CN116554350B - 基于人类甜味受体蛋白的生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于人类甜味受体蛋白的生物传感器及其应用。该生物传感器为一种融合蛋白，具有以下结构：人甜味受体蛋白T1R3的N末端通过连接子1与红色荧光蛋白连接、人甜味受体蛋白T1R3的C末端通过连接子2与绿色荧光蛋白连接，其中，该人甜味受体蛋白T1R3的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：5所示。该生物传感器用于检测糖类物质。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器及生物传感方法，具体涉及一种基于人类甜味受体蛋白的生物传感器及其应用。
背景技术
荧光蛋白生物传感器是通过基因编码将目标蛋白与荧光蛋白相融合，在目标蛋白与目标分子相结合时蛋白质构象的变化转变为荧光信号，而达到实时检测的目的。
人类甜味受体是由T1R2和T1R3组成的异源二聚体，T1R2和T1R3是G蛋白偶联受体(GPCR)C类家族成员，他们都具有相似的结构，N端胞外域是一个捕蝇结构域(Venusflytrap module，VFT)然后通过富含半胱氨酸结构域(Cysteine-rich domain,CRD)与7次跨膜结构域相连接(seven transmembrane domains，TMDS)。两个VFT结构与被报道包含大多数甜味化合物的主要结合位点，包括天然糖(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、三氯蔗糖等)、人工糖(安赛蜜、阿斯巴甜、甜蜜素等)。人类甜味受体蛋白能感知多种甜味分子。
融合蛋白的表达涉及构建重组质粒，在DNA层面上改造蛋白，并在原核或真核生物中表达融合蛋白，进而发挥相应的功能。随着生命科学的迅速发展，生命活动的主要承担者蛋白质的相关研究备受关注。蛋白质的许多重要功能都有小分子的参与，如：味觉蛋白与味觉分子相关作用，并传递味觉信号。甜味受体蛋白特异性的与甜味分子结合，利用这一特性，设计合成能够特异性识别或鉴别甜味分子，感知甜味分子的含量的传感的发展，对食品科学，人工只能感知科学有着非常重要的意义。
构建重组质粒是设计融合蛋白的必要方法，在分子水平上对DNA进行改造，用体外重组的方法将目的基因，插入克隆载体，形成重组克隆，通过转化的方法转入大肠杆菌感受提体内进行复制和扩增，再筛选正确的克隆载体，将正确的克隆载体继续扩增得到纯的重组质粒分子。用此方法可以根据人们的意愿，在DNA层面上设计人们需要的蛋白。因此，重组质粒的构建在生物蛋白传感，蛋白芯片等研究方面有非常大的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物传感器，该生物传感器为一种融合蛋白，具有以下结构：
人甜味受体蛋白T1R3的N末端通过连接子1与红色荧光蛋白连接、人甜味受体蛋白T1R3的C末端通过连接子2与绿色荧光蛋白连接，
其中，所述人甜味受体蛋白T1R3的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：5所示。
在一个实施方案中，所述连接子1和所述连接子2为DA和PLA。
在一个实施方案中，所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：6所示
在一个实施方案中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：7所示
在一个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：2。
在一个实施方案中，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中的SEQ NO：1所示。
本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体，其含有编码所述的融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的又一个目的是提供一种重组菌株，其含有所述的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供所述的融合蛋白作为生物传感器的用途。
