ES2182736T3 - Procedimientos de analisis de la actividad de receptores y constructos utiles en dichos procedimientos. - Google Patents

Abstract

Conjugado que comprende una proteína -arrestina y una molécula detectable, en el que la molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína -arrestina.

Description

Procedimientos de análisis de la actividad de receptores y constructos útiles en dichos procedimientos.

Investigación promovida por la federación

La presente invención se realizó con el soporte del Gobierno según las subvenciones nº HLO3422-02 y nº NS 19576 acordadas por los Institutos de la Salud. El Gobierno tiene determinados derechos en esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de detección de la actividad in vivo e in vitro del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) y proporciona procedimientos de análisis de la actividad de GPCR y procedimientos de identificación de ligandos GPCR, de la actividad de la cinasa del receptor acoplada a la proteína G (GRK) y compuestos que interactúan con componentes del proceso regulador de GPCR. Esta invención proporciona también constructos útiles en dichos procedimientos.

Antecedentes de la invención

Las acciones de muchas señales extracelulares están mediadas por la interacción de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las proteínas reguladores de la unión al nucleótido guanina (proteínas G). Los sistemas de señalización mediados por la proteína G se han identificado en muchos organismos divergentes, tales como mamíferos y levaduras. Las GPCR responden entre otras a señales extracelulares, neurotransmisores, hormonas, olfativos y a la luz. Los GPCR son similares y poseen numerosos aminoácidos muy conservados; se cree que los GPCR representan una gran "superfamilia" de proteínas. Los tipos de GPCR aislados activan una trayectoria particular de transducción de señales; al menos se conocen diez trayectorias diferentes de transducción de señales porque se activan mediante los GPCR. Por ejemplo, el receptor beta 2-adrenérgico (\betaAR) es un GPCR prototipo de mamífero. En respuesta a la unión del agonista, los receptores \betaAR activan una proteína G (G_{S}) que a su vez estimula la producción de adenilato ciclasa y de monofosfato de adenosina cíclico en la célula.

Se ha propuesto que los miembros de la superfamilia GPCR se desensibilizan mediante un mecanismo común que implica la fosforilación de la cinasa del receptor acoplado a la proteína G (GRK) seguida de la unión a la arrestina. Gurevich et. al., J. Biol. Chem. 270:720 (1995); Ferguson et. al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74:1095 (1996). Sin embargo, era desconocida la localización y la fuente del grupo de moléculas de arrestina dirigidas a receptores en respuesta a la activación del agonista. Además, excepto para un número limitado de receptores, no se ha establecido un papel común para la desensibilización de la \beta-arrestina en GPCR. Debido a las observaciones bioquímicas se propuso en primer lugar el papel de las \beta-arrestinas en la transcripción de la señal de GPCR.

Muchos fármacos terapéuticos disponibles en uso hoy en día se dirigen a los GPCR, ya que ellos median las respuestas fisiológicas vitales, incluyendo la vasodilatación, la frecuencia cardíaca, la broncodilatación, la secreción endocrina y la peristaltia de los intestinos. Véase p. ej.: Lefkowitz et. al., Ann Rev. Biochem. 52:159 (1983). Los GPCR incluyen los receptores adrenérgicos (alfa y beta); los ligandos a beta AR se utilizan en el tratamiento de la anafilaxia, el choque, la hipertensión, la hipotensión, el asma y otras enfermedades. Además, tiene lugar la activación espontánea de los GPCR, cuando se genera una respuesta celular a GPCR en ausencia de un ligando. El aumento de actividad espontánea puede disminuir por antagonistas del GPCR (proceso conocido como agonismo inverso); dichos procedimientos son terapéuticamente importantes cuando las enfermedades producen un aumento en la actividad espontánea de GPCR.

Esfuerzos como por ejemplo el Proyecto del Genoma Humano están identificando nuevos GPCR (receptores "sin interés comercial") cuyos papeles fisiológicos y ligandos son desconocidos. Se estima que varios millares de GPCR existen en el genoma humano. Con solo aproximadamente el 10% del genoma humano secuenciado, se han identificado 250 GPCR; mucho menos de 150 se han asociado a ligandos.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la presente invención consiste en un conjugado de una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable, en el que la molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína \beta-arrestina. La molécula detectable puede ser una molécula detectable de forma óptica, tal como la Proteína Verde Fluorescente. El conjugado puede ser una proteína de fusión.

Un aspecto adicional de la presente invención es un producto recombinante de ácido nucleico que comprende un casete de expresión. El constructo incluye, en el sentido 5' a 3', un activador y un segmento de ácido nucleico asociado de forma funcional al activador y el segmento de ácido nucleico codifica una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable en la que la molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína \beta-arrestina. La molécula detectable puede ser una molécula detectable de forma óptica tal como la Proteína Verde Fluorescente.

Un aspecto adicional de la presente invención es una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico que incluye, un activador operable en la célula huésped y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable en la que la molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína \beta-arrestina. La molécula detectable puede ser una molécula detectable de forma óptica, tal como la Proteína Verde Fluorescente. La célula puede ser una célula de mamífero, bacteriana, de levadura, micótica, vegetal o animal y puede estar depositada sobre un sustrato.

Otro aspecto de la presente invención consiste en un procedimiento de evaluación de la actividad de la trayectoria del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en las condiciones de ensayo, proporcionando una célula de ensayo que expresa un GPCR y que contiene un conjugado de una proteína \beta-arrestina, y una molécula visualmente detectable; exponiendo la célula de ensayo a un agonista de GPCR conocido en las condiciones de ensayo; y a continuación detectando la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplasmática de la célula de ensayo hasta el borde de la célula de ensayo. La transposición de la molécula detectable de la célula de ensayo indica la activación de la trayectoria de GPCR. Ejemplos de condiciones de ensayo incluyen la presencia en la célula de ensayo de una cinasa de ensayo y/o una G-proteína de ensayo, o la exposición de la célula de ensayo al ligando de ensayo, o la expresión conjunta en la célula de ensayo de un segundo receptor.

Otro aspecto de la presente invención consiste en un procedimiento para identificar la capacidad de una proteína \beta-arrestina (o un fragmento de una proteína \beta-arrestina) para unirse a un GPCR fosforilado. Se proporciona una célula que expresa un GPCR y que contiene un conjugado de una proteína \beta-arrestina de ensayo y una molécula visualmente detectable. La célula está expuesta a un agonista de GPCR conocido y a continuación se detecta la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplasmática celular hasta el borde de la célula. La transposición de la molécula detectable indica que la molécula \beta-arrestina se puede unir al GPCR fosforilado en la célula de ensayo.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un procedimiento para identificar la actividad del agonista receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en el compuesto de ensayo. Se proporciona una célula de ensayo que expresa un GPCR y contiene un conjugado de una proteína \beta-arrestina y una molécula visualmente detectable. Se expone la célula a un compuesto de ensayo y se detecta la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica celular hasta el borde de la membrana. El desplazamiento de la molécula detectable hasta el borde de la membrana después de la exposición de la célula al compuesto de ensayo indica la actividad agonista de GPCR del compuesto de ensayo. La célula de ensayo puede expresar un GPCR conocido o una variedad de GPCR conocidos o expresar un GPCR desconocido o una variedad de GPCR desconocidos. El GPCR puede ser, por ejemplo un GPCR olfativo o un GPCR \beta-adrenérgico. La célula de ensayo puede ser una célula de mamífero, bacteriana, de levadura, micótica, vegetal o animal.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un procedimiento para identificar la presencia de un agonista en la solución de la muestra en un receptor acoplado a la proteína G (GPCR). Se proporciona una célula de ensayo que expresa un GPCR y contiene un conjugado de una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable visualmente. La célula de ensayo se expone a una solución de muestra y se evalúa la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica celular hasta el borde de la membrana. El desplazamiento de la molécula detectable hasta el borde de la membrana después de la exposición a la solución de muestra indica que la solución de muestra contiene un agonista para un GPCR expresado en la célula.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un procedimiento para la identificación de la actividad antagonista del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en el compuesto de ensayo. Se proporciona una célula que expresa un GPCR y contiene un conjugado de una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable visualmente. La célula se expone a un compuesto de ensayo y a un agonista de GPCR y se detecta la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica celular hasta el borde de la membrana. Cuando la exposición al agonista tiene lugar al mismo tiempo o después de la exposición al compuesto de ensayo, el desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana después de la exposición al compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo no es un antagonista de GPCR.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un procedimiento para la identificación de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en el compuesto de ensayo. Se proporciona una célula de ensayo que expresa un GPCR y contiene un conjugado de una proteína de \beta-arrestina y una molécula detectable visualmente. Se expone la célula a un agonista de GPCR de modo que tenga lugar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula y a continuación la célula se expone al compuesto de ensayo. Cuando la exposición al agonista tiene lugar antes de la exposición al compuesto de ensayo, el desplazamiento de la molécula detectable desde el borde de la membrana de la célula hasta la solución citoplásmica después de la exposición de la célula al compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo tiene actividad antagonista para GPCR.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un procedimiento de identificación de la presencia de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en una célula. Se proporciona una célula de ensayo que contiene un conjugado de una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable visualmente. La célula de ensayo se expone a una solución que contiene un agonista de GPCR. Se detecta cualquier transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana. El desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana después de la exposición de la célula de ensayo a los agonistas de GPCR indica que la célula de ensayo contiene un GPCR.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un procedimiento para identificar las células que contienen un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en un conjunto de células. Se proporcionan un conjunto de estas células de ensayo que tienen un conjugado de una proteína \beta-arrestina y una molécula visualmente detectable y se exponen las células de ensayo a un conocido agonista de GPCR. Se identifican o se detectan las células en las que se traslada la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana. El desplazamiento de la molécula detectable hasta el borde de la membrana después de la exposición a un agonista de GPCR indica que la célula contiene un GPCR sensible a este agonista de GPCR. El conjunto de estas células de ensayo puede estar contenido en un tejido, un órgano o un animal sano.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un sustrato que tiene depositados sobre él una variedad de células que expresan un GPCR y que contienen una proteína \beta-arrestina marcada, en la que la marca es capaz de indicar transposición intracelular y/o distribución de la arrestina. Dichos sustratos se pueden preparar a partir de materiales de vidrio, plástico, cerámica, semiconductores, sílice, fibra óptica, diamante, monómero biocompatible o polímero biocompatible.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un modelo lineal de un conjugado de Proteína Verde Fluorescente (GFP) con \beta-arrestina2/S65T.

La Figura 2A proporciona los resultados de una transferencia de Western de los homogeneizados de las células HEK-293 que expresan el conjugado \betaarr2-GFP además de \beta-arrestina2 endógena. \betaarr2 indica la \beta-arrestina2 celular endógena; \betaarr2-GFP indica el conjugado \beta-arrestina2-GFP; los pesos moleculares aproximados están indicados a la derecha del gel. La banda 1 se trató con un anticuerpo anti-\betaarrestina; la banda 2 con anticuerpo anti-GFP.

