ES2311508T3

ES2311508T3 - Receptores gustativos t1r y genes que codifican dichos receptores.

Info

Publication number: ES2311508T3
Application number: ES01914732T
Authority: ES
Inventors: Jon Elliot Adler; Sergey Zozulya; Shawn M. O'connell; Xiaocong Li; Lena Staszewski
Original assignee: Senomyx Inc
Current assignee: Firmenich Inc
Priority date: 2000-03-07
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: US7244835B2; JP2013247957A; DK1309606T3; CA2402214A1; US7799905B2; US20040191805A1; ES2396681T3; JP5403842B2; HK1139965A1; DE01914732T1; US10093718B2; ES2338497T3; US20040171042A1; US20190085051A1; AU2001240086B9; AU4008601A; NO20024276D0; US20110244563A1; US8802379B2; TW201006846A

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del receptor gustativo T1R3 que tiene al menos una identidad de secuencia de 90% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

Description

Receptores gustativos T1R y genes que codifican dichos receptores.

Campo de la invención

La invención se refiere a receptores acoplados a proteínas G quimiosensoriales de mamífero recién identificados, a la familia de tales receptores, y a los genes y al ADNc que codifican dichos receptores. Más concretamente, la invención se refiere a receptores acoplados a proteínas G quimiosensoriales de mamífero recién identificados activos en la señalización del sabor, a una familia de tales receptores, a los genes y al ADNc que codifica dichos receptores, y a los métodos de utilización de tales receptores, genes, y ADNc en el análisis y descubrimiento de los moduladores del sabor.

Descripción de la técnica relacionada

El sistema gustativo proporciona información sensorial sobre la composición química del mundo exterior. La transducción gustativa es una de las formas más sofisticadas de sensación desencadenada por compuestos químicos en animales. En la actualidad, los métodos por los cuales se obtienen las sensaciones gustativas son escasamente comprendidos. Véanse, p. ej., Margolskee, BioEssays, 15:645-50 (1993); Avenet et al., J. Membrane Biol., 112:1-8 (1989). La señalización gustativa se encuentra en todo el reino animal, desde los simples metazoos hasta los más complejos vertebrados. Se piensa que la sensación gustativa implica distintas rutas de señalización. Se cree que estas rutas están mediadas por receptores, esto es, receptores metabotrópicos o ionotrópicos. Las células que expresan los receptores gustativos, cuando son expuestas a ciertos estímulos químicos, logran la sensación gustativa mediante despolarización para generar un potencial de acción, que se cree que desencadena la sensación. Se cree que este evento desencadena la liberación de neurotransmisores en diferentes sinapsis de las neuronas aferentes gustativas, iniciando de ese modo la señalización a lo largo de las rutas neuronales que median la percepción del gusto. Véase, p. ej., Roper, Ann. Rev. Neurosci., 12:329-53 (1989).

Como tales, los receptores gustativos reconocen específicamente las moléculas que logran la sensación gustativa específica. Estas moléculas también son referidas en la presente memoria como sustancias que estimulan el sentido del gusto (del inglés "tastant"). Muchos receptores gustativos pertenecen a la superfamilia de los receptores transmembrana 7 (Hoon et al., Cell 96:451 (1999); Adler et al., Cell 100:693 (2000)), que son conocidos también como receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Se cree que otros gustos están mediados por proteínas del canal. Los receptores acoplados a proteínas G controlan muchas funciones fisiológicas, tales como la función endocrina, la función exocrina, el ritmo cardíaco, la lipólisis, el metabolismo de los carbohidratos, y la señalización transmembrana. El análisis bioquímico y la clonación molecular de un número de tales receptores han revelado muchos principios básicos referentes a la función de estos receptores.

Por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.691.188 se describe cómo tras la unión del ligando a un GPCR, el receptor experimenta presumiblemente un cambio conformacional que conduce a la activación de la proteína G. Las proteínas G están formadas por tres subunidades: un nucleótido de guanilo que se une a una subunidad \alpha, una subunidad \beta, y una subunidad \gamma. Las proteínas G oscilan entre dos formas, dependiendo de si está unido a la subunidad \alpha GDP o GTP. Cuando está unido GDP, la proteína G existe en forma de heterotrímero: el complejo G\alpha\beta\gamma. Cuando está unido GTP, la subunidad \alpha se disocia del heterotrímero, dejando un complejo G\beta\gamma. Cuando un complejo G\alpha\beta\gamma se asocia operativamente con un receptor acoplado con la proteína G activada en una membrana celular, la velocidad de cambio de GTP por GDP unido aumenta y la velocidad de disociación de la subunidad G\alpha unida del complejo G\alpha\beta\gamma aumenta. La subunidad G\alpha libre y el complejo G\beta\gamma son capaces de ese modo de transmitir una señal a los elementos aguas abajo de una variedad de rutas de transducción de la señal. Estos eventos forman la base para una multiplicidad de fenómenos de señalización diferentes, incluyendo por ejemplo los fenómenos de señalización que se identifican como percepciones sensoriales neurológicas tales como el gusto y/o el olfato.

Se cree que los mamíferos tienen cinco modalidades básicas de gustos: dulce, amargo, ácido, salado, y umami (el sabor del glutamato monosódico). Véanse, p. ej., Kawamura et al., Introduction to Umami: A Basic Taste (1987); Kinnamon et al., Ann. Rev. Physiol., 54:715-31 (1992); Lindemann, Physiol. Rev., 76:718-66 (1996); Stewart et al., Am. J. Physiol., 272:1-26(1997). Numerosos estudios fisiológicos en animales han demostrado que las células receptoras gustativas pueden responder selectivamente a diferentes estímulos químicos. Véanse, p. ej., Akabas et al., Science, 242:1047-50 (1988); Gilbertson et aL, J. Gen. Physiol., 100:803-24 (1992); Bernhardt et al., J. Physiol., 490:325-36 (1996); Cummings et al., J. Neurophysiol., 75:1256-63 (1996).

En los mamíferos, las células receptoras gustativas están reunidas en yemas gustativas que se distribuyen en diferentes papilas en el epitelio de la lengua. Las papilas circunvaladas, encontradas en la parte más posterior de la lengua, contienen de cientos a miles de yemas gustativas. En contraste, las papilas foliadas, localizadas en el borde lateral posterior de la lengua, contienen de docenas a centenares de yemas gustativas. Adicionalmente, las papilas fungiformes, localizadas en la parte delantera de la lengua, contienen solamente una o unas pocas yemas gustativas.

Cada yema gustativa, dependiendo de la especie, contiene de 50 a 150 células, incluyendo células precursoras, células de soporte, y células receptoras gustativas. Véase, p. ej., Lindemann, Physiol. Rev., 76:718-66 (1996). Las células receptoras están inervadas en su base por terminaciones de los nervios aferentes que transmiten la información a los centros gustativos de la corteza por medio de sinapsis en el tronco cerebral y el tálamo. La elucidación de los mecanismos de señalización de las células gustativas y el procesamiento de la información es importante para comprender la función, regulación, y percepción del sentido del gusto.

Aunque se sabe mucho sobre la psicofísica y la fisiología de la función de las células gustativas, se sabe muy poco sobre las moléculas y las rutas que median su respuesta de señalización sensorial. La identificación y el aislamiento de los receptores gustativos novedosos y de las moléculas de señalización gustativas podrían permitir nuevos métodos de modulación química y genética de las rutas de transducción gustativa. Por ejemplo, la disponibilidad de receptores y de moléculas del canal podría permitir el escrutinio de agonistas de elevada afinidad, antagonistas, agonistas inversos, y moduladores de la actividad gustativa. Tales compuestos moduladores del sabor podrían ser útiles en las industrias farmacéutica y alimentaria para mejorar el sabor de una variedad de productos de consumo, o para bloquear sabores no deseables, p. ej., en ciertos fármacos.

En la actualidad se conocen las secuencias completas o parciales de numerosos receptores quimiosensoriales de seres humanos y otros eucariotas. Véanse, p. ej., Pilpel, Y. y Lancet, D., Protein Science, 8:969-977 (1999); Mombaerts, P., Annu. Rev. Neurosci., 22:487-50 (1999). Véanse también,las publicaciones, EP0867508A2, US 5874243, WO 92/17585, WO 95/18140, WO 97/17444, WO 99/67282. Debido a la complejidad de las interacciones ligando-receptor, y más concretamente de las interacciones de la sustancia que estimula el sentido del gusto-receptor, se carece de la información sobre el reconocimiento del ligando por el receptor. En parte, la presente invención está dirigida a la necesidad de comprender mejor las interacciones entre los receptores quimiosensoriales y los estímulos químicos. La presente invención también proporciona, entre otras cosas, receptores quimiosensoriales novedosos, y métodos para utilizar tales receptores, y los genes y los ADNc que codifican tales receptores, para identificar las moléculas que se pueden utilizar para modular la transducción quimiosensorial, tales como la sensación gustativa.

Compendio de la invención

La invención se refiere a una nueva familia de receptores acoplados a proteínas G, y a los genes y ADNc que codifican dichos receptores. Se piensa que los receptores están implicados principalmente en la transducción gustativa dulce, pero también pueden estar implicados en las señales de transducción de otras modalidades de sabor.

La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido receptor gustativo T1R3 que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14, un vector que contiene la secuencia de ácido nucleico y una célula anfitriona transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico aislada o el vector.

Adicionalmente la presente invención proporciona un polipéptido T1R3 aislado codificado por la secuencia de ácido nucleico aislada de la invención

Además la presente invención proporciona un análisis para identificar un compuesto que modula la transducción gustativa que comprende:

(i): poner en contacto un polipéptido T1R3 de acuerdo con la invención con un supuesto compuesto modulador del sabor; y

(ii): detectar si dicho compuesto se une específicamente a dicho polipéptido T1R3.

Se proporcionan métodos para representar la percepción del gusto y/o para pronosticar la percepción del gusto en un mamífero, incluyendo un ser humano. Preferiblemente, tales métodos se pueden realizar utilizando los receptores y genes que codifican dichos receptores descritos en la presente memoria.

A ese fin, un objeto de la descripción es proporcionar una nueva familia de receptores acoplados a proteínas G de mamífero, referidos en la presente memoria como T1R, activos en la percepción gustativa. Otro objeto de la descripción es proporcionar fragmentos y variantes de tales T1R que conserven la actividad de unión a una sustancia que estimula el sentido del gusto.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar secuencias de ácido nucleico o moléculas que codifican tales T1R, fragmentos, o variantes de los mismos.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar vectores de expresión que incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican tales T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, que están conectados operablemente al menos a una secuencia reguladora tal como un promotor, intensificador, u otra secuencia implicada en la transcripción y/o traducción de un gen positiva o negativa.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar células humanas o no humanas que expresen funcionalmente al menos uno de tales T1R, o fragmentos o variantes del mismo.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar proteínas de fusión a T1R o polipéptidos que incluyan un fragmento de al menos uno de tales T1R.

Otro objeto de la descripción es proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido T1R que comprende una secuencia de ácido nucleico que es idéntica al menos en 50%, preferiblemente 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 9, 11, 13, 15, 16, 20, y las variantes modificadas conservativamente de los mismos.

Otro objeto adicional de la descripción es proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 35 a 50%, y preferiblemente 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, 17, y las variantes modificadas conservativamente de los mismos, donde el fragmento tiene una longitud de al menos 20, preferiblemente 40, 60, 80, 100, 150, 200, o 250 aminoácidos. Opcionalmente, el fragmento puede ser un fragmento antigénico que se une a un anticuerpo anti-T1R.

Un objeto adicional de la descripción es proporcionar un polipéptido aislado que comprende una variante de dicho fragmento, donde existe una variación en 10, preferiblemente 5, 4, 3, 2, o 1 restos aminoácido a lo sumo.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar agonistas o antagonistas de tales T1R, o fragmentos o variantes de los mismos.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar métodos para representar la percepción del gusto y/o para pronosticar la percepción del gusto en un mamífero, incluyendo un ser humano. Preferiblemente, tales métodos se pueden realizar utilizando los T1R, o los fragmentos o variantes de los mismos, y los genes que codifican tales T1R, o los fragmentos o variantes de los mismos, descritos en la presente memoria.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar moléculas novedosas o combinaciones de moléculas que logran una percepción gustativa predeterminada en un mamífero. Tales moléculas o composiciones se pueden generar determinando un valor de la percepción gustativa en un mamífero para una molécula o combinaciones de moléculas conocidas; determinar un valor de la percepción gustativa en un mamífero para una o más moléculas o combinaciones de moléculas desconocidas; comparar el valor de la percepción gustativa en un mamífero para una o más composiciones desconocidas con el valor de la percepción gustativa en un mamífero para una o más composiciones conocidas; seleccionar una molécula o combinación de moléculas que logre una percepción gustativa predeterminada en un mamífero; y combinar dos o más moléculas o combinaciones de moléculas desconocidas para formar una molécula o combinación de moléculas que logra una percepción gustativa predeterminada en un mamífero. La etapa de combinación produce una única molécula o combinación de moléculas que logra una percepción gustativa predeterminada en un mamífero.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar un método de escrutinio de uno o más compuestos en cuanto a la presencia de un sabor detectable por un mamífero, que comprende: una etapa en la que se ponen en contacto dichos uno o más compuestos con al menos uno de los T1R fragmentos o variantes del mismo descritos, preferiblemente donde el mamífero es un ser humano.

Otro objeto de la descripción es proporcionar un método de estimulación del sabor, que comprende las etapas de: para cada uno de una pluralidad de T1R, o fragmentos o variantes de los mismos descritos en la presente memoria, preferiblemente TIR humanos, averiguar el grado en el que interacciona el T1R con la sustancia que estimula el sentido del gusto; y combinar una pluralidad de compuestos, teniendo cada uno una interacción averiguada previamente con uno o más de los T1R, en cantidades que proporcionen juntas un perfil de estimulación del receptor que imite el perfil para el sabor. La interacción de una sustancia que estimula el sentido del gusto con un T1R se puede determinar utilizando cualquiera de los análisis de unión o de informador descrito en la presente memoria. La pluralidad de compuestos se puede combinar después para formar una mezcla. Si se desea, se pueden combinar covalentemente uno o más de una pluralidad de compuestos. Los compuestos combinados estimulan sustancialmente al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o 90% o todos los receptores que son estimulados sustancialmente por la sustancia que estimula el sentido del gusto.

En otro aspecto más, se proporciona un método en el que una pluralidad de compuestos patrón se someten a ensayo frente a una pluralidad de T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, para averiguar el grado en el que interacciona cada uno de los T1R con cada compuesto patrón, generando de ese modo un perfil de estimulación del receptor para cada compuesto patrón. Estos perfiles de estimulación del receptor se pueden almacenar después en una base de datos relacional sobre un medio de almacenamiento de datos. El método puede comprender adicionalmente la provisión de un perfil de estimulación del receptor deseado para un sabor; la comparación del perfil de estimulación del receptor deseado con la base de datos relacional; y la averiguación de una o más combinaciones de compuestos patrón que más coincida con el perfil de estimulación del receptor deseado. El método puede comprender adicionalmente combinar los compuestos patrón en una o más de las combinaciones averiguadas para estimular el sabor.

Un objeto adicional de la descripción es proporcionar un método para representar la percepción gustativa de una sustancia concreta que estimula el sentido del gusto en un mamífero, que comprende las etapas de: proporcionar valores X_{1} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada uno de los n T1R de dicho vertebrado, donde n es mayor o igual que 2; y generar a partir de dichos valores una representación cuantitativa de la percepción gustativa. Los T1R pueden ser un receptor gustativo descrito en la presente memoria, o fragmentos o variantes del mismo, la representación puede constituir un punto o un volumen en un espacio n-dimensional, puede constituir un gráfico o un espectro, y puede constituir una matriz de representaciones cuantitativas. Asimismo, la etapa de aprovisionamiento puede comprender poner en contacto una pluralidad de T1R producidos recombinantemente, o fragmentos o variantes de los mismos, con una composición de ensayo y medir cuantitativamente la interacción de dicha composición con dichos receptores.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar un método para pronosticar la percepción gustativa en un mamífero generada por una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero, que comprende las etapas de: proporcionar valores X_{1} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada uno de los n T1R de dicho vertebrado, donde n es mayor o igual que 2; para una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa conocida en un mamífero; y generar a partir de dichos valores una representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen la percepción gustativa conocida en un mamífero, proporcionando los valores X_{l} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada uno de los n T1R de dicho vertebrado, donde n es mayor o igual que 2; para una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero; y generar a partir de dichos valores una representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero, y pronosticar la percepción gustativa en un mamífero generada por una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero comparando la representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero con la representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero. Los T1R utilizados en este método pueden incluir un receptor gustativo, o un fragmento o variante del mismo, descrito en la presente
memoria.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una criosección de lengua de ratón congelada que muestra la expresión del gen T1R3 en yemas gustativas de papilas circunvaladas de ratón mediante hibridación in situ. Las células receptoras gustativas que expresan el T1R3 seleccionado están marcadas con flechas.

Descripción detallada de la invención

La descripción proporciona de este modo moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican receptores acoplados a proteínas G específicos de las células gustativas ("GPCR"), y los polipéptidos que codifican. Estas moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos que codifican son miembros de la familia T1R de GPCR específicos de las células gustativas. Los miembros de la familia T1R de los GPCR específicos de las células gustativas son identificados por Hoon et al., en Cell, 96:541-551 (1999), en la publicación WO 00/06592, y en la publicación WO 00/06593.

Más concretamente, la descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican una familia novedosa de GPCR específicos de las células gustativas. Estos ácidos nucleicos y los receptores que codifican son referidos como miembros de la familia "T1R" de los GPCR específicos de las células gustativas. En realizaciones concretas, los miembros de la familia T1R incluyen rT1R3, mT1R3, hT1R3, y hT1R1. Si bien no se desea estar ligado a la teoría, se cree que estos GPCR específicos de las células gustativas son componentes de la ruta de transducción gustativa, y pueden estar implicados en la detección gustativa de sustancias dulces y/u otras modalidades gustativas.

Adicionalmente, se cree que los miembros de la familia T1R pueden actuar combinados con otros miembros de la familia T1R, otros GPCR específicos de las células gustativas, o una combinación de los mismos, para efectuar de ese modo la transducción gustativa quimiosensorial. Por ejemplo, se cree que T1R1 y T1R3 pueden ser expresados simultáneamente en el mismo tipo de células receptoras gustativas, y los dos receptores pueden interaccionar físicamente para formar un receptor gustativo heterodimérico. Alternativamente, T1R1 y T1R3 se pueden unir independientemente al mismo tipo de ligando, y su unión combinada puede dar como resultado una sensación gustativa percibida específica.

