonisten für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche einen GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren Molekül enthält. Die Testzelle wird einer Probelösung ausgesetzt und die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle bestimmt. Die Bewegung des detektierbaren Moleküls zum Membranrand nach der Exposition der Probelösung zeigt an, dass die Probelösung einen Agonist für einen in der Zelle exprimierten GPCR enthält.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum screenen einer Testverbindung auf Antagonist-Aktivität von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR). Es wird eine Zelle bereitgestellt, welche einen GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren Molekül enthält. Die Zelle wird einer Testverbindung und einem GPCR-Agonisten ausgesetzt und die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle detektiert. Wenn die Exposition mit dem Agonisten zur gleichen Zeit wie die Exposition mit der Testverbindung geschieht oder auf diese folgt, zeigt die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand nach der Exposition mit der Testverbindung an, dass die Testverbindung kein GPCR-Antagonist ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf Antagonist-Aktivität von G-Protein-gekoppeltem Rezeptor (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche einen GPCR exprimiert und ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren Molekül enthält. Die Zelle wird einem GPCR-Agonist ausgesetzt, so dass die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle eintritt und die Zelle wird dann einer Testverbindung ausgesetzt. Wenn die Exposition des Agonisten vor der Exposition mit der Testverbindung stattfindet, zeigt die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Membranrand der Zelle zum Zytosol nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung an, dass die Testverbindung GPCR-Antagonist-Aktivität besitzt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen einer Zelle auf die Anwesenheit eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR). Es wird eine Testzelle bereitgestellt, welche ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbaren Molekül enthält. Die Testzelle wird einer Lösung ausgesetzt, welche einen GPCR-Agonisten enthält. Jede Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand wird detektiert; die Bewegung des detektierbaren Molekül vom Zytosol zum Membranrand nach der Exposition der Testzelle mit einem GPCR-Agonist zeigt an, dass die Testzelle einen GPCR enthält.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen einer Vielzahl von Zellen auf solche Zellen, welche einen G-Protein-gekoppelten Rezep tor (GPCR) enthalten. Eine Vielzahl von Testzellen, die ein Konjugat aus einem β-Arrestin-Protein und einem visuell detektierbares Molekül enthalten, werden bereitgestellt und die Testzellen werden einem bekannten GPCR-Agonisten ausgesetzt. Zellen, in welchen das detektierbare Molekül vom Zytosol zum Membranrand translokalisiert ist, werden identifiziert oder detektiert. Die Bewegung des detektierbaren Moleküls zum Membranrand nach Exposition mit einem GPCR-Agonist zeigt an, dass die Zelle einen GPCR enthält, welcher auf diesen GPCR-Agonisten anspricht. Die Vielzahl von Testzellen können in einem Gewebe, einem Organ oder einem intakten Tier enthalten sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Substrat, auf welches eine Vielzahl von Zellen aufgebracht ist, die einen GPCR exprimieren und die ein markiertes β-Arrestin-Protein enthalten, wobei die Markierung geeignet ist, die intrazelluläre Translokation und/oder die Verteilung des Arrestins anzuzeigen. Solche Substrate können aus Glas, Kunststoff, Keramik, Halbleitern, Silizium, Glasfaser, Diamant, biokompatiblen Monomer- oder biokompatiblen polymeren Materialien hergestellt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein lineares Model des Konjugats aus β- Arrestin-2/S65T-grün-fluoreszierendes-Protein (GFP).
2A stellt die Ergebnisse eines Western-Blots von Homogenaten von HEK-293-Zellen bereit, welche das βarr2-GFP-Konjugat wie auch endogenes β-Arrestin-2 exprimieren. βarr2 kennzeichnet endogenes zelluläres β-Arrestin-2; βarr2-GFP kennzeichnet β-Arrestin-2-GFP-Konjugat; die ungefähren Molekulargewichte werden auf der rechten Seite des Gels angezeigt. Bahn 1 wurde mit anti-β-Arrestin-Antikörper behandelt; Bahn 2 mit anti-GFP-Antikörper.
2B zeigt die Komplexbildung von β2AR in COS-Zellen mit und ohne überexprimiertes β-Arrestin-2 (die beiden linken Balken) und mit und ohne überexprimiertes βarr2-GFP (die beiden rechten Balken). Wildtyp-β-Arrestin und βarr2-GFP erhöhen gleichermaßen die Komplexbildung von β2AR über das Niveau der Kontrolle, wobei sie einen 2,5- beziehungsweise 2,4-fachen Abstieg hervorrufen.
3A: Die Mikroaufnahmen eines konfokalen Mikroskops zeigen die βarr2-GFP-Translokation vom Zytosol (Feld 1, links) zur Membran (Feld 2, rechts) in HEK-293-Zellen, welche das β2AR, aufgrund der Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol enthalten. Maßstab = 10 Mikron.
3B: Die Mikroaufnahmen eines konfokalen Mikroskops zeigen βarr2-GFP-Translokation vom Zytosol (Feld 1, links) zur Membran (Feld 2, rechts) in COS-Zellen, welche das β2AR aufgrund der Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol enthalten. Maßstab = 10 Mikron.
4 stellt eine HEK-293-Zelle dar, welche mit 12CA5(HA) markiertes β2AR enthält (Mikroaufnahmen eines konfokalen Mikroskops). Zeile A zeigt eine Zelle nach der Reorganisation von β2AR in Plasmamembran-Cluster. Zeile B stellt drei Bilder der gleichen Zelle bei 0, 3 und 10 Minuten (von links nach rechts) nach der Zugabe von Agonist bereit. Die Weiterverteilung von βarr2-GFP zu der Zellmembran ist durch die Erhöhung der Membran-Fluoreszenz mit einem begleitenden Verlust an zytosolischer Fluoreszenz gezeigt. Pfeile kennzeichnen Bereiche von Colokalisation; Maßstab = 10 Mikron.
5 zeigt den Einfuß von überexprimiertem GRK auf die Weiterverteilung von βarr2-GFP in HEK-293-Zellen, welche das durch Y326A in der Phosphorylierung verminderte β2AR exprimieren. Zellen ohne (Reihe A) und mit (Reihe B) überexprimierten GRKs wurden einem Agonist ausgesetzt und die Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP wurde beobachtet. Die βarr2-GFP-Translokation in Zellen, welche einen überexprimierten GRK (Reihe B) enthalten, waren stabiler, wodurch eine erhöhte Affinität von βarr2-GFP auf einen Rezeptor angezeigt wird. Maßstab = 10 Mikron.
6A stellt die Agonist-induzierte, zeitabhängige Translokation von βarr2-GFP zu beta2-adrenergenen Rezeptoren in einer repräsentativen HEK-293-Zelle dar.
Die Graphen der 6B zeigen den Zeitverlauf der Agonist-induzierten Translokation von βarr2-GFP zu beta2-adrenergenen Rezeptoren in HEK-293-Zellen; dieser Graph ist quantitativ und basiert auf der Antwort einer Vielzahl von Zellen.
6C stellt die Agonist-induzierte Translokation von βarr2-GFP zu beta-2-adrenergenen Rezeptoren in repräsentativen HEK-293-Zellen, bei variierenden Agonist-Dosen, dar.
Die Graphen der 6D stellen die dosiabhängige, Agonist-induzierte Translokation von βarr2-GFP zu beta-2-adrenergenen Rezeptoren in HEK-293-Zellen dar; Dieser Graph ist quantitativ und basiert auf der Antwort einer Vielzahl von Zellen.
6E evaluiert die Translokation von βarr2-GFP vom Zytosol der Zelle zur Zellemembran als Antwort auf die Exposition mit Rezeptor-Agonist (mittleres Feld) und im Anschluss an die Exposition mit Rezeptor-Antagonist (rechtes Feld).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben ermittelt, dass die β-Arrestin-Weiterverteilung vom Zytosol zur Plasmamembran als Antwort auf die Agonist-Aktivierung von GPCRs eintritt. Die Erfinder haben eine allgemeine Funktion des β-Arrestins in der Agonist-vermittelten Signaltransduktions-Termination, gefolgt von Agonist-Aktivierung von Rezeptoren demonstriert. Die Erfinder haben geeignete Verfahren zur Untersuchung von Agonist-Stimulation von GPCRs in vivo und in vitro in Echtzeit entwickelt. Obwohl sich die Pharmakologie der Mitglieder der GPCR-Superfamilie unter scheidet, nutzen die erfindungsgemäßen Verfahren die β-Arrestin-Translokation um eine Einzelschritt-, Echtzeit-Bewertung der GPCR-Funktion für mehrere, verschiedene Mitglieder der GPCR-Superfamilie. Die vorliegenden Verfahren können zusätzlich bei der Untersuchung und zum Verständnis der Wirkmechanismen verschiedener therapeutischer Mittel eingesetzt werden. Die Erfinder haben ermittelt, dass ein Protein-Konjugat oder eine Chimäre, welche ein Arrestin-Molekül und ein detektierbares Molekül (wie grün fluoreszierendes Protein) umfassen, in solchen Verfahren der Bewertung von In-vivo-GPCR-Aktivität nutzbar sind.
Aufgrund der therapeutischen Bedeutung von GPCRs sind Verfahren zum schnellen Screenen von Verbindungen auf GPCR-Ligand-Aktivität wünschenswert. Zusätzlich unterstützen Verfahren zum Screenen von Orphan-GPCRs auf Wechselwirkungen mit bekannten und putativen GPCR-Liganden die Charakterisierung solcher Rezeptoren. Es sind optische Verfahren zur Untersuchung der Dynamik markierter Proteine intakten Zellen verfügbar, einschließlich Video-Mikroskopie, Fluoreszenzerholung nach Photobleichung und Resonanzenergietransfer. Jedoch besitzen solche Verfahren aufgrund der relativ niedrigen Niveaus der GPCR-Expression und der Änderung der Rezeptor-Funktion, die nach dem Tagging oder Markieren des Rezeptor-Proteins eintritt, begrentzte Nützlichkeit bei der Markierung von GPCRs für Untersuchungen. Beim Screenen auf GPCR-Liganden sind auch radioaktive Markierungen oder Fluoreszenzmarkierungen von Test-Liganden eingesetzt worden. Siehe z. B. Atlas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5490 (1977); US-Patent Nr. 5576436 von McCabe et al. (alle zitierten Patente werden hierin in ihrer Gesamtheit einbezogen). Die Einführung fremder Epitope in Rezeptor-cDNA, um Hybrid-GPCRs zu erzeugen, ist heute eine Standard-Technik und erhöht die Detektion von GPCRs durch die Technologie monoklonaler Antikörper. Jedoch sind solche Techniken ihrer Anwendbarkeit bei lebenden Zellen eingeschränkt. Das US-Patent Nr. 5284746 von Sledziewski beschreibt Hefe-Säugetier-Hybrid-GPCRs und Verfahren zum Screenen auf GPCR-Liganden unter Verwendung solcher Hybrid-Rezeptoren. Das US-Patent Nr. 5482835 von King et al. beschreibt Verfahren zum Untersuchen auf Liganden von Säugetier-GPCRs in Hefezellen. Jedoch erfordert die Anwendung dieser Techniken der Untersuchung oder Identifizierung von Orphan-GPCRs vorheriges Wissen über die Liganden oder die Signaltransduktions-Ereignisse und sie sind deshalb nicht allgemein oder universell einsetzbar.
