DE1015608T1 - Methoden zur bestimmung der rezeptoraktivität und dafür verwendbare konstrukte - Google Patents

Methoden zur bestimmung der rezeptoraktivität und dafür verwendbare konstrukte

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DE1015608T1
DE1015608T1 DE1015608T DE98925260T DE1015608T1 DE 1015608 T1 DE1015608 T1 DE 1015608T1 DE 1015608 T DE1015608 T DE 1015608T DE 98925260 T DE98925260 T DE 98925260T DE 1015608 T1 DE1015608 T1 DE 1015608T1
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DE
Germany
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cell
gpcr
detectable molecule
test
cells
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DE1015608T
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S. Barak
G. Caron
S. Ferguson
Jie Zhang
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University of Durham
Duke University
Original Assignee
University of Durham
Duke University
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Claims (83)

98 925 260.6-2105 Patentansprüche
1. Konjugat, ein ß-Arrestin-Protein und ein
detektierbares Molekül umfassend.
2. Konjugat gemäß Anspruch 1, worin das detektierbare Molekül ein optisch detektierbares Molekül ist.
3. Konjugat gemäß Anspruch 1, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
4. Nukleinsäure-Konstrukt, eine Expressionskassette
umfassend, wobei das Konstrukt von der 5'- zur V-Richtung einen Promoter und ein damit wirksam
verbundenes Nukleinsäuresegment umfasst, wobei das Nukleinsäuresegment eine Sequenz umfasst, die ein ß-Arrestin-Protein und ein detektierbares Molekül
kodiert.
5. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4, worin die Nukleinsäuresequenz, die ein detektierbares Molekül kodiert, ein optisch detektierbares Molekül kodiert.
6. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4, worin die Nukleinsäuresequenz, die ein detektierbares Molekül kodiert, grün fluoreszierendes Protein kodiert.
7. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4, wobei das Konstrukt weiterhin ein Plasmid umfasst.
8. Wirtszelle, die ein Nukleinsäure-Konstrukt gemäß
Anspruch 4 umfasst.
9. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4, das ein DNA-Konstrukt ist.
Ha5DE99S-anspr
10. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 4, das ein RNA-Konstrukt ist.
11. DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 4, worin der Promoter ein ß-Arrestin-Promoter ist.
12. Wirtszelle, ein Nukleinsäuremolekül umfassend, wobei das Nukleinsäuremolekül von der 5'- zur 3'-Richtung einen in der Wirtszelle wirksamen Promoter, eine Nukleinsäuresequenz, die ein ß-Arrestin-Protein kodiert und eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein detekti.erbares Molekül kodiert, wobei die kodierende Nukleinsäuresequenz operabel an den Promoter gebunden ist.
13. Zelle gemäß Anspruch 12, wobei, die Zelle eine Säugetierzelle ist.
14. Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle ausgewählt ist aus HEK-293-Zellen und COS-Zellen.
15. Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen.
16. Substrat, auf dem eine Wirtszelle gemäß Anspruch 12 aufgebracht ist.
17. Verfahren zur Bewertung der Stoffwechsel-Aktivität
des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) unter Versuchsbedingungen, umfassend:
a) Bereitstellung einer Testzelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein ß-
Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares
• · »I
DE/EP 1 015608T1
Molekül umfasst;
b) Exposition der Testzelle mit einem bekannten GPCR-Agonisten unter Versuchsbedingungen und dann
c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Testzelle zum
Membranrand der Testzelle;
worin die Translokation des detektierbaren Moleküls in der Testzelle die Aktivierung des GPCR-Stoffwechseis anzeigt.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin die Versuchsbedingungen die Anwesenheit einer Test-Kinase in der Testzelle bedeuten.
19. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin die
Versuchsbedingungen die Anwesenheit eines Test-G-Proteins in der Testzelle bedeuten.
20. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin die Versuchsbedingungen bedeuten, dass die Testzelle einem Test-Liganden ausgesetzt wird.
21. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin die Versuchsbedingungen die Co-Expression eines zweiten Rezeptors in der Testzelle bedeuten.
22. Verfahren zum Screenen eines ß-Arrestin-Proteins oder
dessen Fragments auf die Fähigkeit, einen phosphorylierten GPCR zu binden, umfassend:
a) Bereitstellung einer Zelle, die: i) einen GPCR exprimiert und
ii) ein Konjugat enthält, das ein ß-Arrestin-Test-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst;
b) Exposition der Zelle mit einem bekannten GPCR-Agonist und dann
Ha5DE995-anspr
c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle;
worin die Translokation des detektierbaren Moleküls in der Testzelle die Bindung des ß-Arrestin-Proteins an den phosphorylierten GPCR anzeigt.
23. Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf die Agonist-Aktivität für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend:
a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR
exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein ß-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst;
b) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung und dann
c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle;
worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung GPCR-Agonist-Aktivität der Testverbindung anzeigt.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle einen bekannten GPCR exprimiert.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle einen unbekannten GPCR exprimiert.
26. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle einen wohlriechenden GPCR exprimiert.
27. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle einen ßadrenergischen GPCR exprimiert.
28. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin das detektierbare Molekül optisch detektierbar ist.
Ha5DE995-anspr
DE/EP 1 015608T1
29. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
30. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.
31. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen.
32. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle gewöhnlich einen GPCR exprimiert.
33. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zelle transformiert worden ist, um einen GPCR zu exprimieren, der gewöhnlich von einer solchen Zelle nicht exprimiert wird.
34. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin sich die Testverbindung in wässriger Lösung befindet.
35. Verfahren gemäß Anspruch 23, worin die Zellen auf einem Substrat aufgebracht werden.
36. Verfahren zum Screenen einer Probenlösung auf die Anwesenheit eines Agonist für einen G-Proteingekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend:
a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, welches ein &bgr;-Arrestin Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst;
b) Exposition der Zelle mit einer Probenlösung und dann
Ha5DE995-anspr
DE/EP 1 015 60ST1
c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle;
worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Probenlösung anzeigt, dass die Probenlösung einen Agonist für einen in der Zelle exprimierten GPCR enthält.
37.Verfahren gemäß Anspruch 36, worin die Zelle einen bekannten GPCR exprimiert.
38. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin die Zelle einen unbekannten GPCR exprimiert.
39. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin die Zelle einen wohlriechenden GPCR exprimiert.
40. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin die Zelle einen ßadrenergischen GPCR exprimiert.
41. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin das detektierbare Molekül optisch detektierbar ist.
42. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
43. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.
44. Verfahren gemäß Anspruch 36, worin die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen.
45. Verfahren für das Screenen einer Testverbindung auf die Antagonist-Aktivität für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend:
Ha5DE995-anspr
DE/EP 1 015608T1
a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein ß-Arrestin Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst;
b) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung
c) Exposition der Zelle mit einem GPCR-Agonist und
d) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle;
worin die Exposition mit dem Agonist zur gleichen Zeit oder nachfolgend auf die Exposition mit der Testverbindung geschieht und worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls aus dem Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung anzeigt, dass die Testverbindung kein GPCR-Antagonist ist.
46. Verfahren gemäß Anspruch 45, worin die Zelle einen bekannten GPCR exprimiert.
47. Verfahren gemäß Anspruch 45, worin die Zelle einen wohlriechenden GPCR exprimiert.
48. Verfahren gemäß Anspruch 45, worin die Zelle einen ßadrenergischen GPCR exprimiert.
49. Verfahren gemäß Anspruch 45, worin das detektierbare Molekül optisch detektierbar ist.
50. Verfahren gemäß Anspruch 4 5, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
51. Verfahren gemäß Anspruch 45, worin die Zelle eine
Säugetierzelle ist.