Estos ácidos nucleicos proporcionan sondas valiosas para la identificación de células gustativas, ya que los ácidos nucleicos son expresados específicamente en las células gustativas. Por ejemplo, las sondas para los polipéptidos y las proteínas T1R pueden ser utilizadas para identificar las células gustativas presentes en las papilas foliadas, circunvaladas, y fungiformes, así como las células gustativas presentes en "geschmackstreifen", la cavidad oral, el epitelio gastrointestinal, y la epiglotis. También pueden servir como herramientas para la generación de mapas topográficos gustativos que elucidan la relación entre las células gustativas de la lengua y las neuronas sensoriales gustativas que conducen a los centros gustativos del cerebro. En particular, se pueden utilizar los métodos de detección de T1R para identificar las células gustativas sensibles a las sustancias dulces que estimulan el sentido del gusto u otras modalidades de sustancias que estimulan el sentido el gusto específicas. Además, los ácidos nucleicos y las proteínas que codifican se pueden utilizar como sondas para analizar minuciosamente los comportamientos inducidos por el gusto. Asimismo, se puede utilizar la localización cromosómica de los genes que codifican los T1R humanos para identificar enfermedades, mutaciones, y rasgos causados por y asociados con los miembros de la familia T1R.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y polipéptidos T1R de la invención pueden ser aislados de una variedad de fuentes, diseñados genéticamente, amplificados, sintetizados, y/o expresados recombinantemente de acuerdo con los métodos descritos en la publicación WO 00/035374.

La invención también proporciona métodos de escrutinio para moduladores, p. ej., activadores, inhibidores, estimuladores, intensificadores, agonistas, y antagonistas, de estos GPCR específicos de las células gustativas novedosos. Tales moduladores de la transducción gustativa son útiles para la modulación farmacológica, química, y genética de las rutas de señalización gustativas. Estos métodos de escrutinio pueden ser utilizados para identificar agonistas y antagonistas de alta afinidad de la actividad de las células gustativas. Estos compuestos moduladores pueden ser utilizados después en las industrias alimentaria y farmacéutica para elaborar sabores al gusto del consumidor, p. ej., para modular los sabores dulces de alimentos o fármacos.

De este modo, la invención proporciona análisis para detectar y caracterizar la modulación gustativa, donde los miembros de la familia T1R actúan como moléculas informadoras directas o indirectas del efecto de los moduladores sobre la transducción gustativa. Los GPCR pueden ser utilizados en análisis p. ej., para medir los cambios en la unión a ligandos, la concentración de iones, el potencial de membrana, el flujo de corriente, el flujo de iones, la transcripción, la transducción de señales, las interacciones receptor-ligando, las concentraciones de segundo mensajero, in vitro, in vivo, y ex vivo. En una realización, los miembros de la familia T1R pueden ser utilizados como informadores indirectos por medio del anclaje a una segunda molécula informadora tal como la proteína fluorescente verde (véase, p. ej., Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 (1997)). En otra realización, los miembros de la familia T1R pueden ser expresados recombinantemente en células, y la modulación de la transducción gustativa por medio de la actividad de los GPCR puede ser analizada midiendo los cambios en los niveles de Ca^{2+} y otros mensajeros intracelulares tales como AMPc, GMPc, o IP3.

En ciertas realizaciones, se fusiona un dominio de un polipéptido T1R, p. ej., un dominio extracelular, transmembrana, o intracelular, con un polipéptido heterólogo, formando de ese modo un polipéptido quimérico, p. ej., un polipéptido quimérico con actividad GPCR. Tales polipéptidos quiméricos son útiles, p. ej., en análisis para identificar ligandos, agonistas, antagonistas, u otros moduladores de un polipéptido T1R. Además, tales polipéptidos quiméricos son útiles para crear receptores gustativos novedosos con especificidad de unión al ligando, modos de regulación, rutas de transducción de la señal, u otras propiedades semejantes novedosos, o para crear receptores gustativos novedosos con combinaciones novedosas de especificidad de unión al ligando, modos de regulación, rutas de transducción de la señal, etc.

En una realización, se expresa un polipéptido T1R en una célula eucariótica como un receptor quimérico, con una secuencia de chaperona, heteróloga que facilita el tráfico en la membrana plasmática, o la maduración y direccionamiento a través de la ruta secretora. La secuencia heteróloga opcional puede ser una secuencia de rodopsina, tal como un fragmento N-terminal de una rodopsina. Semejantes receptores T1R quiméricos pueden ser expresados en cualquier célula eucariótica, tal como células HEK-293. Preferiblemente, las células comprenden una proteína G, p. ej., G\alpha15 o G\alpha16 u otro tipo de proteína G promiscua capaz de emparejar una amplia gama de GPCR quimiosensoriales con una ruta de señalización intracelular o con una proteína de señalización tal como la fosfolipasa C. La activación de tales receptores quiméricos en tales células puede ser detectada utilizando cualquier método normalizado, por ejemplo detectando los cambios en el calcio intracelular mediante la detección de la fluorescencia dependiente de FURA-2 en la célula. Si las células anfitrionas preferidas no expresan una proteína G apropiada, pueden ser transfectadas con un gen que codifique una proteína G promiscua.

Los métodos de análisis de los moduladores de la transducción gustativa incluyen análisis de unión a ligandos in vitro utilizando: polipéptidos T1R, porciones de los mismos, esto es, el dominio extracelular, la región transmembrana, o combinaciones de los mismos, o proteínas quiméricas que comprenden uno o más dominios de un miembro de la familia T1R; oocitos o células de cultivos de tejidos que expresan polipéptidos T1R, fragmentos, o proteínas de fusión; fosforilación y desfosforilación de miembros de la familia T1R; unión de proteínas G a GPCR; análisis de unión a ligandos; cambios en el voltaje, el potencial de membrana y la conductancia; análisis del flujo de iones; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como GMPc, AMPc y trifosfato de inositol; cambios en los niveles intracelulares de calcio; y liberación de neurotransmisores.

Adicionalmente, la descripción proporciona métodos de detección de la expresión de ácido nucleico y proteína T1R, que permiten la investigación de la regulación de la transducción gustativa y la identificación específica de las células receptoras gustativas. Los miembros de la familia T1R también proporcionan sondas de ácido nucleico útiles para las investigaciones de paternidad y forenses. Los genes T1R también son útiles como sondas de ácido nucleico para identificar células receptoras gustativas, tales como las células receptoras gustativas foliadas, fungiformes, circunvaladas, geschmackstreifen, y epiglotis. Los receptores T1R también pueden ser utilizados para generar anticuerpos monoclonales y policlonales útiles para identificar células receptoras gustativas. Las células receptoras gustativas pueden ser identificadas utilizando técnicas tales como la transcripción inversa y la amplificación del ARNm, el aislamiento de ARN total o ARN poli A+, la transferencia northern, la transferencia puntual, la hibridación in situ, la protección de ARNasa, digestión S1, sondeo de matrices de microchips de ADN, transferencias western, y similares.

Funcionalmente, los polipéptidos T1R comprenden una familia de receptores acoplados a proteínas G transmembrana 7 relacionados, que se cree que están implicados en la transducción gustativa y pueden interaccionar con una proteína G para mediar la transducción de la señal gustativa (véase, p. ej., Fong, Cell Signal, 8:217 (1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol., 6:180 (1994)). Estructuralmente, las secuencias de nucleótidos de los miembros de la familia T1R pueden codificar polipéptidos relacionados que comprenden un dominio extracelular, siete dominios transmembrana, y un dominio citoplásmico. Los genes de la familia T1R relacionados de otras especies comparten una identidad de secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 50%, y opcionalmente 60%, 70%, 80%, o 90%, a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, opcionalmente 100, 200, 500, o más nucleótidos de longitud con los SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 9, 11, 13, 15, 16, 20, o variantes modificadas conservativamente de los mismos, o codifican polipéptidos - que comparten una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 35 a 50%, y opcionalmente 60%, 70%, 80%, o 90%, a lo largo de una región de aminoácidos de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, opcionalmente 50 a 100 aminoácidos de longitud con los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, 17, o las variantes modificadas conservativamente de los mismos.

Asimismo se han identificado diversas secuencias de aminoácidos o dominios consenso que son característicos de los miembros de la familia T1R. Por ejemplo, los miembros de la familia T1R comprenden típicamente una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente 50%, opcionalmente 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95-99%, o más, con las secuencias consenso T1R 1 y 2 (SEQ ID NO: 18 y 19, respectivamente). Estos dominios conservados se pueden utilizar de este modo para identificar miembros de la familia T1R, por identidad, hibridación específica o amplificación, o unión específica por medio de anticuerpos originados contra un dominio. Tales secuencias consenso T1R tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

Secuencia Consenso 1 de la Familia T1R:	(SEQ ID NO: 18)
(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)E

Secuencia Consenso 2 de la Familia T1R:	(SEQ ID NO: 19)
(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)

Estas secuencias consenso incluyen aquellas encontradas en los polipéptidos T1R descritos en la presente memoria, pero se puede esperar que los miembros de la familia T1R de otros organismos comprendan secuencias consenso que tengan una identidad de aproximadamente 75% o más con las secuencias consenso incluidas descritas específicamente en la presente memoria.

Se pueden utilizar regiones específicas de las regiones de nucleótidos y aminoácidos T1R para identificar variantes polimórficas, homólogos interespecie, y alelos de los miembros de la familia T1R. Esta identificación puede ser realizada in vitro, p. ej., en condiciones de hibridación restrictivas o PCR (p. ej., utilizando cebadores que codifican las secuencias consenso T1R identificadas antes), o utilizando la información de la secuencia en un sistema computarizado para la comparación con otras secuencias de nucleótidos. Los diferentes alelos de los genes T1R en la población de una única especie también serán útiles en la determinación de si las diferencias en las secuencias alélicas se corresponden con las diferencias en la percepción gustativa entre los miembros de la población. Las técnicas de amplificación de tipo PCR y de clonación clásicas son útiles para el aislamiento de ortólogos, por ejemplo, cuando los cebadores degenerados son suficientes para detectar genes relacionados a través de las especies, que tienen típicamente un nivel superior de identidad relativa que los miembros parálogos de la familia T1R de una única especie.

Por ejemplo, los cebadores degenerados SAP077 (SEQ ID NO: 5) y SAP0079 (SEQ ID NO: 6) pueden ser utilizados para amplificar y clonar los genes T1R3 de diferentes genomas de mamífero. En cambio, los genes de una única especie que están relacionados con T1R3 se identifican mejor utilizando un soporte lógico de reconocimiento de patrones de secuencias para buscar secuencias relacionadas. Típicamente, la identificación de variantes polimórficas y alelos de los miembros de la familia T1R se puede realizar comparando una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 25 aminoácidos o más, p. ej., 50-100 aminoácidos. La identidad de aminoácidos de aproximadamente al menos 35 a 50%, y opcionalmente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95-99%, o superior demuestra típicamente que una proteína es una variante polimórfica, un homólogo interespecie, o un alelo de un miembro de la familia T1R. La comparación de secuencias se puede realizar utilizando cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias comentados más abajo. Los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos T1R o una región conservada de los mismos también se pueden utilizar para identificar alelos, homólogos interespecie, y variantes polimórficas.

Las variantes polimórficas, los homólogos interespecie, y los alelos de los genes T1R pueden ser confirmados examinando la expresión específica de las células gustativas del supuesto polipéptido T1R. Típicamente, los polipéptidos T1R que tienen una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria pueden ser utilizados como control positivo en comparación con el supuesto polipéptido T1R para demostrar la identificación de una variante polimórfica o alelo del miembro de la familia T1R. Se espera que las variantes polimórficas, alelos, y homólogos interespecie conserven la estructura transmembrana siete de un receptor acoplado a proteínas G. Para un mayor detalle, véase la publicación WO 00/06592, que describe miembros relacionados con la familia T1R, GPCR-B3, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia de una manera coherente con esta descripción. Los receptores GPCR-B3 son referidos en la presente memoria como rT1R1 y mT1R1. Adicionalmente, véase la publicación WO 00/06593, que también describe miembros de la familia T1R relacionados, GPCR-B4, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia de una manera coherente con esta descripción. Los receptores GPCR-B4 son referidos en la presente memoria como rT1R2 y mT1R2.

La información de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos para los miembros de la familia T1R también se puede utilizar para construir modelos de polipéptidos específicos de células gustativas en un sistema computarizado. Estos modelos se pueden utilizar con posterioridad para identificar compuestos que pueden activar o inhibir proteínas de receptores T1R. Tales compuestos que modulan la actividad de los miembros de la familia T1R pueden ser utilizados después para investigar el papel de los genes y receptores T1R en la transducción gustativa.

La presente invención también proporciona análisis, preferiblemente análisis de elevado rendimiento, para identificar moléculas que interaccionan y/o modulan un polipéptido T1R. En numerosos análisis, se utiliza un dominio concreto de un miembro de la familia T1R, p. ej., un dominio o región extracelular, transmembrana, o intracelular. En numerosas realizaciones, se puede unir un dominio extracelular, una región transmembrana o una combinación de los mismos a un sustrato sólido, y utilizarlo, p. ej., para aislar ligandos, agonistas, antagonistas, o cualquier otra molécula que se pueda unir a y/o modular la actividad del polipéptido T1R.

En un aspecto de la invención, se proporciona un nuevo gen de GPCR humano de la familia T1R, denominado hTIR3. El gen hT1R3 fue identificado a partir de la base de datos de la secuencia del genoma humano incluyendo la división HTGS de GenBank. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos traducida conceptualmente para hT1R3 se proporcionan en los SEQ ID NOS 1-4. El receptor hT1R3 fue identificado en el clon genómico BAC parcialmente secuenciado RP5-890O3 (número de acceso de la base de datos AL139287) en virtud de su similitud de secuencia con el receptor gustativo de rata candidato rT1R1 (número de acceso AF127389). Como referencia, la identidad por pares entre las secuencias de las proteínas hT1R3 y rT1R1 pronosticadas es de aproximadamente 34%. Las comparaciones de secuencias con miembros adicionales de la Familia C de GPCR (que incluye los receptores sensibles al calcio, los supuestos receptores de feromona V2R, los receptores GABA-B, los receptores gustativos de peces, y los receptores de glutamato metabotrópicos) indican que es probable que hT1R3 pertenezca al subgrupo de la Familia C definido por T1R1 y un segundo receptor gustativo candidato de rata (rT1R2, número de acceso AF127390).

Asimismo se proporciona el ortólogo humano, denominado hT1R1, de un receptor gustativo de rata, denominado rT1R1. Los productos génicos de rT1R1 y hT1R1 son aproximadamente idénticos en un 74%. Se ha informado sobre el gen de ratón, mT1R1, véase Hoon et al., Cell, 96:541-551 (2000), y se mapea un intervalo cromosómico homólogo al intervalo que contiene hT1R1. Las secuencias de nucleótidos y traducidas conceptualmente de hT1R1 se describen en la presente memoria como SEQ. ID NOS 15 y 16, respectivamente.

Si bien no se desea estar ligado a ninguna teoría concreta, se pronostica que la familia de receptores T1R está implicada en la transducción gustativa dulce en virtud de la conexión de mTIR3 al locus Sac, un locus en el extremo distal del cromosoma cuatro que influye en el sabor dulce. Se ha informado que el T1R3 humano se localiza en 1p36.2-1p36.33, una región que presenta sintenia con el intervalo de ratón que contiene Sac y T1R1. Sin embargo, este tipo de receptores T1R puede mediar otras modalidades de sabor, tales como amargo, umami, ácido y salado.

Se prevé que varias mutaciones y sustituciones conservativas se encuentren dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, estaría dentro del nivel del experto en la técnica realizar sustituciones de aminoácidos utilizando protocolos conocidos de tecnología de genes recombinantes incluyendo PCR, clonación de genes, mutagénesis de ADNc dirigida al sitio, transfección de células anfitrionas, y transcripción in-vitro. Las variantes podrían ser escrutadas después en cuanto a la actividad funcional de los GPCR específicos de las células gustativas.

A. Identificación y Caracterización de Polipéptidos T1R

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas y polipéptidos T1R de la invención pueden ser identificadas mediante la supuesta traducción de la secuencia codificadora de ácido nucleico. Estas diversas secuencias de aminoácidos y la secuencia codificadora de ácido nucleico pueden ser comparadas entre sí o con otras secuencias de acuerdo con numerosos métodos.

Por ejemplo, en la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. Se pueden utilizar los parámetros del programa por defecto, como se describe más abajo para los programas BLASTN y BLASTP, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo relativas a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", según se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de las numerosas posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más normalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado óptimamente. Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. suplemento 1995)).

Un ejemplo preferido de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y de similitud de la secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que describen Altschul et al., en Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., en J Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El soporte lógico para realizar análisis BLAST está disponible al público a través de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencia con puntuación elevada (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que se emparejan o satisfacen alguna puntuación umbral T valorada como positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referida como umbral de la puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Estos éxitos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los éxitos de las palabras se amplían en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la puntuación del alineamiento cumulativo. Las puntuaciones cumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos de emparejamiento; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos de emparejamiento erróneo; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La ampliación de los éxitos de las palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación cumulativa del alineamiento desciende la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación cumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras.

Otro ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencia relacionadas utilizando alineamientos por pares, progresivos para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de la secuencia. Asimismo traza un denominado "árbol" o "dendograma" que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento (véase, p. ej., la Figura 2). PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El método utilizado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se alinea después con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias se alinean mediante la simple ampliación del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra por medio de una serie de alineamientos por pares, progresivos. El programa se hace funcionar designando las secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de la secuencia y designando los parámetros del programa. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar la relación de porcentaje de identidad de la secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso del espacio por defecto (3,00), peso de la longitud del espacio por defecto (0,10), y espacios finales pesados. PILEUP puede ser obtenido del paquete de soporte lógico para el análisis de secuencias de GCG, p. ej., versión 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984) codificado por los genes derivados mediante traducción conceptual de los correspondientes marcos de lectura abiertos. La comparación de estas secuencias de proteínas con todas las proteínas conocidas en las bases de datos de secuencias públicas utilizando el algoritmo BLASTP reveló su fuerte homología con los miembros de la familia T1R, teniendo cada una de las secuencias de la familia T1R una identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente 35 a 50%, y preferiblemente al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, y muy preferiblemente al menos 70%, con al menos un miembro conocido de la familia.

B. Definiciones

Según se utilizan en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados adscritos a ellos a menos que se especifique de otro modo.

"Células gustativas" incluye células neuroepiteliales que están organizadas en grupos para formar las yemas gustativas de la lengua, p. ej., células foliadas, fungiformes, y circunvaladas (véase, p. ej., Roper et al., Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353 (1989)). También se encuentran células gustativas en el paladar y otros tejidos, tales como el esófago y el estómago.

"T1R" hace referencia a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados a proteínas G que son expresados en las células gustativas tales como las células foliadas, fungiformes, y circunvaladas, así como células del paladar, y el esófago (véase, p. ej., Hoon et al., Cell, 96:541-551 (1999)). Los miembros de esta familia también son referidos como GPCR-B3 y TR1 en la publicación WO 00/06592 así como GPCR B4 y TR2 en la publicación WO 00/06593. GPCR-B3 también es referido en la presente memoria como rT1R1, y GPCR-B4 es referido como rT1R2. Las células receptoras gustativas también pueden ser identificadas basándose en la morfología (véase,p. ej., Roper, supra), o por medio de la expresión de proteínas expresadas específicamente en las células gustativas. Los miembros de la familia T1R pueden tener la capacidad de actuar como receptores de la transducción gustativa dulce, o para distinguir entre diversas modalidades de gustos distintos.

Los ácidos nucleicos "T1R" codifican una familia de GPCR con siete regiones transmembrana que tienen "actividad de receptor acoplado a proteínas G", p. ej. se pueden unir a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promover la producción de segundos mensajeros tales como IP3, AMPc, GMPc, y Ca^{2+} por medio de la estimulación de enzimas tales como la fosfolipasa C y la adenilato ciclasa (para una descripción de la estructura y función de los GPCR, véase, p. ej., Fong, supra, y Baldwin, supra). Una sola célula gustativa puede contener muchos polipéptidos T1R distintos.