Die Phosphorylierung von GPCRs ist ein Mechanismus, der zur Desensibilisierung der Rezeptoren führt; Rezeptoren, die kontinuierlich oder wiederholt stimuliert worden sind, verlieren ihre Reaktionsfähigkeit, wohingegen die Reaktionsfähigkeit anderer Rezeptoren intakt bleibt. Siehe Harden, Pharmacol. Rev. 35: 5 (1983); Benovic et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 4: 405 (1988). Bei einer Auswahl von Zellen haben sich spezifische Kinasen für spezifische GPCRs entwickelt. Die Desensibilisierung geschieht auf folgendem Weg: die Agonist-Besetzung des Rezeptors transformiert den Rezeptor in ein entsprechendes Substrat für eine assoziierte Kinase; β-Arrestin bindet an den phosphorylierten Kinase-Rezeptor und verhindert die nachfolgende Wechselwirkung mit dem entsprechende G-Protein wie auch die Einleitung sowohl des Internalisierungs- als auch des Resensibilisierungsprozesses. Ferguson et al., Science, 271: 363 (1996); Lohse et al., Science 248: 1547 (1990). Die β-Arrestin-abhängige Desensibilisierung wird nur induziert, wenn der GPCR durch Ligand-Bindung aktiviert ist und ist ein Beispiel homologer Desensibilisierung (d. h. der Ligand desensibilisiert nur seine Ziel-Rezeptoren). Lohse et al. (1990) und Attramadal et al., J. Biol. Chem. 267: 17882 (1992) stellen cDNA- und Aminosäuresequenzen von β-Arrestin bereit. Es sind verschiedene Isoformen von β-Arrestin bekannt; wie hierin verwendet bezieht sich β-Arrestin auf alle diese Isoformen von β-Arrestin, Proteine, welche im Wesentlichen eine mit diesem übereinstimmende Sequenz haben und welche funktionale β-Arrestine sind und dessen funktionale Fragmente. Funktionale Fragmente von β-Arrestin, dessen Isoformen und Analoge können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren ermittelt werden.
Mittels spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunochemischer, elektrischer und optischer Mittel detektierbare Moleküle sind bekannt. Optisch detektierbare Moleküle schließen Fluoreszenzmarker wie kommerziell erhältliches Fluorescein und Texas Rot ein. Detektierbare Moleküle, die erfindungsgemäß geeignet sind, schließen jedes biologisch kompatible Molekül ein, welches mit einem β-Arrestin-Protein konjugiert sein kann, ohne die Befähigung von β-Arrestin zu beeinträchtigen, mit dem GPCR-System zu wechselwirken und ohne die Befähigung des detektierbaren Moleküls, detektiert zu werden, zu beeinträchtigen. Konjugierte Moleküle (oder Konjugate) aus β-Arrestin und detektierbaren Molekülen (die auch als 'detektierbar markierte β-Arrestine' bezeichnet werden können) sind deshalb erfindungsgemäß geeignet. Bevorzugt sind detektierbare Moleküle, die in der zu untersuchenden Zelle synthetisiert werden können (z. B. dort, wo die Zelle mit heterologer DNA transformiert werden kann, so dass das Chimäre aus β-Arrestin und detektierbarem Molekül innerhalb der Zelle erzeugt wird). Insbesondere bevorzugt sind solche detektierbaren Moleküle, die in vivo inhärent fluoreszieren. Geeignete detektierbare Moleküle müssen in der Lage sein, mit ausreichender Auflösung innerhalb einer Zelle detektierbar zu sein, so dass die Translokation von β-Arrestin vom Zytosol zur Zellmembran als Antwort auf die Agonist-Bindung an einen GPCR qualitativ oder quantitativ festgestellt werden kann. Mittels optischer Mittel detektierbare Moleküle sind gegenwärtig bevorzugt.
Fusionsproteine mit kodierenden Sequenzen für Beta-Galactosidase, Firefly-Luciferase und bakterielle Luciferase sind in Verfahren zur Detektion von Genexpression und Protein-Wechselwirkungen in Zellen verwendet worden. Diese Verfahren erfordern jedoch exogen hinzugefügte Substrate oder Cofaktoren. In den erfindungsgemäßen Verfahren ist ein inhärent fluoreszierendes Marker-Molekül, wie GFP, bevorzugt, weil die intrazelluläre Detektion eines solchen Markers nur die Bestrahlung mit Licht entsprechender Wellenlänge erfordert und nicht Substrat-limitiert ist.
Grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurde zuerst aus der Qualle Aequorea victoria isoliert und besitzt eine inhärente grüne Biolumineszenz, die optisch mittels blauem Licht oder nicht-strahlendem Energie-Transfer angeregt werden kann. Die Sequenzen von GFP-kodierender cDNA und GFP-Proteinen sind bekannt; siehe z. B. Prasher et al., Gene, 111: 229 (1992). Die kristalline Struktur von GFP ist in Ormo et al., Science 273: 1392 (1996) beschrieben worden. Gereinigtes natürliches GFP absorbiert blaues Licht (maximal bei 395 nm mit einem Nebenmaximum bei 470 nm) und emittiert grünes Licht (Emissionsmaximum bei 509 nm) (Morise et al., Biochemistry, 13: 2656 (1974); Ward et al., Photochem. Photobiol., 31: 611 (1980)). Es wurde gezeigt, dass in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen exprimiertes GFP eine starke grüne Fluoreszenz entwickelt, wenn es mittels nahem UV- oder blauem Licht angeregt wird (siehe US-Patent Nr. 5491084 von Chalfie und Prasher); da diese Fluoreszenz keine zusätzlichen Genprodukte von A. victoria erfordert, ist die Chromophor-Bildung nicht speziesspezifisch und geschieht entweder durch den Einsatz ubiquitärer zellulärer Komponenten oder mittels Autokatalyse. Die Expression von GFP in Eschericha coli resultiert in einer leicht zu detektierenden grünen Fluoreszenz, die in Kontroll-Bakterien nicht gesehen wird. Siehe Chalfie et al., Science 263: 802 (1994); US-Patent Nr. 5491084. Zellen, welche grün-fluoreszierende Proteine exprimieren, können mittels eines fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierers bequem von jenen abgetrennt werden, die das Protein nicht exprimieren.
Wie hierin verwendet bezieht sich grün fluoreszierendes Protein auf die verschiedenen, natürlich vorkommenden Formen von GFP, welche aus natürlichen Quellen isoliert werden können, wie auch künstlich modifizierte GFPs, welche die Fluoreszenzeigenschaften von natürlichem GFP beibehalten. Wie in Ormo et al., Science 273: 1392 (1996), diskutiert, sind verschiedene Mutanten von GFP, mit veränderten Anregungs- und Emissionsmaxima erzeugt worden. Zwei Eigenschaften von Wild-Typ-GFP, welche dessen Verwendbarkeit in Säugetier-Zell-Linien beeinflussen, sind die Notwendigkeit dieses bei UV-Wellenlängen anzuregen, um ein maximales Fluoreszenzsignal zu erhalten und die verminderte Fluoreszenz bei Temperaturen über 23°C. Jedoch überwindet der S65T/GFP-Mutant diese Beschränkungen. Heim et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 12501 (1994). Zusätzliche Veränderungen in der GFP-Proteinsequenz, welche inhärent fluoreszierende, biologisch kompatible Moleküle bereitstellen, werden dem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein; es können Änderungen der Sequenz durchgeführt werden, um die Löslichkeitseigenschaften des Proteins, seine Anregungswellenlänge oder andere Eigenschaften zu verändern, während die nützlichen Fluoreszenzeigenschaften erhalten bleiben. Siehe z. B. US-Patent 5625048 von Tsien und Heim; WO 9711091 (Bjorn, Poulsen, Thastrup und Tullin); WO 9627675 (Haseloff, Hodge, Prasher und Siemering); WO 9627027 (Ward); WO 9623898 (Bjorn et al.); WO 9623810 (Heim und Tsien); WO 9521191 (Chalfie und Ward).
Zellen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, schließen eukaryotische und prokaryotische Zellen ein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Bakte rienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Insektenzellen, Nematodenzellen, Pflanzen- oder Tierzellen. Geeignete Tierzellen schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, HEK-Zellen, HeLa-Zellen, COS-Zellen und verschiedene primäre Säugetierzellen. Zellen, die in intakten Tieren enthalten sind, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Nematoden, Zebrafisch (und andere transparente oder semi-transparente Tiere) und Fruchtfliegen, können auch in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Ein Tier-Modell, welches ein Fusionsprotein aus β-Arrestin und einem detektierbaren Molekül überall in seinen Geweben oder innerhalb eines bestimmten Organs oder Gewebe-Typ exprimiert, wird bei der Untersuchung zellulärer Targets bekannter oder unbekannter GPCR-Liganden, von Nutzen sein.
Zellen, die in den vorliegenden Verfahren nützlich sind, schließen jene ein, welche einen bekannten GPCR oder eine Auswahl bekannter GPCRs exprimieren oder welche einen unbekannten GPCR oder eine Auswahl unbekannter GPCRs exprimieren. Wie hierin verwendet, ist eine Zelle, welche einen GPCR exprimiert, eine Zelle, welche diesen GPCR als einen funktionalen Rezeptor in ihrer Membran enthält; die Zellen können den beziehungsweise die interessierenden GPCR(s) natürlich exprimieren oder können gentechnisch hergestellt sein, um den beziehungsweise die interessierenden GPCR(s) zu exprimieren. Wie hierin verwendet ist ein 'unbekannter' oder 'Orphan'-Rezeptor einer, dessen Funktion unbekannt ist und/oder dessen Liganden unbekannt sind.
Die vorliegenden Versuche
Grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist verwendet worden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu untersuchen. Siehe Kaether & Gerdes, FEBS Lett. 369: 267 (1995); Olson et al., J. Cell. Biol. 130: 639 (1995). Grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist aufgrund seiner inhärenten Fluoreszent und seiner Faltung, welche es offensichtlich von seinen konjugierten Partnern isoliert, als Reporter-Molekül für Fusionsproteine geeignet. Prasher et al., Gene 111: 229 (1992); Ormo et al., Science 273: 1392 (1996). Beispielsweise zeigt ein Sieben-Transmembran-Protein, das so komplex ist wie das β2AR, welches dreimal so groß ist wie GFP, nach der GFP-Konjugation an seinen C-Terminus normale Biochemie. Barak et al., Mol. Pharmacol. 51: 177 (1997).
Die Erfinder haben festgestellt, dass ein Fusionsprotein, welches aus einem β-Arrestin-Molekül (β-Arrestin-2) besteht, das an seinem C-Terminus mit einem GFP konjugiert ist (βarr2-GFP, 1), in Zellen exprimiert wird und biologisch aktiv ist. Das βarr2-GFP-Fusionsprotein ist ungefähr um 50% größer als β-Arrestin-2 und diese Erhöhung der Größe wird durch seine langsamere Migration auf SDS-Page (2A) widergespiegelt. Die linke Bahn von 2A, die einem Antikörper gegen β-Arrestin ausgesetzt wurde, zeigt, dass βarr2-GFP langsamer läuft als endogenes β-Arrestin-2 (hervorgehobenes mittlere Bande). Die rechte Bahn von 2A, die mit einem monoklonalen anti-GFP-Antikörper behandelt wurde, zeigt, dass die langsamere Bande tatsächlich GFP enthält.