La Figura 2B presenta el secuestro de \beta2AR en células COS con y sin \beta-arrestina2 sobreexpresada (dos barras a la izquierda) y con y sin \betaarr2-GFP sobreexpresada (dos barras a la derecha). La \beta-arrestina2 natural y la \betaarr2-GFP mejoró el secuestro de \beta2AR igualmente bien por encima de los niveles de control, produciendo un aumento de 2,5 y 2,4, respectivamente.

Figura 3A: Fotomicrografías por microscopía confocal demuestran la transposición de \betaarr2-GFP desde la solución citoplásmica (panel 1 a la izquierda) hasta la membrana (panel 2 a la derecha) en las células HEK-293 que contiene la \beta2AR, debido a la adición de isoproterenol al agonista \betaAR2. Bar = 10 micras.

Figura 3B: Fotomicografías por microscopía confocal demuestran la transposición de \betaarr2-GFP desde la solución citoplásmica (panel 1 a la izquierda) hasta la membrana (panel 2 a la derecha) en las células COS que contiene la \beta2AR, debido a la adición de isoproterenol al agonista \betaAR2. Bar = 10 micras.

La Figura 4 representa una célula HEK-293 que contiene 12CA5(HA) dirigida a \beta2AR (fotografías microscópicas confocales). La fila A presenta una célula después de la reorganización de \beta2AR en agregados de membrana plasmática. La fila B proporciona tres fotografías de la misma célula a 0,3 y 10 minutos (de izquierda a derecha) después de la adición de agonista. La redistribución de \betaarr2-GFP a la membrana celular está presentada por el aumento de la fluorescencia de la membrana con una pérdida correspondiente de fluorescencia de la solución citoplásmica. Las flechas indican las áreas de localización conjunta; bar = 10 micras.

La Figura 5 presenta la influencia de GRK expresada en la redistribución de \betaarr2-GFP en células HEK293 que expresan a \beta2AR alterada por fosforilación de Y326A. Se expusieron al agonista células sin (fila A) y con (fila B) GRK sobreexpresada y se observó la redistribución en tiempo real de \betaarr2-GFP. La transposición de \betaarr2-GFP en células que contienen GRK sobreexpresada (fila B) fue más robusta, indicando un aumento de afinidad de \betaarr2-GFP por el receptor. Bar = 10 micras.

La Figura 6A representa el tiempo inducido por el agonista dependiente de la transposición de \betaarr2-GFP a los receptores adrenérgicos de beta2 en una célula HEK-293 representativa.

La Figura 6B representa el transcurso del tiempo de una transposición inducida por el agonista de \betaarr2-GFP en receptores adrenérgicos beta2 en células HEK-293; este gráfico es cuantitativo y está basado en las respuestas de varias células.

La Figura 6C representa la transposición inducida por el agonista de \betaarr2-GFP a los receptores adrenérgicos de beta2 en células HEK-293 representativas a varias dosis de agonista.

La Figura 6D representa la dosis dependiente de la transposición inducida por el agonista de \betaarr2-GFP a los receptores adrenérgicos de beta2 en las células HEK-293; este gráfico es cuantitativo y está basado en las respuestas de un conjunto de células.

La Figura 6E evalúa la transposición de \betaarr2-GFP desde la solución citoplasmática celular a la membrana celular, en respuesta a la exposición al agonista del receptor (panel intermedio) y la exposición posterior al antagonista receptor (panel derecho)

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han determinado que la redistribución de \beta-arrestina desde la solución citoplasmática hasta la membrana plasmática tiene lugar en respuesta a la activación de los GPCR al agonista. Los presentes inventores demostraron un papel común de \beta-arrestina en la terminación de la transducción de la señal mediada por el agonista después de la activación por el agonista de los receptores. Los presentes inventores han ideado procedimientos convenientes para ensayar la estimulación por el agonista de los GPCR in vivo e in vitro en tiempo real. Aunque la farmacología de los miembros de la superfamilia GPCR difiere, los procedimientos de la presente invención utilizan la transposición de la \beta-arrestina para proporcionar una evaluación en tiempo real de una sola etapa de la función de GPCR para múltiples miembros distintos de la superfamilia GPCR. Los presentes procedimientos se pueden utilizar además para estudiar y comprender los mecanismos de las acciones de varios agentes terapéuticos. Los presentes inventores han determinado que un conjugado o híbridos que comprenden una molécula de arrestina y una molécula detectable (tal como una Proteína Verde Fluorescente) es útil en dichos procedimientos de análisis de la actividad de GPCR in vivo.

Debido a la importancia terapéutica de los GPCR, son deseables procedimientos para la rápida identificación de la actividad del ligando GPCR en los compuestos. Además, los procedimientos de identificación de interacciones en los GPCR sin interés comercial con conocidos y supuestos ligandos de GPCR contribuyen a caracterizar dichos receptores. Están disponibles procedimientos ópticos para estudiar la dinámica de la proteína marcada en las células íntegras, incluyendo la microscopía por video, la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueamiento y la transferencia de energía de resonancia. Sin embargo, dichos procedimientos son de utilidad limitada en el marcado de los GPCR para estudio, debido al nivel relativamente bajo de la expresión de GPCR y a las alteraciones en la función receptora que puede tener lugar después del direccionamiento o del marcado de la proteína receptora. El radiomarcado o el marcado fluorescente de los ligandos de ensayo se ha utilizado también en la identificación de los ligandos GPCR. Véase, p. ej. Atlas et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5490 (1977); la patente US nº 5.576.436 de McCabe et. al. (todas las patentes citadas en la presente memoria están incorporadas en ella en su totalidad). La introducción de epítopos extraños dentro del ADNc receptor para producir GPCR híbridos es actualmente una técnica habitual y mejora la detección de los GPCR por la tecnología de anticuerpo monoclonal. Sin embargo, dichas técnicas están limitadas en su aplicación a las células vivas. La patente US nº 5.284.746 de Sledziewski describe el híbrido de levadura-mamífero de los GPCR y los procedimientos de identificación de ligandos de GPCR que utilizan dichos receptores híbridos. La patente US nº 5.482.835 de King et. al. describe procedimientos para probar en células de levadura ligandos de los GPCR de mamífero. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas al estudio o a la identificación de los GPCR sin interés comercial requiere conocimiento previo de los ligandos o de los casos de transducción de señales y por lo tanto no son de aplicación general o universal.

La fosforilación de los GPCR consiste en un mecanismo que conduce a la desensibilización de los receptores; receptores a los que se ha estimulado continua o repetidamente la pérdida de sensibilidad, en tanto que las respuestas de otros receptores permanecen intactas. Véase Harden, Pharmacol, Rev. 35:5 (1983); Benovic et. al., Annu. Rev. Cell. Biol. 4:405 (1988). En un conjunto de células, las cinasas específicas han producido GPCR específicos. La desensibilización tiene lugar mediante la trayectoria siguiente: la ocupación del agonista por el receptor transforma el receptor en un sustrato apropiado para una cinasa asociada; \beta-arrestina se une al receptor fosforilado por la cinasa e impide la interacción posterior con la proteína G apropiada, además de iniciar tanto los procesos de interiorización como de resensibilización. Ferguson et. al., Science, 271:363 (1996); Lohse et. al., Science 248:1547 (1990). La desensibilización dependiente de \beta-arrestina se produce únicamente cuando se activa el GPCR por la unión del ligando y es un ejemplo de desensibilización homóloga (es decir el ligando desensibiliza únicamente sus receptores diana). Lohse et. al. (1990) y Attramadal et. al., J. Biol. Chem. 267:17882 (1992) proporciona el ADNc y la secuencias de aminoácido de la \beta-arrestina. Se conocen varias isoformas de \beta-arrestina; tal como se utiliza en la presente memoria, \beta-arrestina se refiere a todas las isoformas de \beta-arrestina, proteínas que tiene similitud de secuencia sustancial a éstas que son \beta-arrestinas funcionales y los fragmentos funcionales de las mismas. Los fragmentos funcionales de \beta-arrestina, sus isoformas y análogos, se pueden determinar utilizando técnicas conocidas en la materia.

Se conocen las moléculas detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos y ópticos. Las moléculas detectable de forma óptica incluyen marcas fluorescentes, tales como la fluoresceína disponible en el comercio y Texas Red. Las moléculas detectables útiles en la presente invención comprenden cualquier molécula biológicamente compatible que se pueda conjugar a una proteína \beta-arrestina sin comprometer la capacidad de la \beta-arrestina para interactuar con el sistema de GPCR y sin comprometer la capacidad la molécula detectable para ser detectada. Las moléculas conjugadas (o conjugados) de \beta-arrestina y las moléculas detectables (que también se pueden denominar "\beta-arrestinas marcadas de forma detectable") son útiles por lo tanto en la presente invención. Se prefieren las moléculas detectables capaces de ser sintetizadas por la célula que se ha de estudiar (p. ej., cuando la célula se puede transformar con ADN heterólogo de modo que se produzca el híbrido de la molécula detectable por la \beta-arrestina dentro de la célula). Se prefieren particularmente aquellas moléculas detectables que son intrínsecamente fluorescentes in vivo. Se pueden evaluar cualitativa o cuantitativamente las moléculas detectables adecuadas deben ser capaces de ser detectadas con suficiente solución dentro de una célula cuya transposición de la \beta-arrestina desde la solución citoplasmática hasta la membrana celular en respuesta a la unión del agonista GPCR. Actualmente se prefieren las moléculas detectables por medios ópticos.

Se han utilizado proteínas de fusión con secuencias de codificación para beta-galactosidasa, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana en los procedimientos de detección de la expresión genética y de interacciones de proteínas en las células. Sin embargo, estos procedimientos requieren sustratos añadidos exógenamente o cofactores. En los procedimientos de la presente invención, se prefiere una molécula marcadora intrínsecamente fluorescente, como por ejemplo GFP, ya que la detección de dicho marcador requiere únicamente de forma intracelular la radiación por la longitud de onda apropiada de la luz y no está limitada por el sustrato.