El término familia "T1R" hace referencia por lo tanto a las variantes polimórficas, los alelos, los mutantes, y los homólogos interespecie que: (1) tienen al menos aproximadamente una identidad de la secuencia de aminoácidos de 35 a 50%, opcionalmente aproximadamente una identidad de la secuencia de aminoácidos de 60, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o 99% con los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, o 17, a lo largo de una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente 50-100 aminoácidos; (2) se unen específicamente con anticuerpos originados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, 17, y las variantes modificadas conservativamente de la misma; (3) están codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida específicamente (con un tamaño de al menos aproximadamente 100, opcionalmente al menos aproximadamente 500-1000 nucleótidos) en condiciones de hibridación restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 9, 11, 13, 15, 16, 20, y las variantes modificadas conservativamente de la misma; (4) comprenden una secuencia idéntica al menos aproximadamente en un 35 a 50% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, o 17; o (5) son amplificados por cebadores que hibridan específicamente en condiciones de hibridación restrictivas con la misma secuencia que los grupos de cebadores degenerados que codifican los SEQ ID NOS: 7, 8, y las variantes modificadas conservativamente de la misma.

Topológicamente, ciertos GPCR quimiosensoriales tienen un "dominio N-terminal"; "dominios extracelulares"; "dominios transmembrana" que comprenden siete regiones transmembrana, y los correspondientes bucles citoplásmicos, y extracelulares; "dominios citoplásmicos", y un "dominio C-terminal" (véase, p. ej., Hoon et al., Cell, 96:541-551 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-187 (1991)). Estos dominios pueden ser identificados estructuralmente utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como los programas de análisis de secuencia que identifican los dominios hidrofóbicos e hidrofílicos (véase, p. ej., Stryer, Biochemistry, (3ª ed. 1988); véase también cualquiera de los numerosos programas de análisis de secuencias con base en Internet, tales como aquellos encontrados en dot.imgen.bcm.tmc.edu). Tales dominios son útiles para elaborar proteínas quiméricas y para análisis in vitro de la invención, p. ej., análisis de unión a ligandos.

"Dominios extracelulares" hace referencia por lo tanto a los dominios de los polipéptidos T1R que sobresalen de la membrana celular y están expuestos a la cara extracelular de la célula. Tales dominios incluyen generalmente el "dominio N-terminal" que está expuesto a la cara extracelular de la célula, y opcionalmente pueden incluir porciones de los bucles extracelulares del dominio transmembrana que están expuestos a la cara extracelular de la célula, esto es, los bucles entre las regiones transmembrana 2 y 3, entre las regiones transmembrana 4 y 5, y entre las regiones transmembrana 6 y 7.

La región del "dominio N-terminal" comienza en el extremo N y se extiende a una región próxima al inicio del dominio transmembrana. Más concretamente, en una realización de la invención, este dominio comienza en el extremo N y termina aproximadamente en el ácido glutámico conservado de la posición del aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. La región correspondiente a los aminoácidos 1-580 del SEQ ID 40 es una realización concreta de un dominio extracelular que se extiende ligeramente al dominio transmembrana. Estos dominios extracelulares son útiles para análisis de unión a ligandos in vitro, tanto en fase soluble como sólida. Además, las regiones transmembrana, descritas más abajo, también se pueden unir al ligando o bien combinadas con el dominio extracelular, y son por lo tanto útiles para análisis de unión a ligandos in vitro.

"Dominio transmembrana", que comprende las siete "regiones transmembrana", hace referencia al dominio de los polipéptidos T1R que se encuentra dentro de la membrana plasmática, y también puede incluir los correspondientes bucles citoplásmicos (intracelulares) y extracelulares. En una realización, esta región corresponde al dominio de los miembros de la familia T1R que comienza aproximadamente en el resto ácido glutámico conservado en la posición del aminoácido 563 más o menos 20 aminoácidos y termina aproximadamente en el resto aminoácido tirosina conservado en la posición del aminoácido 812 más o menos 10 aminoácidos. Las siete regiones transmembrana y los bucles extracelulares y citoplásmicos pueden ser identificadas utilizando métodos normalizados, como describen Kyte & Doolittle, en J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)), o en Stryer, supra.

"Dominios citoplásmicos" hace referencia a los dominios de los polipéptidos T1R que dan al interior de la célula, p. ej., "el dominio C terminal" y los bucles intracelulares del dominio transmembrana, p. ej., el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 1 y 2, el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 3 y 4, y el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 5 y 6. "Dominio C terminal" hace referencia a la región que abarca el extremo del último dominio transmembrana y el extremo C de la proteína, y que está localizada normalmente dentro del citoplasma. En una realización, esta región comienza en el resto aminoácido tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos y continúa hasta el extremo C del polipéptido.

El término "región de unión al ligando" o "dominio de unión al ligando" hace referencia a secuencias derivadas de un receptor quimiosensorial, concretamente un receptor gustativo, que incorpora sustancialmente al menos el dominio extracelular del receptor. En una realización, el dominio extracelular de la región de unión al ligando puede incluir el dominio N-terminal y, opcionalmente, porciones del dominio transmembrana, tales como los bucles extracelulares del dominio transmembrana. La región de unión al ligando puede ser capaz de unirse a un ligando, y más concretamente a una sustancia que estimula el sentido del gusto.

Las frase "efectos funcionales" en el contexto de los análisis para someter a ensayo compuestos que modulan la transducción gustativa mediada por un miembro de la familia T1R incluye la determinación de cualquier parámetro que esté directamente o indirectamente bajo la influencia del receptor, p. ej., efectos funcionales, físicos y químicos. Incluye la unión al ligando, los cambios en el flujo de iones, el potencial de membrana, el flujo de corriente, la transcripción, la unión a la proteína G, la fosforilación o desfosforilación de GPCR, la transducción de la señal, las interacciones receptor-ligando, las concentraciones de segundo mensajero (p. ej., AMPc, GMPc, IP3, o Ca^{2+} intracelular), in vitro, in vivo, y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como el aumento y la disminución de liberación de neurotransmisor y hormona.

Por "determinación del efecto funcional" en el contexto de los análisis se quieren significar análisis para un compuesto que aumentan o disminuyen un parámetro que está indirectamente o directamente bajo la influencia de un miembro de la familia T1R, p. ej., efectos funcionales, físicos y químicos. Tales efectos funcionales se pueden medir mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, p. ej., cambios en las características espectroscópicas (p. ej., fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (p. ej., la forma), cromatográficas, o de solubilidad, pinzamiento zonal, colorantes sensibles al voltaje, corrientes de células completas, eflujo de radioisótopos, marcadores inducibles, expresión del gen T1R en oocitos; expresión de T1R en células de cultivos de tejidos; activación transcripcional de genes T1R; análisis de unión al ligando; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; análisis del flujo de iones; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc, GMPc, y trifosfato de inositol (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisores, y similares.

"Inhibidores", "activadores", y "moduladores" de los genes o proteínas T1R se utilizan indistintamente para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras, o moduladoras identificadas utilizando análisis in vitro e in vivo para la transducción gustativa, p. ej., ligandos, agonistas, antagonistas, y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, p. ej., se unen, bloquean parcialmente o totalmente la estimulación, disminuyen, evitan, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan, o regulan a la baja la transducción gustativa, p. ej., antagonistas. Los activadores son compuestos que, p. ej., se unen a, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activación sensibilizan, o regulan al alza la transducción gustativa, p. ej., agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, p. ej., alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (p. ej., ebnerina y otros miembros de la familia de portadores hidrofóbicos); proteínas G; quinasas (p. ej., homólogos de rodopsina quinasa y quinasas de receptores adrenérgicos que están implicados en la desactivación y desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan los receptores. Los moduladores pueden incluir versiones genéticamente modificadas de los miembros de la familia T1R, p. ej., con una actividad alterada, así como ligandos naturales y sintéticos, antagonistas, agonistas, pequeñas moléculas químicas y similares. Tales análisis para los inhibidores y activadores incluyen, p. ej., expresar miembros de la familia T1R en células o membranas celulares, aplicar supuestos compuestos moduladores, en presencia o ausencia de sustancias que estimulan el sentido del gusto, p. ej., sustancias que estimulan el sentido del gusto dulce, y después determinar los efectos funcionales sobre la transducción gustativa, como se ha descrito antes. Las muestras o análisis que comprenden miembros de la familia T1R que se tratan con un activador, inhibidor, o modulador potencial se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador, o modulador para examinar el grado de modulación. A las muestras de control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor de actividad T1R relativo de 100%. La inhibición de un T1R se logra cuando el valor de actividad T1R relativo al control es de aproximadamente 80%, opcionalmente 50% o 25-0%. La activación de T1R se logra cuando el valor de actividad T1R relativo al control es 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200-500%, o 1000-3000% superior.

Los términos "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado" según se utilizan en la presente memoria hacen referencia al estado en el que el compuesto de la invención se encuentra libre de otros compuestos diferentes con los que se asocia normalmente en su estado natural, de manera que el sujeto "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado" comprende al menos 0,5%, 1%, 5%, 10%, o 20%, y muy preferiblemente al menos 50% o 75% de la masa, en peso, de una muestra dada. En otra realización preferida, estos términos hacen referencia al compuesto de la invención que comprende al menos 95% de la masa, en peso, de una muestra dada. Según se utiliza en la presente memoria, los términos "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado", cuando se refieren a un ácido nucleico o proteína, de ácidos nucleicos o proteínas, también hacen referencia a un estado de purificación o concentración diferente de aquél que se encuentra naturalmente en el organismo de mamíferos, especialmente de seres humanos. Cualquier grado de purificación o concentración mayor de aquél que se produce naturalmente en el organismo de mamíferos, especialmente seres humanos, incluyendo (1) la purificación a partir de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos con los cuales no se asocia normalmente en el organismo de mamíferos, especialmente seres humanos, están dentro del significado de "aislado". El ácido nucleico o la proteína o las clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en la presente memoria, pueden ser aislados, o asociados de otro modo con estructuras o compuestos a los cuales no están normalmente asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aislado", cuando se refiere a un ácido nucleico o polipéptido hace referencia a un estado de purificación o concentración diferente al que se existe naturalmente en el organismo de mamíferos, especialmente del ser humano. Cualquier grado de purificación o concentración mayor que el que existe naturalmente en la naturaleza en el organismo, incluyendo (1) la purificación a partir de otras estructuras o compuestos asociados naturalmente, o (2) la asociación con estructuras o compuestos con los cuales no está normalmente asociado en el organismo se encuentran dentro del significado de "aislado" según se utiliza en la presente memoria. Los ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en la presente memoria pueden estar aislados o asociados de otro modo con estructuras o compuestos con los cuales no se encuentran normalmente asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utilizan en la presente memoria, los términos "amplificar" y "amplificación" hacen referencia al uso de cualquier metodología de amplificación adecuada para generar o detectar ácidos nucleicos recombinantes o expresados naturalmente, como se describe con detalle más abajo. Por ejemplo, la invención proporciona métodos y reactivos (p. ej., pares de cebadores oligonucleotídicos degenerados específicos) para amplificar (p. ej., mediante reacción en cadena de la polimerasa, PCR) los ácidos nucleicos de la invención (p. ej., secuencias de unión a sustancias que estimulan el sentido del gusto de la invención) expresados naturalmente (p. ej., genómico o ARNm) o recombinantes (p. ej., ADNc) in vivo o in vitro.

El término "receptor transmembrana 7" representa un polipéptido que pertenece a la superfamilia de las proteínas transmembrana que tienen siete dominios que abarcan la membrana plasmática siete veces (de este modo, los siete dominios se denominan dominios "transmembrana" o "TM" TM I a TM VII). Las familias de receptores olfatorios y ciertos receptores gustativos pertenecen a esta superfamilia. Los polipéptidos del receptor transmembrana 7 tienen las estructuras primaria, secundaria y terciaria similares y características, como se comenta con más detalle más abajo.

El término "genoteca" representa una preparación que es una mezcla de diferentes moléculas de ácido nucleico o polipéptido, tal como la genoteca de dominios de unión a ligandos de receptores quimiosensoriales, concretamente gustativos, generados recombinantemente, generados mediante amplificación de ácido nucleico con pares de cebadores degenerados, o una colección aislada de vectores que incorporan los dominios de unión a ligandos amplificados, o una mezcla de células transfectadas cada una al azar con al menos un vector que codifica un receptor gustativo.

El término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" hace referencia a un oligonucleótido de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma de hebra sencilla o doble. El término abarca ácidos nucleicos, esto es, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras de tipo ácido nucleico con esqueletos sintéticos (véase p. ej., Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, ed. F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the N.Y. Academy of Sciences, Vol. 600, Eds. Baserga et al. (NYAS 1992); Milligan J. Med. Chem. 36:1923-1937 (1993); Antisense Research and Applications (1993, CRC Press), publicación WO 97/03211; publicación WO 96/39154; Mata, Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197 (1997); Strauss-Soukup, Biochemistry 36:8692-8698 (1997); Samstag, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 6:153-156 (1996)).

A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico concreta también abarca implícitamente las variantes modificadas conservativamente de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) las secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden obtener generando, p. ej., secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados es sustituida con bases mixtas y/o restos desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se utiliza indistintamente con genes, ADNc, ARNm, oligonucleótidos, y polinucleótidos.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a un polímero de restos aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos aminoácido son un mimético químico artificial del correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "dominio de translocación de la membrana plasmática" o simplemente "dominio de translocación" representa un dominio polipeptídico que, cuando es incorporado al extremo amino de una secuencia codificadora polipeptídica, puede "acompañar como chaperona" o "translocar" con gran eficacia la proteína híbrida ("fusión") a la membrana plasmática celular. Por ejemplo, un "dominio de translocación" puede derivar del extremo amino del polipéptido receptor de rodopsina bovina, un receptor transmembrana 7. Sin embargo, se puede utilizar la rodopsina de cualquier mamífero, como también otras secuencias que faciliten la translocación. De este modo, el dominio de translocación es particularmente eficaz en la translocación de las proteínas de fusión transmembrana 7 a la membrana plasmática, y una proteína (p. ej., un polipéptido receptor gustativo) que comprenda un dominio de translocación amino terminal será transportada a la membrana plasmática más eficazmente que sin el dominio. Sin embargo, si el dominio N-terminal del polipéptido es activo en la unión, se puede preferir el uso de otros dominios de translocación.

El "dominio de translocación", el "dominio de unión al ligando", y las composiciones de receptores quiméricos descritos en la presente memoria también incluyen "análogos", o "variantes conservativas" y "miméticos" ("peptidomiméticos") con estructuras y actividad que corresponden sustancialmente a las secuencias ilustrativas. De este modo, los términos "variante conservativa" o "análogo" o "mimético" hacen referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada, de manera que el cambio o los cambios no alteran sustancialmente la estructura y/o actividad del polipéptido (las variantes conservativas), como se define en la presente memoria. Estos incluyen las variaciones modificadas conservativamente de una secuencia de aminoácidos, esto es, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos de aquellos restos que no son críticos para la actividad de la proteína, o la sustitución de aminoácidos por restos que tienen propiedades similares (p. ej., ácido, alcalino, cargado positivamente o negativamente, polar o no polar, etc.) de manera que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no alteran sustancialmente la estructura y/o actividad.

Más concretamente, "variantes modificadas conservativamente" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico concretas, las variantes modificadas conservativamente hacen referencia a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada.

Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en la que la alanina está especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado.

Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente memoria que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón del ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para la metionina, y TGG, que es normalmente el único codón para el triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, una pauta ilustrativa para seleccionar sustituciones conservativas incluye (resto original seguido de sustitución ilustrativa): ala/gly o ser; arg/lys; asn/gln o his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala o pro; his/asn o gln; ile/leu o val; leu/ile o val; lys/arg o gln o glu; met/leu o tyr o ile; phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp o phe; val/ile o leu. Una pauta ilustrativa alternativa utiliza los siguientes seis grupos, que contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparragina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (I); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); (véase también, p. ej., Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company (1984); Schultz y Schimer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag (1979)). Un experto en la técnica apreciará que las sustituciones identificadas antes no son las únicas sustituciones conservativas posibles. Por ejemplo, para algunos fines, se pueden considerar todos los aminoácidos cargados como sustituciones conservativas entre sí ya sean positivos o negativos. Además, también se pueden considerar "variaciones modificadas conservativamente" las sustituciones, deleciones o adiciones que alteran, añaden o suprimen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada.

Los términos "mimético" y "peptidomimético" hacen referencia a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos, p. ej., dominios de translocación, dominios de unión al ligando, o receptores quiméricos de la invención. El mimético puede estar compuesto completamente por análogos no naturales, sintéticos de aminoácidos, o puede ser una molécula quimérica con parte de los aminoácidos peptídicos naturales y parte de los análogos de aminoácidos no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales con tal que tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético.

Como con los polipéptidos de la invención que son variantes conservativas, la experimentación rutinaria determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, esto es, que su estructura y/o función no está sustancialmente alterada. Las composiciones miméticas polipeptídicas pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales, que son típicamente de tres grupos estructurales: a) grupos de unión a restos distintos de las uniones de los enlaces amida naturales ("enlace peptídico"); b) restos no naturales en lugar de restos aminoácido naturales; o c) restos que inducen mimetismo estructural secundario, esto es, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, p. ej., una conformación en giro beta, giro gamma, lámina beta, hélice alfa, y similares. Un polipéptido puede ser caracterizado como mimético cuando todos o algunos de sus restos están unidos mediante medios químicos distintos de los enlaces peptídicos naturales. Los restos peptidomiméticos individuales pueden estar unidos por enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, p. ej., glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropil-carbodiimida (DIC). Los grupos conectores que pueden ser una alternativa a las conexiones de enlaces amida convencionales ("enlace peptídico") incluyen, p. ej., cetometileno (p. ej., -C(=O)-CH_{2}- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH_{2}-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH_{2}-O), tioéter (CH_{2}-S), tetrazol (CN_{4}), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (véase, p. ej., Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, págs. 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NY (1983)). Un polipéptido también puede ser caracterizado como mimético por contener todos o algunos de los restos naturales en lugar de los restos aminoácido naturales; los restos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patentes.

Una "marca" o "radical detectable" es una composición detectable mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, las marcas útiles incluyen P^{32}, colorantes fluorescentes, reactivos electrón-densos, enzimas (p. ej., como las utilizadas comúnmente en ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas que se pueden volver detectables, p. ej., incorporando una marca radiactiva al péptido o se pueden utilizar para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido.

Una "sonda de ácido nucleico u oligonucleótido marcado" es aquélla que está unida, covalentemente, por medio de un conector o enlace químico, o no covalentemente, por medio de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos, o de hidrógeno a una marca de tal manera que la presencia de la sonda puede ser percibida detectando la presencia de la marca unida a la sonda.