Gewöhnlich komplexiert β2AR schlecht in COS-Zellen und das wurde mit der relativ schwachen Expression von endogenem β-Arrestinen in COS-Zellen in Zusammenhang gebracht. Menard et al., Mol. Pharmacol. 51: 800 (1997); Zhang et al., J. Biol. Chem. 271: 18302 (1996). Die Überexpression von exogenem β-Arrestin erhöht die β2AR-Komplexierung in diesen Zellen; ähnlich wie hierin gezeigt, steigert die βarr2-GFP-Überexprimierung in COS-Zellen die β2AR-Internalisierung (2B), wodurch nachgewiesen wird, dass βarr2-GFP biologisch aktiv und äquivalent zu nativem β-Arrestin ist.
Biochemische Beweise zeigen, dass β-Arrestine vorwiegend zytosolische Proteine sind. Ferguson et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: 1095 (1996). Die Erfinder haben unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie an βarr2-GFP in HEK-293-Zellen (3A, linkes Feld) bestätigt, dass βarr2-GFP im gesamten Zytosol verteilt ist und vom Kern ausgeschlossen ist. Die vorliegenden Daten weisen zum ersten mal auch nach, dass β-Arrestin in Abwesenheit von einem Agonisten nicht vorwiegend an der Plasmamembran verteilt ist, aber dass in Abwesenheit eines Agonisten, durch die Zugabe von Sättigungskonzentrationen eines Agonisten zum Zellmedium β-Arrestin vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran translokalisiert wird. Dort wo β-Arrestin, wie hierin gezeigt, mit einem optisch detektierbaren Molekül wie GFP konjugiert ist, tritt eine schnelle, leicht beobachtbare optische Verstärkung der Membran und ein damit einhergehender Verlust zytosolischer optischer Signale auf (siehe die 3A und 3B, worin aufgrund der Translokation des β-Arrestin-GFP-Chimären die Membran-Fluoreszenz erhöht ist und die Zytosol-Fluoreszenz erniedrigt ist).
Um zu untersuchen, ob die intrazelluläre Translokation von β-Arrestin auf andere Bindungsstellen als β2AR in der Plasmamembran gerichtet ist, haben die Erfinder zuerst die Rezeptoren unter Verwendung monoklonaler Antikörper vernetzt. Wie hierin berichtet und in 4 gezeigt imitierte die Geometrie der Agonist-induzierten zeitabhängigen Translokation von β-Arrestin zur Plasmamembran die Verteilung von preaggregierten β2ARs, wodurch angezeigt wird, dass die Stelle von β-Arrestin, auf die abgezielt wird, tatsächlich β2AR oder eine assoziierte Komponente ist.
Es ist postuliert worden, dass die Phosphorylierung von GPCRs mittels GRKs die Desensibilisierung durch die Erhöhung ihrer Affinität für β-Arrestine erleichtert. Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 16879 (1993); Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 11628 (1993). Wenn sie in HEK-293-Zellen exprimiert werden und einem Agonisten ausge setzt werden, werden mutante Y326A-β2ARs durch endogene GRKs nicht wesentlich phosphoryliert (Ferguson et al., J. Biol. Chem., 270: 24782 (1995). Deshalb nutzten die Erfinder diesen Mutant-Rezeptor, um die obige Frage der β-Arrestin-Affinität in vivo zu untersuchen. Y326A-β2AR wurde mit βarr2-GFP in HEK-Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von cotransfizierter GRK cotransfiziert. Wenn die obige Hypothese wahr wäre, würde die Umkehrung der Phosphorylierungs-Verminderung durch überexprimierte GRKs in einem merklichen Unterschied in der βarr2-GFP-Translokation resultieren. Wie hierin berichtet schreitet ohne hinzugefügte GRK die βarr2-GFP-Translokation als Antwort auf einen Agonisten schwach voran; mit der Zugabe von GRK war die βarr2-GFP-Translokation zur Plasmamembran viel stärker (5), wodurch die Bedeutung der Phosphorylierung für die β-Arrestin-Aktivität angezeigt wird.
Die Erfinder ermittelten, dass die Translokation von β-Arrestin vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran ein Indikator für die Agonist-Stimulation der GPCR-Aktivität ist und dass ein chimäres Protein, welches β-Arrestin und das detektierbare Molekül GFP umfasst, in der Lage ist, detektierbar die Echtzeit-Translokation von β-Arrestin als Antwort auf Agonist-Aktivierung von GPCRs anzuzeigen.
Die hierin dargestellten Ergebnisse etablieren, dass β-Arrestin auf GPCRs oder ein assoziertes Molekül gerichtet ist, gefolgt von der Agonist-Bindung und der Rezeptor-Phosphorylierung. Diese Daten belegen ein biologisches Verhalten für β-Arrestin, dass nur aus biochemischen Untersuchungen postuliert worden ist und sie beschreiben zum ersten mal, wie sich die β-Arrestin-Kompartimentierung nach der Einleitung der Rezeptor-Signal-Transduktion verändert. Die Agonist-Aktivierung eines GPCR gipfelt schließlich in der Assoziierung von β-Arrestinen mit GPCRs und folglich stellt die Visualisie rung der Agonist-vermittelten β-Arrestin-Translokation einen universellen Indikator für GPCR-Aktivierung bereit.
Die Erfinder haben belegt, dass die GPCR-Signal-Transduktion einen schnellen, wesentlichen Anstieg der relativen und absoluten Menge an Plasmamembran-gebundenem β-Arrestin induziert. Die Agonist-vermittelte Umverteilung von β-Arrestin, das an ein detektierbares Molekül gekoppelt ist, stellt eine optische Amplifikation der extrazellulären Signale, transduziert durch GPCRs, bereit und diese tritt gleichzeitig mit oder innerhalb des gleichen Zeitfensters auf wie die chemische Amplifikation, die gewöhnlich durch Second-Messenger-Kaskaden, bereitgestellt wird. Chimäre aus β-Arrestin und einem detektierbaren Molekül sind zur Untersuchung von β-Arrestin-Kinetiken und mit GPCR in Beziehung stehendem Verhalten, wie Endozytose, geeignet. Zusätzlich sind solche Chimäre als Biosensoren zur Anzeige, dass GPCRs aktiviert werden, geeignet und stellen Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf GPCR-Aktivität und zum Screenen von Orphan-GPCRs auf Liganden-Responsivität bereit. Zusätzlich zeigt die Befähigung der cotransfizierten GRKs, sowohl die Geschwindigkeit als auch das Ausmaß der β-Arrestin-Translokation zu erhöhen, an, dass die vorliegenden Verfahren und Konstrukte auch zur Überwachung von GRK-Aktivität wie auch zum Überwachen von Arzneimitteln, Proteinen und Verbindungen zur Aktivierung oder Hemmung des GRK/β-Arrestin-Prozesses verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf GPCR-Agonist-Aktivität bereit, umfassend: a) Bereitstellung einer Zelle, welche einen bekannten oder unbekannten GPCR exprimiert und ein chimäres Protein enthält, das ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Protein umfasst; b) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung und c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle die Aktivierung des GPCR anzeigt und dementsprechend den GPCR-Aktivierungseffekt der Testverbindung. Die Translokation des chimären Proteins wird mittels eines Anstiegs der Intensität des detektierbaren Signals am Membranrand (und/oder eine Verminderung im Zytosol) nachgewiesen, wobei die Änderung nach der Exposition der Testverbindung auftritt. Die Translokation kann deshalb durch einen Vergleich der zeitlichen Änderungen des detektierbaren Signals in der gleichen Zelle (d. h. vor und nach der Exposition mit der Testverbindung) detektiert werden. Alternativ kann eine Testzelle mit einer Kontrollzelle (keine Exposition mit der Testverbindung) verglichen werden oder eine Testzelle kann mit einem bereits eingeführten Standard verglichen werden. Wenn ein bekannter Agonist verfügbar ist, kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um auf einen GPCR-Antagonisten zu screenen und diesen zu untersuchen. Zusätzlich sollte die Membran-Assoziation des β-Arrestins durch Expression eines Überschusses an Rezeptor oder mittels eines grundlegend aktiven GPCR, welcher sogar in Abwesenheit eines Agonisten durch GRKs Phosphorylierung erfährt, erhöht werden. Deshalb kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um auf inverse Agonisten von GPCRs zu prüfen.
Verfahren zur Detektion der intrazellulären Translokation des chimären Proteins werden von dem eingesetzten speziellen, detektierbar Protein abhängen; ein Durchschnittsfachmann wird aufgrund der Lehren der vorliegenden Beschreibung und dem Fachwissen leicht Detektionsverfahren entwerfen, die für spezielle, detektierbare Moleküle geeignet sind. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das visuell detektierbare Protein ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie hierin unten diskutiert wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen leicht detektierbare Ergebnisse bereit. Die Translokation des β- Arrestins, das an ein detektierbares Molekül wie GFP gekoppelt ist, als Antwort auf GPCR-Aktivierung, resultiert in einer relativen Erhöhung des detektierbaren Signals am Zellrand (d. h. an der Zellemembran). Zusätzlich bedeutet die begleitende Verminderung des detektierbaren Signals im Zytosol der Zelle, dass das 'Hintergrundrauschen' (detektierbare Signale, welche sich nicht als Antwort auf GPCR-Aktivierung ändern) minimiert ist. In bestimmten Zellen wird die Aktivierung von GPCRs in einem essentiellen Bleichen des detektierbaren Signals aus dem Zytosol und einem 100-fachen Anstieg (oder mehr) des detektierbaren Signals an der Zellemembran resultieren. In den vorliegenden Verfahren ist es bevorzugt, dass das detektierbare Signal am Membranrand nach GPCR-Aktivierung wenigstens auf das doppelte, stärker bevorzugt wenigstens auf das 3-fache und stärker bevorzugt wenigstens auf das 5-fache oder wenigstens auf das zehnfache ansteigt.
Wie hierin verwendet kann die Einführung eines chimären Proteins in eine Zelle durch Einführung einer Nukleinsäuresequenz oder eines Konstrukt (z. B. DNA oder RNA), welche das chimäre Protein kodiert, in die Zelle (oder in den Vorläufer der Zelle), und Kultivieren der Zelle in einer Umgebung, welche die Expression des chimären Proteins gestattet, durchgeführt werden. Die Einführung von Nukleinsäuren, welche das chimäre Protein kodieren oder die Einführung des Proteins selbst in eine Zelle kann mittels jedes der vielen geeigneten Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion und Liposom-Transport.
Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Konstrukt bereit, das einen Promotor, DNA, welche ein β-Arrestin-Protein kodiert, das mit diesem wirksam verbunden ist und DNA umfasst, welche ein visuell detektierbares Marker-Protein kodiert, welches damit wirksam verbunden ist. Der Promotor ist wirksam mit der kodierenden DNA verbunden: DNA, welche β-Arrestin kodiert, kann sich 5' von der DNA befinden, welche den visuell detektierbaren Marker kodiert, oder umgekehrt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kodiert die DNA, welche einen visuell detektierbaren Marker kodiert, ein grün fluoreszierendes Protein (GFP). Vektoren, welche solche DNA-Konstrukte umfassen, sind ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Konjugate bereit (wie chimäre Proteine oder Fusionsproteine), welche ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Protein enthalten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das visuell detektierbare Protein ein grün fluoreszierendes Protein (GFP).