La Proteína Verde Fluorescente (GFP) se aisló en primer lugar de la medusa Aequorea victoria, y presenta una bioluminiscencia verde propia que se puede excitar ópticamente por luz azul o por transferencia de energía no radiactiva. Las secuencias de ADNc que codifican GFP y las proteínas de GFP son conocidas; véase, p. ej. Prasher et. al., Gene, 111:229 (1992). La estructura cristalina de GFP se describe en Ormo et. al., Science 273:1392 (1996). La GFP natural purificada absorbe la luz azul (al máximo a 395 nm con un pico menor a 470 nm) y emite luz verde (emisión del pico a 509 nm) (Morise et. al., Biochemistry, 13:2656 (1974); Ward et. al., Photochem. Photobiol., 31:611 (1980)). Se ha demostrado que GFP expresada en las células procarióticas y eucarióticas produce una fuerte fluorescencia verde cuando se excita por el UV próximo o por la luz azul (la patente US nº 5.491.084 de Chalfie y Prasher); como esta fluorescencia no requiere productos génicos adicionales de A. victoria, la formación de cromóforos no es específica de la especie y tiene lugar bien mediante la utilización de componentes celulares ubicuos o por autocatálisis. La expresión de GFP en Escherichia coli produce una fluorescencia verde fácilmente detectada que no se observa en las bacterias de referencia. Véase Chalfie et. al., Science 263:802 (1994); patente US nº 5.491.084. Las células que expresan las proteínas fluorescentes verdes se pueden separar de forma apropiada de las que no expresan la proteína mediante un clasificador celular activado por fluorescencia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, Proteína Verde Fluorescente se refiere a las diversas formas de GFP que se presentan en la naturaleza que se pueden aislar a partir de fuentes naturales, así como las GFP modificadas artificialmente que conservan capacidades fluorescentes de las GFP naturales. Tal como se describe en Ormo et. al., Science 273:1392 (1996), se han creado varios mutantes de GFP con excitación alterada y máxima emisión. Dos características de GFP de tipo natural que afectan su utilidad en las líneas celulares de mamífero son la necesidad de excitarlas en longitudes de onda UV para obtener una señal fluorescente máxima y la fluorescencia disminuida a temperaturas por encima de 23ºC. Sin embargo, el mutante S65T/GFP supera estas limitaciones. Heim et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501 (1994). Otras alteraciones en la secuencia de la proteína GFP que proporcionan moléculas biológicamente compatibles intrínsecamente fluorescentes serán puestas de manifiesto por expertos en la materia; se pueden realizar alteraciones de secuencia para alterar las características de solubilidad de la proteína, su longitud de onda de excitación y otras características, mientras conserven las propiedades fluorescentes útiles. Véase, p. ej. la patente US nº 5.625.048 de Tsien y Heim; el documento WO 9711091 (Bjorn, Poulsen, Thastrup y Tullin); el documento WO 9627675 (Haseloff, Hodge, Prasher y Siemering); el documento WO 9627027 (Ward); el documento WO 9623898 (Bjorn et. al.); el documento WO 9623810 (Heim y Tsein) y el documento WO 9521191 (Chalfie y Ward).

Las células útiles en los procedimientos de la presente invención incluyen las células eucarióticas y procarióticas, que incluyen pero no se limitan a las células bacterianas, células de levaduras, células micóticas, células de insectos, células de nematodos, células vegetales o animales. Las células animales adecuadas comprenden, pero no se limitan a las células HEK, células HeLa, células COS y varias células primarias de mamífero. Las células contenidas en animales sanos, que incluyen pero que no se limitan a nematodos, pez cebra (y otros animales transparentes o semitransparentes) y las moscas de la fruta, se pueden también utilizar en los procedimientos de la presente invención. Un modelo animal que expresa una proteína de fusión con molécula detectable por \beta-arrestina en todos sus tejidos o dentro de un órgano o tipo de tejido determinado, será útil para estudiar los objetivos celulares de ligandos de GPCR conocidos o desconocidos.

Las células útiles en los presentes procedimientos incluyen aquellas que expresan un GPCR conocido o una variedad de GPCR conocidos o que expresan un GPCR desconocido o una variedad de GPCR desconocidos. Tal como se utiliza en la presente memoria, una célula que expresa un GPCR es la que contiene este GPCR como receptor funcional en su membrana; las células pueden expresar de forma natural el/los GPCR(s) en cuestión, o pueden ser modificadas genéticamente para expresar el/los GPCR(s) en cuestión. Tal como se utiliza en la presente memoria, un receptor "desconocido" o "sin interés comercial" es aquel cuya función es desconocida y/o cuyos ligandos son desconocidos.

Presentes experimentos

Se ha utilizado la Proteína Verde Fluorescente (GFP) para estudiar las interacciones proteína a proteína en células vivas. Véase Kaether & Gerdes, FEBS Lett. 369:267 (1995); Olson et. al., J. Cell. Biol. 130:639 (1995). La Proteína Verde Fluorescente (GFP) es útil como molécula indicadora para las proteínas de fusión debido a su fluorescencia propia y a su plegamiento, que la aisla aparentemente de su pareja conjugada. Prasher et.al., Gene 111:229 (1992); Ormo et. al., Science 273:1392 (1996). Por ejemplo, una proteína con siete proteínas de transmembrana tan compleja como \beta2AR que es tres veces mayor que GFP, presenta bioquímica normal después de la conjugación de GFP a su terminal C. Barak et. al., Mol. Pharmacol. 51:177 (1997).

Los presentes inventores establecieron que una proteína de fusión que consta de una molécula de \beta-arrestina (\beta-arrestina2) conjugada a una GFP en su terminal C (\betaarr2-GFP, Figura 1) se expresa en las células y es biológicamente activa. La proteína de fusión \betaarr2-GFP es aproximadamente 50% mayor que la \beta-arrestina2 y este aumento de tamaño se refleja en su migración más lenta en SDS-Page (Figura 2A). La banda izquierda de la Figura 2A expuesta a un anticuerpo contra \beta-arrestina, demuestra que \betaarr2-GFP se desplaza más despacio que la \beta-arrestina2 endógena (banda del medio muy iluminada). La banda derecha de la Figura 2, tratada con un anticuerpo anti-GFP monoclonal, demuestra que la banda inferior no contiene realmente GFP.

\beta-2AR en general secuestra mal en las células COS y esto se ha correlacionado con la expresión relativamente escasa de \beta-arrestinas endógenas en células COS. Menard et. al., Mol. Pharmacol. 51:800 (1997); Zhang et. al., J. Biol. Chem. 271:18302 (1996). La sobreexpresión de \beta-arrestina exógena mejora el secuestro de \beta2AR en estas células, igualmente como se presenta en la presente memoria, la sobreexpresión de \betaarr2-GFP en las células COS aumentó la interiorización de \beta2AR (Figura 2B) demostrando que \betaarr2-GFP es biológicamente activa y equivalente a la \beta-arrestina natural.

Las pruebas bioquímicas indican que las \beta-arrestinas son principalmente proteínas citoplasmáticas. Ferguson et. al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74:1095 (1996). Los presentes inventores, utilizando microscopía confocal de \betaarr2-GFP en células HEK-293 (Figura 3A, panel izquierdo), confirmaron que \betaarr2-GFP se distribuye en toda la solución citoplasmática y está excluida del núcleo. Los datos presentes establecen así mismo por primera vez que la \beta-arrestina no está principalmente compartimentada en la membrana del plasma en ausencia de agonista pero que, en el momento de la adición de las concentraciones de saturación de un agonista al medio celular, la \beta-arrestina se traslada de la solución citoplásmica celular a la membrana celular. Cuando la \beta-arrestina está conjugada con una molécula detectable de forma óptica, como por ejemplo GFP, según se muestra en la presente memoria, tiene lugar un rápido y fácilmente observable aumento óptico de la membrana y una pérdida correspondiente de las señales ópticas de la solución citoplásmica (véase Figura 3A y 3B, en las que la fluorescencia de la membrana aumenta y la fluorescencia de la solución citoplasmática disminuye debido a la transposición de los híbridos de \beta-arrestina-GFP).

Para investigar si la transposición intracelular de \beta-arrestina dirigió los puntos de unión en la membrana plasmática aparte de en \beta2AR, los presentes inventores reticularon en primer lugar los receptores utilizando anticuerpos monoclonales. Como se describe en la presente memoria y se muestra en la Figura 4, la geometría de la transposición de \beta-arrestina dependiente del tiempo provocada por el agonista en la membrana plasmática simularon la distribución de los \beta2AR agregados previamente, lo que indica que el punto dirigido de la \beta-arrestina es realmente \beta2AR o un componente asociado.

Se ha propuesto que la fosforilación de los GPCR por las GRK facilita la desensibilización aumentando su afinidad por las \beta-arrestinas. Gurevich et. al., J. Biol. Chem. 268:16879 (1993); Gurevich et. al., J. Biol. Chem. 268;11628 (1993). Cuando se expresa en células HEK-293 y se expone al agonista, los mutantes Y326A-\beta2AR, no se fosforilan de forma significativa por los GRK endógenos (Ferguson et. al., J. Biol. Chem., 270:24782 (1995). Por lo tanto, los presentes inventores utilizaron este receptor mutante para investigar la cuestión anterior de la afinidad de la \beta-arrestina in vivo. Y326A-\beta2AR se cotransfectó con \betaarr2-GFP en las células HEK en ausencia y presencia de GRK cotransfectada. Si la hipótesis anterior fuese verdad, la inversión de la alteración por fosforilación por las GRK sobreexpresadas produciría una diferencia notable en la transposición de \betaarr2-GFP. Como se describe en la presente memoria, sin GRK añadido, la transposición de \betaarr2-GFP en respuesta al agonista procedió mal; con la adición de GRK, la transposición de la membrana plasmática fue mucho más robusta (Figura 5), indicando la importancia de la fosforilación en la actividad de la \beta-arrestina.

Los presentes inventores determinaron que la transposición de \beta-arrestina desde la solución citoplásmica celular a la membrana celular es un indicador de la estimulación del agonista de la actividad de GPCR, y que una proteína híbrida que comprende \beta-arrestina y la molécula GFP detectable era capaz de presentar en forma detectable la transposición en tiempo real de \beta-arrestina en respuesta a la activación del agonista de los GPCR.

Los resultados presentados en la presente memoria establecen que \beta-arrestina dirige los GPCR o una molécula asociada después de la unión del agonista y la fosforilación del receptor. Estos datos demuestran un comportamiento biológico de \beta-arrestina que se ha propuesto solamente para estudios bioquímicos y caracteriza por primera vez cómo los cambios de compartimentación de \beta-arrestina después del inicio de la transducción de la señal del receptor. La activación del agonista de un GPCR culmina por último en la asociación de las \beta-arrestinas con los GPCR, de este modo la visualización de los procesos de transposición de \beta-arrestina mediados por el agonista proporcionan un indicador universal de la activación de GPCR.