Según se utiliza en la presente memoria una "sonda de ácido nucleico u oligonucleótido" se define como un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria por medio de uno o más tipos de enlaces químicos, normalmente por medio de emparejamiento de bases complementarias, normalmente por medio de formación de enlaces de hidrógeno. Según se utiliza en la presente memoria, una sonda puede incluir bases naturales (esto es, A, G, C, o T) o modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases de una sonda pueden estar unidas por una conexión distinta de un enlace fosfodiéster, con tal que no interfiera en la hibridación. De este modo, por ejemplo, las sondas pueden ser ácido nucleicos peptídicos en los cuales las bases constitutivas están unidas por enlaces peptídicos en lugar de por conexiones fosfodiéster. Un experto en la técnica entenderá que las sondas se pueden unir a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo del carácter restrictivo de las condiciones de hibridación. Las sondas están marcadas directamente opcionalmente con isótopos, cromóforos, lumíforos, cromógenos, o indirectamente por ejemplo con biotina a la cual se une más tarde un complejo de estreptavidina. Analizando la presencia o ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia seleccionada.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico es producido típicamente recombinantemente, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para formar un nuevo ácido nucleico funcional, p. ej., un promotor de una fuente y una región codificadora de otra fuente. De un modo similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (p. ej., una proteína de fusión).

Un "promotor" se define como una disposición de secuencias de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Según se utiliza en la presente memoria, un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos intensificadores o represores distales, que pueden estar localizados a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones medioambientales o evolutivas. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo una regulación medioambiental o evolutiva. El término "conectado operablemente" hace referencia a una conexión funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, o una disposición de sitios de unión al factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Según se utiliza en la presente memoria, "recombinante" hace referencia a un polinucleótido sintetizado o manipulado de otro modo in vitro (p. ej., "polinucleótido recombinante"), a los métodos de utilización de polinucleótidos recombinantes para formar productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. "Métodos recombinantes" también abarca la ligación de ácidos nucleicos que tienen diversas regiones codificadoras o dominios o secuencias promotoras de diferentes fuentes en un casete o vector de expresión, p. ej., de expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que comprende un dominio de translocación de la invención y una secuencia de ácido nucleico amplificada utilizando un cebador de la invención.

La frase "hibrida selectivamente (o específicamente) con" hace referencia a la unión, formación de dúplex, o hibridación de una molécula solamente con una secuencia de nucleótidos concreta en condiciones de hibridación restrictivas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (p. ej., ADN o ARN celular total o de una genoteca).

La frase "condiciones de hibridación restrictivas" hace referencia a condiciones en las cuales una sonda hibridará con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una pauta extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que se encuentren a aproximadamente 5-10ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica, pH, y concentración nucleica definidos) a la cual el 50% de las sondas complementarias con la diana hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (a medida que las secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones restrictivas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es una concentración de iones sodio menor de aproximadamente 1,0 M, típicamente una concentración de iones sodio de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para las sondas cortas (p. ej., 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para las sondas largas (p. ej., mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para una hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces la hibridación del fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación del fondo. Las condiciones de hibridación restrictivas ilustrativas pueden ser las siguientes: formamida al 50%, Sx SSC, y SDS al 1%, incubación a 42ºC, o, Sx SSC, SDS al 1%, incubación a 65ºC, con un lavado en 0,2x SSC, y SDS al 0,1% a 65ºC. Tales etapas de hibridación y lavado se pueden llevar a cabo, p. ej., durante 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60; o más
minutos.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones restrictivas todavía están sustancialmente relacionados si los polipéptidos que codifican están sustancialmente relacionados. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos hibridan típicamente en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas. Las "condiciones de hibridación moderadamente restrictivas" incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 1X SSC a 45ºC. Tales etapas de hibridación y lavado se pueden llevar a cabo, por ejemplo, durante 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, o más minutos. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Los expertos reconocerán fácilmente que la hibridación alternativa y las condiciones de lavado se pueden utilizar para proporcionar condiciones de un carácter restrictivo similar.

"Anticuerpo" hace referencia a un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une específicamente y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon, y mu, así como la miriada de genes de las regiones variables de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ilustrativa comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de los antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) hacen referencia a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la cual (a) la región constante, o una porción de la misma, es alterada, remplazada o intercambiada de manera que el sitio de unión al antígeno (región variable) está conectado a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, p. ej., una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, es alterada, remplazada o intercambiada por una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada.

Un "anticuerpo anti-T1R" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido codificado por un gen T1R, ADNc, o una subsecuencia del mismo.

El término "inmunoanálisis" es un análisis que utiliza un anticuerpo para unirse específicamente a un antígeno. El inmunoanálisis está caracterizado por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo concreto para aislar, dirigir, y/o cuantificar el antígeno.

La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo, o "específicamente (o selectivamente inmunorreactivo con", cuando hace referencia a una proteína o péptido, hace referencia a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas u otras moléculas biológicas. De este modo, en las condiciones de inmunoanálisis designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína concreta al menos a dos veces el fondo y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína concreta. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales originados para un miembro de la familia T1R de una especie específica tal como rata, ratón, o humano se pueden seleccionar para obtener solamente aquellos anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con el polipéptido T1R o una porción inmunogénica de los mismos y no con otras proteínas, excepto para las variantes ortólogas o polimórficas y alelos del polipéptido T1R. Esta selección se puede lograr restando los anticuerpos que presentan reacción cruzada con moléculas T1R de otras especies u otras moléculas T1R. También se pueden seleccionar anticuerpos que reconocen solamente los miembros de la familia de GPCR T1R pero no los GPCR de otras familias. Se pueden utilizar una variedad de formatos de inmunoanálisis para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína concreta. Por ejemplo, los imunoanálisis ELISA en fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos específicamente reactivos con una proteína (véase, p. ej., Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoanálisis que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad específica). Típicamente una reacción específica o selectiva tendrá al menos dos veces la señal de fondo o ruido y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo.

La frase "se asocia selectivamente con" hace referencia a la capacidad de un ácido nucleico para "hibridar selectivamente" con otro como se ha definido antes, o la capacidad de un anticuerpo para "unirse selectivamente" (o específicamente) a una proteína, como se ha definido antes.

El término "vector de expresión" hace referencia a cualquier sistema de expresión recombinante para expresar una secuencia de ácido nucleico de la invención in vitro o in vivo, constitutivamente o induciblemente, en cualquier célula, incluyendo células procarióticas, de levadura, fúngicas, vegetales, de insecto o de mamífero. El término incluye sistemas de expresión lineales o circulares. El término incluye sistemas de expresión que permanecen como episomas o se integran en el genoma de la célula anfitriona. Los sistemas de expresión pueden tener la capacidad de autorreplicar o no, esto es, conducir solamente la expresión transitoria en una célula. El término incluye "casetes" de expresión recombinante que contienen solamente los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante.

Por "célula anfitriona" se quiere significar una célula que contiene un vector de expresión y apoya la replicación o expresión del vector de expresión. Las células anfitrionas pueden ser células procarióticas tales como E. toll, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio, o mamífero tales como CHO, HeLa, HEK-293, y similares, p. ej., células cultivadas, explantes, y células in vivo.

C. Aislamiento y Expresión de Polipéptidos T1R

El aislamiento y la expresión de los T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, de la invención se pueden realizar como se describe más abajo. Los cebadores de PCR se pueden utilizar para la amplificación de ácidos nucleicos que codifican las regiones de unión a ligandos de los receptores gustativos, y se pueden generar opcionalmente las genotecas de estos ácidos nucleicos. Los vectores de expresión individuales o las genotecas de vectores de expresión se pueden utilizar después para infectar o transfectar células anfitrionas para la expresión funcional de estos ácidos nucleicos o genotecas. Estos genes y vectores se pueden elaborar y expresar in vitro o in vivo. Un experto en la técnica reconocerá que los fenotipos deseados para alterar y controlar la expresión de los ácidos nucleicos se pueden obtener modulando la expresión o actividad de los genes y ácidos nucleicos (p. ej., promotores, intensificadores y similares) en los vectores de la invención. Se puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos descritos para incrementar o disminuir la expresión o actividad. La invención se puede poner en práctica junto con cualquier método o protocolo conocido en la técnica, que están bien descritos en la literatura científica y de patentes.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención y otros ácidos nucleicos utilizados para poner en práctica esta invención, ARN, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, se pueden aislar de una variedad de fuentes, diseñar genéticamente, amplificar, y/o expresar recombinantemente. Se puede utilizar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo, además de células de mamífero, p. ej., sistemas bacterianos, de levaduras, de insectos, o vegetales.

Alternativamente, estos ácidos nucleicos pueden ser sintetizados in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como las descritas, p. ej., por Carruthers, en Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982); Adams, Am. Chem. Soc. 105:661 (1983); Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 (1995); Blommers, Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.458.066. Después se pueden obtener fragmentos de ADN de doble hebra sintetizando la hebra complementaria e hibridando las hebras entre sí en condiciones apropiadas, o añadiendo la hebra complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.

Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, para generar mutaciones en las secuencias, subclonar, marcar sondas, secuenciar, hibridar y similares están descritas en la literatura científica y de patentes. Véanse,p. ej., Sambrook, ed., Molecular Cloning: a Laboratory manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory y Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

Los ácidos nucleicos, vectores, cápsidas, polipéptidos, y similares se pueden analizar y cuantificar mediante cualquiera de los numerosos métodos generales bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, p. ej., métodos bioquímicos analíticos tales como RMN, espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), y cromatografía de hiperdifusión, diversos métodos inmunológicos, p. ej., reacciones con precipitina fluidas o en gel, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoanálisis (RIA), análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), análisis inmunofluorescentes, análisis Southern, análisis Northern, análisis de transferencia puntual, electroforesis en gel (p. ej., SDS-PAGE), RT-PCR, PCR cuantitativa, otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos o dianas o señales, radiomarcaje, recuento por centelleo, y cromatografía de afinidad.

Se pueden utilizar cebadores oligonucleotídicos para amplificar fragmentos de ácido nucleico que codifican regiones de unión a ligandos de los receptores gustativos. Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria también pueden ser clonados o medidos cuantitativamente utilizando técnicas de amplificación. Los métodos de amplificación también son bien conocidos en la técnica, e incluyen, p. ej., reacción en cadena de la polimerasa, PCR (PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, ed. Innis. Academic Press, N.Y. (1990) y PCR Strategies, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y. (1995), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, p. ej., Wu, Genomics 4:560 (1989); Landegren, Science 241:1077,(1988); Barringer, Gene 89:117 (1990)); amplificación de la transcripción (véase, p. ej., Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)); y, replicación de secuencias auto-sostenida (véase, p. ej., Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990)); Q amplificación mediante Beta replicasa (véase, p. ej., Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491 (1997)); análisis de amplificación mediante Q beta replicasa automatizado (véase, p. ej., Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271 (1996)) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (p. ej., NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger, Methods Enzymol. 152:307-316 (1987); Sambrook; Ausubel; Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan, Biotechnology 13:563-564 (1995). Se pueden diseñar cebadores para que conserven la secuencia original del receptor de membrana de membrana con 7 "donadores". Alternativamente, los cebadores pueden codificar restos aminoácido que son sustituciones conservativas (p. ej., resto hidrófobo por resto hidrófobo, véase el comentario anterior) o sustituciones funcionalmente beneficiosas (p. ej., no evitan la inserción en la membrana plasmática, ocasionan la escisión por peptidasas, ocasionan un plegamiento anómalo del receptor, y similares). Una vez amplificados, los ácidos nucleicos, ya sean individuales o en forma de genotecas, pueden ser clonados de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, si se desea, en cualquiera de los numerosos vectores utilizando los métodos biológicos moleculares rutinarios; los métodos para la clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados se describen, p. ej., en la Patente de los Estados Unidos 5.426.039.

Los pares de cebadores pueden ser diseñados para amplificar selectivamente regiones de unión a ligandos de los miembros de la familia T1R. Estas regiones pueden variar para los diferentes ligandos o sustancias que estimulan el sentido del gusto. De este modo, lo que puede ser una región de unión mínima para una sustancia que estimula el sentido del gusto, puede ser demasiado limitante para una segunda sustancia que estimula el sentido del gusto. Por consiguiente, se pueden amplificar regiones de unión a ligandos de diferentes tamaños que comprenden diferentes estructuras de dominios extracelulares.

Los paradigmas para diseñar pares de cebadores degenerados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se encuentra disponible un programa de ordenador con una estrategia COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP) como http://blocks.fhcrc.org/codehop.html, y está directamente conectado con el sitio de alineamiento de secuencias múltiple BlockMaker para la predicción de cebadores híbridos que comienzan con un grupo de secuencias de proteína relacionadas, como las regiones de unión a ligandos de los receptores gustativos (véase, p. ej., Rose, Nucleic Acids Res. 26:1628-1635 (1998); Singh, Biotechniques 24:318-319 (1998)).

Los medios para sintetizar pares de cebadores oligonucleotídicos son bien conocidos en la técnica. Se pueden utilizar pares de bases "naturales" o pares de bases sintéticos. Por ejemplo, el uso de nucleobases artificiales ofrece un enfoque versátil para manipular la secuencia de cebadores y generar una mezcla más compleja de productos de amplificación. Algunas familias de nucleobases artificiales son capaces de asumir múltiples orientaciones de los enlaces de hidrógeno por medio de rotaciones de los enlaces internos para proporcionar un medio de generación del reconocimiento molecular. La incorporación de estos análogos a una única posición de un cebador de PCR permite la generación de una genoteca compleja de productos de amplificación. Véase, p. ej., Hoops, Nucleic Acids Res. 25:4866-4871 (1997). Se pueden utilizar moléculas no polares para imitar la forma de las bases de ADN naturales. Una imitación de una forma de enlace distinta del de hidrógeno para la adenina puede replicar eficazmente y selectivamente frente a una imitación de una forma no polar para la timina (véase, p. ej., Morales, Nat. Struct. Biol. 5:950-954 (1998)). Por ejemplo, dos bases degeneradas pueden ser la base pirimidínica 6H,8H-3,4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona o la base púrica N6-metoxi-2,6-diaminopurina (véase, p. ej., Hill, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4258-4263 (1998)). Los cebadores degenerados ilustrativos de la invención incorporan el análogo de la nucleobase 5'-Dimetoxitritil-N-benzoil-2'-desoxi-Citidina, 3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita (el término "P" en las secuencias, véase más arriba). Este análogo de pirimidina se une por medio de enlaces hidrógeno con purinas, incluyendo los restos A y G.

Las variantes polimórficas, alelos, y homólogos interespecie que son sustancialmente idénticos a un receptor gustativo descrito en la presente memoria pueden ser aislados utilizando las sondas de ácido nucleico descritas antes. Alternativamente, se pueden utilizar genotecas de expresión para clonar polipéptidos T1R y variantes polimórficas, alelos, y homólogos interespecie de los mismos, detectando los homólogos expresados inmunológicamente con antisuero o anticuerpos purificados elaborados contra un polipéptido T1R, que también reconoce y se une selectivamente al homólogo de T1R.

Los ácidos nucleicos que codifican regiones de unión al ligando de los receptores gustativos pueden ser elaborados mediante amplificación (p. ej., PCR) de las secuencias de ácido nucleico apropiadas utilizando los pares de cebadores degenerados. El ácido nucleico amplificado puede ser ADN genómico de cualquier célula o tejido o ARNm o ADNc derivado de células que expresan los receptores gustativos.

En una realización, se pueden construir secuencias que codifican proteínas híbridas, que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican T1R fusionadas a secuencias de translocación. También se proporcionan T1R híbridos que comprenden los motivos de translocación y dominios de unión a sustancias que estimulan el sentido del gusto de otras familias de receptores quimiosensoriales, concretamente receptores gustativos. Estas secuencias de ácido nucleico pueden estar unidas operablemente a elementos de control de la transcripción o la traducción, p. ej., secuencias de inicio de la transcripción y la traducción, promotores e intensificadores, terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de poliadenilación, y otras secuencias útiles para transcribir ADN a ARN. En la construcción de casetes de expresión, vectores, y transgénicos recombinantes, se puede emplear un fragmento promotor para dirigir la expresión del ácido nucleico deseado en todas las células o tejidos deseados.

En otra realización, las proteínas de fusión pueden incluir secuencias de translocación C-terminales o N-terminales. Adicionalmente, las proteínas de fusión pueden comprender elementos adicionales, p. ej., para la deleción, purificación de proteínas, u otras aplicaciones. Los dominios que facilitan la detección y la purificación incluyen, p. ej., péptidos quelantes de metales tales como zonas de polihistidina, módulos de histidina-triptófano, u otros dominios que permiten la purificación sobre metales inmovilizados; proteína de unión a maltosa; dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada; o el dominio utilizado en el sistema de prolongación con FLAGS/purificación por afinidad (Immunex Corp, Seattle WA).

La inclusión de secuencias conectoras escindibles tales como el Factor Xa (véase, p. ej., Ottavi, Biochimie 80:289-293 (1998)), el motivo de reconocimiento de la proteasa de subtilisina (véase, p. ej., Polyak, Protein Eng. 10:615-619 (1997)); la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA), y similares, entre el dominio de translocación (para la expresión eficaz en la membrana plasmática) y el resto del polipéptido recién traducido puede ser útil para facilitar la purificación. Por ejemplo, un constructo puede incluir un polipéptido que codifica una secuencia de ácido nucleico unida a seis restos histidina seguido de una tiorredoxina, un sitio de escisión de enteroquinasa (véase, p. ej., Williams, Biochemistry 34:1787-1797 (1995)), y un dominio de translocación C-terminal. Los restos histidina facilitan la detección y purificación a la vez que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar la proteína o las proteínas deseadas del resto de la proteína de fusión. La tecnología relacionada con los vectores que codifican proteínas de fusión y la aplicación de proteínas de fusión están bien descritas en la literatura científica y de patentes, véase, p. ej., Kroll, DNA Cell. Biol. 12:441-53 (1993).

Se pueden introducir vectores de expresión, ya sean en forma de vectores de expresión individuales o en forma de genotecas de vectores de expresión, que comprenden secuencias que codifican el dominio de unión al ligando en un genoma o en el citoplasma o el núcleo de una célula y expresar por medio de una variedad de técnicas convencionales, bien descritas en la literatura científica y de patentes. Véanse, p. ej., Roberts, Nature 328:731 (1987); Berger supra; Schneider, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Sambrook; Tijssen; Ausubel. La información del producto de los fabricantes de reactivos biológicos y de equipos experimentales también proporciona información referente a métodos biológicos conocidos. Los vectores pueden ser aislados de fuentes naturales, obtenidos de fuentes tales como las genotecas ATCC o GenBank, o preparados mediante métodos sintéticos o recombinantes.

Los ácidos nucleicos se pueden expresar en casetes de expresión, vectores o virus que son expresados en las células establemente o transitoriamente (p. ej., sistemas de expresión episómicos). Los marcadores de selección pueden ser incorporados en casetes y vectores de expresión para conferir un fenotipo seleccionable a las células y secuencias transformadas. Por ejemplo, los marcadores de selección pueden codificar el mantenimiento y la replicación episómicos de manera que no se requiera la integración en el genoma del anfitrión. Por ejemplo, el marcador puede codificar la resistencia a antibióticos (p. ej., cloramfenicol, kanamicina, G418, bleomicina, higromicina) o la resistencia a herbicidas (p. ej., clorosulfuron o Basta) para permitir la selección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, p. ej., Blondelet-Rouault, Gene 190:315-317 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:992-997 (1997)). Debido a que los genes marcadores seleccionables que confieren resistencia a sustratos tales como neomicina o higromicina solamente pueden ser utilizados en el cultivo de tejidos, los genes de quimiorresistencia también son utilizados como marcadores seleccionables in vitro e in vivo.