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Zelle bereit, die ein DNA-Molekül umfasst, wobei dieses DNA-Molekül in der 5'- zu 3'-Richtung einen Promotor, DNA, welche ein damit wirksam verbundenes β-Arrestin-Protein kodiert und DNA umfasst, welche ein visuell detektierbares Marker-Protein kodiert, das damit wirksam verbunden ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kodiert die DNA, welche einen visuell detektierbaren Marker kodiert, ein grün fluoreszierendes Protein (GFP).
Die erfindungsgemäßen Zellen können verwendet werden, um die Anwesenheit spezifischer Moleküle in verschiedenen Arten von Proben zu detektieren, wie z. B. wässrige Proben, biologische Proben (zum Beispiel Blut, Urin oder Speichel), Proben aus der Umwelt oder industrielle Proben. Bei solchen Verwendungen enthalten die Zellen einen GPCR, dessen Agonisten bekannt sind. Die Aktivierung des GPCR und die begleitende Translokation des detektierbaren Signals vom Zytosol zum Membranrand zeigt die Anwesenheit eines Agonisten für den GPCR an. Eine Zelle, die in einem solchen Verfahren verwendet wird, kann nur einen einzelnen Typ eines bekannten GPCR oder eine Auswahl bekannter GPCRs enthalten. Eine solche Detektion wird für medizinische und tierärztliche diagnostische Zwecke, industrielle Zwecke und für das Screenen auf den Missbrauch von Arzneimitteln oder Chemikalien oder auf biologische Toxine, welche die GPCR-vermittelte Signal-Transduktion beeinflussen, nützlich sein.
Die erfindungsgemäßen Zellen können aufgebracht sein auf oder befestigt sein an, gehalten werden von oder immobilisiert sein auf einem Substrat. Das Substrat kann aus jedem geeigneten Material bestehen, das nicht schädlich oder nachteilig für darauf aufgebrachte lebende Zellen ist, das heißt, dass es biokompatibel mit den darauf aufgebrachten lebenden Material ist. Das Substrat kann steif, halb-steif oder flexibel sein und kann blickdicht, transparent, oder semi-transparent sein. Die Größe, Geometrie und andere physikalische Eigenschaften des Substrats werden durch die beabsichtigte Verwendung vorgegeben werden, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird. Geeignete Substrate schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Kunststoffe, Glas, Keramik, Silizium, biokompatible Monomer- und Polymer-Zusammensetzungen, Halbleitermaterialien, Glasfaser-Materialien, Polystyrole, Membrane, Sephadex und bioorganische Materialien. Beispiele biokompatibler Materialien werden auch in den US-Patenten Nr. 5578079, 5575997 und 5582834 von Leung und Clark und 5522896 von Prescott bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen auf die Anwesenheit eines GPCR-Agonisten in einer Lösung bereit, welches umfasst: a) Bereitstellung einer Zelle, welche einen bekannten oder unbekannten GPCR exprimiert und ein chimäres Protein enthält, welches ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Protein umfasst; b) Exposition der Zelle mit einer Testlösung und c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle die Aktivierung des GPCR und dementsprechend den GPCR-Agonist-Effekt der Testlösung anzeigt. Die Translokation des chimären Proteins wird nachgewiesen, wie es oben diskutiert wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen auf die Anwesenheit eines GPCR-Antagonisten in einer Lösung bereit, welches umfasst: a) Bereitstellung einer Zelle, welche einen GPCR exprimiert und ein chimäres Protein enthält, welches ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Protein umfasst; h) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung, dann c) Exposition der Zelle mit einem Agonisten für den in der Zelle exprimierten GPCR und d) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle. Wenn die Testverbindung einen Antagonisten enthält, wird die Translokation des detektierbaren Moleküls für einen Zeitraum verzögert, welcher der Dauer der Antagonist-Wirkung auf den Rezeptor entspricht (wobei der Zeitraum variieren wird, in Abhängigkeit vom Antagonisten und/oder Rezeptor). Die Translokation des detektierbaren Molekül vom Zytosol zum Membranrand der Zelle zeigt die Aktivierung des GPCR mittels des Agonisten an. Wenn die Translokation nicht eintritt oder verzögert ist (verglichen mit der, die in Abwesenheit der Testverbindung auftreten würde), enthält die Testverbindung dementsprechend einen Antagonisten für den GPCR. Abwesenheit oder Verzögerung der Translokation kann durch den Vergleich mit einer Kontrollzelle (die nicht der Testverbindung ausgesetzt wurde) oder mit einem vorher festgelegten Standard bewertet werden. Die Translokation des chimären Proteins wird nachgewiesen, wie es oben beschrieben wurde. Die Exposition mit der Testverbindung und dem bekannten Agonisten kann zur im Wesentlichen gleichen Zeit geschehen oder die Exposition mit dem Agonisten kann im Anschluss an die Exposition mit der Testverbindung erfolgen. Wie hierin verwendet, bedeutet Exposition im Anschluss die Exposition innerhalb eines Zeitraums, während welchem man von einem potentiellen Antagonisten erwarten würde, dass er mit dem GPCR wechselwirkt (d. h. Bindung des GPCR oder gebunden sein an den GPCR).
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen einer Zelle auf die Anwesenheit eines GPCR bereit, umfassend: a) Bereitstellung einer Testzelle; b) Einführung eines chimären Proteins, welches ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Protein umfasst, in die Testzelle und dann c) Exposition der Zelle mit einer Testlösung, welche einen bekannten Agonisten für den GPCR enthält und d) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle die Aktivierung eines GPCR anzeigt und dementsprechend dass die Testzelle einen solchen GPCR enthält. Die Translokation des chimären Proteins wird nachgewiesen, wie es oben diskutiert wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen einer Zellpopulation auf die Anwesenheit von Zellen bereit, welche GPCRs enthalten, umfassend: a) Bereitstellung einer Population von Testzellen, wobei diese Testzellen chimäre Proteine umfassen, welche ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Protein umfassen und dann b) Exposition der Zellenpopulation mit einer Testlösung, welche einen Agonisten für einen GPCR enthält und d) Detektion jener Zellen, in welchen die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle eintritt, wobei die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand einer Zelle die Aktivierung eines GPCR anzeigt und dementsprechend anzeigt, dass die fragliche Zelle einen GPCR enthält. Die Translokation des chimären Proteins wird nachgewiesen, wie es oben diskutiert wurde. Zu screenede Zellpopulationen schließen eine Sammlung individueller Zellen, ein Gewebe, welches eine Vielzahl gleichartiger Zellen umfasst, ein Organ, welches eine Vielzahl verwandter Zellen umfasst oder einen Organismus ein, der eine Vielzahl von Geweben oder Organen umfasst.
Wie hierin verwendet bedeutet, 'Exposition' einer Zelle mit einer Testverbindung oder Lösung, dass das Äußere der Zelle in Kontakt mit der Testverbindung oder Lösung gebracht wird. Wenn die Testverbindung oder Lösung auf GPCR-Ligand-Aktivität gescreent wird, wird die Exposition unter Bedingungen durchgeführt, welche die Bindung eines GCPR-Liganden an einen in der Zelle exprimierten Rezeptor gestatten würden. Wie hierin verwendet bezieht sich 'Translokation' von β-Arrestin auf die Bewegung des β-Arrestin-Moleküls von einem Bereich der Zelle zu einem anderen.
Die vorliegenden Verfahren können weiterhin verwendet werden, um den Effekt eines jeden Moleküls im GPCR-Stoffwechsel zu bewerten oder zu untersuchen, welches seinen Effekt stromaufwärts der β-Arrestin-Bindung (d. h. vor der β-Arrestin-Bindung an den phosphorylierten GPCR) ausübt. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bewertung von GPCR-Stoffwechselfunktionen im allgemeinen bereit. Wie hierin verwendet, bezieht sich GPCR-Stoffwechsel auf eine Reihe von Ereignissen, welche mit der Agonist-Aktivierung eines GPCR beginnen, gefolgt von der Desensibilisierung des Rezeptors über G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase-Phosphorylierung (GRK) und β-Arrestin-Bindung.
Im weitesten Sinn stellt die vorliegende Erfindung demnach ein Verfahren zum Screenen von Testverbindungen und Testbedingungen auf die Befähigung einen GPCR-Stoffwechsel zu beeinflussen (aktivieren oder hemmen, verstärken oder unterdrücken) bereit und stellt Verfahren zur allgemeinen Bewertung von GPCR-Stoffwechselfunktion in einer Zelle bereit. In den vorliegenden Verfahren wird das Ausmaß der Translokation des β-Arrestins mittels des Grads an detektierbaren Veränderungen in der Zelle angezeigt; das Ausmaß der β-Arrestin-Translokation ist ein Indikator des Umfangs der Vollendung des GPCR-Stoffwechsels. Es kann das relative Ausmaß der Translokation unter veränderten Testbedingungen verglichen werden oder eine Testbedingung kann mit einer Kontrollbedingung oder einem vorher bestimmten Standard verglichen werden.
Beispielsweise können die Spezifität und die Effekte verschiedener Kinasen (einschließlich jener, für die bekannt ist, dass sie mit dem GPCR-Stoffwechsel wechselwirken und jener, von denen bisher nicht bekannt war, dass sie mit GPCRs wechselwirken) für einen spezifischen GPCR oder eine Gruppe von GPCRs durch die Bereitstellung einer Testkinase für eine Testzelle, die einen GPCR exprimiert und ein detektierbares β-Arrestin Molekül enthält, Exposition der Zelle mit einem GPCR-Agonisten und Bewertung der Translokation des detektierbaren β-Arrestins vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran, bewertet werden (siehe das hierin aufgeführte Beispiel 7). Die Translokation des β-Arrestins zur Zellmembran zeigt an, dass die Testkinase, als Antwort auf die Agonist-Belegung des Rezeptors, in der Lage ist, den Rezeptor zu binden und zu phosphorylieren, so dass das β-Arrestin dann an den durch die Kinase phosphorylierten Rezeptor binden wird und eine anschließende Wechselwirkung mit dem geeigneten G-Protein verhindern wird. Auf ähnlichem Weg kann die Funktion veränderter, rekombinanter oder mutanter Kinasen bewertet werden; es können Verbindungen auf ihre Befähigung den GPCR-Stoffwechsel, G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinasen oder β-Arrestin-Bindung zu aktivieren oder zu hemmen gescreent werden und es kann die Funktion von G-Proteinen bewertet werden. Zum Beispiel können die folgenden Testbedingungen unter Verwendung von Verfahren, wie sie hierin beschrieben wurden, bewertet werden: Die Effekte von G-Proteinen (einschließlich natürlicher, heterologer oder künstlich veränderter G-Proteine) innerhalb der Testzel le; Exposition der Testzelle mit bekannten oder putativen GPCR-Liganden und Coexpression eine zweiten Rezeptors in der Testzelle, die einen GPCR exprimiert.