Los presentes inventores han demostrado que la transducción de la señal de GPCR produce un aumento rápido y sustancial en la cantidad relativa y absoluta de la \beta-arrestina unida a la membrana plasmática. La redistribución mediada del agonista de \beta-arrestina acoplada a una molécula detectable proporciona una amplificación óptica de las señales extracelulares transducidas por los GPCR y esto tiene lugar a la vez que, o dentro del mismo espacio de tiempo que, la amplificación química proporcionada normalmente por las cascadas del segundo mensajero. Los híbridos de \beta-arrestina y una molécula detectable son útiles en el estudio de la cinética de \beta-arrestina y del comportamiento relacionado con GPCR, tal como la endocitosis. Además, dichos híbridos son útiles como biosensores para la señalización cuando los GPCR llegan a estar activados y proporcionan procedimientos de identificación de la actividad de GPCR en compuestos y de identificación de sensibilidad del ligando en GPCR sin interés comercial. Además, la capacidad de cotransfectar los GRK para aumentar tanto la cantidad como la extensión de la transposición de \beta-arrestina indican que se pueden también utilizar los presentes procedimientos y constructos para controlar la actividad de GRK, así como para controlar fármacos, proteínas y compuestos para la activación o inhibición del proceso de GRK/\beta-arrestina.

La presente invención proporciona un procedimiento para identificar la actividad del agonista de GPCR en los compuestos, que comprende: a) proporcionar una célula que expresa un GPCR conocido o desconocido y que contiene una proteína híbrida que comprende una proteína \beta-arrestina y una proteína detectable a simple vista; b) exponer la célula a un compuesto de ensayo y c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula; cuando la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana de la célula indica la activación del GPCR y, por consiguiente, el efecto de activación del GPCR del compuesto de ensayo. La transposición de la proteína híbrida se pone de manifiesto por un aumento en la intensidad de la señal detectable localizada en el borde de la membrana (y/o una disminución de la solución citoplásmica), cuando el cambio tiene lugar después de la exposición al compuesto de ensayo. La transposición se puede detectar de este modo comparando los cambios en la señal detectable en la misma célula a lo largo del tiempo (es decir antes y después de la exposición al compuesto de ensayo). Por otra parte, una célula de ensayo se puede comparar con una célula de referencia (sin exposición al compuesto de ensayo) o una célula de ensayo se puede comparar a un patrón establecido previamente. Si un está disponible agonista conocido se pueden utilizar los presentes procedimientos para identificar y estudiar los antagonistas de GPCR. Además, la asociación a la membrana de \beta-arrestina se debería aumentar mediante la expresión de un exceso de receptor o mediante un GPCR constitutivamente activo que experimenta fosforilación por los GRK incluso en ausencia de agonista. Por consiguiente, los presentes procedimientos se pueden utilizar para controlar agonistas inversos de GPCR.

Los procedimientos para detectar la transposición intracelular de la proteína híbrida dependerán de la proteína detectable particular utilizada; un experto en la materia será capaz de prever fácilmente los procedimientos de detección adecuados para determinadas moléculas detectables, dadas a las instrucciones de la presente invención y el conocimiento en la técnica. En una forma de realización preferida, la proteína detectable a simple vista es una proteína verde fluorescente (GFP) tal como se describe más adelante.

Los procedimientos de la presente invención proporcionan resultados fácilmente detectables. La transposición de \beta-arrestina acoplada a una molécula detectable tal como GFP, en respuesta a la activación de GPCR, produce un aumento relativo de la señal detectable en el borde de la célula (es decir, en la membrana celular). Además, la disminución correspondiente en la señal detectable procedente de la solución citoplásmica celular significa que el "ruido de fondo" (señales detectables que no cambian en respuesta a la activación de GPCR) está minimizado. En determinadas células, la activación de los GPCR producirá una clarificación esencial de la señal detectable procedente de la solución citoplásmica y un aumento de 100 veces (o más) de la señal detectable en la membrana celular. En los presentes procedimientos, es preferible que la señal detectable en el borde de la membrana aumente, después de la activación de GPCR, al menos dos veces, más preferentemente al menos 3 veces y más preferentemente al menos 5 veces o al menos diez veces.

Tal como utiliza en la presente memoria, la introducción de una proteína quimérica dentro de una célula se puede realizar introduciendo en la célula (o en el ascendiente de las células) una secuencia o constructo de ácido nucleico (p. ej.: ADN o ARN) que codifica la proteína híbrida, y cultivando la célula en un medio que permita la expresión de la proteína híbrida. La introducción de los ácidos nucleicos que codifican la proteína híbrida o la introducción de la propia proteína, dentro de una célula se puede realizar por cualquiera de los muchos procedimientos adecuados que son conocidos en la técnica, incluyendo la transfección, electroporación, microinyección y administración de liposomas.

La presente invención proporciona un constructo de ADN que comprende un activador, un ADN que codifica una proteína \beta-arrestina asociada de forma funcional a éste y un ADN que codifica una proteína marcadora detectable a simple vista asociada de forma funcional a éste. El activador está asociado de forma funcional con el ADN codificador: el ADN que codifica \beta-arrestina puede estar en 5' a partir del ADN que codifica el marcador detectable a simple vista o viceversa. En una forma de realización preferida, el ADN que codifica un marcador detectable a simple vista codifica una proteína verde fluorescente (GFP). Los vectores que comprenden dichos constructos de ADN constituyen un aspecto adicional de la presente invención.

La presente invención proporciona además conjugados (tales como proteínas híbridas o proteínas de fusión) que comprenden una proteína \beta-arrestina y una proteína detectable a simple vista. En una forma de realización preferida, la proteína detectable a simple vista es una proteína verde fluorescente (GFP).

La presente invención proporciona además una célula que comprende una molécula de ADN, molécula de ADN que comprende, en el sentido de 5' a 3', un activador, un ADN que codifica una proteína \beta-arrestina asociada de forma funcional a ésta y un ADN que codifica una proteína marcadora detectable a simple vista asociada de forma funcional a ésta. En una forma de realización preferida, el ADN que codifica un marcador detectable a simple vista codifica una proteína verde fluorescente (GFP).

Las células de la presente invención se pueden utilizar para detectar la presencia de moléculas específicas en varios tipos de muestras tales como, p. ej.: muestras acuosas, muestras biológicas (por ejemplo sangre, orina o saliva), muestras ambientales o muestras industriales. En dichas utilizaciones, las células contienen un GPCR cuyos agonistas son conocidos. La activación del GPCR y la transposición correspondiente de la señal detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana indica la presencia del agonista del GPCR. Una célula utilizada en dicho procedimiento puede contener solamente un solo tipo de GPCR conocido o una variedad de GPCR conocidos. Dicha detección será útil con fines de diagnóstico médico y veterinario; con fines industriales y para la identificación de fármacos o productos químicos de adicción o de toxinas biológicas que afectan la transducción de las señales mediadas por GPCR.

Las células de la presente invención se pueden depositar sobre, fijarse a, ser soportadas por o inmovilizadas sobre un sustrato. El sustrato puede ser de cualquier material adecuado que no sea nocivo o perjudicial para las células vivas depositadas sobre él, es decir, que sea biocompatible con la materia vivo depositada sobre él. El sustrato puede ser rígido, semirrígido o flexible; y puede ser opaco, transparente o semitransparente. El tamaño, geometría y otras características físicas del sustrato pueden estar dictados por la utilización a que se destinen, como es evidente para cualquier experto en la materia. Los sustratos adecuados incluyen, pero no están limitados a, plásticos, vidrio, cerámica, sílice, monómero biocompatible y composiciones de polímeros, materiales semiconductores, materiales de fibra óptica, poliestireno, membranas, sephadex y materiales bioorgánicos. Ejemplos de materiales biocompatibles se proporcionan en las patentes US nº 5.578.079; nº 5.575.997 y nº 5.582.834 de Leung y Clark y la nº 5.522.896 de Prescott.

La presente invención proporciona procedimientos para la identificación de la presencia de un agonista de GPCR en una solución que comprende: a) proporcionar una célula que expresa un GPCR conocido o desconocido y que contiene una proteína híbrida que comprende una proteína \beta-arrestina y una proteína detectable a simple vista; b) exponer la célula a una solución de ensayo y c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula; cuando la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana de la célula indica la activación del GPCR y, por consiguiente, el efecto agonista del GPCR de la solución de ensayo. La transposición de la proteína híbrida se pone de manifiesto tal como se describió anteriormente.

La presente invención proporciona además procedimientos para la identificación de la presencia de un antagonista de GPCR en una solución que comprende: a) proporcionar una célula que expresa un GPCR y que contiene una proteína híbrida que comprende una proteína \beta-arrestina y una proteína detectable a simple vista; b) exponer la célula a un compuesto de ensayo; a continuación c) exponer la célula a un agonista conocido al GPCR expresado en la célula; y d) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula. Si el compuesto de ensayo contiene un antagonista, se retardará la transposición de la molécula detectable durante un período de tiempo correspondiente a la duración de la acción del antagonista sobre el receptor (período de tiempo que variará en función del antagonista y/o del receptor). La transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana de la célula indica la activación del GPCR por el agonista. Por consiguiente, cuando la transposición no tiene lugar o se retarda (en comparación con lo que ocurriría en ausencia del compuesto de ensayo), el compuesto de ensayo contiene un antagonista en el GPCR. La ausencia o retardo de la transposición se puede evaluar por comparación con una célula de referencia (no expuesta al compuesto de ensayo) o a un patrón determinado previamente. La transposición de la proteína híbrida se pone de manifiesto tal como se describió anteriormente. La exposición al compuesto de ensayo y el agonista conocido puede tener lugar esencialmente a la vez o la exposición al agonista puede tener lugar después de la exposición al compuesto de ensayo. Tal como se utiliza en la presente memoria, exposición posterior se refiere a la exposición comprendida en el período de tiempo durante el cual es de esperar que el antagonista potencial interactúe con el GPCR (es decir, uniéndose a o unido al GPCR).

La presente invención proporciona además procedimientos de identificación de una célula para la presencia de un GPCR, que comprende: a) proporcionar una célula de ensayo; b) introducir dentro de la célula de ensayo una proteína híbrida que comprende una proteína \beta-arrestina y una proteína detectable a simple vista; y a continuación c) exponer la célula a la solución de ensayo que contiene un agonista conocido para un GPCR; y d) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula; cuando la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde la membrana de la célula indique la activación de un GPCR y, por consiguiente, que la célula de ensayo contiene dicho GPCR. La transposición de la proteína híbrida se pone de manifiesto tal como se describió anteriormente.

La presente invención proporciona además procedimientos de identificación de la presencia de células en una población celular que contiene los GPCR, que comprende: a) proporcionar una población de células de ensayo, conteniendo dichas células de ensayo proteínas híbridas que comprenden una proteína \beta-arrestina y una proteína detectable a simple vista; y a continuación b) exponer la población celular a una solución de ensayo que contiene un agonista de un GPCR; y d) detectar las células en las que tiene lugar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula; cuando la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde la membrana de una célula indique la activación de un GPCR y, por consiguiente, que la célula en cuestión contiene un GPCR. La transposición de la proteína híbrida se pone de manifiesto tal como se describió anteriormente. La población de las células que se ha de identificar incluye una colección de células aisladas, un tejido que comprende diversas células similares, un órgano que comprende diversas células relacionadas o un organismo que comprende diversos tejidos y órganos.