在一个实施方案中，所述生物传感器用于定性检测甜味物质。
本发明的生物传感器能检测包括但不限于葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖、甜蜜素等多种甜味物质。
附图说明
图1为本发明实施例中克隆人类甜味受体胞外域、线性化pNCS-twitch GR的PCR电泳图。
图2为本发明实施例中将红色荧光蛋白基因、甜味受体蛋白胞外域基因和绿色荧光蛋白基因编辑在一起的测序结果对应氨基酸图。
图3为本发明实施例中在大肠杆菌中表达融合蛋白并用荧光显微镜观察的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白图。
图4为本发明实施例中表达的融合蛋白与不同浓度葡萄糖溶液相互作用的光谱图以及荧光FRET变化效率图。
图5为本发明实施例中表达的融合蛋白与不同浓度蔗糖溶液相互作用的光谱图以及荧光FRET变化效率图。
图6为本发明实施例中表达的融合蛋白与不同浓度三氯蔗糖溶液相互作的光谱图以及荧光FRET变化效率图。
图7为本发明实施例中表达的融合蛋白与不同浓度甜蜜素溶液相互作用的光谱图以及荧光FRET变化效率图。
图8为对比例的融合蛋白的二级结构示意图。
图9为对比例中表达的融合蛋白与不同浓度葡萄糖溶液相互作用的光谱图以及荧光FRET变化效率图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特别说明，本发明实施例中使用药品及试剂均来源为正规而易购渠道。质粒购买自addgene官网，所有引物均自己设计由擎科生物上有限公司合成。
本发明的一个方面是基于荧光蛋白对的生物传感器，其原理是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。当供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱重叠，并且供体和受体的距离小于10nm就会发生荧光共振能量转移，通过荧光共振能量转移(FRET)效率以及荧光强度可以反应出目标物的浓度变化。由于该传感器本身由基因编码，以蛋白质的形式发挥作用，因此体积非常小，是纳米级别的微型传感器。基于自然界中存在的蛋白与底物特异性结合的原理，因此该传感器对底物的响应具有非常高的特异性。此外，与传统传感器相比，荧光蛋白生物传感器具有微型化、精准化、响应速度快等诸多优点。
本发明旨在创新性地将与甜味物质相互作用的受体蛋白胞外域与荧光蛋白对相融合，设计了一种生物传感器，其利用甜味分子与甜味受体结合域结合时产生的蛋白构象改变，进而改变与其融合的荧光蛋白对的距离，使得荧光蛋白的能量共振转移效率发生改变，以此检测溶液中的甜味物质或者发掘新的甜味分子。
为了实现上述目的，本发明提供了能够作为生物传感器的融合蛋白。其中，绿色荧光蛋白受激发后发射出的荧光作为激发光激发与其相邻近的红色荧光蛋白，使得红色荧光蛋白发射出红光。甜味蛋白受体胞外域是主要的甜味分子结合位点，与甜味分子结合后会产生构象的改变。甜味蛋白受体胞外域N端融合红色荧光蛋白和C端融合绿色荧光蛋白，构建成完整的生物传感器，当甜味分子与甜味蛋白结合域结合时，红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白之间的荧光共振能量转移效率发生变化，能实时地反应甜味分子与甜味受体蛋白结合域的结合。
实施例1：基于人类甜味受体蛋白的生物传感器
1.1含人类甜味受体蛋白T1R3胞外域序列和荧光蛋白序列的载体的克隆
1)取2只干净的PCR管，并做好标记A，在每个PCR管加入9.5μl PCR级别的超纯水，然后在管中加入1μl pNCS-twitch GR的质粒模板，再加入1μl 1-cpGFP-F和1μl 2-RFP-R的引物，再加入12.5μl PCR高保真酶混合物(2×Phanta Flash Master Mix)，混合均匀。
2)取1只干净的PCR管，并做好标记B，在每个PCR管加入9.5μl PCR级别的超纯水，在B管中加入1μl pCEP4-HLA-c-myc-optiT1R3 ECD-MHC质粒作为模板，加入1μl 3-RFP-T1R3-F和1μl 4-cpGFP-T1R3-R的引物，再加入12.51μl PCR高保真酶混合物(2×PhantaFlash Master Mix)，混合均匀。
3)放入伯乐的T100型号的PCR仪中，设置程序，先98℃3min，再98℃10s、60℃10s、72℃延伸2min进行35个循环，再72℃3min，最后4℃保存。