Weiterhin erlauben die vorliegenden Verfahren das Screenen von β-Arrestinen (natürlich vorkommende, künstlich eingeführte oder veränderte, mutante oder rekombinante) auf die Befähigung einen phosphorylierten GPCR zu binden. In solchen Verfahren ist das Test-β-Arrestin mit einem detektierbaren Molekül wie GFP konjugiert und wird in einer Zelle platziert, die einen GPCR enthält. Die Zelle wird einem bekannten Agonisten für den GPCR ausgesetzt und die Translokation des detektierbaren Moleküls om Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle wird detektiert. Die Translokation des detektierbaren Moleküls zeigt an, dass das Test-β-Arrestin-Protein in der Lage ist, an den phosphorylierten GPCR zu binden. Wie in anderen erfindungsgemäßen Verfahren kann die Translokation mit einer Kontrollzelle verglichen werden, welche ein bekanntes β-Arrestin oder einen vorher bestimmten Standard enthält.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
GPCRs, die zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignet sind, sind jene, bei welchen die Agonist-Bindung eine Kinase-Phosphorylierung (GRK) des G-Protein-gekoppelten Rezeptors induziert; die Translokation des Arrestins vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran tritt im Anschluss ein. Es wird angenommen, dass nahezu alle Mitglieder der GPCR-Superfamilie über diesen gemeinsamen Mechanismus sensibilisieren, wobei die Beispiele geeigneter GPCR-Typen einschließen, aber nicht begrenzt sind auf, beta- und alpha-adrenergene Rezeptoren, GPCRs, die Neurotransmitter (wie Dopamin) binden, GPCRs die Hormone binden, die Klasse der Geruchsrezeptoren (Geschmacks-, Geruch- und chemotaktischer Rezeptoren, wie sie in der Naschenschleimhaut und der Zunge und im Sperma, Ei, Zellen des Immunsystems und Blutzellen gefunden werden); die Klasse der Typ-II-GPCRs, einschließlich Secretin, Glucagon und anderer Rezeptoren des Verdauungstrakts; licht-aktivierte GPCRs (wie Rhodopsin) und Mitglieder der Typ-III-Familie der GPCRs, welche metabotopische Glutamat-Rezeptoren und GABA_B-Rezeptoren einschließen, aber nicht auf diese begrenzt sind. Zusätzlich zu natürlich vorkommenden GPCRs können GPCRs spezifisch gentechnisch hergestellt werden oder mittels Zufallsmutagenese erzeugt werden. Solche nicht natürlich vorkommenden GPCRs können auch in den vorliegenden Verfahren eingesetzt werden und mittels dieser gescreent werden. Die vorliegenden Verfahren können bei jedem Membran-Rezeptor-Protein eingesetzt werden, in welchem die Agonist-Bindung in der Translokation von β-Arrestin resultiert. Solche Rezeptoren schließen Wachstumsfaktoren ein, welche durch G-Proteine Signale übermitteln.
Automatisierte Screening-Verfahren
Die erfindungsgemäßen Verfahren können automatisiert werden um zweckmäßige Echtzeitverfahren mit hohen Volumina zum Screenen von Verbindungen auf GPCR-Ligand-Aktivität oder zum Screenen auf die Anwesenheit eines GPCR-Liganden in einer Testprobe bereitzustellen. Automatisierte Verfahren werden derart gestaltet, dass sie die Änderung der Konzentration von markiertem β-Arrestin an der Zellemembran und/oder im Zytosol nach der Exposition mit einem GPCR-Agonisten detektieren. Die Änderung der β-Arrestin-Verteilung kann im Zeitverlauf (d. h. durch den Vergleich derselben Zelle vor und nach der Exposition mit der Testprobe) oder mittels Vergleich mit einer Kontrollzelle, die nicht der Testprobe ausgesetzt wird, oder mittels Vergleich mit vorher festgelegten Indikatoren detektiert werden. Sowohl die qualitativen Bewertungen (positiv/negativ) als auch die quantitativen Bewertungen (ver gleichender Grad der Translokation) können mittels des vorliegenden, automatisierten Verfahrens bereitgestellt werden, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird.
Es ist demnach ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum automatisierten Screenen auf GPCR-Aktivität mittels Detektion der Translokation des detektierbar markierten β-Arrestins vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran, als Antwort auf die Agonist-Aktivierung von GPCRs, bereitzustellen. Die Translokation kann mittels der Veränderung der Verteilung eines detektierbaren Signals innerhalb einer Zelle im zeitlichen Verlauf, zwischen einer Testzelle und einer Kontrollzelle oder mittels Vergleich mit vorher festgelegten Parametern, detektiert werden. Insbesondere werden gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von Zellen, welche GPCRs exprimieren und chimäre Proteine enthalten, welche ein detektierbares Molekül und ein β-Arrestin-Molekül umfassen, bereitgestellt. Es werden dann, unter Verwendung konventioneller Techniken, Indikatoren für die Verteilung der detektierbaren Moleküle gemessen. In verschiedenen Ausführungsbeispielen (a) erfolgt die Messung der optischen Indikatoren vor und nach der Zugabe einer Testprobe zu einer Zelle und es werden die Zeitpunktsmessungen verglichen; (b) werden die optischen Indikatoren in einer Testzelle, die einer Testprobe ausgesetzt wurde, und in einer Kontrollzelle gemessen, die dieser nicht ausgesetzt wurde und werden diese Messungen verglichen und (c) die Messung einer Testzelle nach Addition einer Testprobe wird mit vorher festgelegten Parametern verglichen. Die gemessenen optischen Indikatoren können Fluoreszenzsignale (z. B. Fluoreszenzintensitäten) sein, wenn das detektierbare Molekül des chimären β-Arrestin-Proteins ein Fluoreszenzindikator wie GFP ist. Andere optische Indikatoren, die für Echtzeit messungen geeignet sind, können auch verwendet werden, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird.
Es kann ein Gerät zur Bestimmung der GPCR-Antwort auf eine Testprobe verwendet werden. Dieses Gerät umfasst Mittel wie Instrumente zur Fluoreszenzmessung, zur Messung von Indikatoren der intrazellulären Verteilung detektierbarer β-Arrestin-Proteine in wenigstens einer Testzelle und optional auch in einer Kontroll- oder Kalibrierungszelle. Die Messpunkte können über die Zeit oder zwischen Test- und Kontrollzellen genommen werden. Ein Comuterprogramm-Produkt kontrolliert die Funktion der Messvorrichtungen und führt numerische Operationen durch, welche die oben beschrieben Schritte betreffen. Das bevorzugte Computerprogramm-Produkt umfasst ein computerlesbares Speichermedium, welches eine computerlesbare Programmcode-Vorrichtung besitzt, die im Medium enthalten ist. Hardware, die zur Verwendung in solchen automatisierten Geräten geeignet ist, wird einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein und kann Computer-Controller, automatisierte Probenhandhabungsvorrichtungen, Geräte zur Fluoreszenzmessung, Drucker und optische Displays einschließen. Die Messvorrichtung kann einen Photodetektor oder mehre Photodetektoren zur Messung des Fluoreszenzsignals von Proben enthalten, in denen Moleküle in dem detektierbare β-Arrestin-Konstrukt eingesetzt werden, die mittels Fluoreszenz detektierbar sind. Die Messvorrichtung kann auch einen computergesteuerten Schrittmotor enthalten, so dass jede Kontroll- und/oder Testprobe als eine Anordnung von Proben aufgestellt sein kann und automatisch und wiederholt während des Schritts der Messung der Fluoreszenzintensität einem Photodetektor gegenüberliegend angeordnet werden kann.
Die Messvorrichtung ist bevorzugt operativ an einen Allzweck- oder anwendungsspezifischen Computer-Controller gekoppelt. Der Controller umfasst bevorzugt ein Computerprogramm-Produkt zur Steuerung der Funktion der Messvor richtung und zur Durchführung numerischer Operationen, welche die oben beschriebenen Schritte betreffen. Der Controller kann Setup-Daten und andere verwandte Daten über Datei, Disketten-Input oder Datenbus annehmen. Ein Display und ein Drucker können auch bereitgestellt werden, um die durch den Controller vorgenommenen Operationen visuell anzuzeigen. Ein Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass die mittels des Controllers durchgeführten Abläufe insgesamt oder teilweise als Software-Module realisiert werden können, die auf einem Allzweck-Computersystem ablaufen. Alternativ kann ein fest zugeordnetes, allein operierendes System mit anwendungsspezifischen, integrierten Schaltkreisen zur Durchführung der oben beschriebenen Abläufe und Operationen bereitgestellt werden.
Wie oben vorgesehen, können die Indikatoren der β-Arrestin-Verteilung die Form von Fluoreszenz-Signalen haben können, obwohl für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird, dass noch andere Indikatoren bekannt sind und bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wie vielleicht jene, die mittels Markierungen bereitgestellt werden, welche Signale erzeugen, die mittels Fluoreszenz, Radioaktivität, Colorimetrie, Röntgenbeugung oder Absorption oder Magnetismus detektierbar sind. Solche Markierungen schließen zum Beispiel Fluorophore, Chromophore, radioaktive Isotope (z. B. ³²P oder ¹²⁵I) und Elektronendichte-Reagenzien ein.
Definitionen
Wie hierin verwendet bezieht sich exogene oder heterologe DNA (oder RNA) auf DNA (oder RNA), welche mittels menschlicher Bemühungen in eine Zelle (oder den Vorläufer einer Zelle) eingeführt wurde. Solche heterologe DNA kann eine Kopie einer Sequenz sein, die in der transformierten Zelle natürlich vorkommt oder sie kann eine Sequenz oder Fragmente von dieser Sequenz sein, welche naturgemäß nicht in der transformierten Zelle gefunden wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff 'Gen' auf eine DNA-Sequenz, welche (1) stromaufwärts (5') Regulationssignale einschließlich eines Promotors, (2) eine kodierende Region, welche das Produkt, Protein oder die RNA des Gens spezifiziert, (3) stromabwärts (3') Regionen, welche Transkriptionstermination und Polyadenylierungssignale einschließen und (4) assoziierte Sequenzen inkorporiert, die für die effiziente und spezifische Expression erforderlich sind.
Die Verwendung des Ausdrucks "im Wesentlichen Sequenz-Ähnlichkeit" bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung auf DNA-, RNA- oder Aminosäuresequenzen, welche leichte und nicht-konsequente Sequenzvariationen einer interessierenden Sequenz besitzen und als äquivalent mit der interessierenden Sequenz angesehen werden. Diesbezüglich bedeutet "leichte und nicht-konsequente Sequenzvariationen", dass "ähnliche" Sequenzen (d. h. Sequenzen, welche im Wesentlichen Sequenz-Ähnlichkeit besitzen), funktionell äquivalent sein werden. Funktionell äquivalente Sequenzen werden im Wesentlichen in gleicher Weise arbeiten um im Wesentlichen die gleichen Zusammensetzungen zu erzeugen.
Wie hierin verwendet bedeutet eine "native DNA-Sequenz" oder "natürliche DNA-Sequenz" eine DNA-Sequenz, welche aus nicht-transgenen Zellen oder Gewebe isoliert werden kann. Native DNA-Sequenzen sind solche, die nicht künstlich, wie durch ortsspezifische Mutagenese, verändert wurden. Sobald native DNA-Sequenzen identifiziert sind, können DNA-Moleküle, welche native DNA-Sequenzen besitzen, chemisch synthetisiert werden und unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren, wie im Stand der Technik bekannt, erzeugt werden.