Tal como se utiliza en la presente invención, "exponer" una célula a un compuesto o solución de ensayo significa poner el exterior de la célula en contacto con el compuesto o la solución de ensayo. Cuando se está identificando la actividad del ligando de GPCR en el compuesto o en la solución de ensayo, la exposición se realiza en condiciones que permitan la unión de un ligando de GPCR a un receptor expresado en esta célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, "transposición" de \beta-arrestina se refiere al desplazamiento de la molécula de \beta-arrestina desde una zona a otra de la célula.

Los presentes procedimientos se pueden utilizar además para evaluar o estudiar los efectos de cualquier molécula en la trayectoria de GPCR que ejerce su efecto corriente arriba de la unión de \beta-arrestina (es decir antes que la \beta-arrestina se una al GPCR fosforilado). Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos para evaluar las funciones de la trayectoria de GPCR en general. Tal como se utiliza en la presente memoria, la trayectoria de GPCR se refiere a la serie de sucesos que comienzan con la activación del agonista de un GPCR seguido de la desensibilización del receptor mediante la fosforilación del receptor cinasa acoplado a la proteína G (GRK) y de la unión de la \beta-arrestina.

En un sentido amplio la presente invención proporciona de este modo un procedimiento para identificar la capacidad de los compuestos de ensayo y condiciones de ensayo para afectar (activar o inhibir, aumentar o disminuir) una trayectoria de GPCR y proporciona procedimientos de evaluación de la función de la trayectoria de GPCR en una célula en general. En los presentes procedimientos, el alcance de la transposición de la \beta-arrestina está indicado por el grado de cambios detectables en la célula; la extensión de la transposición de la \beta-arrestina es un indicador de la extensión de la terminación de la trayectoria de GPCR. El alcance relativo de la transposición en condiciones variadas de ensayo se puede comparar o una condición de ensayo se puede comparar a una condición de referencia o a un patrón determinado previamente.

Por ejemplo, la especificidad y los efectos de varias cinasas (incluyendo las conocidas que interactúan con las trayectorias de GPCR y las no conocidas previamente que interactúan con los GPCR) para un GPCR específico o se puede evaluar un grupo de GPCR proporcionando una cinasa de ensayo a la célula de ensayo que expresa un GPCR y que contiene una molécula de \beta-arrestina detectable, exponiendo la célula a un agonista de GPCR y evaluando la transposición de la \beta-arrestina detectable desde la solución citoplásmica a la membrana celular (véase el Ejemplo 7 en la presente memoria). La transposición de la \beta-arrestina a la membrana celular indica que la cinasa de ensayo, en respuesta a la ocupación por el agonista del receptor, es capaz de unirse y fosforilar el receptor, de modo que la \beta-arrestina se unirá a continuación al receptor fosforilado por la cinasa e impedirá la interacción posterior con la proteína G apropiada. De forma similar, se puede evaluar la función de las cinasas alteradas, recombinantes o mutantes; se puede identificar la capacidad de los compuestos para activar o inhibir la trayectoria de GPCR, las cinasas receptoras acopladas a la proteína G o la unión a la \beta-arrestina; y se puede evaluar la función de las proteínas G. Por ejemplo, se pueden evaluar las siguientes condiciones de ensayo utilizando procedimientos como los descritos en la presente memoria: los efectos de las proteínas G (incluyendo las proteínas G naturales, heterólogas o alteradas artificialmente) dentro de la célula de ensayo; la exposición de la célula de ensayo a conocidos o supuestos ligandos de GPCR y la expresión conjunta de segundo receptor en la célula de ensayo que expresa un GPCR.

Además todavía, los presentes procedimientos permiten la identificación de la capacidad de las \beta-arrestinas (naturales, introducidas artificialmente o alteradas, mutantes o recombinantes) para unirse a un GPCR fosforilado. En dichos procedimientos, la \beta-arrestina de ensayo está conjugada con una molécula detectable tal como GFP, y se coloca en el interior de una célula que contiene un GPCR. La célula está expuesta a un conocido agonista del GPCR y se detecta la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula. La transposición de la molécula detectable indica que la proteína \beta-arrestina de ensayo es capaz de unirse al GPCR fosforilado. Como en otros procedimientos de la presente invención, la transposición se puede comparar con una célula de referencia que contiene una \beta-arrestina conocida o a un patrón determinado previamente.

Receptores acoplados a la proteína G

Los GPCR adecuados para su utilización en los presentes procedimientos son aquellos en los que la unión al agonista produce la fosforilación de la cinasa receptora acoplada a la proteína G (GRK); la transposición de la arrestina desde la solución citoplásmica de la célula a la membrana de la célula tiene lugar posteriormente. Como se cree que prácticamente todos los miembros de la superfamilia GPCR se desensibilizan a través de este mecanismo común, los ejemplos de los tipos adecuados de GPCR, incluyen pero no están limitados a, los receptores beta y alfa adrenérgicos; los neurotransmisores (tal como la dopamina) que se unen a los GPCR; las hormonas que se unen a los GPCR; la clase de receptores olfativos (receptores del sabor, olor y quimiotácticos, tal como se encuentran en la mucosa nasal y en la lengua y/o en el esperma, huevo, células del sistema inmunitario y células de la sangre); la clase de los GPCR de tipo II que incluye secretina, glucagón y otros receptores del aparato digestivo; los GPCR activados por la luz tal como la rodopsina) y miembros del tipo III de la familia de los GPCR que incluyen, pero no están limitados a, receptores de glutamato metabotópicos y receptores de GABA_{B}. Además de los GPCR naturales, los GPCR se pueden modificar genéticamente o crear específicamente por mutagénesis aleatoria. Dichos GPCR no naturales se pueden también utilizar e identificar mediante los presentes procedimientos. Los procedimientos se pueden utilizar con cualquier proteína del receptor de membrana en la que la unión al agonista produzca la transposición de la \beta-arrestina. Dichos receptores incluyen los factores de crecimiento que señalan a través de las proteínas G:

Procedimientos de identificación automáticos

Los procedimientos de la presente invención se pueden automatizar para proporcionar procedimientos apropiados, en tiempo real de alto volumen de identificación de la actividad del ligando de GPCR en los compuestos, o de identificación de la presencia de un ligando de GPCR en una muestra de ensayo. Los procedimientos automáticos se diseñan para detectar el cambio en la concentración de la \beta-arrestina marcada en la membrana celular y/o en solución citoplásmica después de la exposición al agonista GPCR. La alteración de la distribución de la \beta-arrestina se pude detectar a lo largo del tiempo (es decir, comparando la misma célula antes y después de la exposición de una muestra de ensayo), o por comparación con una célula de referencia que está expuesta a la muestra de ensayo o por comparación con indicios establecidos previamente. Tanto las evaluaciones cualitativas (positivas/negativas) como las evaluaciones cuantitativas (grado comparativo de transposición) pueden ser proporcionadas por los presentes procedimientos automáticos, como es evidente para los expertos en la técnica.

Por lo tanto otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos para la identificación automática de la actividad de GPCR, detectando la transposición de \beta-arrestina marcada de forma detectable desde la solución citoplásmica celular a la membrana celular en respuesta a la activación por el agonista de los GPCR. La transposición puede estar indicada por una alteración en la distribución de una señal detectable dentro de una célula a lo largo del tiempo, entre una célula de ensayo y una célula de referencia o por comparación con los parámetros establecidos previamente. En particular, según una forma de realización de la presente invención, se proporcionan muchas de las células que expresan los GPCR y que contienen proteínas híbridas que comprenden una molécula detectable y una molécula de \beta-arrestina. Los indicios de la distribución de las moléculas detectables se miden a continuación utilizando técnicas convencionales. En varias formas de realización, (a) la medición de los indicios ópticos tiene lugar antes y después de la adición de una muestra de ensayo a una célula y se comparan las mediciones en el punto de tiempo; (b) se miden los indicios ópticos en la célula de ensayo expuesta a una muestra de ensayo y en una célula de referencia no expuesta y se comparan estas mediciones; y (c) la medición de una célula de ensayo después de la adición de una muestra de ensayo se compara con los parámetros establecidos previamente. Los indicios ópticos que se miden pueden ser señales fluorescentes (p. ej.: intensidades fluorescentes) si la molécula detectable de la proteína \beta-arrestina híbrida es un indicador fluorescente tal como GFP. Otros indicios ópticos que son adecuados para la medición en tiempo real se pueden también utilizar como es evidente para los expertos en la técnica.

Se puede utilizar un aparato para determinar la respuesta de GPCR a una muestra de ensayo. Este aparato comprende medios, tales como una herramienta de medición de fluorescencia, para medir indicios de la distribución intracelular de las proteínas detectables de \beta-arrestina en al menos una célula de ensayo y opcionalmente también en una célula de referencia o para calibración. Los puntos de medición pueden ser a lo largo del tiempo o entre las células de ensayo y de referencia. Un programa informático controla la operación de los medios de medición y realiza operaciones numéricas en relación con las etapas descritas anteriormente. El programa informático preferido comprende un medio de almacenamiento legible por el ordenador que tiene medios de código del programa legibles por el ordenador incorporados en el medio. El sistema informático adecuado para su utilización en dicho aparato automático es evidente para los expertos en la técnica y puede incluir controladores del ordenador, manipuladores de la muestra automática, herramientas de medición de fluorescencia, impresoras y pantallas ópticas. La herramienta de medición puede contener uno o más fotodetectores para medir las señales de fluorescencia procedentes de las muestras en las que se utilizan moléculas detectables por fluorescencia en el constructo detectable de \beta-arrestina. La herramienta de medición puede también contener un motor fotorrepetidor controlado por el ordenador de forma que cada muestra de referencia y/o de ensayo se puede clasificar como una disposición de muestras y estar colocadas de forma automática y repetida en frente de un fotodetector durante la etapa de medición de la intensidad de la fluorescencia.

La herramienta de medición se acopla a un controlador del ordenador para fines o aplicaciones específicas o universales. El controlador comprende preferentemente un programa informático para controlar la operación de la herramienta de medición y realizar operación aritméticas relacionadas con las etapas descritas anteriormente. El controlador puede aceptar la instalación y otros datos relacionados mediante un archivo, entrada de disco o conductor de datos. Se puede también disponer de una pantalla y una impresora para presentar de forma visual las operaciones realizadas por el controlador. Los expertos en la técnica deben entender que las funciones realizadas por el controlador se pueden realizar en la totalidad o en parte de los módulos del programa informático que se realizan en un sistema informático general. Por otra parte, se puede proporcionar un sistema autónomo dedicado en la aplicación de circuitos integrados específicos para realizar las funciones y las operaciones descritas anteriormente.