其中，pNCS-twitch GR和pCEP4-HLA-c-myc-optiT1R3 ECD-MHC购买自addgene官网。
引物序列如下；
| 引物名称 | 5’-3’ |
| 1-cpGFP-F | cctctggccagtgttcaactg |
| 2-RFP-R | agcatcggagtggcggccctc |
| 3-RFP-T1R3-F | agggccgccactccgatgctgcgcccctgtgcctgtctcag |
| 4-cpGFP-T1R3-R | ccagttgaacactggccagaggggccagaaacctactccttc |
1-cpGFP-F和2-RFP-R引物以pNCS-twitch GR为模板；3-RFP-T1R3-F和4-cpGFP-T1R3-R引物以人类甜味受体蛋白T1R3的cDNA为模板，配制如下反应体系，进行多聚酶链式反应(PCR)分别获得PCR产物A和B；
PCR反应程序如下：
1.2人类甜味受体蛋白T1R3胞外域和荧光蛋白载体序列的凝胶电泳
1)配制1×TAE电泳液，取20mL 50×TAE电泳液，加入980mL纯净水配制成1×TAE电泳液。
2)在电子天枰上称量0.6g琼脂糖，放入烧杯中，并加入50mL 1×TAE电泳液，在微波炉中加热2-3min，让琼脂糖完全溶解。
3)稍微冷却一会之后，加入5μl核酸染料(10000×)，倒入大孔梳中冷却30min。
4)冷却后小心拔掉梳孔，然后在一号泳道加入3μl 5000bp DNAmarker，二号泳道加入PCR产物A、三号泳道加入PCR产物A、四号泳道加入PCR产物B，放入电泳槽中，120V电泳，电泳30min。
5)电泳结束后，先用DNA凝胶成像仪拍照记录PCR结果，然后用小刀切取目标条带放入干净的EP管中，并做好标记。
电泳结果如图1所示，pNCS-mScarlet-cpGFP线性化之后在第2、3泳道约5kb，T1R3(ECD)胞外域在第4泳道约1.6kb。
1.3人类甜味受体蛋白T1R3胞外域和荧光蛋白载体序列重组连接
1)用DNA凝胶试剂盒按照试剂盒说明书进行凝胶回收，得到纯化后得PCR产物A和B。
2)取1μl纯化后的产物，用Nanodrop测试浓度，A产物的浓度为83ng，B产物的浓度为121ng。
3)取1μl纯化后PCR产物A和2μl纯化后的PCR产物B，加入4μl超纯水，再加入2μl 5×buffer(诺唯赞，ClonExpress II One Step Cloning Kit)，最后加入1μl同源重组酶(诺唯赞，ClonExpress II One Step Cloning Kit)，混合均匀，在PCR仪中37℃反应30min，冰上静置5min，获得重组反应溶液，待用。
1.4重组载体的转化
1)将DH5a感受态细胞提前5min从-80℃冰箱取出至于冰上解冻，解冻后分装成每支50μl。
2)将5μl上述重组反应溶液添加到50μl溶解的DH5a感受态细胞中，轻柔混匀，在冰上静置30min。
3)将水浴锅设置成42℃，步骤2)完成后，将冰上静置30min的感受态细胞放入42℃水浴锅中热激45s，然后放置冰上静置2min，然后其中添加500μl SOC培养基。
4)37℃200rpm摇床上培养45min，然后用涂布棒涂布在氨苄青霉素的固体LB平板上，涂抹均匀后，将平板倒置放置于37℃的培养箱中培养12～16h。
1.5：转化后挑单克隆测序
1)配制1L LB液体培养基：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeastextract)5g、氯化钠(NaCl)10g，然后加入1L超纯水，用高压蒸汽灭菌锅，在121℃条件下灭菌20min，冷却后放置在4℃冰箱备用。
2)取一支50mL离心管，加入50mL LB溶液，再加入50μl氨苄青霉素，混合均匀。再取四支摇菌管并做好标记(T3-1、T3-2、T3-3 T3-4)，分别加入3mL含氨苄青霉素的LB溶液。
3)用10μl移液器的枪头挑取单克隆，依次放入摇菌管(T3-1、T3-2、T3-3 T3-4)中，放入37℃200rpm的摇床上培养12h。
4)将摇菌管用封口膜封好，然后进行测序，测序引物为通用引物mCherry-F，序列为：5’-ccccgtaatgcagaagaaga-3’。
序列信息如下：