Wie hierin verwendet ist "ein regulatorisches Element" eines Gens die DNA-Sequenz, wie beispielsweise ein Promotor, die zur Expression des Gens erforderlich ist. In dieser Erfindung bedeutet der Begriff "wirksam verbunden", dass einer solchen Verknüpfung folgend ein regulatorisches Element die Expression einer gebundenen DNA-Sequenz regeln kann.
Der Begriff 'Promotor' bezieht sich auf eine Region einer DNA-Sequenz, welche die für die effiziente Expression einer kodierenden Sequenz erforderlichen Signale inkorporiert. Das kann Sequenzen einschließen, an welche eine RNA-Polymerase bindet, ist jedoch nicht auf solche Sequenzen beschränkt und kann Regionen, an welche andere Regulatorproteine binden, zusammen mit Regionen einschließen, die an der Kontrolle der Proteintranslation beteiligt sind und kann kodierende Sequenzen einschließen. Geeignete Promotoren werden einem Durchschnittfachmann offensichtlich sein und werden in Abhängigkeit von der Zelle, in welcher die DNA exprimiert werden soll, variieren. Ein Promotor, der zur Verwendung in DNA-Konstrukten geeignet ist, die ein β-Arrestin/detektierbares Molekülkonstrukt kodieren, kann ein Promotor sein, der natürlich in der Zelle vorkommt, in welcher die Expression gewünscht ist; optional kann der Promotor des β-Arrestins innerhalb des Konstrukts benutzt werden. Sowohl induzierbare als auch konstitutive Promotoren werden für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
DNA-Konstrukte
Erfindungsgemäße DNA-Konstruke oder "Expressions-Cassetten" schließen in der 5'- zur 3'-Richtung der Transkription einen Promotor, eine DNA-Sequenz, die wirksam mit the Promotor verbunden ist, und optional eine Terminatorsequenz einschließlich Stopsignal für RNA-Polymerase und ein Polyadenylierungssignal für Polyadenylase ein. Alle diese Regulatorregionen sollten in der Lage sein in der zu transformierenden Zelle wirksam zu sein. Geeignete Terminatorsignale für ein vorgebenes DNA-Konstrukt werden einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein.
Der Begriff "wirksam verbunden", wie er hierin verwendet wird, betrifft DNA-Sequenzen in einem einzelnen DNA-Molekül, die derart verbunden sind, dass die Funktion der einen durch die andere beeinflusst wird. Demnach ist ein Promotor wirksam mit einer DNA verbunden, wenn er in der Lage ist, die Transkription dieser DNA zu beeinflussen (d. h. die DNA steht unter der Transkriptionskontrolle des Promotors). Der Promotor wird als "stromaufwärts" von der DNA bezeichnet, welche wiederum als "stromabwärts" vom Promotor bezeichnet wird.
Die Expressions- oder Transkriptionskontrolle kann in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt werden, welches auch wenigstens ein Replikationssystem besitzt. Der Einfachheit halber ist es gängig ein Replikationssystem zu haben, dass in Escherichia coli, wie ColE1, pSC101, pACYC184 oder dergleichen wirksam ist. Auf diese Weise kann auf jeder Stufe nach jeder Manipulation das resultierende Konstrukt kloniert, sequenziert und die Richtigkeit der Manipulation bestimmt werden. Zusätzlich oder an Stelle des E. coli Replikationssystems kann ein Replikationssystem mit einem breiten Wirtsspektrum, wie die Replikationssysteme der P-1-Inkompatibilitäts-Plasmide, z. B. pRK290, eingesetzt werden. Zusätzlich zum Replikationssystem wird häufig wenigstens ein Marker, der in einem Wirt oder in weiteren Wirten verwendbar ist oder werden verschiedene Marker für individuelle Wirte anwesend sein. Das heißt, dass ein Marker zur Selektion in einem prokaryotischen Wirt eingesetzt werden kann, währen ein anderer Marker zur Selektion in einem eukaryotischen Wirt eingesetzt werden kann. Die Marker können ein Schutz gegen Biozide wie Antibiotika, Toxine, Schwermetalle oder dergleichen sein; sie können für Komplementation sorgen, indem sie einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleihen oder sie können durch die Produktion einer neuen Verbindung in der Pflanze einen sichtbaren Phenotyp erzeugen.
Die verschiedenen Fragmente, welche die verschiedenen Konstrukte, Expressions-Cassetten, Marker und dergleichen umfassen, können konsekutiv mittels Restriktionsenzym-Spaltung eines geeigneten Replikationssystems und Insertion des entsprechenden Konstrukts oder Fragments in die verfügbare Stelle eingeführt werden.
Nach Ligation und Klonierung kann das DNA-Konstrukt für weitere Manipulation isoliert werden. Alle diese Techniken werden in der Literatur, wie von J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Gold Spring Harbor Laboratory), ausführlich erläutert.
Die folgenden Beispiele werden dargelegt um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und sollen nicht als deren Begrenzung betrachtet werden. Wie hierin verwendet bedeuten βarr2-GFP = β-Arrestin-grün-fluoreszierendes-Protein; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GPCR = G-Protein-gekoppelter Rezeptor; βARK = beta-adrenergene Rezeptor-Kinase; GRK = G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase; β2AR = beta-2-adrenergener Rezeptor; HEK-293 = menschliche embryonale Nieren-Zellen; DMEM = Dulbecco's modified Eagle medium und MEM = Minimal Essential Medium.
BEISPIEL 1
Materialien und Verfahren
Materialien: Isoproterenol wurde von Sigma RBI bezogen. Anti-Maus-Antikörper wurde von Sigma Chemicals oder Molecular Probes bezogen. Monoklonaler Maus-Antikörper gegen das 12CA5-Epitop wurde von Boehringer Mannheim bezogen. Zellkultur-Medien wurden von Mediatech und fetales Rinderserum wurde von Atlanta Biologicals bezogen. Physiologische Puffer wurden von Gibco-Life Technologies Inc., Restriktionsenzyme wurden von Promega oder New England Biolabs, T4-Ligase wurde von Promega und Hot-Tub- DNA-Polymerase wurde von Amersham bezogen. Kommerziell erhältliche Plasmide, welche Varianten von grün fluoreszierendem Protein enthalten, wurden von Clontech bezogen.
Zellkultur und Transfektion: HEX-293- und COS-Zellen wurden erhalten und wie von Barak et al., Mol. Pharm. 51: 177 (1997), beschrieben, transfiziert. Zellen, welche sowohl beta-2-adrenergenen Rezeptor als auch β-Arrestin-Konstrukte enthalten, wurden mit zwischen 5–10 μg Rezeptor-cDNA in pcDNA1/AMP und 0,5–1 μg Barr2-GFP-cDNA pro 100 mm Schale transfiziert. GRKs wurden unter Verwendung von 5 μg transfizierter cDNA in pcDNA1/AMP pro Schale exprimiert.
Konfokale Mikroskopie: HEK-293-Zellen, die transfiziert wurden wie es oben beschrieben worden ist, wurden auf 35 mm Schalen plattiert, die einen zentrierten, 1 cm Well enthielten, der aus einem Loch im Kunststoff gebildet wird, das mit einem Glasdeckel verschlossen wurde. Primäre und sekundäre Antikörpermarkierung von Lebendzellen wurde bei 37°C 30 Minuten lang in Medien ohne Serum in einem 5%-CO₂ Inkubator durchgeführt. Die Zellen wurden zwischen den Anwendungen dreimal gewaschen. Zellen, die wie oben beschrieben in MEM oder DMEM, gepuffert mit 20 mM Hepes, plattiert wurden, wurden mit einem konfokalen Zeiss Laser-Scan-Mikroskop betrachtet.
Komplexbildung: Durchflusszytometrie-Analyse wurde unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie sie in Barak et al., J. Biol. Chem. 269: 2790 (1994) beschrieben werden, durchgeführt.
BEISPIEL 2
Konstruktion von β-Arrestin-2-GFP-Plasmid
β-Arrestin-2-cDNA in dem Plasmid pCMVS wurde als Templat verwendet. Oligonukleotid-Primer, welche eine distale XhoI-Restriktionsstelle und das C-terminale Stopcodon von β-Arrestin-2 umgeben, wurden verwendet, um das Stopcodon durch eine in-frame-BamHI-Restriktiosstelle mittels ortsspezifischer Mutagenese zu ersetzen (Valette et al., Nucleic Acids Res. 17: 723 (1989); Attramadal et al., J. Biol. Chem. 267: 17882 (1992); Lohse et al., Science 248: 1547 (1990)). Das XhoI, BamHI-Segment wurde isoliert. Dieses Segment wurde an den N-terminalen Teil von β-Arrestin-cDNA (aus pCMV5 mittels SacI und XhoI geschnitten) in den Polylinker eines Plasmids ligiert, das vorher mit SacI und BamHI verdaut wurde und das S65T-grün-fluoreszierendes-Protein distal und in-frame zu der Stelle der β-Arrestin-cDNA-Insertion enthielt. Lohse et al., Science 248: 1547 (1990). Das resultierende β-Arrestin-GFP-Konstrukt wurde nach Insertion und Vermehrung in E. coli. isoliert. Die Konstrukte wurden mittels Sequenzierung verifiziert.
Ein lineares Modell des β-Arrestin-2/S65T-GFP-Konjugats ist in 1 bereitgestellt.
BEISPIEL 3
Charakterisierung von βarr2-GFP, das mittels HEK-293-Zellen exprimiert wird
Homogenate von HEK-293-Zellen, die mit dem Plasmid aus Beispiel 2 transformiert sind, wurden unter Verwendung bekannter Western-Blot-Techniken untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass HEK-293-Zellen sowohl β-Arrestin als auch das βarr2-GFP-Konjugat endogen exprimieren.
Es wurden Western-Blots von Homogenaten von HEK-293-Zellen, die mit dem Plasmid aus Beispiel 2 transfiziert wurden und βarr2-GFP exprimieren, durchgeführt. Eine äquivalente Menge des Homogenatmaterials wurde auf jede von zwei Bahnen übertragen (2A). Die linke Bahn wurde anti-β-Arrestin-Antikörper ausgesetzt (Menard et al., Mol. Pharm. 51: 800 (1997)), wohingegen die rechte Bahn einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen GFP ausgesetzt wurde. Das βarr2-GFP-Fusionsprotein ist ungefähr um 50% größer als β-Arrestin-2 und man würde deshalb erwar ten, dass es auf SDS-Page langsamer wandert als β-Arrestin.
Die Exposition mit anti-β-Arrestin-Antikörper lässt mehrere Banden erkennen (linke Bahn); die Exposition mit monoklonalem anti-GFP-Antikörper lässt eine einzelne Bande erkennen (rechte Bahn). Die Position von endogenem zellulärem β-Arrestin-2 wird durch die mittlere Bande in der linken Bahn (βarr2) angezeigt. Die schwere Bande direkt unter 71000 auf der linken Bahn (βarr2-GFP) wird durch ein ähnliche Bande auf der linken Bahn gespiegelt. Im Gegensatz dazu wird bei der Exposition mit anti-GFP-Antikörper keine Bande beobachtet, die mit dem endogenen zellulären β-Arrestin-2 korrespondiert. Die Behandlung der rechten Bahn mit anti-GFP-Antikörper zeigte, dass die langsamere Bande, die mittels anti-β-Arrestin-Antikörper markiert wurde, GFP enthielt.