Como se dispuso anteriormente, los indicios de la distribución de \beta-arrestina pueden tomar la forma de señales fluorescentes, aunque los expertos en la técnica apreciarán que se conocen otros indicios y se pueden utilizar en la puesta en práctica de la presente invención, tal como se puede proporcionar mediante marcas que producen señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción o absorción de rayos X o magnestismo. Dichas marcas incluyen, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (p. ej.: ^{32}P o ^{125}I) y reactivos densos en electrones.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, ADN (o ARN) exógeno o heterólogo se refiere al ADN (o ARN), que se ha introducido en una célula (o en el antecesor de la célula) por aportación humana. Dichos ADN heterólogos puede ser una copia de una secuencia que se encuentra en forma natural en la célula que se está transformando o una secuencia que no se encuentra en forma natural en la célula que se está transformando o fragmentos de las mismas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que incorpora (1) señales reguladoras (5') corriente arriba que incluyen un activador, (2) una zona de codificación que especifica el producto, la proteína o el ARN del gen, (3) señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que incluyen las zonas (3') corriente abajo y (4) secuencias asociadas requeridas para la expresión eficaz y específica.

El empleo de la frase "similitud sustancial de secuencia" en la presente memoria se refiere a las secuencias de ADN, ARN o de aminoácidos que presentan variaciones ligeras y sin consecuencia de una secuencia en cuestión y se consideran que son equivalentes a la secuencia en cuestión. A este respecto, "variaciones ligeras y sin consecuencia de la secuencia" significa que las secuencias "similares" (es decir secuencias que presentan similitud sustancial de la secuencia) serán funcionalmente equivalentes. Las secuencias funcionalmente equivalentes funcionarán prácticamente de la misma manera que producen sustancialmente las mismas composiciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "secuencia de ADN no modificada" o una "secuencia de ADN natural" significa una secuencia de ADN que se puede aislar de células o tejidos no transgénicos. Las secuencias de ADN no modificadas son aquellas que no se han alterado artificialmente, como por ejemplo por mutagénesis dirigida a la zona. Una vez se han identificado las secuencias de ADN no modificadas, se pueden sintetizar o producir por vía química las moléculas de ADN que tienen secuencias de ADN no modificadas utilizando procedimientos de ADN recombinantes tal como se conocen en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "un elemento regulador" de un gen es la secuencia de ADN que es necesaria para la expresión del gen, tal como un activador. En la presente invención, el término "unido e forma funcional" significa que después de dicha unión un elemento regulador puede dirigir la expresión de una secuencia unida al ADN.

El término "activador" se refiere a la zona de una secuencia de ADN que incorpora las señales necesarias para la expresión eficaz de una secuencia de codificación. Éste puede incluir secuencias en las que se une una ARN polimerasa, pero no está limitado a dichas secuencias y puede incluir zonas en las que se unen otras proteínas reguladoras junto con zonas implicadas en el control de la traducción de la proteína y puede incluir secuencias de codificación. Los activadores adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica y variarán en función de la célula en la que se debe expresar el ADN. Un activador adecuado para su utilización en los constructos de ADN que codifican un constructo de la molécula detectable por \beta-arrestina puede ser un activador natural que se encuentra en la célula y cuya expresión se desea; opcionalmente, se puede utilizar el activador de la \beta-arrestina dentro del constructo. Tanto los activadores inducibles como los constitutivos se contemplan para su utilización en la presente invención.

Constructos de ADN

Los constructos de ADN o los "casetes de expresión" de la presente invención incluyen, 5' a 3' en el sentido de la transcripción, un activador, una secuencia de ADN asociada de forma funcional al activador y, opcionalmente, una secuencia de terminación que incluye la señal de terminación para la ARN polimerasa y una señal de poliadenilación para la poliadenilasa. Todas estas zonas reguladoras deberían ser capaces de operar en la célula que se ha de transformar. Las señales de terminación adecuadas para un constructo de ADN dada será evidentes para los expertos en la técnica.

El término "asociado de forma funcional" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las secuencias de ADN en una sola molécula aislada de ADN que están asociadas de modo que la función de una está afectada por la otra. Por lo tanto, un activador está asociado de forma funcional al ADN cuando es capaz de afectar a la transcripción de este ADN (es decir, el ADN está bajo el control transcripcional del activador). Se dice que el activador está "corriente arriba" del ADN, que a su vez se dice que está "corriente abajo" del activador.

El casete de expresión o de transcripción se puede proporcionar en un constructo de ADN que asimismo tiene por lo menos un sistema de replicación. Por comodidad, es frecuente tener un sistema de replicación funcional Escherichia coli, como por ejemplo Co1E1, pSC101, pACYC184 o similares. De esta manera, en cada etapa después de cada manipulación, el constructo resultante se puede clonar, secuenciar y determinar la exactitud de la manipulación. Además o en lugar del sistema de replicación de E. coli, se puede emplear un sistema de replicación de intervalo amplio en el huésped, tales como los sistemas de replicación de los plásmidos de incompatibilidad con P-1, p. ej.: pRK290. Además del sistema de replicación, existirá con frecuencia al menos un marcador presente, que puede ser útil en uno o más huéspedes o diferentes marcadores para los huéspedes individuales. Esto es, se puede emplear un marcador para la selección en un huésped procariótico, mientras que se puede emplear otro marcador para la selección en un hésped eucariótico. Los marcadores pueden constituir una protección frente a un biocida, tales como antibióticos, toxinas, metales pesados o similares; pueden proporcionar complementación, comunicando fototrofía a un huésped auxótrofo; o pueden proporcionar un fenotipo visible mediante la producción de un compuesto nuevo en la planta.

Los diversos fragmentos que comprenden los diversos constructos, casetes de expresión, marcadores y similares se pueden introducir consecutivamente por escisión de la enzima de restricción de un sistema de replicación apropiado y la inserción del constructo o del fragmento particular en la zona disponible. Después de la ligadura y de la clonación se puede aislar el constructo de ADN para su manipulación posterior. Todas estas técnicas se ejemplifican ampliamente en la bibliografía tal como son ejemplificadas por J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).

Los ejemplos que siguen se indican para ilustrar la presente invención, y no se deben considerar como limitantes de la misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, \betaarr2-GFP = proteína verde fluorescente \beta-arrestina2; GFP = proteína verde fluorescente; GPCR = receptor acoplado a la proteína G; \betaARK = cinasa del receptor beta adrenérgico; GRK = cinasa del receptor acoplado a la proteína G; \beta2AR = receptor beta 2 adrenérgico: HEK-293 = células embrionarias del riñón humano; DMEM = medio Eagle modificado por Dulbecco y MEM = Medio Esencial Mínimo.

Ejemplo 1 Materiales y procedimientos

Materiales: se adquirió isoproterenol en Sigma RBI. Se adquirió anticuerpo anti-ratón en Sigma Chemicals o en Molecular Probes. El anticuerpo monoclonal de ratón contra el epítopo 12CA5 se adquirió en Boehringer Mannheim. El medio de cultivo celular se adquirió en Mediatech y el suero bovino fetal en Atlanta Biologicals. Los tampones fisiológicos fueron de Gibco-Life Technologies Inc. Las enzimas de restricción se adquierieron en Promega o New England Biolabs, la ligasa T4 fue de Promega y Hot Tub ADN polimerasa de Amersham. Los plásmidos disponibles en el comercio que contienen variantes de Proteína Verde Fluorescente se adquirieron en Clontech.

Cultivo y transfección de células: Células HEK-293 y COS se mantuvieron y se transfectaron como describe Barak et al., Mol. Pharm. 51:177 (1997). Las células que contienen receptor beta2adrenégico y constructos de \beta-arrestina se trasnfectaron con 5 a 10 \mug de ADNc del receptor en pcADN1/AMP y 0,5 a 1 \mug de ADNc de \betaarr2-GFP por placa de 100 mm. Se expresaron los GRK utilizando 5 \mug de ADNc transfectado en pcADN1/AMP por placa.

Microscopía confocal: Células HEK-293 transfectadas descritas anteriormente se colocaron en placas de 35 mm que contenían un pocillo de 1 cm centrado, formado en un orificio en el plástico sellado por un cubreobjetos de vidrio. Se realizó el marcaje del anticuerpo primario y secundario de las células vivas a 37ºC durante 30 minutos en medio sin suero en un incubador con CO_{2} al 5%. Se lavaron las células tres veces entre aplicaciones. Se observaron al microscopio confocal de barrido con láser Zeiss células en placas como anteriormente en MEM o DMEM tamponado con Hepes 20 mM.

Secuestro: Se realizó el análisis citométrico de flujo utilizando técnicas conocidas en la materia, tal como describe Barak et al., J. Biol. Chem. 269:2790 (1994)

Ejemplo 2 Constructo del plásmido de \beta-arrestina2-GFP

Se utilizó como plantilla el ADNc de \beta-arrestina2 en el plásmido pCMV5. Se utilizaron cebadores de oligonucleótido que rodean una zona de restricción distal de XhoI y el codón de terminación del C-terminal de \beta-arrestina2 para sustituir el codón de terminación por una zona de restricción de BamHI del marco por mutagénesis dirigida (Valette et al. Nucleic Acids Res. 17:723 (1989); Attramadal et al., J. Biol. Chem. 267:17882 (1992); Lohse et al., Science 248:1547 (1990)). Se aisló el segmento BamHI, de XhoI. Este segmento se unió a la porción N-terminal del ADNc de \beta-arrestina (corte desde pCMV5 por SacI y XhoI) en el policonectador de un plásmido que había sido digerido previamente con SacI y BamHI y que contenía Proteína Verde Fluorescente con S65T distal y en el marco hasta el sitio de la inserción del ADNc en \beta-arrestina. Lohse et al., Science 248:1547 (1990). Se aisló el constructo de \beta-arrestina-GFP resultante después de la inserción y del crecimiento en E. coli. Los constructos se comprobaron por secuenciado.

En la Figura 1 se proporciona un modelo lineal del conjugado de \beta-arrestina2/S65T-GFP.

Ejemplo 3 Caracterización de \betaarr2-GFP expresada por las células HEK-293

Se estudiaron homogeneizados de células HEK-293 transformadas con el plásmido del Ejemplo 2 utilizando técnicas conocidas de transferencia de Western. Los resultados demuestran que las células HEK-293 expresaron tanto la \beta-arrestina endógena como el conjugado \betaarr2-GFP.

Se transformaron transferencias de Western de los homogeneizados de las células HEK-293 transfectadas con el plásmido del Ejemplo 2 y que expresan \betaarr2-GFP. Se cargó una cantidad igual de material de homogeneizado en cada una de las dos bandas (Figura 2A). La banda izquierda se expuso al anticuerpo anti-\betaarrestina (Menard et al., Mol. Pharm. 51:800 (1997)), mientras que la banda izquierda se expuso a un anticuerpo monoclonal de ratón frente a GFP. La proteína de fusión de \betaarr2-GFP es aproximadamente el 50% mayor que \beta-arrestina2 y, por lo tanto, es de esperar que migre más lentamente que la \beta-arrestina en SDS-Page.