编码融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ NO:1所示。融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ NO:2所示。
图2示出了融合蛋白的二级结构示意图，N末端第34位缬氨酸(V)-第255位丝氨酸(S)位为红色荧光蛋白，第256和257位的天冬氨酸(D)和丙氨酸(A)是连接域1，第258位的丙氨酸(A)-第800位的丙氨酸(A)为人类甜味受体蛋白T1R3胞外域，第801、802和803位的脯氨酸(P)、亮氨酸(L)_和丙氨酸(A)为连接域2，第804位的丝氨酸(S)-1048甘氨酸(A)为绿色荧光蛋白。
1.6表达融合蛋白
1)将测序正确的重组质粒，重新转化一次，挑取单克隆，接种于3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12h，然后以1：100的比例接种到100mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养，在37℃200rpm摇床上培养12h。
取少量菌液5-10μl体积的菌液放入载玻片上，盖上盖玻片，先用荧光显微镜观察红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白是否表达，结果如图3：在488通道显示绿色荧光蛋白表达的信号，在594通道下显示红色荧光蛋白表达的信号。红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白基本重合。
2)将100mL菌液分装到两个50mL离心管中，在4℃12000rpm条件下离心5min，去掉上清，使液体摒弃干净。收集细菌沉淀，并在电子天枰上称量沉淀重量。
3)按照1g沉淀加入10mL细菌活性蛋白抽提试剂(碧云天：BeyoLyticTM细菌活性蛋白抽提试剂)的比例，在0.5g沉淀中加入5mL细菌裂解液。在100rpm的室温摇床上裂解30min，然后在4℃12000rpm条件下离心5min，收集蛋白上清，对收集的蛋白溶液进行光谱测试。
1.7融合蛋白与葡萄糖反应的光谱测试
1)不同浓度的葡萄糖配制：称取0.9g
葡萄糖溶解在5mL超纯水中，配制成终浓度为1M葡萄糖溶液。然后取100μl 1M葡萄糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成100mM葡萄糖溶液。然后取100μl 100mM葡萄糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成10mM葡萄糖溶液。
2)将蛋白上清溶液添加到384孔板的四个孔中，每孔加入100μl蛋白样本，然后，再分别加入1μl超纯水、1μl 10mM葡萄糖溶液、1μl 100mM葡萄糖溶液、1μl 1M葡萄糖溶液。
3)在室温摇床上以100rpm的转速，混匀液体10min，然后用光谱仪测试光谱。
4)将检测的数据导入GraphPad软件，绘制荧光蛋白的荧光吸收光谱图。然后用Matlab软件计算每组结果数据：mScarlet/cpGFP比值计算FRET效率，用GraphPad软件绘制不同浓度葡萄糖溶液作用时的FRET变化比率。
结果如图4所述，融合蛋白与不同浓度葡萄反应的FRET变化，在葡萄糖浓度为100uM时变化为1.0182432％，葡萄糖浓度为1mM时变化为1.030582％，葡萄糖浓度为10mM时变化为1.035758％。
1.8：融合蛋白与蔗糖反应的光谱测试
1)不同浓度的蔗糖配制：称取1.71g蔗糖溶解在5mL超纯水中，配制成终浓度为1M蔗糖溶液。然后取100μl 1M蔗糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成100mM蔗糖溶液。然后取100μl 100mM蔗糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成10mM蔗糖溶液。
2)将蛋白上清溶液添加到384孔板的四个孔，每孔加入100μl蛋白样本，然后，再分别加入1μl超纯水、1μl 10mM蔗糖溶液、1μl 100mM蔗糖溶液、1μl 1M蔗糖溶液。
3)在室温摇床上以100rpm的转速，混匀液体10min，然后用光谱仪测试光谱。