BEISPIEL 4
Biologische Aktivität von β-Arrestin-GFP-Konjugat
Die β-Arrestin-Aktivität kann indirekt mittels Messung seines Effekts auf die Rezeptor-Komplexierung bewertet werden (siehe Menard et al., Mol. Pharm. 51: 800 (1997); Ferguson et al., Science 271: 363 (1996)). Das β2AR komplexiert gewöhnlich in COS-Zellen nur schlecht und das wurde mit der relativ schwachen Expression von endogenen β-Arrestinen in Zusammenhang gebracht (siehe Menard et al. Mol. Pharmacol. 51: 800 (1997); Ferguson et al. Science 271: 363 (1996)). Die Überexpression von exogenem β-Arrestin erhöht die β2AR-Komplexierung in diesen Zellen. Um zu zeigen, dass das βarr2-GFP-Konjugat ein biologisch aktives β-Arrestin ist, wurden COS-Zellen, welche βarr2-GFP überexprimieren, auf die Steigerung der β2AR-Internalisierung, im Vergleich zur Steigerung von βAR2, die bei der Überexpression von β-Arrestin-2 beo bachtet wird, untersucht. Die Ergebnisse sind in 2B gezeigt.
Unter Verwendung epitopmarkierter βAR2-Rezeptoren wurde die Komplexierung von βAR2 in COS-Zellen, die entweder (1) exogenes β-Arrestin-2 noch (2) das βarr2-GFP-Konjugat überexprimieren, untersucht. 2B zeigt die Komplexierung von β2AR in COS-Zellen mit und ohne überexprimiertes β-Arrestin-2 (die beiden linken Banden) und mit und überexprimiertem βarr2-GFP (die beiden rechten Banden). Die Agonist-vermittelte β2AR-Komplexierung stieg in Anwesenheit von überexprimiertem β-Arrestin-2 von 15 ± 7% auf 39 ± 5% an; die Überexpression von βarr2-GFP erhöhte auf gleiche Weise die Agonist-vermittelte β2AR-Komplexierung von 25 ± 4% auf 58 ± 1%. Wild-Typ-β-Arrestin-2 und βarr2-GFP erhöhten die β2AR-Komplexierung gleichermaßen gut über die Kontroll-Niveaus, wobei ein 2,5- beziehungsweise 2,4-facher Anstieg der β2AR-Komplexierung hervorgerufen wurde.
Die obigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass das βarr2-GFP-Konjugat wie ein biologisch aktives Arrestin wirkt.
BEISPIEL 5
Agonist-vermittelte Translokation von βarr2-GFP
Die Agonist-vermittelte Translokation des βarr2-GFP-Chimären vom Zytosol der Zelle zur Membran wurde unter Verwendung von HEK-293- und COS-Zellen untersucht, die mit Plasmiden transfiziert waren, welche cDNA für den β2AR-Rezeptor und für das βarr2-GFP-Konjugat enthielten.
HEK-293- und COS-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, welche 10 μg cDNA für β2AR und 0,5–1,0 μg für βarr2-GFP enthielten. Die Zellen wurden unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie bewertet, um die inhärente intrazelluläre Fluoreszenz von GFP zu detektieren. Transfizierte HEK-293-Zellen sind in 3A gezeigt, wobei Feld 1 Zellen vor der Zugabe von βAR2-Agonist bild lich darstellt und Feld 2 Zellen im Anschluss an die Zugabe von Agonist bildlich darstellt. Transfizierte COS-Zellen sind in 3B gezeigt, wobei Feld 1 die Zellen kurz vor der Zugabe von βAR2-Agonist bildlich darstellt und Feld 2 die Zellen zehn Minuten nach der Zugabe von Agonist bildlich darstellt.
Wie in 3A gezeigt, war die βarr2-GFP-Verteilung in HEK-239-Zellen anfänglich zytosolisch (Feld 1). Es war keine signifikante Verstärkung im Kern oder in der Membran sichtbar. Im Anschluss an die Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol zum Zellmedium wurde die Agonist-vermittelte Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP unter Verwendung konfokaler Mikroskopie beobachtet. Zehn Minuten nach der Zugabe von Isoproterenol (Sättigungskonzentrationen) wurde der Anstieg der Membran-Fluoreszenz mit einem gleichzeitigen Verlust an zytosolischer Fluoreszenz beobachtet, wodurch angezeigt wird, dass sich die βarr2-GFP-Verteilung zur Membran verschoben hat (Feld 2). Diese Ergebnisse beweisen, dass in HEK-293-Zellen, welche das β2AR enthalten, das durch die Zelle exprimierte βarr2-GFP im Anschluss an die Zugabe eines βAR2-Agonisten vom Zytosol zur Membran translokalisiert wird. Die Exposition der Testzellen mit GPCR-Agonist erhöht die membrangebundene Fluoreszenz zehnfach über die, welche vor der Agonist-Exposition beobachtet wurde.
Wie in 3A gezeigt war die βarr2-GFP-Verteilung in COS-Zellen anfänglich zytosolisch (Feld 1). Es war keine signifikante Verstärkung im Kern oder in der Membran sichtbar. Im Anschluss an die Zugabe des βAR2-Agonisten Isoproterenol zum Zellmedium wurde die Agonist-vermittelte Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP unter Verwendung konfokaler Mikroskopie beobachtet. Zehn Minuten nach der Zugabe von Isoproterenol (Sättigungskonzentrationen) wurde der Anstieg der Membran-Fluoreszenz mit einem gleichzeitigen Verlust an zytosolischer Fluoreszenz beobachtet, wodurch angezeigt wird, dass sich die βarr2- GFP-Verteilung zur Membran verschoben hat (Feld 2). Diese Ergebnisse beweisen, dass in COS-Zellen, welche das β2AR enthalten, das durch die Zelle exprimierte βarr2-GFP im Anschluss an die Zugabe eines βAR2-Agonisten vom Zytosol zur Membran translokalisiert wird.
Ein Vergleich der 3A und 3B zeigt, dass das Fluoreszenzsignal in COS-Zellen im Vergleich zu HEK-Zellen reduziert ist, wodurch die geringere Effizienz der Komplexierung von β2AR in COS-Zellen widergespiegelt wird. Jedoch ist sogar in COS-Zellen die Verschiebung von βarr2-GFP vom Zytosol zur Membran in Anschluss an die Zugabe von βAR2-Agonist aufgrund der Fluoreszenz der GFP-Komponente erkennbar.
Die obigen Versuche mit COS- und HEK-239 Zellen wurden reproduziert, mit der Ausnahme dass der βAR2-Antagonist Propranolol zu dem Zellmedium hinzugefügt wurde. Die Verwendung konfokaler Mikroskopie, um das βarr2-GFP wie oben in der Zelle in Echtzeit zu verfolgen, zeigte an, dass keine Verschiebung von βarr2-GFP vom Zytosol zur Membran als Antwort auf einen βAR2-Antagonisten erfolgt ist. Wie in 6E gezeigt resultierte die Zugabe eines Agonisten (mittleres Feld) in der Translokation von βarr2-GFF vom Zytosol zur Membran; nachfolgende Zugabe eines Antagonisten (rechtes Feld) kehrte die Translokation um (vergleiche dazu die Kontrolle, linkes Feld).
Der biochemische Beweis zeigt an, dass β-Arrestine vorwiegend zytosolische Proteine sind. Ferguson et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: 1095 (1996). Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen, dass βarr2-GFP im gesamten Zytosol verteilt ist und vom Kern ausgeschlossen ist. Diese Daten belegen auch, dass βarr2-GFP in Abwesenheit eines Agonisten nicht vorwiegend in der Plasmamembran kompartimentiert ist, sondern dass das zelluläre βarr2-GFP durch die Exposition mit einem Agonisten zur Membran verschoben wird. Die vorliegenden Ergebnisse weisen außerdem darauf hin, dass die Verschiebung des βarr2-GFP- Konjugats als Antwort auf die Zugabe eines G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten optisch als Verstärkung der Membranfluoreszenz und/oder einem begleitenden Verlust an zytosolischer Fluoreszenz detektiert werden kann und dass diese Antwort schnell beobachtet wird.
BEISPIEL 6
Intrazelluläres βarr2-GFP richtet sich auf Membran-Rezeptoren
4 zeigt den Zeitverlauf der βarr2-GFP-Weiterverteilung zur Plasmamembran von mit 12CA5(HA) markiertem β2AR in HEK-293-Zellen, wie mittels konfokaler Mikroskopie gezeigt wird.
Das vorliegende Beispiel zeigt, dass die β2ARs das Ziel der intrazellulären βarr2-GFP-Konjugat-Proteine sind. HEK-239-Zellen, welche mit 12CA5(HA) markierte β2AR-Rezeptoren enthalten, wurden untersucht. Die Rezeptoren der HEK-293-Zellen waren durch Vernetzung mit einem monoklonalen Maus-Antikörper, der auf ein N-terminales Epitop gerichtet war, gefolgt von einem mit Texas Rot konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper, reorganisiert. In 4 zeigen die drei Felder von Zeile A die gleiche HEK-293-Zelle mit βAR2-Rezeptoren, die in Plasmamembran-Clustern reorganisiert sind.
HEK-239-Zellen wurden dann einem Agonisten (Isoproterenol, das wie oben dem Zellmedium zugefügt wurde); die drei Felder von Zeile B in 4 wurden nach der Agonist-Zugabe nacheinander aufgenommen (von links nach rechts bei 0, 3 und 10 Minuten nach der Agonist-Zugabe). Die Echtzeit-Weiterverteilung von βarr2-GFP auf die Rezeptoren über einen Zeitraum von zehn Minuten ist dadurch mittels Vergleich der Felder der Zeile A und der Zeile B von 4 gezeigt. In 4 zeigen Pfeile Bereiche von Colokalisation an und der Maßstab = 10 Mikron.
4 veranschaulicht, dass die Geometrie der Agonist-induzierten, zeitabhängigen Translokation von βarr2- GFP zur Plasmamembran die Weiterverteilung von voraggregierten β2ARs imitiert. Dadurch wird angezeigt, dass die primäre Stelle, auf die β-Arrestin gerichtet ist, β2AR oder eine damit nahe verbundene Komponente ist.
BEISPIEL 7
Intrazelluläres βarr2-GFP ist auf Membran-Rezeptoren gerichtet
Es ist postuliert worden, dass die Phosphorylierung von GPCRs mittels GRKs die Desensibilisierung durch Erhöhung ihrer Affinität für β-Arrestine erleichtert. Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 16879 (1993); Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268: 11628–11638 (1993); Ferguson et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: 1095 (1996). Wenn sie in HEK-293-Zellen exprimiert werden und einem Agonist ausgesetzt werden, werden mutante Y326A-β2ARs durch endogene GRKs nicht signifikant phosphoryliert. Barak et al., Biochem. 34: 15407 (1995); Ferguson et al., J. Biol. Chem. 270: 24782 (1995). Diese Phosphorylierungs-Abschwächung in Y326A-βAR2s wird durch die Überexpression von GRKs in der gleichen Zelle umgekehrt. Menard et al., Biochem. 35: 4155 (1996). Der mutante Y326A-Rezeptor wurde verwendet, um die β-Arrestin-Affinität in vivo zu untersuchen; der Effekt von überexprimiertem GRK auf die Y326A-β2AR-Wechselwirkung mit βarr2-GFP wurde gezeigt.