Una secuencia de ácido nucleico quimérica puede codificar un dominio de unión al ligando T1R en cualquier polipéptido transmembrana 7. Debido a que los polipéptidos receptores transmembrana 7 tienen secuencias primarias y estructuras secundarias y terciarias similares, los dominios estructurales (p. ej., el dominio extracelular, los dominios TM, el dominio citoplásmico, etc.) pueden ser fácilmente identificados mediante análisis de la secuencia. Por ejemplo, el modelado por homología, el análisis de Fourier y la detección de la periodicidad helicoidal pueden identificar y caracterizar los siete dominios con una secuencia de receptor transmembrana 7. Se pueden utilizar los algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) para evaluar los períodos dominantes que caracterizan los perfiles de carácter hidrófobo y variabilidad de las secuencias analizadas. La intensificación de la detección de periodicidad y el índice de periodicidad helicoidal se pueden realizar, p. ej., como Donnelly, Protein Sci. 2:55-70 (1993). También se conocen en la técnica otros algoritmos de alineamiento y modelado, véase, p. ej., Peitsch, Receptors Channels 4:161-164 (1996); Kyte & Doolittle, J. Md. Bio., 157:105-132 (1982); Cronet, Protein Eng. 6:59-64 (1993) (homology and "discover modeling"); http://bioinfo.weizmann.ac.il/.

La presente descripción también incluye no solamente el ADN y las proteínas que tienen secuencias nucleicas y de aminoácidos especificadas, si no también fragmentos de ADN, concretamente fragmentos, p. ej., de 40, 60, 80, 100, 150, 200, o 250 nucleótidos, o más, así como fragmentos de proteínas, p. ej., de 10, 20, 30, 50, 70, 100, o 150 aminoácidos, o más. Opcionalmente, los fragmentos de ácido nucleico pueden codificar un polipéptido antigénico que es capaz de unirse a un anticuerpo originado contra un miembro de la familia T1R. Adicionalmente, un fragmento de proteína puede ser opcionalmente un fragmento antigénico que es capaz de unirse a un anticuerpo originado contra un miembro de la familia T1R.

También se contemplan las proteínas quiméricas, que comprenden al menos 10, 20, 30, 50, 70, 100, o 150 aminoácidos, o más, de al menos uno de los polipéptidos T1R descritos en la presente memoria, acoplado a aminoácidos adicionales que representan todo o parte de otro GPCR, preferiblemente un miembro de la superfamilia transmembrana 7. Estas quimeras se pueden elaborar a partir de los presentes receptores y otros GPCR, o se pueden elaborar combinando dos o más de los presentes receptores. En una realización, una porción de la quimera corresponde a o deriva del dominio extracelular de un polipéptido T1R de la invención. En otra realización, una porción de la quimera corresponde a, o deriva del dominio extracelular y uno o más de los dominios transmembrana de un polipéptido T1R descrito en la presente memoria, y la porción o porciones restantes pueden proceder de otro GPCR. Los receptores quiméricos son bien conocidos en la técnica, y también son conocidas las técnicas para crearlos y la selección y los límites de los dominios o fragmentos de los receptores acoplados a la proteína G para la incorporación a ellos. De este modo, este conocimiento de los expertos en la técnica puede ser utilizado fácilmente para crear tales receptores quiméricos. El uso de tales receptores quiméricos puede proporcionar, por ejemplo, un selectividad gustativa característica de uno de los receptores específicamente descritos en la presente memoria, acoplada con las características de la transducción de la señal de otro receptor, tal como un receptor bien conocido utilizado en los sistemas de análisis de la técnica anterior.

Por ejemplo, un dominio tal como un dominio de unión al ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio citoplásmico, un dominio N-terminal, un dominio C-terminal, o cualquier combinación de los mismos, puede ser conectado a una proteína heteróloga. Por ejemplo, un dominio extracelular T1R se puede conectar a un dominio transmembrana de GPCR heterólogo, o un dominio extracelular de GPCR heterólogo puede estar conectado a un dominio transmembrana T1R. Otras proteínas heterólogas de elección pueden incluir, p. ej., proteína fluorescente verde, \beta-gal, receptor de glutamato, y la presecuencia de rodopsina.

Asimismo dentro del alcance de la invención se encuentran células anfitrionas para la expresión de los T1R, o las variantes de la invención. Para obtener elevados niveles de expresión de un gen clonado o un ácido nucleico, tal como los ADNc que codifican los T1R, o las variantes de la invención, un experto subclona típicamente la secuencia de ácido nucleico de interés en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción, y si es para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica y se describe, p. ej., en Sambrook et al. Sin embargo, se pueden utilizar sistemas de expresión bacterianos o eucarióticos.

Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de nucleótidos foráneas en células anfitrionas. Estos incluyen el uso de la transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores de plasma, vectores virales y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético foráneo en una célula anfitriona (véase,p. ej., Sambrook et al.). Solamente es necesario que el procedimiento de ingeniería genética concreto utilizado sea capaz de introducir con éxito al menos una molécula de ácido nucleico en la célula anfitriona capaz de expresar el T1R, fragmento, o variante de interés.

Una vez que el vector de expresión es introducido en las células, las células transfectadas son cultivadas en condiciones que favorecen la expresión del receptor, fragmento, o variante de interés, que después es recuperado del cultivo utilizando mecanismos normalizados. Los ejemplos de tales mecanismos son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., WO 00/06593.

D. Detección de polipéptidos T1R

Además de la detección de genes T1R y de la expresión de genes utilizando la tecnología de hibridación de ácidos nucleicos, también se pueden utilizar inmunoanálisis para detectar T1R, p. ej., para identificar células receptoras gustativas, y variantes de miembros de la familia T1R. Se pueden utilizar inmunoanálisis para analizar cualitativamente o cuantitativamente los T1R. Una visión de conjunto general de la tecnología aplicable se puede encontrar en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988).

1. Anticuerpos para los miembros de la familia T1R

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con un miembro de la familia T1R son conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed. 1986); y Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)). Tales técnicas incluyen la preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos a partir de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales inmunizando conejos o ratones (véase,p. ej., Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)).

Se pueden utilizar numerosos inmunógenos que comprenden T1R para producir anticuerpos específicamente reactivos con un miembro de la familia T1R. Por ejemplo, se puede aislar un polipéptido T1R recombinante, o un fragmento antigénico del mismo, como se describe en la presente memoria. Las regiones antigénicas adecuadas incluyen, p. ej., las secuencias consenso que se utilizan para identificar los miembros de la familia T1R. Las proteínas recombinantes pueden ser expresadas en células eucarióticas o procarióticas como se ha descrito antes, y purificadas como se ha descrito generalmente antes. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Alternativamente, se puede utilizar un inmunógeno como péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente memoria y conjugado con una proteína portadora. La proteína natural también se puede utilizar en forma pura o impura. El producto es inyectado después en un animal capaz de producir anticuerpos. Se puede generar cualquiera de los anticuerpos monoclonales o policlonales, para su uso posterior en inmunoanálisis para medir la proteína.

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cepa endogámica de ratones (p. ej., ratones BALB/C) o conejos es inmunizada con la proteína utilizando un coadyuvante normalizado, tal como coadyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización normalizado. La respuesta inmunitaria del animal a la preparación de inmunógeno es controlada tomando muestras de sangre de ensayo y determinando el título de reactividad para T1R. Cuando se obtienen títulos apropiadamente elevados de anticuerpo para el inmunógeno, se recoge la sangre del animal y se prepara antisuero. Se puede realizar si se desea un fraccionamiento adicional del antisuero para enriquecerlo en anticuerpos reactivos para la proteína (véase Harlow & Lane,
supra).

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante diversos mecanismos familiares para los expertos en la técnica. En resumen, se pueden inmortalizar células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519 (1976)). Los métodos de inmortalización alternativos incluyen la transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Las colonias que se originan a partir de células inmortalizadas son escrutadas en cuanto a la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad por el antígeno deseadas, y el rendimiento de los anticuerpos producidos por tales células puede ser intensificado mediante diversos mecanismos, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un anfitrión vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo escrutando una genoteca de ADN a partir de células B humanas de acuerdo con el protocolo general esbozado por Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989).

Los anticuerpos monoclonales y los sueros policlonales se recogen y se titulan frente a la proteína inmunogénica en un inmunoanálisis, por ejemplo, un inmunoanálisis en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Típicamente, los antisueros policlonales con un título de 104 o mayor se seleccionan y se someten a ensayo en cuanto a su reactividad cruzada frente a polipéptidos no T1R, o incluso otros miembros de la familia T1R u otras proteínas relacionadas de otros organismos, utilizando un inmunoanálisis de unión competitivo. Los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales específicos se unirán normalmente con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, más normalmente al menos aproximadamente 1 pM, opcionalmente al menos aproximadamente 0,1 pM o mejor, y opcionalmente 0,01 pM o mejor.

Una vez que los anticuerpos específicos para el miembro de la familia T1R se encuentran disponibles, se pueden detectar las proteínas T1R individuales o los fragmentos de proteína por medio de una variedad de métodos de inmunoanálisis. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoanálisis, véase Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7ª ed. 1991). Por otra parte, los inmunoanálisis de la presente invención se pueden realizar en cualquiera de numerosas configuraciones, que se revisan extensamente en Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); y Harlow & Lane, supra.

2. Análisis de unión inmunológica

Se pueden detectar y/o cuantificar las proteínas T1R, los fragmentos, y las variantes utilizando cualquiera de los numerosos análisis de unión inmunológica bien reconocidos (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoanálisis generales, véanse también Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7ª ed. 1991). Los análisis de unión inmunológica (o inmunoanálisis) utilizan típicamente un anticuerpo que se une específicamente a una proteína o antígeno de elección (en este caso un miembro de la familia T1R o una subsecuencia antigénica del mismo). El anticuerpo (p. ej., anti-TIR) puede ser producido por medio de cualquiera de los numerosos métodos bien conocidos por los expertos en la técnica y descritos antes.

Los inmunoanálisis también utilizan a menudo un agente de marcaje para que se una específicamente y marque el complejo formado por el anticuerpo y el antígeno. El propio agente de marcaje puede ser uno de los radicales de los que consta el complejo anticuerpo/antígeno. De este modo, el agente de marcaje puede ser un polipéptido T1R marcado o un anticuerpo anti-T1R marcado. Alternativamente, el agente de marcaje puede ser un tercer radical, tal como un anticuerpo secundario, que se une específicamente al complejo anticuerpo/T1R (un anticuerpo secundario es típicamente específico para los anticuerpos de la especie de la cual deriva el primer anticuerpo). También se pueden utilizar otras proteínas capaces de unirse específicamente a las regiones constantes de la inmunoglobulina, tales como la proteína A o la proteína G como agente de marcaje. Estas proteínas muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de las inmunoglobulinas de una variedad de especies (véase, p. ej., Kronval et al., J. Immunol., 111:1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol., 135:2589-2542 (1985)). El agente de marcaje puede ser modificado con un radical detectable, tal como biotina, a la cual se puede unir específicamente otra molécula, tal como estreptavidina. Una variedad de radicales detectables son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En todos los análisis, se pueden requerir etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, opcionalmente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. No obstante, el tiempo de incubación dependerá del formato del análisis, del antígeno, del volumen de la solución, de las concentraciones, y similares. Normalmente, los análisis se llevarán a cabo a la temperatura ambiente, aunque se pueden llevar a cabo a lo largo de un intervalo de temperaturas, por ejemplo de 10ºC a 40ºC.

a. Formatos de análisis no competitivos

Los imunoanálisis para detectar un polipéptido T1R en una muestra pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoanálisis no competitivos son análisis en los cuales se mide directamente la cantidad de antígeno. En un análisis "sándwich" preferido, por ejemplo, se pueden unir los anticuerpos anti-T1R directamente a un sustrato sólido sobre el cual son inmovilizados. Estos anticuerpos inmovilizados capturan después el polipéptido T1R presente en la muestra de ensayo. El polipéptido T1R inmovilizado de este modo es unido después por un agente de marcaje, tal como un segundo anticuerpo para T1R que porta una marca. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede carecer de marca, pero puede, a su vez, ser unido por un tercer anticuerpo marcado específico para los anticuerpos de las especies de las cuales deriva el segundo anticuerpo. El segundo o tercer anticuerpo es modificado típicamente con un radical detectable, tal como biotina, a la cual se une específicamente otra molécula, p. ej., estreptavidina, para proporcionar un radical detectable.

b. Formatos de análisis competitivos

En los análisis competitivos, la cantidad de polipéptido T1R presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un polipéptido T1R conocido, añadido (exógeno) desplazado (por competencia) de un anticuerpos anti-T1R por el polipéptido T1R desconocido presente en la muestra. En un análisis competitivo, se añade una cantidad conocida de polipéptido T1R a una muestra y la muestra se pone en contacto después con un anticuerpo que se une específicamente al T1R. La cantidad de polipéptido T1R exógeno unido al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de polipéptido T1R presente en la muestra. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo es inmovilizado sobre un sustrato sólido. La cantidad de polipéptido T1R unido al anticuerpo se puede determinar midiendo la cantidad de polipéptido T1R presente en un complejo T1R/anticuerpo, o alternativamente midiendo la cantidad de proteína que no forma complejo restante. La cantidad de polipéptido T1R se puede detectar proporcionando una molécula T1R marcada.

Un análisis de inhibición de haptenos es otro análisis competitivo preferido. En este análisis el polipéptido T1R conocido es inmovilizado sobre un sustrato sólido. Se añade una cantidad conocida de anticuerpo anti-T1R a la muestra, y la muestra se pone en contacto después con el T1R inmovilizado. La cantidad de anticuerpo anti-T1R unido al polipéptido T1R inmovilizado es inversamente proporcional a la cantidad de polipéptido T1R presente en la muestra. De nuevo, la cantidad de anticuerpo inmovilizado puede ser detectada percibiendo la fracción inmovilizada de anticuerpo o la fracción del anticuerpo que permanece en solución. La detección puede ser directa cuando el anticuerpo está marcado o indirecta por medio de la posterior adición de un radical marcado que se une específicamente al anticuerpo como se ha descrito antes.

c. Determinaciones de la reactividad cruzada

También se pueden utilizar inmunoanálisis en el formato de unión competitiva para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, se puede inmovilizar una proteína codificada al menos parcialmente por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria a un soporte sólido. Se añaden proteínas (p. ej., polipéptidos T1R y homólogos) al análisis que compite por la unión del antisuero al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas añadidas para competir por la unión del antisuero a la proteína inmovilizada se compara con la capacidad del polipéptido T1R codificado por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria para competir consigo mismo. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calcula utilizando cálculos normalizados. Aquellos antisueros con una reactividad cruzada de menos del 10% con cada una de las proteínas añadidas enumeradas antes se seleccionan y se reúnen. Los anticuerpos que presentan reacción cruzada se separan opcionalmente de los antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con las proteínas añadidas consideradas, p. ej., homólogos ligeramente semejantes. Además, los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos que representan motivos conservados que se utilizan para identificar los miembros de la familia T1R se pueden utilizar las determinaciones de la reactividad cruzada.

Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se utilizan después en un inmunoanálisis de unión competitiva como se ha descrito antes para comparar una segunda proteína, que se piensa que es quizás un alelo o una variante polimórfica de un miembro de la familia T1R, con la proteína inmunógena (esto es, el polipéptido T1R codificado por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria). Con el fin de realizar esta comparación, se analizan cada una de las dos proteínas a una amplia gama de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida para inhibir el 50% de la unión es menor de 10 veces la cantidad de la proteína codificada por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria requerida para inhibir el 50% de la unión, se dice que la segunda proteína se une específicamente a los anticuerpos policlonales generados para un inmunógeno T1R.

También se pueden utilizar anticuerpos originados contra los motivos conservados de T1R para preparar anticuerpos que se unen específicamente sólo a los GPCR de la familia T1R, pero no a los GPCR de otras familias.

Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un miembro concreto de la familia T1R se pueden elaborar sustrayendo los anticuerpos que presentan reacción cruzada utilizando otros miembros de la familia T1R. Se pueden elaborar anticuerpos policlonales específicos de la especie de una manera similar. Por ejemplo, se pueden elaborar anticuerpos específicos para T1R1 humano, sustrayendo los anticuerpos que presentan reacción cruzada con secuencias ortólogas, p. ej., T1R1 de rata o T1R1 de ratón.

d. Otros formatos de análisis

Se utiliza el análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de polipéptido T1R en la muestra. La técnica comprende generalmente separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado, (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon, o un filtro de nailon transformado), e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido T1R. Los anticuerpos anti-polipéptido T1R se unen específicamente al polipéptido T1R sobre el soporte sólido. Estos anticuerpos se pueden marcar directamente o alternativamente se pueden detectar con posterioridad utilizando anticuerpos marcados (p. ej., anticuerpos anti-ratón de oveja marcados) que se unen específicamente a los anticuerpos anti-T1R.

Otros formatos de análisis incluyen inmunoanálisis con liposomas (LIA), que utilizan liposomas diseñados para unirse a moléculas específicas (p. ej., anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. Los productos químicos liberados se detectan después de acuerdo con mecanismos normalizados (véase Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev., 5:34-41 (1986)).

e. Reducción de la unión no específica

Un experto en la técnica apreciará que a menudo es deseable minimizar la unión no específica en los inmunoanálisis. Concretamente, cuando el análisis implica un antígeno o anticuerpo inmovilizado sobre un sustrato sólido es deseable minimizar la cantidad de unión no específica al sustrato. Los medios para reducir semejante unión no específica son bien conocidos en la técnica. Típicamente, esta técnica implica recubrir el sustrato con una composición proteinácea. En particular, se utilizan ampliamente composiciones de proteína tales como seralbúmina bovina (BSA), leche en polvo desnatada, y gelatina, siendo muy preferida la leche en polvo.

f. Marcas

La marca o grupo detectable concreto utilizado en el análisis no es un aspecto crítico de la invención, con tal que no interfiera significativamente en la unión específica del anticuerpo utilizado en el análisis. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Tales marcas detectables han sido desarrolladas en el campo de los inmunoanálisis y, en general, la mayoría de las marcas útiles en tales métodos se puede aplicar a la presente invención. De este modo, una marca es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen cuentas magnéticas (p. ej., DYNABEADSTM), colorantes fluorescentes (p. ej., isotiocianato de fluoresceina, rojo Texas, rodamina, y similares), radiomarcas (p. ej., H^{3}, I^{125}, S^{35}, C^{14}, o P^{32}), enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras utilizadas comúnmente en ELISA), y marcas colorimétricas tales como oro coloidal o cuentas de vidrio o plástico coloreadas (p. ej., poliestireno, polipropileno, látex,
etc.).

La marca puede ser acoplada directamente o indirectamente al componente deseado del análisis de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Como se ha indicado antes, se puede utilizar una amplia variedad de marcas, dependiendo la elección de la marca de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requerimientos de estabilidad, el instrumental disponible, y las estipulaciones sobre los residuos.

Las marcas no radiactivas a menudo son ancladas mediante medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (p. ej., biotina) es unida covalentemente a la molécula. Después se une el ligando a otras moléculas (p. ej., estreptavidina), que son inherentemente detectables o covalentemente unidas a un sistema señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Los ligandos y sus dianas se pueden utilizar en cualquier combinación adecuada con anticuerpos que reconocen un polipéptido T1R, o anticuerpos secundarios que reconocen anti-T1R.