4)将检测的数据导入GraphPad软件，绘制荧光蛋白的荧光吸收光谱图。然后用Matlab软件计算每组结果数据：mScarlet/cpGFP比值计算FRET效率，用GraphPad软件绘制不同浓度蔗糖溶液作用时的FRET变化比率。
结果如图5所述，融合蛋白与不同浓度蔗糖反应的FRET变化，在蔗糖浓度为100uM时变化为1.0287289％，蔗糖浓度为1mM时变化为1.0325211％，葡萄糖浓度为10mM时变化为1.032666％。
1.9：融合蛋白与三氯蔗糖反应的光谱测试
1)不同浓度的三氯蔗糖配制：称取1.98g三氯蔗糖溶解在5mL超纯水中，配制成终浓度为1M三氯蔗糖溶液。然后取100μl 1M三氯蔗糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成100mM三氯蔗糖溶液。然后取100μl100mM三氯蔗糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成10mM三氯蔗糖溶液。
2)将蛋白上清溶液添加到384孔板的四个孔，每孔加入100μl蛋白样本，然后，再分别加入1μl超纯水、1μl 10mM三氯蔗糖溶液、1μl 100mM三氯蔗糖溶液、1μl 1M三氯蔗糖溶液。
3)在室温摇床上以100rpm的转速，混匀液体10min，然后用光谱仪测试光谱。
4)将检测的数据导入GraphPad软件，绘制荧光蛋白的荧光吸收光谱图。然后用Matlab软件计算每组结果数据：mScarlet/cpGFP比值计算FRET效率，用GraphPad软件绘制不同浓度三氯蔗糖溶液作用时的FRET变化比率。
结果如图6所述，融合蛋白与不同浓度三氯蔗糖反应的FRET变化，在三氯蔗糖浓度为100uM时变化为1.0266665％，三氯蔗糖浓度为1mM时变化为1.0250887％，葡萄糖浓度为10mM时变化为1.054338％。
1.10：融合蛋白与甜蜜素反应的光谱测试
1)不同浓度的甜蜜素配制：称取1g甜蜜素溶解在5mL超纯水中，配制成终浓度为1M甜蜜素溶液。然后取100μl 1M甜蜜素溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成100mM甜蜜素溶液。然后取100μl 100mM甜蜜素溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成10mM甜蜜素溶液。
2)将蛋白上清溶液添加到384孔板的四个孔，每孔加入100μl蛋白样本，然后，再分别加入1μl超纯水、1μl 10mM甜蜜素溶液、1μl 100mM甜蜜素溶液、1μl 1M甜蜜素溶液。
3)在室温摇床上以100rpm的转速，混匀液体10min，然后用光谱仪测试光谱。
4)将检测的数据导入GraphPad软件，绘制荧光蛋白的荧光吸收光谱图。然后用Matlab软件计算每组结果数据：mScarlet/cpGFP比值计算FRET效率，用GraphPad软件绘制不同浓度甜蜜素溶液作用时的FRET变化比率。
结果如图7所述，融合蛋白与不同浓度甜蜜素反应的FRET变化，在甜蜜素浓度为100uM时变化为1.0137231％，甜蜜素浓度为1mM时变化为1.0307355％，甜蜜素浓度为10mM时变化为1.048326％。
对比例
1.1含人类甜味受体蛋白T1R2胞外域序列和荧光蛋白序列的载体的克隆
1)取2只干净的PCR管，并做好标记A，在每个PCR管加入9.5μl PCR级别的超纯水，然后在管中加入1μl pNCS-twitch GR的质粒模板，再加入1μl1-cpGFP-F和1μl 2-RFP-R的引物，再加入12.5μl PCR高保真酶混合物(2×Phanta Flash Master Mix)，混合均匀。
2)取1只干净的PCR管，并做好标记B，在每个PCR管加入9.5μl PCR级别的超纯水，在B管中加入1μpcDNA3.1(+)-HA-Flag-natT1R2质粒作为模板，加入1μmScarlet-T1R2-F和1μl cpGFP-T1R2-R的引物，再加入12.51μl PCR高保真酶混合物(2×Phanta Flash MasterMix)，混合均匀。
3)放入伯乐的T100型号的PCR仪中，设置程序，先98℃3min，再98℃10s、60℃10s、72℃延伸2min进行35个循环，再72℃3min，最后4℃保存。
其中，pNCS-twitch GR和pcDNA3.1(+)-HA-Flag-natT1R2购买自addgene官网。
引物序列如下；
| 引物名称 | 5’-3’ |