Y326A-β2AR und βarr2-GFP wurden in HEK-239-Zellen, in Abwesenheit und Anwesenheit von cotransfiziertem GRK, cotransfiziert. Wenn die Phosphorylierung von GPCRs durch GRKs die Desensibilisierung durch die Erhöhung ihrer Affinität für β-Arrestine erleichtert, dann würde die Überexprimierung GRK in einem merklichen Unterschied der βarr2-GFP Translokation resultieren.
5 zeigt den Einfuß von überexprimiertem GRK auf die Wiederverteilung von βarr2-GFP in HEK-293-Zellen, welche das durch Y326A phosphorylierungsabgeschwächte β2AR enthalten. Zellen ohne (Zeile A) und mit (Zeile B) überexprimierten GRKs wurden einem Agonisten ausgesetzt und es wurde die Echtzeit-Wiederverteilung von βarr2-GFP beobachtet. Ohne hinzugefügten GRK, schritt, wie es in Zeile A von 5 gezeigt wird, die βarr2-GFP-Translokation als Antwort auf den Agonisten schlecht voran. Die βarr2-GFP-Translokation in Zellen, welche überexprimierten GRK (Zeile B) enthielten, war stabiler, was eine erhöhte Rezeptor-Affinität von βarr2-GFP und den Zusammenhang zwischen Phosphorylierung und β-Arrestin-Aktivität anzeigt.
BEISPIEL 8
Untersuchung zusätzlicher Rezeptoren in der β2AR/Rhodopsin-Unterfamilie
Es sind zwölf verschiedene Mitglieder der β2AR/Rhodopsin-Unterfamilie von GPCRs untersucht worden. Zellen, welche einen speziellen GPCR exprimieren und chimäre β-Arrestin-GFP-Proteine enthalten, wurden einem bekannten Agonisten ausgesetzt um den GPCR zu untersuchen. In allen Fällen wurde innerhalb von Minuten nach der Zugabe des GPCR-Agonisten eine sichtbare Translokation der chimären β-Arrestin-GFP-Proteine vom Zytosol der Zelle zur Zellmembran hervorgerufen (die Daten werden nicht gezeigt).

Claims

Konjugat, ein β-Arrestin-Protein und ein detektierbares Molekül umfassend, worin das detektierbare Molekül in der Lage ist, die intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen.
Konjugat gemäß Anspruch 1, das ein Fusionsprotein ist.
Konjugat gemäß Anspruch 1, worin das detektierbare Molekül ein optisch detektierbares Molekül und optional das grün fluoreszierende Protein ist.
Nukleinsäure-Konstrukt, eine Expressionskassette umfassend, wobei das Konstrukt in der 5'- zu 3'-Richtung einen Promoter und ein damit wirksam verbundenes Nukleinsäuresegment umfasst, wobei das Nukleinsäuresegment eine Sequenz umfasst, die ein Polypeptid kodiert, welches ein β-Arrestin-Protein und ein detektierbares Molekül umfasst, wobei dieses detektierbare Molekül in der Lage ist, die intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen.
Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4, worin die Nukleinsäuresequenz, die ein detektierbares Molekül kodiert, ein optisch detektierbares Molekül kodiert und optional das grün fluoreszierende Protein kodiert.
Nukleinsäure-Konstrukt gemäß der Ansprüche 4 oder 5, das irgendeines oder mehrere der folgenden Merkmale einschließt: (i) das Konstrukt umfasst weiterhin ein Plasmid; (ii) das Konstrukt ist ein DNA- oder RNA-Konstrukt und (iii) der Promoter ist ein β-Arrestin-Promoter.
Wirtszelle, die ein Nukleinsäure-Konstrukt gemäß irgendeinem der Ansprüche 4–6 enthält.
Wirtszelle, ein Nukleinsäuremolekül umfassend, wobei das Nukleinsäuremolekül in der 5'- zu 3'-Richtung einen in der Wirtszelle wirksamen Promoter, eine Nukleinsäuresequenz, die ein β-Arrestin-Protein kodiert und eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein detektierbares Molekül kodiert, wobei die kodierenden Nukleinsäuresequenzen operabel an den Promoter gebunden sind, worin das Nukleinsäuremolekül ein β-Arrestin-Protein exprimiert und worin das detektierbare Molekül in der Lage ist, die intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des β-Arrestin-Proteins anzuzeigen.
Zelle gemäß Anspruch 8, wobei die Zelle: (i) eine Säugetierzelle ist und optional eine HEK-293-Zelle oder eine COS-Zelle ist oder (ii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen
Substrat, auf dem eine Wirtszelle gemäß Anspruch 8 oder 9 aufgebracht ist.
Verfahren zur Bewertung der Stoffwechsel-Aktivität des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) unter Versuchsbedingungen, wobei die Versuchsbedingungen opti onal die Anwesenheit einer Test-Kinase oder eines Test-G-Proteins in einer Testzelle sind oder bedeuten, dass die Testzelle einem Test-Liganden ausgesetzt wird oder dass die Co-Expression eines zweiten Rezeptors in der Testzelle stattfindet, das Verfahren umfassend: (a) Bereitstellung einer Testzelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; (b) Exposition der Testzelle mit einem bekannten GPCR-Agonist unter Versuchsbedingungen und dann (c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Testzelle zum Membranrand der Testzelle; worin die Translokation des detektierbaren Moleküls in der Testzelle die Aktivierung des GPCR-Stoffwechsels anzeigt.
Verfahren zum Screenen eines β-Arrestin-Proteins oder dessen Fragments auf die Fähigkeit, einen phosphorylierten GPCR zu binden, umfassend: (a) Bereitstellung einer Zelle, die: (i) einen GPCR exprimiert und (ii) ein Konjugat enthält, das ein β-Arrestin-Test-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; (b) Exposition der Zelle mit einem bekannten GPCR-Agonist und dann (c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle; worin die Translokation des detektierbaren Moleküls in der Testzelle die Bindung des β-Arrestin-Proteins an den phosphorylierten GPCR anzeigt.
Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf die Agonist-Aktivität für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend: a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; b) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung, wobei sich die Testverbindung optional in wässriger Lösung befindet und dann c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Zellen optional auf einem Substrat aufgebracht sind; worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung GPCR-Agonist-Aktivität der Testverbindung anzeigt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, worin die Zelle irgendeinen oder mehrere der folgendenden exprimiert: (i) einen bekannten GPCR; (ii) einen unbekannten GPCR; (iii) einen wohlriechenden GPCR; (iv) einen β-adrenergischen GPCR.
Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, das weiterhin die Merkmale von Anspruch 3 und/oder Anspruch 9 einschließt.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13–15, worin die Zelle gewöhnlich einen GPCR exprimiert oder optional die Zelle transformiert worden ist, um einen GPCR zu exprimieren, der gewöhnlich von einer solchen Zelle nicht exprimiert wird.
Verfahren zum Screenen einer Probenlösung auf die Anwesenheit eines Agonist für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend: a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, welches ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; b) Exposition der Zelle mit einer Probenlösung und dann c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle; worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Probenlösung anzeigt, dass die Probenlösung einen Agonist für einen in der Zelle exprimierten GPCR enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 17, das weiterhin irgendein Merkmal oder mehrere Merkmale der Ansprüche 3, 9 oder 14 einschließt.
Verfahren zum Screenen einer Zelle auf die Anwesenheit eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR), umfassend: (a) Bereitstellung einer Testzelle, die ein Konjugat enthält, das ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; (b) Exposition der Testzelle mit einer Lösung, die einen GPCR-Agonist enthält und (c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle; worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Testzelle mit dem GPCR-Agonist anzeigt, dass die Testzelle einen GPCR enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 19, das weiterhin irgendeines der Merkmale von Anspruch 3 einschließt.
Verfahren zum Screenen einer Vielzahl von Zellen auf solche Zellen, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) enthalten, wobei die Zellen optional in Gewebe oder einem Organ enthalten sind, umfassend: (a) Bereitstellung einer Vielzahl von Testzellen, die ein Konjugat enthalten, das ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; (b) Exposition der Testzellen mit einem bekannten GPCR-Agonist oder einer Vielzahl von bekannten GPCR-Agonisten und c) Detektion solcher Zellen, in welchen das detektierbare Molekül vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle translokalisiert ist; worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle nach der Exposition mit dem GPCR-Agonist anzeigt, dass die Zelle einen GPCR für diesen bekannten GPCR-Agonist enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 21, das weiterhin irgendein Merkmal oder mehrere der Merkmale von Anspruch 3 einschließt.
Verwendung eines GPCR-translokalisierbaren beta-Arrestin-Proteins, das an ein detektierbares Molekül gekoppelt ist, zum Screenen einer Testverbindung auf GPCR-Agonist-Funktion, durch Detektion von intrazellulärer Translokation des beta-Arrestin-Proteins als Antwort auf die Exposition der Zelle mit der Testver bindung vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle.
Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf Antagonist-Aktivität für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend: (a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein β-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; (b) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung; (c) Exposition der Zelle mit einem GPCR-Agonist und d) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle, wobei die Zellen optional auf einem Substrat aufgebracht sind; worin die Exposition mit dem Agonist zur gleichen Zeit oder nachfolgend auf die Exposition mit der Testverbindung geschieht und worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung anzeigt, dass die Testverbindung kein GPCR-Antagonist ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, das weiterhin irgendein Merkmal oder mehrere der Merkmale der Ansprüche 3, 9 oder 14 einschließt.
Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf die Antagonist-Aktivität für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), wobei sich die Testverbindung optional in wässriger Lösung befindet, umfassend: (a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein β- Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst; (b) Exposition der Zelle mit einem GPCR-Agonist, so dass die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle eintritt; (c) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung, wobei die Zellen optional auf einem Substrat aufgebracht sind; wobei die Exposition mit dem Agonist vor der Exposition mit der Testverbindung eintritt und worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Membranrand der Zelle zum Zytosol der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung anzeigt, dass die Testverbindung GPCR-Antagonist-Aktivität besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 26, das weiterhin irgendein Merkmal oder mehrere der Merkmale der Ansprüche 3 oder 9 einschließt.
Verwendung eines GPCR-translokalisierbaren beta-Arrestin-Proteins, das an ein detektierbares Molekül gekoppelt ist, zum Screenen einer Testverbindung auf GPCR-Antagonist-Funktion, durch Detektion der Translokation des beta-Arrestin-Proteins vom Membranrand der Zelle zum Zytosol der Zelle als Antwort auf die Exposition der Zelle mit der Testverbindung.
Substrat, auf dem eine Vielzahl von Zellen aufgebracht sind, welche einen GPCR und ein markiertes β-Arrestin-Protein exprimieren, wobei die Markierung in der Lage ist, intrazelluläre Translokation und/oder Verteilung des Arrestins anzuzeigen.
Substrat gemäß Anspruch 29, das weiterhin irgendeines oder mehrere der Merkmale der Ansprüche 3, 9 oder 14 einschließt.
Substrat gemäß irgendeinem der Ansprüche 10, 29 oder 30, worin das Substrat hergestellt wird aus einem Material, ausgewählt aus Glas, Kunststoff, Keramik, Halbleiter, Kieselgel, Glasfaser, Diamant, biokompatiblen Monomer- und biokompatiblen Polymer-Materialien.