35
Ha5DE995-anspr
DE/EP 1 Q1 5 608T1
52. Verfahren gemäß Anspruch 45, worin die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen.
53. Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die Zellen auf einem Substrat aufgebracht sind.
54. Verfahren zum Screenen einer Testverbindung auf die Antagonist-Aktivität für G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), umfassend:
a) Bereitstellung einer Zelle, die einen GPCR exprimiert und ein Konjugat enthält, das ein ß-Arrestin Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst;
b) Exposition der Zelle mit einem GPCR-Agonist, so dass die Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle eintritt;
c) Exposition der Zelle mit einer Testverbindung; wobei die Exposition mit dem Agonist vor der Exposition mit der Testverbindung eintritt und worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Membranrand der Zelle zum Zytosol der Zelle nach der Exposition der Zelle mit der Testverbindung anzeigt, dass die Testverbindung GPCR-Antagonist-Aktivität besitzt.
55. Verfahren gemäß Anspruch 54, worin das detektierbare Molekül optisch detektierbar ist.
56. Verfahren gemäß Anspruch 54, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Molekül ist.
57. Verfahren gemäß Anspruch 54, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.
Ha5DE995-anspr
DE/EP 1 015608T1
58. Verfahren gemäß Anspruch 54, worin die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen.
59. Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei die Testverbindung in wässriger Lösung ist.
60. Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei die Zellen auf einem Substrat aufgebracht sind.
61. Verfahren zum Screenen einer Zelle auf die Anwesenheit eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR), umfassend:
a) Bereitstellung einer Testzelle, wobei die
Testzelle ein Konjugat enthält, das ein ß-Arrestin Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfasst;
b) Exposition der Testzelle mit einer Lösung, die einen GPCR-Agonist enthält und
c) Detektion der Translokation des detektierbaren Moleküls vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle;
worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Testzelle nach der Exposition der Testzelle mit dem GPCR-Agonist anzeigt, dass die Zelle einen GPCR enthält.
62. Verfahren gemäß Anspruch 61, worin das detektierbare Molekül optisch detektierbar ist.
63. Verfahren gemäß Anspruch 61, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
64. Verfahren zum Screenen einer Vielzahl von Zellen auf solche Zelle, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) enthalten, umfassend:
Ha5DE995-anspr
&iacgr;&ogr;
DE/EP 1 01560811
a) Bereitstellung einer Vielzahl von Testzellen, die ein Konjugat enthalten, das ein ß-Arrestin-Protein und ein visuell detektierbares Molekül umfassen;
b) Exposition der Testzellen mit einem bekannten GPCR-Agonist und
c) Detektion solcher Zellen, in welchen das detektierbare Molekül vom Zytosol der Zelle zum Membranrand der Zelle translokalisiert ist worin die Bewegung des detektierbaren Moleküls vom Zytosol zum Membranrand der Zelle nach der Exposition mit dem GPCR-Agonist anzeigt, dass die Zelle einen GPCR für diesen bekannten GPCR-Agonist enthält.
65. Verfahren gemäß Anspruch 64, worin das detektierbare Molekül optisch detektierbar ist.
66. Verfahren gemäß Anspruch 64 worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
67. Verfahren gemäß Anspruch 64, worin die Vielzahl der Testzellen in einem Gewebe enthalten sind.
68. Verfahren gemäß Anspruch 64, worin die Vielzahl der Testzellen in einem Organ enthalten sind.
69. Verfahren gemäß Anspruch 64, worin Schritt (b) die Exposition der Testzellen mit einer Vielzahl bekannter GPCR-Agonisten umfasst.
70. Substrat, auf dem eine Vielzahl von Zellen aufgebracht ist, die einen GPCR exprimieren und ein Konjugat enthalten, das ein ß-Arrestin-Protein und ein detektierbares Molekül umfasst.