Las moléculas también se pueden conjugar directamente con compuestos generadores de señales, p. ej., mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como marcas serán principalmente hidrolasas, concretamente fosfatasas, esterasas y glicosidadas, u oxidasas, concretamente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalazinodionas, p. ej., luminol. Para una revisión de los diversos sistemas de marcaje o producción de señales que se pueden utilizar, véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.391.904.

Los medios de detección de marcas son bien conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, cuando la marca es una marca radiactiva, los medios para la detección incluyen un contador de centelleo o una película fotográfica como en la autorradiografía. Cuando la marca es una marca fluorescente, ésta puede ser detectada excitando el fluorocromo con la longitud de onda luminosa apropiada y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, por medio de una película fotográfica, mediante el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados por carga (CCD) o fotomultiplicadores y similares. De un modo similar, las marcas enzimáticas se pueden detectar proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente se pueden detectar marcas colorimétricas simples observando simplemente el color asociado con la marca. De este modo, en diversos análisis de tira reactiva, el oro conjugado aparece a menudo de color rosa, mientras las diversas cuentas conjugadas aparecen del color de la cuenta.

Algunos formatos de análisis no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, se pueden utilizar análisis de aglutinación para detectar la presencia de los anticuerpos diana. En este caso, se aglutinan las partículas recubiertas con antígeno por medio de muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, ninguno de los componentes necesita estar marcado y la presencia del anticuerpo diana es detectada por medio de una simple inspección visual.

E. Detección de Moduladores

Las composiciones y métodos para determinar si un compuesto de ensayo se une específicamente a un receptor quimiosensorial de la invención, tanto in vitro como in vivo, se describen más abajo. Muchos aspectos de la fisiología celular se pueden controlar para evaluar el efecto de la unión del ligando a un polipéptido T1R de la invención. Estos análisis se pueden realizar sobre células intactas que expresan un receptor quimiosensorial, sobre células permeabilizadas, o sobre fracciones de membrana producidas mediante métodos normalizados.

Los receptores gustativos se unen a las sustancias que estimulan el sentido del gusto e inician la transducción de estímulos químicos a señales eléctricas. Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de las enzimas diana, canales, y otras proteínas efectoras. Algunos ejemplos son la activación de la GMPc fosfodiesterasa mediante transducción en el sistema visual, la adenilato ciclasa por la proteína G estimuladora, la fosfolipasa C por Gq y otras proteínas G cognadas, y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. Las consecuencias aguas abajo también pueden ser examinadas por ejemplo mediante generación de diacilglicerol e IP3 por fosfolipasa C, y a su vez, para la movilización de calcio por IP3.

Las proteínas o polipéptidos T1R del análisis se seleccionarán típicamente a partir de un polipéptido que tiene una secuencia de los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, 17, o fragmentos o variantes modificadas conservativamente de la misma. Opcionalmente, los fragmentos y variantes pueden ser fragmentos antigénicos y variantes que se unen a un anticuerpo anti-T1R.

Alternativamente, las proteínas o polipéptidos T1R del análisis pueden derivar de una célula anfitriona eucariota y pueden incluir una subsecuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con los SEQ ID NOS: 4, 10, 12, 14, 17, o fragmentos o variantes modificadas conservativamente de la misma. Generalmente, la identidad de la secuencia de aminoácidos será de al menos 35 a 50%, u opcionalmente de 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. Opcionalmente, las proteínas o polipéptidos T1R de los análisis pueden comprender un dominio de una proteína T1R, tal como un dominio extracelular, una región transmembrana, un dominio transmembrana, un dominio citoplásmico, un dominio de unión al ligando, y similares. Adicionalmente, como se ha descrito antes, la proteína T1R o el dominio de la misma se puede unir covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica utilizada en los análisis descritos en la presente memoria.

Los moduladores de la actividad del receptor T1R se someten a ensayo utilizando proteínas o polipéptidos T1R como se ha descrito antes, ya sean recombinantes o de origen natural. Las proteínas o polipéptidos T1R pueden ser aislados, expresados en una célula, expresados en una membrana derivada de una célula, expresados en un tejido o en un animal, ya sea recombinante o de origen natural. Por ejemplo, se pueden utilizar secciones de lengua, células disociadas de lengua, células transformadas, o membranas. La modulación se puede someter a ensayo utilizando uno de los análisis in vitro o in vivo descritos en la presente memoria.

1. Análisis de unión in vitro

La transducción gustativa también se puede examinar in vitro con reacciones gustativas solubles o en estado sólido, utilizando un polipéptido T1R de la invención. En una realización concreta, se puede utilizar un dominio de unión al ligando T1R in vitro en reacciones solubles o en estado sólido para analizar la unión al ligando.

Por ejemplo, se pronostica que el dominio N-terminal de T1R está implicado en la unión al ligando. Más concretamente, los T1R pertenecen a una subfamilia de GPCR que se caracteriza por segmentos N-terminales extracelulares, grandes, de aproximadamente 600 aminoácidos. Se piensa que estos segmentos N-terminales forman, al menos en parte, los dominios de unión al ligando, y por lo tanto son útiles en análisis bioquímicos para identificar los agonistas y antagonistas de T1R. El dominio de unión al ligando también puede contener porciones adicionales del dominio extracelular, tales como los bucles extracelulares del dominio transmembrana. Se han utilizado análisis similares con otros GPCR que están relacionadas con los T1R, tales como los receptores de glutamato metabotrópicos (véase, p. ej., Han y Hampson, J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999)). Estos análisis podrían implicar el desplazamiento de un ligando marcado radiactivamente o fluorescentemente, midiendo los cambios en la fluorescencia intrínseca o los cambios en la susceptibilidad proteolítica, etc.

La unión del ligando a un polipéptido T1R de la invención puede ser sometida a ensayo en solución, en una membrana bicapa, opcionalmente anclada a una fase sólida, en una monocapa lipídica, o en vesículas. La unión de un modulador puede ser sometida a ensayo utilizando, p. ej., cambios en las propiedades espectroscópicas (p. ej., fluorescencia, absorbancia, índice de refracción) hidrodinámicas (p. ej., la forma), cromatográficas, o de solubilidad características. Los análisis de unión preferidos de la invención son los análisis de unión bioquímicos que utilizan dominios T1R N-terminales solubles recombinantes.

También se pueden examinar las interacciones receptor-proteína G. Por ejemplo, se puede examinar la unión de la proteína G al receptor, o su liberación desde el receptor. Más concretamente, en ausencia de GTP, un activador conducirá a la formación de un complejo ajustado de una proteína G (las tres subunidades) con el receptor. Este complejo puede ser detectado de varias maneras, como se ha observado antes. Semejante análisis puede ser modificado para buscar inhibidores, p. ej., añadiendo un activador al receptor y proteína G en ausencia de GTP, que forma un complejo ajustado, y después escrutar inhibidores observando la disociación del complejo receptor-proteína G. En presencia de GTP, la liberación de la subunidad alfa de la proteína G de las otras dos subunidades de la proteína G sirve como criterio de activación. Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de las enzimas diana, de los canales, y de otras proteínas efectoras.

En otra realización de la invención se puede utilizar un análisis GTP\gammaS. Como se ha descrito antes, tras la activación de un GPCR, la subunidad G\alpha del complejo de la proteína G es estimulada a cambiar el GDP unido a GTP. La estimulación mediada por ligando de la actividad de intercambio de la proteína G puede ser medida en un análisis bioquímico que mide la unión de los GTP\gammaS^{35} marcados radiactivamente a la proteína G en presencia de un supuesto ligando. Típicamente, las membranas que contienen el receptor quimiosensorial de interés se mezclan con un complejo de proteínas G. Los potenciales inhibidores y/o activadores y los GTP\gammaS se añaden al análisis, y se mide la unión de los GTP\gammaS a la proteína G. La unión se puede medir mediante recuento de centelleo en líquido o cualquier otro medio conocido en la técnica, incluyendo los análisis de centelleo por proximidad (SPA). En otros formatos de análisis, se pueden utilizar GTP\gammaS marcados fluorescentemente.

2. Análisis de Polarización de la Fluorescencia

En otra realización, se pueden utilizar análisis basados en la Polarización de la Fluorescencia ("FP") para detectar y controlar la unión al ligando. La polarización de la fluorescencia es una técnica de laboratorio versátil para medir la unión en equilibrio, la hibridación de ácidos nucleicos, y la actividad enzimática. Los análisis de polarización de la fluorescencia son homogéneos ya que no requieren una etapa de separación tal como centrifugación, filtración, cromatografía, precipitación, o electroforesis. Estos análisis se realizan en tiempo real, directamente en solución y no requieren una fase inmovilizada. Los valores de polarización se pueden medir repetidamente y después de la adición de los reactivos puesto que la medida de la polarización es rápida y no destruye la muestra. Generalmente, esta técnica se puede utilizar para medir los valores de polarización de fluoróforos de niveles picomolares a micromolares bajos. Esta sección describe cómo se puede utilizar la polarización de la fluorescencia de una manera simple y cuantitativa para medir la unión de ligandos a los polipéptidos T1R de la invención.

Cuando una molécula marcada fluorescentemente es excitada con luz polarizada plana, emite una luz que tiene un grado de polarización que es inversamente proporcional a su rotación molecular. Las moléculas grandes marcadas fluorescentemente permanecen relativamente estacionarias durante el estado excitado (4 nanosegundos en el caso de la fluoresceína) y la polarización de la luz permanece relativamente constante entre la excitación y la emisión. Las moléculas pequeñas marcadas fluorescentemente rotan rápidamente durante el estado excitado y la polarización cambia significativamente entre la excitación y la emisión. Por lo tanto, las moléculas pequeñas tienen valores de polarización bajos y las moléculas grandes tienen valores de polarización elevados. Por ejemplo, un oligonucleótido marcado con fluoresceína en una sola hebra tiene un valor de polarización relativamente bajo pero cuando es hibridado con una hebra complementaria, tiene un valor de polarización más alto. Cuando se utiliza la FP para detectar y controlar la unión a una sustancia que estimula el sentido del gusto que puede activar o inhibir los receptores quimiosensoriales de la invención, se pueden utilizar sustancias que estimulan el sentido del gusto marcadas con fluorescencia o sustancias que estimulan el sentido del gusto auto-fluorescentes.

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La polarización de la fluorescencia (P) se define como:

1

Donde \Pi es la intensidad de la emisión de luz paralela al plano de excitación de la luz e Int \bot es la intensidad de la emisión de luz perpendicular al plano de excitación de la luz. P, que es una proporción de intensidades de luz, es un número adimensional. Por ejemplo, se pueden utilizar Beacon® y Beacon 2000® System con relación a estos análisis. Tales sistemas expresan típicamente la polarización en unidades de milipolarización (1 Unidad de Polarización = 1000 Unidades mP).

La relación entre la rotación molecular y el tamaño es descrita por la ecuación de Perrin y se remite al lector a Jolley, M. E. (1991) en Journal of Analytical Toxicology, págs. 236-240, que proporciona una explicación completa de esta ecuación. Resumidamente, la ecuación de Perrin establece que la polarización es directamente proporcional al tiempo de relajación rotacional, el tiempo que lleva que una molécula rote por medio de un ángulo de aproximadamente 68,5º. El tiempo de relajación rotacional está relacionado con la viscosidad (\eta), la temperatura absoluta (T), el volumen molecular (V), y la constante de los gases (R) por medio de la siguiente ecuación:

2

El tiempo de relajación rotacional es pequeño (\approx 1 nanosegundo) para las moléculas pequeñas (p. ej. la fluoresceína) y grande (\approx 100 nanosegundos) para las moléculas grandes (p. ej. las inmunoglobulinas). Si la viscosidad y la temperatura se mantienen constantes, el tiempo de relajación rotacional, y por lo tanto la polarización, están directamente relacionados con el volumen molecular. Los cambios en el volumen molecular pueden estar debidos a interacciones con otras moléculas, a disociación, a polimerización, a degradación, a hibridación, o a cambios conformacionales de la molécula marcada fluorescentemente. Por ejemplo, se ha utilizado la polarización de la fluorescencia para medir la escisión enzimática de polímeros grandes marcados con fluoresceína por las proteasas, las ADNasas, y las ARNasas. También se ha utilizado para medir la unión en equilibrio de interacciones proteína/proteína, de la unión anticuerpo/antígeno, y de la unión proteína/ADN.

3. Análisis en estado sólido y soluble de alto rendimiento

En otra realización, la invención proporciona análisis solubles utilizando un polipéptido T1R; o una célula o tejido que expresa un polipéptido T1R. En otra realización, la invención proporciona análisis in vitro basados en fases sólida en un formato de alto rendimiento, donde el polipéptido T1R, o la célula o tejido que expresa el polipéptido T1R está anclado a un sustrato en fase sólida.

En los análisis de alto rendimiento de la invención, es posible escrutar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo día. En particular, cada pocillo de una placa de microtitulación puede ser utilizado para realizar un análisis separado frente a un modulador potencial seleccionado, o, si se van a observar los efectos de la concentración o el tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos pueden someter a ensayo un único modulador. De este modo, una única placa de microtitulación normalizada puede analizar aproximadamente 100 (p. ej., 96) moduladores. Si se utilizan placas de 1536 pocillos, una única placa puede analizar fácilmente de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 1.500 compuestos diferentes. También es posible analizar múltiples compuestos en cada pocillo de la placa. Es posible analizar varias placas diferentes por día; es posible analizar escrutinios para aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes utilizando los sistemas integrados de la invención. Más recientemente, se han desarrollado enfoques microfluidificados para la manipulación de reactivos.

La molécula de interés se puede unir al componente en estado sólido, directamente o indirectamente, por medio de enlaces covalentes o no covalentes, p. ej., por medio de una etiqueta. La etiqueta puede ser cualquiera de una variedad de componentes. En general, una molécula que se une a la etiqueta (un agente de unión de la etiqueta) se fija a un soporte sólido, y la molécula etiquetada de interés (p. ej., la molécula de transducción gustativa de interés) se ancla al soporte sólido mediante interacción de la etiqueta y el agente de uniónde la etiqueta.

Se pueden utilizar numerosas etiquetas y agentes de unión de etiquetas, basándose en interacciones moleculares conocidas bien descritas en la literatura. Por ejemplo, cuando una etiqueta tiene un agente de unión natural, por ejemplo, biotina, proteína A, o proteína G, ésta se puede utilizar junto con los agentes de unión de a la etiqueta apropiados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos para las moléculas con agentes de unión naturales tales como la biotina también son agentes de unión de etiquetas ampliamente asequibles y apropiados (véase, SIGMA Immunochemicals 1998 catálogo SIGMA, St. Louis MO).

De un modo similar, se puede utilizar cualquier compuesto hapténico o antigénico combinado con un anticuerpo apropiado para formar un par etiqueta/agente de unión de etiqueta. Se encuentran disponibles en el mercado miles de anticuerpos específicos y muchos anticuerpos adicionales se describen en la literatura. Por ejemplo, en una configuración común, la etiqueta es un primer anticuerpo y el agente de unión de la etiqueta es un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, las interacciones receptor-ligando también son apropiadas como pares de etiqueta y agente de unión de la etiqueta. Por ejemplo, los agonistas y antagonistas de los receptores de la membrana celular (p. ej., las interacciones receptor celular-ligando tales como transferrina, c-kit, ligandos de receptores virales, receptores de citoquinas, receptores de quimioquinas, receptores de interleuquina, receptores de inmunoglobulina y anticuerpos, la familia de la cadherina, la familia de la integrina, la familia de la selectina, y similares; véase, p. ej., Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)). De un modo similar, las toxinas y venenos, los epítopos virales, las hormonas (p. ej., opiáceos, esteroides, etc.), los receptores intracelulares (p. ej., que median los efectos de diversos ligandos pequeños, incluyendo esteroides, hormona tiroidea, retinoides, y vitamina D; péptidos), fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (configuraciones poliméricas tanto lineales como cíclicas), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interaccionar todos con diversos receptores celulares.

Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, poliarilensulfuros, polisiloxanos, poliimidas, y poliacetatos también pueden formar una etiqueta o agente de unión de la etiqueta apropiado. Muchos otros pares de etiqueta/agente de unión de la etiqueta también son útiles en los sistemas de análisis descritos en la presente memoria, como resultará evidente para un experto tras la revisión de esta descripción.

Los conectores comunes tales como péptidos, poliéteres, y similares también pueden servir como etiquetas, e incluyen secuencias polipeptídicas, tales como secuencias poli-gly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Tales conectores flexibles son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los conectores de poli(etilenglicol) son asequibles de Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos conectores tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfhidrilo, o enlaces heterofuncionales.

Los agentes de unión de etiquetas se fijan a sustratos sólidos utilizando cualquiera de una variedad de métodos asequibles actualmente. Los sustratos sólidos son transformados o funcionalizados comúnmente exponiendo todo o una porción del sustrato a un reactivo químico que une un grupo químico a la superficie que es reactiva con una porción del agente de unión de la etiqueta. Por ejemplo, los grupos que son adecuados para el anclaje a una porción de la cadena más larga incluirían grupos amina, hidroxilo, tiol, y carboxilo. Se pueden utilizar aminoalquilsilanos e hidroxialquilsilanos para funcionalizar una variedad de superficies, tales como superficies de vidrio. La construcción de tales matrices biopoliméricas en fase sólida está bien descrita en la literatura. Véanse, p. ej., Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) (que describe la síntesis en fase sólida, p. ej., de péptidos); Geysen et al., J. Immun. Meth., 102:259-274 (1987) (que describe la síntesis de componentes en fase sólida sobre alfileres); Frank & Doring, Tetrahedron, 44:60316040 (1988) (que describe la síntesis de diversas secuencias peptídicas sobre discos de celulosa); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry, 39(4):718-719 (1993); y Kozal et al., Nature Medicine, 2(7):753759 (1996) (que describen todos matrices de biopolímeros fijados en sustratos sólidos). Los enfoques no químicos para unir agentes de unión de etiquetas a sustratos incluyen otros métodos comunes, tales como calor, entrecruzamiento mediante radiación UV, y similares.

4. Análisis por ordenador

Otro análisis más para los compuestos que modulan la actividad del polipéptido T1R implica el diseño de compuestos asistido por ordenador, en el que se utiliza un sistema computarizado para generar una estructura tridimensional de un polipéptido T1R basándose en la información estructural codificada por su secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos introducida interacciona directamente y activamente con un algoritmo preestablecido en un programa de ordenador para producir modelos estructurales secundarios, terciarios, y cuaternarios de la proteína. Los modelos de la estructura de la proteína se examinan después para identificar las regiones de la estructura que tienen capacidad de unión, p. ej., ligandos. Estas regiones se utilizan después para identificar los ligandos que se unen a la proteína.

El modelo estructural tri-dimensional de la proteína es generado introduciendo las secuencias de aminoácidos de la proteína de al menos 10 restos aminoácido o las correspondientes secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido T1R en el sistema computarizado. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido T1R, o la secuencia de aminoácidos de la misma, puede ser cualquier secuencia descrita en la presente memoria, y las versiones modificadas conservativamente de la misma.