La exposición al anticuerpo anti-\betaarrestina puso de manifiesto barras múltiples (banda izquierda); la exposición al anticuerpo monoclonal anti-GFP puso de manifiesto una sola barra (banda derecha). La posición de la \beta-arrestina2 celular endógena está indicada por la barra intermedia en la banda izquierda (\betaarr2). La banda pesada justo por debajo de 71.000 en la banda izquierda (\betaarr2-GFP) es reflejada por una banda similar en la banda derecha. En cambio no se observa ninguna banda correspondiente a la \beta-arrestina 2 celular endógena con la exposición del anticuerpo anti-GFP. El tratamiento de la banda derecha con anticuerpo anti-GFP demostró que la banda más lenta marcada por el anticuerpo anti-\betaarrestina contenía GFP.

Ejemplo 4 Actividad biológica del conjugado \betaarrestina-GFP

La actividad de \beta-arrestina se puede evaluar indirectamente midiendo su efecto sobre el secuestro del receptor (véase Menard et al., Mol. Pharm. 51:800 (1997); Ferguson et al., Science 271:363 (1996)). El \beta2AR normalmente secuestra mal en las células COS y esto se ha correlacionado con la expresión relativamente mala de las \beta-arrestinas endógenas (véase Menard et al., Mol. Pharmacol. 51:800 (1997); Ferguson et al., Science 271:363 (1996)). La sobreexpresión de \beta-arrestina endógena mejora el secuestro de \beta2AR en estas células. Para demostrar que el conjugado \betaarr2-GFP es una \beta-arrestina biológicamente activa se examinó el aumento de la interiorización de \beta2AR en las células COS que sobreexpresan \betaAR2-GFP, comparado con el aumento de \betaAR2 observado en la sobreexpresión de \beta-arrestina2. Los resultados se muestran en la Figura 2B.

Utilizando los receptores de \betaAR2 dirigidos al epítopo, se estudió el secuestro de \betaAR2 en las células COS que sobreexpresan ya sea (1) \beta-arrestina2 exógena o (2) el conjugado \betaarr2-GFP. La Figura 2B presenta el secuestro de \beta2AR en las células COS con y sin \beta-arrestina2 sobreexpresada (las dos barras de la izquierda) y con y sin \betaarr2-GFP sobreexpresada (las dos barras de la derecha). El secuestro de \beta2AR mediado por el agonista aumentó desde 15\pm7% a 39\pm5% en presencia de \beta-arrestina2 sobreexpresada; igualmente la sobreexpresión de \betaarr2-GFP aumentó el secuestro de \beta2AR mediado por el agonista desde 25\pm4% hasta 58\pm1%. La \beta-arrestina2 natural y \betaarr2-GFP aumentaron igualmente bien el secuestro de \beta2AR por encima de los niveles de referencia, produciendo un aumento de 2,5 y 2,4 veces en el secuestro de \beta2AR, respectivamente.

Los resultados anteriores indicaron que el conjugado \betaarr2-GFP actúa como una arrestina biológicamente activa.

Ejemplo 5 Transposición mediada por el agonista de \betaarr2-GFP

Se estudió la transposición mediada por el agonista del híbrido \betaarr2-GFP desde la solución citoplásmica celular a la membrana utilizando células HEK-293 y COS transfectadas con plásmidos que contienen ADNc para el receptor \beta2AR y para el conjugado \betaarr2-GFP.

Se tranfectaron células HEK-293 y COS con plásmidos que contienen 10 \mug de ADNc para \beta2AR y 0,5 a 1,0 \mug para \betarr2-GFP. Las células se evaluaron utilizando microscopía confocal para detectar la fluorescencia intracelular inherente de GFP.

Las células HEK-293 transfectadas se presentan en la Figura 3A, en la que el panel 1 representa las células antes de la adición del agonista \betaAR2 y el panel 2 representa las células después de la adición del agonista. Las células COS transfectadas se muestran en la Figura 3B, en la que el panel 1 representa las células justo antes de la adición del agonista \betaAR2 y el panel 2 representa las células diez minutos después de la adición del agonista.

Tal como se presenta en la Figura 3A, la distribución de \betaarr2-GFP en las células HEK-239 fue al principio citoplásmica (panel 1). No se manifestó ningún aumento significativo del núcleo o de la membrana. Después de la adición del isoproterenol del agonista \betaAR2 al medio celular, se observó la redistribución mediada por el agonista en tiempo real de \betaarr2-GFP utilizando microscopía confocal. Diez minutos después de la adición de isoproterenol (concentraciones de saturación) se observó el aumento de fluorescencia de la membrana con una pérdida correspondiente de fluorescencia citoplásmica, lo que indica que la distribución de \betaarr2-GFP se había desplazado a la membrana (panel 2). Estos resultados establecen que en las células HEK-293 que contienen \beta2AR, los \betaarr2-GFP expresados por la célula se desplazan desde la solución citoplásmica a la membrana después de la adición de un agonista \betaAR2. La exposición de las células de ensayo al agonista de GPCR aumentó la fluorescencia ligada a la membrana diez veces sobre la observada antes de la exposición al agonista.

Como se presenta en la Figura 3B, la distribución de \betaarr2-GFP en las células COS fue al principio citoplásmica (panel 1). No se observó ningún aumento nuclear ni de membrana. Después de la adición del isoproterenol del agonista \betaAR2 al medio de cultivo, se observó la redistribución mediada por el agonista en tiempo real de \betaarr2-GFP, utilizando microscopía confocal. Diez minutos después de la adición de isoproterenol (concentraciones saturadas) se observó el aumento de la fluorescencia de la membrana con una pérdida correspondiente de fluorescencia citoplásmica, indicando que la distribución de \betaarr2-GFP ha cambiado a la membrana (panel 2). Estos resultados establecen que en las células COS que contienen el \beta2AR, \betaarr2-GFP expresadas por la célula se desplazan desde la solución citoplásmica hasta la membrana después de la adición de un agonista \betaAR2.

Comparando las Figuras 3A y 3B se demuestra que la señal fluorescente se reduce en las células COS en comparación con las células HEK, reflejando la inferior eficacia de secuestro de \beta2AR en las células COS. Sin embargo, incluso en las células COS el desplazamiento de \betaarr2-GFP en las células COS desde la solución citoplásmica a la membrana después de la adición del agonista \betaAR2 es claramente discernible debido a la fluorescencia del grupo GFP.

Se reprodujeron los experimentos anteriores con COS y HEK-239 excepto que el se añadió al medio celular propanolol antagonista de \betaAR2. La utilización de microscopía confocal para seguir la pista visualmente a \betaarr2-GFP en la célula en tiempo real, como anteriormente, indicó que no tuvo lugar ningún cambio en \betaarr2-GFP desde la solución citoplásmica hasta la membrana en respuesta a un agonista \betaAR2. Como se muestra en la Figura 6E la adición de un agonista (panel intermedio) produjo el desplazmiento de \betaarr2-GFP desde la solución citoplásmica hasta la membrana; la adición posterior de un antagonista (panel derecho) invirtió la transposición (compárese con la referencia, panel izquierdo).

La prueba bioquímica indica que las \beta-arrestinas son fundamentalmente proteínas citoplásmicas. Ferguson et al., Can. J. Physiol Pharmacol. 74:1095 (1996). Los presentes resultados confirman que \betaarr2-GFP se distribuye en toda la solución citoplásmica y se excluye en el núcleo. Estos datos también establecen que \betaarr2-GFP no está compartimentada principalmente en la membrana plasmática en ausencia de agonista, sino que en la exposición a un agonista el \betaarr2-GFP celular se traslada a la membrana. Los presentes resultados indican además que el movimiento del conjugado \betaarr2-GFP en respuesta a la adición de un agonista receptor acoplado a la proteína G se puede detectar ópticamente como un aumento de la fluorescencia de la membrana y/o una pérdida correspondiente de fluorescencia citoplásmica y que esta respuesta se observa rápidamente.

Ejemplo 6 \betaarr2-GFP intracelular se dirige a los receptores de la membrana

La Figura 4 presenta la redistribución de \beta2AR dirigidos a 12CA5(HA) de la membrana plasmática en células HEK-293 en el trascurso del tiempo de \betaarr2-GFP, tal como se muestra por microscopía confocal.

El presente ejemplo demuestra que los \beta2AR son el objetivo de las proteínas conjugadas \betaarr2-GFP intracelulares. Se estudiaron las células HEK-239 que contienen receptores \beta2AR dirigidos a 12CA5(HA). Los receptores en las células HEK-293 se reorganizaron en grupos de membrana plasmática (Fila A) reticulándose con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra un epítopo N-terminal, seguido del anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado de Texas Red. En la Figura 4, los tres paneles de la fila A presentan la misma célula HEK-293 con receptores \betaAR2 reorganizados en grupos de membrana plasmática.

Las células HEK-239 se expusieron a continuación al agonista (se añadió isoproterenol al medio celular, como anteriormente); los tres paneles de la fila B en la Figura 4 se tomaron consecutivamente después de la adición del agonista (de izquierda a derecha, a los 0,3 y 10 minutos después de la adición del agonista). Se demuestra de este modo la redistribución en tiempo real de \betarra2-GFP a los receptores durante un período de tiempo de diez minutos comparando los paneles de la fila A y de la fila B de la Figura 4. En la Figura 4, las flechas indican áreas de colonización y el bar=10 micras.

La Figura 4 demuestra que la geometría de la transposición en función del tiempo producida por el agonista de \betaarr2-GFP en la membrana plasmática simuló la distribución de los \beta2AR agregados previamente. Esto indica que la zona principal dirigida por \beta-arrestina es la \beta2AR o un componente estrechamente relacionado.

Ejemplo 7 \betaarr2-GFP intracelular dirige los receptores de la membrana

Se ha propuesto que la fosforilación de los GPCR por GRK facilite la desensibilización aumentando su afinidad hacia las \beta-arrestinas. Gurevich et al. J. Biol. Chem. 268:16879 (1993); Gurevich et al., J. Biol. Chem. 268:11628-11638 (1993); Ferguson et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 74:1095 (1996). Cuando se expresa en las células HEK-293 y se expone al agonista, los Y326A-\beta2AR mutantes no son fosforilados de manera significativa por los GRK endógenos. Barak et al., Biochem. 34:15407 (1995); Ferguson et al., J. Biol. Chem. 270:24782 (1995). Esta alteración de la fosforilación en los Y326A-\betaAR2 se invierte por la sobreexpresión de los GRK en la misma célula. Menard et al., Biochem. 35:4155 (1996). Se utilizó el receptor mutante Y326A para investigar la afinidad in vivo de la \beta-arrestina. Se presentó el efecto del GRK sobreexpresado sobre la interacción Y326A-\beta2AR con \betaarr2-GFP.