71. Substrat gemäß Anspruch 70, worin das detektierbare Molekül ein optisch detektierbares Molekül ist.
72. Substrat gemäß Anspruch 70, worin das detektierbare Molekül grün fluoreszierendes Protein ist.
73. Substrat gemäß Anspruch 70, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.
74. Substrat gemäß Anspruch 70, worin die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen.
75. Substrat gemäß Anspruch 70, worin die Zelle einen olfaktorischen GPCR exprimiert.
76. Substrat gemäß Anspruch 70, worin die Zelle einen ßadrenergischen GPCR exprimiert.
77. Substrat gemäß Anspruch 70, worin das Substrat
hergestellt wird aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Kunststoff, Keramik, Halbleiter, Kieselgel, Glasfaser, Diamant, biokompatiblen Monomer- und biokompatiblen Polymer-Materialien.
78. Gerät zur Bestimmung der GPCR-Aktivität in einer
Testzelle, umfassend:
Vorrichtung zur Messung von Hinweisen auf die intrazelluläre Verteilung eines detektierbaren Moleküls und
eine Computerprogramm-Vorrichtung, welche ein computerlesbares Speichermedium umfasst, das in diesem Medium eine Vorrichtung für einen computerlesbaren Programmcode eingeschlossen enthält, wobei die Vorrichtung für einen computerlesbaren Programmcode umfasst:
eine Vorrichtung für einen computerlesbaren Programmcode zur Bestimmung, ob die Hinweise auf die Verteilung des detektierbaren Moleküls in der Testzelle die Konzentration des detektierbaren Moleküls an der Zellmembran anzeigen, basierend
auf dem Vergleich der gemessenen Hinweise der intrazellulären Verteilung des detektierbaren Moleküls in derKontrollzelle.
79. Gerät zur Bestimmung der GPCR-Aktivität in einer Testzelle, umfassend:
Vorrichtung zur Messung von Hinweisen auf die intrazelluläre Verteilung eines detektierbaren Moleküls in wenigstens einer Testzelle zu vielen verschiedenen Zeitpunkten und eine Computerprogramm-Vorrichtung, die ein computerlesbares Speichermedium umfasst, welches eine Vorrichtung für einen computerlesbaren Programmcode in diesem Medium eingeschlossen hat, wobei die Vorrichtung für den computerlesbaren Programmcode umfasst:
eine Vorrichtung für einen computerlesbaren Programmcode zu Bestimmung, ob die Hinweise auf die Verteilung des detektierbaren Moleküls in der Testzelle zu vielen verschiedenen Zeitpunkten die Translokation des detektierbaren Moleküls zur
Zellmembran anzeigen.
80. Gerät zur Bestimmung der GPCR-Aktivität in einer Testzelle, umfassend:
Vorrichtung zur Messung von Hinweisen auf die intrazelluläre Verteilung eines detektierbaren Moleküls in mindestens einer Testzelle und eine Computerprogramm-Vorrichtung, die ein computerlesbares Speichermedium umfasst, welches einen Vorrichtung für einen computerlesbaren Programmcode in diesem Medium eingeschlossen enthält,
Ha5DE995-anspr
wobei die Vorrichtung für den computerlesbaren Programmcode umfasst:
eine Vorrichtung für computerlesbaren Programmcode, basierend auf dem Vergleich vorher festgelegter Kriterien, zur Bestimmung, ob die
Hinweise auf die Verteilung des detektierbaren Moleküls in der Testzelle die Konzentration des detektierbaren Moleküls an der Zellmembran anzeigt.
10
81. Gerät nach Anspruch 78, worin die genannten Hinweise auf die intrazelluläre Verteilung eines detektierbaren Moleküls optische Hinweise sind.
82. Gerät nach Anspruch 78, worin die Messvorrichtung eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzintensität umfasst.
83. Gerät nach Anspruch 78, worin das zu detektierende Molekül ein über die Fluoreszenz zu detektierendes Molekül ist und worin der Schritt der Messung der Hinweise auf die intrazelluläre Verteilung des detektierbaren Moleküls die Messung des Fluoreszenzsignale der Testzelle und von Kontrollzellen umfasst.
Ha5DE995-anspr
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