La secuencia de aminoácidos representa la secuencia o subsecuencia primaria de la proteína, que codifica la información estructural de la proteína. Al menos 10 restos de la secuencia de aminoácidos (o la secuencia de nucleótidos que codifica los 10 aminoácidos) son introducidos en el sistema computarizado desde los teclados del ordenador, sustratos legibles por el ordenador que incluyen, pero no están limitados a, medios de almacenamiento electrónico (p. ej., disquetes magnéticos, cintas, cartuchos, y chips), medios ópticos (p. ej., CD ROM), información distribuida por sitios de internet, y mediante RAM. El modelo estructural tri-dimensional de la proteína es generado después por la interacción de la secuencia de aminoácidos y el sistema computarizado, utilizando el soporte lógico conocido por los expertos en la técnica.

La secuencia de aminoácidos representa una estructura primaria que codifica la información necesaria para formar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína de interés. El soporte lógico contempla ciertos parámetros codificados por la secuencia primaria para generar el modelo estructural. Estos parámetros son referidos como "términos de energía", e incluyen principalmente potenciales electrostáticos, potenciales hidrófobos, superficies accesibles al disolvente, y enlaces de hidrógeno. Los términos de energía secundarios incluyen los potenciales de van der Waals. Las moléculas biológicas forman las estructuras que minimizan los términos de energía de una manera cumulativa. El programa de ordenador está utilizando por lo tanto estos términos codificados por la estructura primaria o la secuencia de aminoácidos para crear el modelo estructural secundario.

Después se forma la estructura terciaria de la proteína codificada por la estructura secundaria basándose en los términos de energía de la estructura secundaria. En este punto el usuario puede introducir variables adicionales tales como si la proteína está unida a la membrana o es soluble, su localización en el organismo, y su localización celular, p. ej., citoplásmica, de superficie, o nuclear. Estas variables junto con los términos de energía de la estructura secundaria se utilizan para formar el modelo de la estructura terciaria. En el modelado de la estructura terciaria, el programa de ordenador empareja las caras hidrofóbicas de la estructura secundaria con las similares, y las caras hidrofílicas de la estructura secundaria con las similares.

Una vez que se ha generado la estructura, se identifican las regiones de unión al ligando potenciales por medio del sistema computarizado. Las estructuras tridimensionales para los ligandos potenciales se generan introduciendo secuencias de aminoácidos o nucleótidos o fórmulas químicas de los compuestos, como se ha descrito antes. La estructura tridimensional del ligando potencial se compara después con la del polipéptido T1R para identificar los ligandos que se unen a la proteína. La afinidad de unión entre la proteína y los ligandos se determina utilizando términos de energía para determinar qué ligandos tienen una mayor probabilidad de unirse a la proteína.

Los sistemas computarizados también se utilizan para escrutar mutaciones, variantes polimórficas, alelos, y homólogos interespecie de los genes T1R. Tales mutaciones pueden estar asociadas con estados de enfermedad o rasgos genéticos. Como se ha descrito antes, también se puede utilizar GeneChip® y la tecnología relacionada para escrutar mutaciones, variantes polimórficas, alelos, y homólogos interespecie. Una vez que se han identificado las variantes, se pueden utilizar análisis de diagnóstico para identificar a los pacientes que tienen tales genes mutados. La identificación de los genes T1R mutados implica recibir la entrada de una primera secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de un gen T1R, o de versiones modificadas conservativamente de la misma. La secuencia se introduce en el sistema computarizado como se ha descrito antes. La primera secuencia de ácido nucleico o aminoácidos se compara después con una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácidos que tiene una identidad sustancial con la primera secuencia. La segunda secuencia se introduce en el sistema computarizado de la manera descrita antes. Una vez que se comparan la primera y la segunda secuencias, se identifican las diferencias de nucleótidos o aminoácidos entre las secuencias. Tales secuencias pueden representar diferencias alélicas en diversos genes T1R, y mutaciones asociadas con estados de enfermedad y rasgos genéticos.

5. Análisis de unión basados en células

En una realización, se expresa una proteína o polipéptido T1R en una célula eucariótica como un receptor quimérico con una secuencia de chaperona, heteróloga que facilita su maduración y redireccionamiento a través de la ruta secretora. Tales polipéptidos T1R quiméricos pueden ser expresados en cualquier célula eucariótica, tal como las células HEK-293. Preferiblemente, las células comprenden una proteína G funcional, p. ej., G\alpha15, que es capaz de acoplar el receptor quimérico a una ruta de señalización intracelular o a una proteína de señalización tal como la fosfolipasa C. La activación de tales receptores quiméricos en tales células puede ser detectada utilizando cualquier método normalizado, por ejemplo detectando cambios en el calcio intracelular mediante la detección de FURA-2 dependiente de la fluorescencia en la célula.

Los receptores GPCR activados se convierten en sustratos para las quinasas que fosforilan la cola C-terminal del receptor (y posiblemente también otros sitios). De este modo, los activadores promoverán la transferencia de P32 desde el GTP marcado en gamma al receptor, lo que puede ser analizado con un contador de centelleo. La fosforilación de la cola C-terminal promoverá la unión de las proteínas de tipo arrestina e interferirá en la unión de las proteínas G. La ruta quinasa/arrestina juega un papel clave en la desensibilización de muchos receptores GPCR. Por ejemplo, en los compuestos que modulan la duración sería útil un receptor gustativo que permanezca activo como medio de prolongación de un sabor deseado o de interrupción de uno desagradable. Para una revisión general de la transducción de la señal de GPCR y los métodos de análisis de la transducción de la señal, véase, p. ej., Methods in Enzymology, vols. 237 y 238 (1994) y volumen 96 (1983); Bourne et al., Nature, 10:349:117-27 (1991); Bourne et al., Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher et al., Annu. Rev. Biochem., 67:653-92 (1998).

La modulación de T1R puede ser analizada comparando la respuesta de un polipéptido T1R tratado con un supuesto modulador T1R con la respuesta de una muestra de control no tratada. Tales supuestos moduladores de T1R pueden incluir sustancias que estimulan el sentido del gusto que inhiben o activan la actividad del polipéptido T1R. En una realización, se asigna a las muestras de control (no tratadas con activadores o inhibidores) un valor de actividad T1R relativo de 100. La inhibición de un polipéptido T1R se logra cuando el valor de la actividad de T1R con respecto al control es aproximadamente 90%, opcionalmente 50%, opcionalmente 25-0%. La activación de un polipéptido T1R se logra cuando el valor de la actividad T1R con respecto al control es 110%, opcionalmente 150%, 200-500%, o 1000-2000%.

Los cambios en el flujo iónico se pueden evaluar determinando los cambios en la polarización iónica (esto es, el potencial eléctrico) de la célula o la membrana que expresa un polipéptido T1R. Un medio para determinar los cambios en la polarización celular consiste en medir los cambios en la corriente (midiendo de ese modo los cambios en la polarización) con técnicas de fijación de voltaje y registro zonal (véase, p. ej., el modo "anclado a la célula", el modo "dentro-fuera", y el modo "célula completa", p. ej., Ackerman et al., New Engl. J Med., 336:1575-1595 (1997)). Las corrientes en las células completas se determinan convenientemente utilizando el patrón. Otros análisis conocidos incluyen: análisis de flujo de iones radiomarcados y análisis de fluorescencia utilizando colorantes sensibles al voltaje (véase, p. ej., Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol., 88:67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol., 4:269277 (1997); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994)). Generalmente, los compuestos que se van a someter a ensayo están presentes en el intervalo de 1 pM a 100 mM.

Los efectos de los compuestos de ensayo sobre la función de los polipéptidos se pueden medir examinando cualquiera de los parámetros descritos antes. Cualquier cambio fisiológico que afecte la actividad de GPCR puede ser utilizado para evaluar la influencia de un compuesto de ensayo sobre los polipéptidos de esta invención. Cuando las consecuencias funcionales se determinan utilizando células intactas o animales, también se pueden medir una variedad de efectos tales como la liberación de transmisores, la liberación de hormonas, los cambios transcripcionales para marcadores genéticos tanto conocidos como no caracterizados (p. ej., transferencias northern), los cambios en el metabolismo celular tales como el crecimiento celular o los cambios de pH, y los cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como Ca^{2+}, IP3, GMPc, o AMPc.

Los análisis preferidos para los GPCR incluyen células que están cargadas con colorantes sensibles a iones o al voltaje para informar de la actividad del receptor. Los análisis para determinar la actividad de tales receptores también pueden utilizar agonistas y antagonistas conocidos para otros receptores acoplados a proteínas G como controles negativos o positivos para evaluar la actividad de los compuestos sometidos a ensayo. En los análisis para identificar compuestos moduladores (p. ej., agonistas, antagonistas), se controlarán los cambios en el nivel de iones en el citoplasma o el voltaje de membrana utilizando un indicador fluorescente sensible a los iones o al voltaje de la membrana, respectivamente. Entre los indicadores sensibles a los iones y las sondas de voltaje que se pueden emplear se encuentran aquellos descritos en Molecular Probes 1997 Catalog. Para los receptores acoplados a proteínas G, se pueden utilizar proteínas G promiscuas tales como G\alpha15 y G\alpha16 en el análisis de elección (Wilkie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10049-10053 (1991)). Tales proteínas G promiscuas permiten el acoplamiento de una amplia gama de receptores.

La activación de los receptores se inicia típicamente después de eventos intracelulares, p. ej., aumento de los segundos mensajeros tales como IP3, que libera los almacenamientos intracelulares de iones calcio. La activación de algunos receptores acoplados a proteínas G estimula la formación de inositol trifosfato (IP3) por medio de la hidrólisis mediada por fosfolipasa C del fosfatidilinositol (Berridge & Irvine, Nature, 312:315-21 (1984)). El IP3 estimula a su vez la liberación de los almacenamientos de ión calcio intracelulares. De este modo, se puede utilizar un cambio en los niveles de ión calcio citoplásmico, o un cambio en los niveles de segundos mensajeros tales como IP3 para evaluar la función de los receptores acoplados a proteínas G. Las células que expresan tales receptores acoplados a proteínas G pueden mostrar niveles incrementados de calcio citoplasmático como resultado de la contribución tanto de los almacenamientos intracelulares como por medio de la activación de los canales iónicos, en cuyo caso puede ser deseable aunque no necesario realizar tales análisis en tampón sin calcio, opcionalmente con un suplemento de agente quelante tal como EGTA, para distinguir la respuesta de fluorescencia resultante de la liberación de calcio desde los almacenamientos internos.

Otros análisis pueden implicar la determinación de la actividad de los receptores que, cuando son activados, dan como resultado un cambio en el nivel de nucleótidos cíclicos intracelulares, p. ej., AMPc o GMPc, activando o inhibiendo enzimas tales como la adenilato ciclasa. Existen canales iónicos regulados por nucleótidos cíclicos, p. ej., los canales de las células fotorreceptoras en bastón y los canales de las neuronas olfatorias que son permeables a los cationes tras la activación por la unión de AMPc o GMPc (véase, p. ej., Altenhofen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:9868-9872 (1991) y Dhallan et al., Nature, 347:184-187 (1990)). En los casos en los que la activación del receptor da como resultado un descenso de los niveles de nucleótidos cíclicos, puede ser preferible exponer las células a agentes que aumentan los niveles de nucleótidos cíclicos intracelulares, p. ej., forskolina, antes de añadir un compuesto activador del receptor a las células en el análisis. Las células para este tipo de análisis se pueden elaborar mediante co-transfección de una célula anfitriona con ADN que codifica un canal iónico regulado por nucleótidos cíclicos, GPCR fosfatasa y ADN que codifica un receptor (p. ej., ciertos receptores de glutamato, receptores de acetilcolina muscarínicos, receptores de dopamina, receptores de serotonina, y similares), que, cuando son activados, ocasionan un cambio en los niveles de nucleótidos cíclicos en el citoplasma.

En una realización preferida, se mide la actividad del polipéptido T1R expresando un gen T1R en una célula heteróloga con una proteína G promiscua que conecta el receptor a una ruta de transducción de la señal de la fosfolipasa C (véase Offermanns & Simon, J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995)). Opcionalmente la línea celular es HEK-293 (que no expresa naturalmente los genes T1R) y la proteína G promiscua es G\alpha15 (Offermanns & Simon, supra). La modulación de la transducción de la señal se analiza midiendo los cambios en los niveles intracelulares de Ca^{2+}, que cambian en respuesta a la modulación de la ruta de transducción de la señal de T1R por medio de la administración de una molécula que se asocia con un polipéptido T1R. Los cambios en los niveles de Ca^{2+} se miden opcionalmente utilizando colorantes indicadores de Ca^{2+} fluorescentes y formación de imágenes fluorimétricas.

En una realización, los cambios en el AMPc o el GMPc se pueden medir utilizando inmunoanálisis. El método descrito por Offermanns & Simon, J. Bio. Chem., 270:15175-15180 (1995), puede ser utilizado para determinar el nivel de AMPc. Asimismo, el método descrito por Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell y Mol. Biol., 11:159-164 (1994), puede ser utilizado para determinar el nivel de GMPc. Adicionalmente, se describe un kit de análisis para medir AMPc y/o GMPc en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.115.538, incorporada en la presente memoria como referencia.

En otra realización, se puede analizar la hidrólisis de fosfatidil inositol (PI) de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos 5.436.128. Brevemente, el análisis implica marcar las células con 3H-mioinositol durante 48 o más horas. Las células marcadas se tratan con un compuesto de ensayo durante una hora. Las células tratadas se someten a lisis y se extraen en cloroformo-metanol-agua después de lo cual se separan los fosfatos de inositol mediante cromatografía de intercambio iónico y se cuantifican mediante recuento por centelleo. La El índice de estimulación se determina calculando la razón de cpm en presencia de agonista, con respecto a las cpm en presencia de tampón de control. Del mismo modo, el índice de inhibición se determina calculando la razón de cpm en presencia de antagonista, con respecto a las cpm en presencia de tampón de control (que puede contener o no un agonista).

En otra realización, los niveles de transcripción se pueden medir para evaluar los efectos de un compuesto de ensayo sobre la transducción de la señal. Una célula anfitriona que contiene un polipéptido T1R de interés se pone en contacto con un compuesto de ensayo durante un tiempo suficiente para efectuar cualquiera de las interacciones, y después se mide el nivel de expresión génica. La cantidad de tiempo para efectuar semejantes interacciones se puede determinar empíricamente, por ejemplo haciendo pasar el tiempo y midiendo el nivel de transcripción como una función del tiempo. La cantidad de transcripción se puede medir utilizando cualquier método conocido por los expertos en la técnica por ser adecuado. Por ejemplo, se puede detectar la expresión del ARNm de la proteína de interés utilizando transferencias northern o se pueden identificar sus productos polipeptídicos utilizando inmunoanálisis. Alternativamente, se pueden utilizar análisis basados en la transcripción utilizando genes informadores como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.436.128. Los genes informadores pueden ser, p. ej., cloramfenicol acetiltransferasa, luciferasa, 3'-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Además, se puede utilizar la proteína de interés como un informador indirecto por medio del anclaje a un segundo informador tal como la proteína fluorescente verde (véase, p. ej., Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 (1997)).

La cantidad de transcripción se compara después con la cantidad de transcripción o bien en la misma célula en ausencia de compuesto de ensayo, o se puede comparar con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que carece del polipéptido T1R de interés. Se puede transformar una célula sustancialmente idéntica de las mismas células de las cuales se preparó la célula recombinante pero que no había sido modificada por la introducción de ADN heterólogo. Cualquier diferencia en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de ensayo tiene en cierto modo alterada la actividad del polipéptido T1R de interés.

6. Animales no humanos transgénicos que expresan receptores quimiosensoriales

Los animales no humanos que expresan una o más secuencias de receptores quimiosensoriales de la invención, también se pueden utilizar para análisis de receptores. Semejante expresión se puede utilizar para determinar si un compuesto de ensayo se une específicamente a un polipéptido del receptor transmembrana gustativo de mamífero in vivo poniendo en contacto un animal no humano transfectado establemente o transitoriamente con un ácido nucleico que codifica un receptor quimiosensorial o una región de unión al ligando del mismo con un compuesto de ensayo y determinando si el animal reacciona con el compuesto de ensayo mediante la unión específica al polipéptido del receptor.

Los animales transfectados o infectados con los vectores de la invención son particularmente útiles para análisis para identificar y caracterizar sustancias que estimulan el sentido del gusto/ligandos que se pueden unir a un receptor específico o grupos de receptores. Tales animales infectados con el vector que expresan las secuencias del receptor quimiosensorial humano pueden ser utilizadas para el escrutinio in vivo de sustancias que estimulan el sentido del gusto y p. ej., sus efectos sobre la fisiología celular, (p. ej., sobre las neuronas gustativas), sobre el SNC, o el comportamiento.

Los medios para infectar/expresar los ácidos nucleicos y vectores, ya sea individualmente o en forma de genotecas, son bien conocidos en la técnica. Se pueden medir una variedad de parámetros de células individuales, órganos, o animales completos por medio de una variedad de métodos. Las secuencias T1R de la invención pueden ser expresadas por ejemplo en tejidos gustativos de animales con un agente infeccioso, p. ej., vector de expresión de adenovirus.

Los genes de receptores quimiosensoriales endógenos pueden permanecer funcionales y puede estar todavía presente la actividad de tipo salvaje (nativa). En otras situaciones, cuando es deseable que toda la actividad del receptor quimiosensorial sea por medio del receptor híbrido exógeno introducido, se prefiere el uso de una línea con un gen modificado. Los métodos para la construcción de animales transgénicos no humanos, concretamente ratones transgénicos, y la selección y preparación de los constructos recombinantes para generar células transformadas son bien conocidos en la técnica.

La construcción de una célula y un animal con un gen modificado está basada en la premisa de que el nivel de expresión de un gen concreto en una célula de mamífero puede ser disminuido o completamente anulado introduciendo en el genoma una nueva secuencia de ADN que sirva para interrumpir alguna porción de la secuencia de ADN del gen que se va a suprimir. Asimismo, se puede utilizar la "inserción por trampa de genes" para interrumpir un gen del anfitrión, y se pueden utilizar células del tallo embrionario de ratón (ES) para producir animales transgénicos con un gen desactivado (véase, p. ej., Holzschu, Transgenic Res 6:97-106 (1997)). La inserción del exógeno es típicamente mediante recombinación homóloga entre secuencias complementarias de ácido nucleico. La secuencia exógena es alguna porción del gen diana que va a ser modificado, tal como secuencias exónicas, intrónicas o reguladoras de la transcripción, o cualquier secuencia genómica que es capaz de afectar al nivel de expresión del gen diana; o una combinación de las mismas. El redireccionamiento de genes por medio de recombinación homóloga en células del tallo embrionario pluripotenciales permite modificar precisamente la secuencia genómica de interés. Se puede utilizar cualquier técnica para crear, escrutar, propagar, un animal con un gen modificado, p. ej., véase Bijvoet, Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998); Moreadith, J. Mol. Med. 75:208-216 (1997); Tojo, Cytotechnology 19:161-165 (1995); Mudgett, Methods Mol. Biol. 48:167-184 (1995); Longo, Transgenic Res. 6:321-328 (1997); Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.616.491; 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992; 5.627.059; 5.272.071; publicaciones WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650.

También se pueden utilizar los ácidos nucleicos de la invención como reactivos para producir células humanas "con un gen modificado" y su progenie. Del mismo modo, los ácidos nucleicos de la invención también se pueden utilizar como reactivos para producir ratones en los que se ha sustituido un gen endógeno por otro. Las secuencias génicas T1R de humano o rata pueden remplazar el T1R ortólogo en el genoma del ratón. De este modo, se produce un ratón que expresa un T1R de humano o de rata. Este ratón puede ser utilizado para analizar la función de T1R de humano o de ratón, y para identificar los ligandos para tales T1R.