Y326A-\beta2AR y \betaarr2-GFP se cotransfectaron dentro de células HEK-239 en ausencia y presencia de GRK cotransfectadas. Si la fosforilación de los GPCR por GRK facilita la desensibilización aumentando su afinidad por las \beta-arrestinas, entonces la sobreexpresión de GRK produciría una diferencia notable en la transposición de \betaarr2-GFP.

La Figura 5 presenta la influencia de GRK sobreexpresado en la redistribucion de \betaarr2-GFP en las células HEK-293 que expresan \beta2AR alteradas por la fosforilación de Y326A. Las células sin (fila A) y con (fila B) los GRK sobreexpresados se expusieron al agonista y se observó la redistribución de \betaarr2-GFP en tiempo real. Sin añadir GRK, la transposición de \betaarr2-GFP en respuesta al antagonista, procedió mal, como se demuestra en la fila A de la Figura 5. La transposición de \betaarr2-GFP en las células que contienen GRK sobreexpresado (fila B) fue más robusta, indicando un aumento de afinidad de \betaarr2-GFP por el receptor y de la relación de fosforilación y de la actividad de \beta-arrestina.

Ejemplo 8 Prueba de receptores adicionales en la subfamilia \beta2AR/rodopsina

Se han estudiado doce miembros diferentes de la subfamilia \beta2AR/rodopsina de los GPCR. Se expusieron las células que expresan un GPCR particular y que contienen proteínas híbridas \betaarrestina-GFP a conocidos agonistas para el GPCR en estudio. En cada caso, se produjo una transposición observable de las proteínas híbridas \betaarrestinas-GFP desde la solución citoplásmica celular hasta la membrana celular en los minutos siguientes a la adición del agonista GPCR (datos no mostrados).

Claims (31)

1. Conjugado que comprende una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable, en el que la molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína \beta-arrestina.

2. Conjugado según la reivindicación 1, que consiste en una proteína de fusión.

3. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la molécula detectable consiste en una molécula detectable de forma óptica y opcionalmente es la Proteína Verde Fluorescente.

4. Constructo de ácido nucleico que comprende un casete de expresión, comprendiendo dicho constructo, en el sentido 5' a 3', un activador y un segmento de ácido nucleico asociado a él de forma funcional, comprendiendo el segmento de ácido nucleico una secuencia que codifica un polipéptido que comprende una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable, en el que dicha molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína \beta-arrestina.

5. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula detectable, codifica una molécula detectable de forma óptica y opcionalmente codifica la Proteína Verde Fluorescente.

6. Constructo de ácido nucleico según una de las dos reivindicaciones 4 ó 5, que incluye una cualquiera o más de las características siguientes:

(i)

el constructo comprende además un plásmido;

(ii)

el constructo es un ADN o ARN; y

(iii)

el activador es un activador de \beta-arrestina.

7. Célula huésped que contiene un constructo de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico, comprendiendo la molécula de ácido nucleico, en el sentido 5' a 3', un activador que puede funcionar en la célula huésped, una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína \beta-arrestina y una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula detectable, estando las secuencias de codificación del ácido nucleico asociadas de forma funcional con el activador, en la que la molécula de ácido nucleico expresa una proteína \beta-arrestina y en la que la molécula detectable es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la proteína \beta-arrestina.

9. Célula según la reivindicación 8, en la que la célula:

(i) consiste en una célula de mamífero y opcionalmente es una célula HEK-293 o una célula
COS; o

(ii) se selecciona de entre el grupo constituido por células bacterianas, células de levadura, células micóticas, células vegetales y células animales.

10. Substrato sobre el que está depositada una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. Procedimiento para la evaluación de la actividad de la trayectoria del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en las condiciones del ensayo, siendo opcionalmente las condiciones del ensayo la presencia en una célula de ensayo de una cinasa de ensayo o una proteína G de ensayo o la exposición de la célula de ensayo al ligando de ensayo o la co-expresión en la célula de ensayo de un segundo receptor, comprendiendo dicho procedimiento:

a) proporcionar una célula de ensayo que expresa un GPCR, y contiene un conjugado que comprende una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula de ensayo a un agonista conocido de GPCR bajo las condiciones del ensayo; y a continuación

c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula de ensayo hasta el borde de membrana de la célula de ensayo;

en el que la transposición de la molécula detectable en la célula de ensayo indica la activación de la trayectoria de GPCR.

12. Procedimiento para la detección de la capacidad de la proteína \beta-arrestina o de un fragmento de la misma para unirse a un GPCR fosforilado, que comprende:

a) proporcionar una célula que:

i)

expresa un GPCR; y

ii)

contiene un conjugado que comprende una proteína \beta-arrestina de ensayo y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula a un agonista conocido de GPCR; y a continuación

c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de la membrana de la célula;

en el que la transposición de la molécula detectable en la célula de ensayo indica la unión de la proteína \beta-arrestina al GPCR fosforilado.

13. Procedimiento para la identificación de la actividad del agonista de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en un compuesto de ensayo, que comprende:

a) proporcionar una célula que expresa un GPCR, y que contiene un conjugado que comprende una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula a un compuesto de ensayo; estando el compuesto de ensayo opcionalmente en solución acuosa; y a continuación

c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de membrana de la célula, estando depositadas las células opcionalmente sobre un sustrato;

en el que el desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de membrana de la célula, en la compuesto de ensayo indica la actividad agonista GPCR del compuesto de ensayo.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en la que la célula expresa uno cualquiera o más de los siguientes compuestos:

(i)

un GPCR conocido;

(ii)

un GPCR desconocido;

(iii)

un GPCR olfativo;

(iv)

un grupo GPCR \beta-adrenérgico.

15. Procedimiento según una de las dos reivindicaciones 13 ó 14, que incluye además las características previstas en la reivindicación 3 y/o la reivindicación 9.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la célula expresa normalmente un GPCR u opcionalmente la célula se ha transformado para expresar un GPCR no expresado normalmente por dicha célula.

17. Procedimiento para la identificación de la presencia de un agonista de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en una solución de ensayo; que comprende:

a) proporcionar una célula que expresa un GPCR, y que contiene un conjugado, comprendiendo el conjugado la proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula a una solución de ensayo; y a continuación

c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de membrana de la célula;

en el que el desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de membrana de la célula después de la exposición de la célula a la solución de la muestra indica que la solución de la muestra contiene un agonista para un GPCR expresado en la célula.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, que incluye además una cualquiera o varias de las características previstas en las reivindicaciones 3, 9 ó 14.

19. Procedimiento para la identificación de la presencia de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en una célula; que comprende:

a) proporcionar una célula de ensayo, conteniendo dicha célula de ensayo un conjugado, que comprende la proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula de ensayo a una solución que contiene un agonista de GPCR; y

c) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de membrana de la célula;

en el que el desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de membrana de la célula de ensayo después de la exposición de la célula de ensayo al agonista de GPCR indica que la célula de ensayo contiene un GPCR.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, que incluye además cualquiera de las características previstas en la reivindicación 3.

21. Procedimiento para la identificación de las células que contiene un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en una conjunto de células, estando las células opcionalmente contenidas en un tejido o en un órgano, que comprende:

a) proporcionar un conjunto de células de ensayo, conteniendo dichas células de ensayo un conjugado, que comprende una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer las células de ensayo a un, o a un conjunto de, agonista(s) conocido(s) de GPCR; y

c) detectar aquellas células en las que la molécula detectable se traslada desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de membrana de la célula; en el que el desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de membrana de la célula después de la exposición del agonista de GPCR indica que la célula contiene un GPCR para este agonista de GPCR conocido.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, que incluye además una cualquiera o varias de las características previstas en la reivindicación 3.

23. Utilización de una proteína \beta-arrestina trasladable por GPCR acoplada a una molécula detectable para identificar la función del agonista GPCR en un compuesto de ensayo, que detecta la transposición intracelular desde la solución citoplásmica celular hasta el borde de la membrana de la célula de la proteína \beta-arrestina sensible a la exposición de la célula al compuesto de ensayo.

24. Procedimiento para la identificación de la actividad de un antagonista de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en un compuesto de ensayo, que comprende:

a) proporcionar una célula que expresa un GPCR, y contiene un conjugado, comprendiendo el conjugado una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula a un compuesto de ensayo;

c) exponer la célula a un agonista de GPCR; y

d) detectar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica de la célula hasta el borde de membrana de la célula, estando las células depositadas opcionalmente sobre un sustrato;

en el que la exposición al agonista tiene lugar al mismo tiempo que, o posteriormente a, la exposición al compuesto de ensayo, y en el que el desplazamiento de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de membrana de la célula después de exponer la célula al compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo no es un antagonista de GPCR.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, que incluye además una cualquiera o varias de las características previstas en las reivindicaciones 3, 9 ó 14.

26. Procedimiento para identificar la actividad antagonista de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en un compuesto de ensayo, estando el compuesto de ensayo opcionalmente en solución acuosa, que comprende:

a) proporcionar una célula que expresa un GPCR, y contiene un conjugado, comprendiendo el conjugado una proteína \beta-arrestina y una molécula detectable de forma visual;

b) exponer la célula a un agonista de GPCR de modo que tenga lugar la transposición de la molécula detectable desde la solución citoplásmica hasta el borde de la membrana de la célula;

c) exponer la célula a un compuesto de ensayo, estando las células depositadas opcionalmente sobre un sustrato; en el que la exposición al agonista tiene lugar antes de la exposición al compuesto de ensayo y en el que el desplazamiento de la molécula detectable desde el borde de la membrana de la célula hasta la solución citoplásmica después de la exposición de la célula al compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo presenta una actividad antagonista de GPCR.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, que incluye además una cualquiera o varias de las características previstas en las reivindicaciones 3 ó 9.

28. Utilización de una proteína \beta-arrestina trasladable por GPCR acoplada a una molécula detectable para identificar la función antagonista de GPCR en un compuesto de ensayo, que detecta la transposición desde el borde de la membrana de la célula hasta la solución citoplásmica celular de la proteína \beta-arrestina sensible a la exposición de la célula al compuesto de ensayo.

29. Substrato sobre el que están depositadas un conjunto de células, expresando dichas células un GPCR y una proteína \beta-arrestina marcada, en el que la marca es capaz de indicar la transposición intracelular y/o la distribución de la \beta-arrestina.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, que incluye además una cualquiera o varias de las características previstas en las reivindicaciones 3, 9 ó 14.

31. Substrato según cualquiera de las reivindicaciones 10, 29 ó 30, en el que el substrato está realizado en un material seleccionado de entre vidrio, plástico, cerámica, semiconductores, sílice, fibra óptica, diamante, monómero biocompatible, y materiales polímeros biocompatibles.