F. Moduladores

Los compuestos sometidos a ensayo como moduladores de un miembro de la familia T1R pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o entidad biológica, tal como una proteína, azúcar, ácido nucleico o lípido. Alternativamente, los moduladores pueden ser versiones alteradas genéticamente de un gen T1R. Típicamente, los compuestos de ensayo serán moléculas químicas pequeñas y péptidos. Esencialmente se puede utilizar cualquier compuesto químico en forma de modulador o ligando potencial en los análisis de la invención, aunque muy a menudo se utilizan compuestos que pueden ser disueltos en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente basadas en DMSO). Los análisis se diseñan para escrutar grandes genotecas químicas automatizando las etapas de análisis y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente a los análisis, que se realizan típicamente en paralelo (p. ej., en formatos de microtitulación sobre placas de microtitulación en análisis robóticos). Se apreciará que existen muchos suministradores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland) y similares.

En una realización preferida, los métodos de escrutinio de alto rendimiento implican proporcionar una genoteca química o peptídica combinatoria que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos moduladores o ligandos potenciales). Tales "genotecas químicas combinatorias" o "genotecas de ligandos" se escrutan después en uno o más análisis, como se describe en la presente memoria, para identificar aquellos miembros de la genoteca (especie o subclase química concreta) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como "compuestos cabeza de serie" convencionales o pueden ser utilizados como tales como agentes terapéuticos potenciales o reales.

Una genoteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados mediante síntesis química o síntesis biológica, combinando numerosos "componentes básicos" tales como reactivos. Por ejemplo, una genoteca química combinatoria tal como una genoteca polipeptídica se forma combinando un grupo de componentes básicos químicos (aminoácidos) en cada forma posible para una longitud del compuesto dada (esto es, el número de aminoácidos de un compuesto polipeptídico). Se pueden sintetizar millones de compuestos químicos por medio de semejante mezcla combinatoria de componentes básicos químicos.

La preparación y el escrutinio de genotecas químicas combinatorias son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales genotecas químicas combinatorias incluyen, pero no están limitadas a, genotecas peptídicas (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991) y Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991)). También se pueden utilizar otros compuestos químicos para generar genotecas de diversidad química. Tales compuestos químicos incluyen, pero no están limitadas a: peptoides (p. ej., la Publicación PCT Núm. WO 91/19735), péptidos codificados (p. ej., la Publicación PCT WO 93/20242), bio-oligómeros al azar (p. ej., la Publicación PCT Núm. WO 92/00091), benzodiazepinas (p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con armazón de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánica de análogos de genotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science, 261:1303 (1993)), peptidilfosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem., 59:658 (1994)), genotecas de ácidos nucleicos (Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra), genotecas de ácidos nucleicos peptídicos (Patente de los Estados Unidos 5.539.083), genotecas de anticuerpos (Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y publicación PCT/US96/10287), genotecas de carbohidratos (Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y Patente de los Estados Unidos 5.593.853), genotecas de moléculas orgánicas pequeñas (benzodiazepinas, Baum, C&EN, Enero 18, página 33 (1993); tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de los Estados Unidos 5.549.974; pirrolidinas, Patentes de los estados Unidos 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolina, Patente de los Estados Unidos 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514, y similares).

Los dispositivos para la preparación de genotecas combinatorias se encuentran disponibles en el mercado (véase,p. ej., 357 MPS, 390 MPS (Advanced Chem Tech, Louisville KY), Symphony (Rainin, Woburn, MA), 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA), 9050 Plus (Millipore, Bedford, MA)). Además, se encuentran disponibles en el mercado numerosas genotecas combinatorias como tales (véase, p. ej., ComGenex, Princeton, NJ; Tripos, Inc., St. Louis, MO; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences; Columbia, MD; etc.).

En un aspecto de la descripción, se pueden utilizar moduladores de T1R en cualquier producto alimenticio, confitería, composición farmacéutica, o ingrediente del mismo para modular de ese modo el sabor del producto, composición, o ingrediente de la manera deseada. Por ejemplo, se pueden añadir moduladores de T1R que potencian la sensación del sabor dulce para edulcorar un producto o composición, mientras se pueden añadir moduladores de t1R que bloquean sensaciones gustativas no deseables para mejorar el sabor de un producto o composición.

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G. Métodos para Representar y Pronosticar la Percepción del Sabor

La descripción también proporciona preferiblemente los métodos para representar la percepción del sabor y/o para pronosticar la percepción del sabor en mamíferos, incluyendo seres humanos. Preferiblemente, tales métodos se pueden realizar utilizando los receptores y genes que codifican dichos polipéptidos T1R descritos en la presente memoria.

También se describe un método de escrutinio de uno o más compuestos en cuanto a la presencia de un sabor detectable por un mamífero, que comprende: poner en contacto dichos uno o más compuestos con los receptores descritos, preferiblemente cuando el mamífero es un ser humano. También se describe un método para representar la percepción gustativa de un sabor concreto en un mamífero, que comprende las etapas de: proporcionar los valores X_{1} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada uno de los n receptores quimiosensoriales de dicho vertebrado, donde n es mayor o igual que 2; y generar a partir de dichos valores una representación de la percepción gustativa. Los receptores quimiosensoriales pueden ser un receptor quimiosensorial descrito en la presente memoria, la representación puede constituir un punto o un volumen en un espacio n-dimensional, puede constituir un gráfico o un espectro, y puede constituir una matriz de representaciones cuantitativas. Asimismo, la etapa de suministro puede comprender poner en contacto una pluralidad de receptores quimiosensoriales producidos recombinantemente con una composición de ensayo y medir cuantitativamente la interacción de dicha composición con dichos
receptores.

También se describe un método de pronóstico de la percepción gustativa en un mamífero generado por una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero, que comprende las etapas de: proporcionar valores X_{1} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada uno de los n receptores quimiosensoriales de dicho vertebrado, donde n es mayor o igual que 2, para una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa conocida en un mamífero; y generar a partir de dichos valores una representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa conocida en un mamífero, que proporcionan los valores X_{1} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada uno de los n receptores quimiosensoriales de dicho vertebrado, donde n es mayor o igual que 2, para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero; y generar a partir de dichos valores una representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero, y pronosticar la percepción gustativa en un mamífero generada por una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero comparando la representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa desconocida en un mamífero con la representación cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para las una o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción gustativa conocida en un mamífero. Los receptores quimiosensoriales utilizados en este método pueden incluir un receptor quimiosensorial descrito en la presente memoria.

En otra realización, se generan moléculas o combinaciones de moléculas novedosas que logran una percepción gustativa predeterminada en un mamífero determinando un valor de la percepción gustativa en un mamífero para una molécula o combinación de moléculas conocida como se ha descrito antes; determinando un valor de la percepción gustativa en un mamífero para una o más moléculas o combinaciones de moléculas desconocidas como se ha descrito antes; comparando el valor de la percepción gustativa en un mamífero para una o más composiciones desconocidas con el valor de la percepción gustativa en un mamífero para una o más composiciones conocidas; seleccionando una molécula o combinación de moléculas que logra una percepción gustativa predeterminada en un mamífero; y combinando dos o más moléculas o combinaciones de moléculas conocidas para formar una molécula o combinación de moléculas que logran una percepción gustativa predeterminada en un mamífero. La etapa de combinación produce una única molécula o combinación de moléculas que logra una percepción gustativa predeterminada en un
mamífero.

En otra realización, se proporciona un método para estimular un sabor, que comprende las etapas de: para cada uno de una pluralidad de receptores quimiosensoriales clonados, preferiblemente receptores humanos, averiguar el grado en el que el receptor interacciona con la sustancia estimuladora del sentido del gusto; y combinar una pluralidad de compuestos, teniendo cada uno una interacción previamente averiguada con uno o más de los receptores; en cantidades que proporcionan juntas un perfil de estimulación del receptor que imita el perfil de la sustancia que estimula el sentido del gusto. La interacción de una sustancia que estimula el sentido del gusto con un receptor quimiosensorial puede ser determinada utilizando cualquiera de los análisis de unión o informadores descritos en la presente memoria. La pluralidad de compuestos se puede combinar después para formar una mezcla. Si se desea, se pueden combinar covalentemente uno o más de una pluralidad de compuestos. Los compuestos combinados estimulan sustancialmente al menos 75%, 80%, o 90% de los receptores que son estimulados sustancialmente por la sustancia que estimula el sentido del gusto.

En otra realización preferida, se someten a ensayo una pluralidad de compuestos patrón frente a una pluralidad de receptores quimiosensoriales para averiguar el grado en el que cada uno de los receptores interacciona con cada compuesto patrón, generando de ese modo un perfil de estimulación de cada compuesto patrón. Estos perfiles de estimulación se pueden almacenar después en una base de datos relacional sobre un medio de almacenamiento de datos. El método puede comprender adicionalmente suministrar un perfil de estimulación del receptor deseado para un sabor; comparar el perfil de estimulación del receptor deseado con la base de datos relacional; y averiguar una o más combinaciones de compuestos patrón que se emparejen más íntimamente con el perfil de estimulación del receptor deseado. El método puede comprender adicionalmente combinar los compuestos patrón en una o más de las combinaciones averiguadas para estimular el sabor.

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H. Kits

Los genes T1R y sus homólogos son herramientas útiles para identificar las células receptoras quimiosensoriales, para determinaciones forenses y de paternidad, y para examinar la transducción gustativa. Los reactivos específicos de los miembros de la familia T1R que hibridan específicamente con ácidos nucleicos de T1R, tales como las sondas y cebadores de T1R, y los reactivos específicos de T1R que se unen específicamente a un polipéptido T1R, p. ej., anticuerpos para T1R se utilizan para examinar la expresión de las células gustativas y la regulación de la transducción gustativa.

Los análisis de ácidos nucleicos en cuanto a la presencia de ADN y ARN para un miembro de la familia T1R en una muestra incluyen numerosos mecanismos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el análisis southern, el análisis northern, las transferencias puntuales, la protección de ARNasa, el análisis S1, técnicas de amplificación tales como la PCR, y la hibridación in situ. En la hibridación in situ, por ejemplo, el ácido nucleico diana es liberado de sus contornos celulares para que se encuentre disponible para la hibridación en la célula a la vez que se conserva la morfología celular para su posterior interpretación y análisis. Los siguientes artículos proporcionan una visión de conjunto de la técnica de hibridación in situ: Singer et al., Biotechniques, 4:230250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, vol. VII, pp. 189-226 (1984); y Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Names et al., eds. 1987). Además, se puede detectar un polipéptido T1R con las diversas técnicas de inmunoanálisis descritas antes. La muestra de ensayo se compara típicamente tanto con un control positivo (p. ej., una muestra que expresa un polipéptido T1R recombinante) como con un control negativo.

La presente invención también proporciona kits para escrutar moduladores de los miembros de la familia T1R. Tales kits se pueden preparar a partir de materiales y reactivos fácilmente asequibles. Por ejemplo, tales kits pueden comprender uno cualquiera o más de los siguientes materiales: ácidos nucleicos o proteínas de T1R, tubos de reacción, e instrucciones para someter a ensayo la actividad T1R. Opcionalmente, el kit contiene un receptor T1R biológicamente activo. Se pueden preparar una amplia variedad de kits y componentes de acuerdo con la presente invención, dependiendo del usuario deseado del kit y de las necesidades concretas del usuario.

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Ejemplos

En las secuencias de proteína presentadas en la presente memoria, el código de una letra X o Xaa hace referencia a cualquiera de los veinte restos aminoácido comunes. En las secuencias de ADN presentadas en la presente memoria, el código de una letra N o n hace referencia a cualquiera de las cuatro bases nucleotídicas, A, T, C, o G.

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Ejemplo 1

hT1R3

El ADN genómico de hT1R3 es proporcionado más abajo como SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 con las secuencias codificadoras pronosticadas (cds) mostradas en negrita. La interrupción entre los cóntigos 5' y 3' se muestra en forma de elipsis ("........."). Los cds pronosticados de hT1R3 se describen en el SEQ ID NO 3. Finalmente, se proporciona una secuencia de aminoácidos de hT1R pronosticada, preferida en forma de SEQ ID NO 4, utilizando el código de una letra para los aminoácidos.

3

4

6

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7

8

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9

10

11

Ejemplo 2

rT1R3 y mT1R3

Se aislaron segmentos de los genes de T1R3 de rata y de ratón mediante amplificación por PCR a partir de ADN genómico utilizando cebadores degenerados basados en la secuencia de T1R3 humana. Los cebadores degenerados SAP077 (5'-CGNTTYYTNGCNTGGGGNGARCC-3'; SEQ ID NO 5) y SAP079 (5'-CGNGCNCGRTTRTAR
CANCCNGG-3'; SEQ ID NO 6) son complementarios a los restos de T1R3 humano RFLAWGEPA (correspondientes al SEQ ID NO 7) y PGCYNRAR (correspondientes al SEQ ID NO 8), respectivamente. Los productos de la PCR se clonaron y se secuenciaron. El plásmido SAV115 lleva un segmento clonado del gen T1R3 de ratón, y SAV118 lleva un segmento del gen de rata. Estas secuencias, mostradas más abajo, representan claramente las contrapartes de roedor del T1R3 humano, puesto que el segmento de ratón es idéntico en 74% al correspondiente segmento del T1R3 humano, y el segmento de rata es idéntico en 80% al correspondiente segmento de T1R3 humano. Los segmentos de ratón y de rata son idénticos en 88%. Ninguna otra secuencia de las bases de datos son idénticas en más de 40% a estos segmentos de T1R3.

12

120

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13

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14

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Ejemplo 3

Clonación de rT1R3

Los fragmentos mT1R3 y rT1R3 identificados antes como SEQ ID NO 9 y 11 se utilizaron para escrutar una genoteca de ADNc derivado de tejido gustativo de rata. Se secuenció un clon positivo y se encontró que contenía la secuencia rT1R3 completa presentada más abajo como SEQ ID NO 13. La comparación de la secuencia con las secuencias mT1R3 y rT1R3 parciales y con la secuencia hT1R3 completa estableció que este ADNc representa la contraparte de rata para hT1R3. Por ejemplo, la identidad de aminoácidos por pares entre rT1R3 y hT1R3 es de aproximadamente 72%, mientras la secuencia indicada más relacionada en los bancos de datos de secuencias de ADN públicos es idéntica solamente en aproximadamente 33% a rT1R3.

15

16

17

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Ejemplo 4

Expresión de mT1R3

El fragmento T1R3 de ratón descrito antes contenido en SAV115 fue amplificado mediante PCR utilizando cebadores M13directo y M13inverso y después fue purificado en gel. El molde de ADN de T1R3 fue colocado en una reacción de marcaje de la transcripción in vitro donde se incorporaba UTP marcado con digoxigenina en una sonda de ARNc antisentido. Esta sonda se hibridó con tejido gustativo de ratón adulto que contenía papilas circunvaladas. La hibridación con T1R3 in situ y la detección se realizaron siguiendo el protocolo de Schaeren-Wiemers et al., Histochemistry, 100:431-400 (1993). Brevemente, se seccionó lengua de ratón recién congelada a 14 \mum y se preparó para la hibridación. Se hibridaron 200 ng/mL de la sonda de T1R3 con Digoxigenina antisentido durante 14 horas a 72ºC. La posthibridación consistió en un lavado con 0,2xSSC a 72ºC. La detección de la Digoxigenina se completó mediante incubación con una dilución 1:5000 de anticuerpo anti-Fosfatasa Alcalina DIG seguido de 12 horas de reacción de la fosfatasa en NBT/BCIP. La Figura 1 muestra la expresión génica de T1R3 en las yemas gustativas de las papilas circunvaladas de ratón.

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Ejemplo 5

hT1R1

El ortólogo humano (núm. de acceso de la Base de datos AL159177) de un receptor gustativo de rata, denominado rT1R1, es proporcionado más abajo como SEQ ID NO 15. Las cds pronosticadas están indicadas en negrita y algunos intervalos de la secuencia intrónica están indicados como series de N. Las secuencias de hT1R de nucleótidos y traducidas conceptualmente también se describen en la presente memoria como SEQ ID NO 16 y 17, respectivamente

18

19

20

21

22

24

<110> SENOMYX, INC.

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<120> RECEPTORES GUSTATIVOS T1R Y GENES QUE LOS CODIFICAN

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<130> 078003-0128439

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US01/07265

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-03-07

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/187,546

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-03-07

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/195,536

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-07

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/209,840

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-06-06

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2687

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2553

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 850

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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28

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador degenerado

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebadores degenerados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 552

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2577

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 858

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

41

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1251)..(1300)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1951)..(2000)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

44

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2526

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 841

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

48

49

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia consenso de la familia T1R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> t o r

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> f o 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r, q o p

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> s, p o v

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> v, e, r, k o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a o e

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> w o 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r, h o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 1 o q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> e, g o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n, r o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

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<223> r o e

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r o k

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> c, g o f

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> v, 1 o i

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> f o 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a o s

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (15)

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> m o 1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

52

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<210> 20

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<211> 3563

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 20

53

Claims

1. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del receptor gustativo T1R3 que tiene al menos una identidad de secuencia de 90% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

2. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

3. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 96% con el polipéptido contenido en SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

4. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 97% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

5. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 98% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

6. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 99% con el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

7. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que codifica el polipéptido contenido en el SEQ ID NO: 4, 10 o 14.

8. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de ácido nucleico contenido en el SEQ ID NO: 3, 9 o 13.

9. La secuencia de ácido nucleico de T1R3 aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que está conectada operablemente a un promotor regulable.

10. La secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que está conectada operablemente a un promotor constitutivo.

11. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-10.

12. Una célula anfitriona que ha sido transformada o transfectada con una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-10 o un vector de acuerdo con la reivindicación 11.

13. El vector de la reivindicación 11 que se selecciona del grupo que consiste en vectores de mamífero, vectores de insecto, vectores bacterianos, vectores de levadura, vectores retrovirales, vectores de bacteriófago, plásmidos lineales o circulares, y moléculas de ácido nucleico que son capaces de integrarse en el genoma de una célula deseada.

14. La célula anfitriona de la reivindicación 12 que se selecciona del grupo que consiste en células procarióticas, células de mamífero, células de levadura, células de insecto, células de anfibio, células vegetales y células fúngicas.

15. La célula anfitriona de la reivindicación 14 que es una célula humana.

16. La célula anfitriona de la reivindicación 17 que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, células CHO, células HeLa, y células HEK-293.

17. La célula anfitriona de la reivindicación 14 que es una célula cultivada o un explante.

18. Un polipéptido T1R3 aislado codificado por la secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

19. Un análisis para identificar un compuesto que modula la transducción gustativa que comprende:

(i): poner en contacto un polipéptido T1R3 de acuerdo con la reivindicación 18 con un supuesto compuesto modulador del sabor; y

20. El análisis de la reivindicación 19, donde dicho polipéptido T1R3 es expresado por una célula.

21. El análisis de la reivindicación 19, donde dicho polipéptido T1R3 es expresado por una membrana celular.

22. El análisis de la reivindicación 19, donde dicho polipéptido T1R3 está incluido sobre un soporte en fase sólida.

23. El análisis de la reivindicación 19, donde dicho polipéptido T1R3 está en solución.

24. El análisis de la reivindicación 19, donde dicho T1R3 está anclado al polipéptido fluorescente verde.