| 1-cpGFP-F | cctctggccagtgttcaactg |
| 2-RFP-R | agcatcggagtggcggccctc |
| mScarlet-T1R2-F | agggccgccactccgatgctatgaagaccatcatcgccctg |
| cpGFP-T1R2-R | cagttgaacactggccagaggagcgatggtgggtgcctcatg |
1-cpGFP-F和2-RFP-R引物以pNCS-twitch GR为模板；mScarlet-T1R2-F和cpGFP-T1R2-R引物以pcDNA3.1(+)-HA-Flag-natT1R2为模板，配制如下反应体系，进行多聚酶链式反应(PCR)分别获得PCR产物A’和B’；
PCR反应程序如下：
1.2人类甜味受体蛋白T1R2胞外域和荧光蛋白载体序列的凝胶电泳
1)配制1×TAE电泳液，取20mL 50×TAE电泳液，加入980mL纯净水配制成1×TAE电泳液。
2)在电子天平上称量0.6g琼脂糖，放入烧杯中，并加入50mL 1×TAE电泳液，在微波炉中加热2-3min，让琼脂糖完全溶解。
3)稍微冷却一会之后，加入5μl核酸染料(10000×)，倒入大孔梳中冷却30min。
4)冷却后小心拔掉梳孔，然后在一号泳道加入3μl 5000bp DNAmarker，二号泳道加入PCR产物A、三号泳道加入PCR产物A、四号泳道加入PCR产物B，放入电泳槽中，120V电泳，电泳30min。
1.3人类甜味受体蛋白T1R3胞外域和荧光蛋白载体DNA重组连接
1)用DNA凝胶试剂盒按照试剂盒说明书进行凝胶回收，得到纯化后得PCR产物A’和B’。
2)取1μl纯化后的产物，用Nanodrop测试浓度，A’产物的浓度为83ng，B’产物的浓度为131ng。
3)取1μl纯化后PCR产物A’和2μl纯化后的PCR产物B’，加入4μl超纯水，再加入2μl5×buffer(诺唯赞的ClonExpress II One Step Cloning Kit)，最后加入1μl同源重组酶(诺唯赞的ClonExpress II One Step Cloning Kit)，混合均匀，在PCR仪中37℃反应30min，冰上静置5min，获得重组反应溶液，待用。
1.4重组载体的转化
1)将DH5a感受态细胞提前5min从-80℃冰箱取出至于冰上解冻，解冻后分装成每支50μl。
2)将5μl上述重组反应溶液添加到50μl溶解的DH5a感受态细胞中，轻柔混匀，在冰上静置30min。
3)将水浴锅设置成42℃，步骤2)完成后，将冰上静置30min的感受态细胞放入42℃水浴锅中热激45s，然后放置冰上静置2min，然后其中添加500μl SOC培养基。
4)37℃200rpm摇床上培养45min，然后用涂布棒涂布在氨苄青霉素的固体LB平板上，涂抹均匀后，将平板倒置放置于37℃的培养箱中培养12～16h。
1.5：转化后挑单克隆测序
1)配制1L LB液体培养基：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeastextract)5g、氯化钠(NaCl)10g，然后加入1L超纯水，用高压蒸汽灭菌锅，在121℃条件下灭菌20min，冷却后放置在4℃冰箱备用。
2)取一支50mL离心管，加入50mL LB溶液，再加入50μl氨苄青霉素，混合均匀。再取四支摇菌管并做好标记(T2-1、T2-2、T2-3、T2-4)，分别加入3mL含氨苄青霉素的LB溶液。
3)用10μl移液器的枪头挑取单克隆，依次放入摇菌管((T2-1、T2-2、T2-3、T2-4)中，放入37℃200rpm的摇床上培养12h。
4)将摇菌管用封口膜封好，然后进行测序，测序引物为通用引物mCherry-F，序列为：5’-ccccgtaatgcagaagaaga-3’。
序列信息如下：
编码对比例的融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ NO:3所示。编码对比例的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ NO:4所示。
图8示出了对比例的融合蛋白的二级结构示意图，N末端第34位缬氨酸(V)-第255位丝氨酸(S)位为红色荧光蛋白，第256和257位的天冬氨酸(D)和丙氨酸(A)是连接域1，258位的蛋氨酸(M)-第833位的丙氨酸(A)为人类甜味受体蛋白T1R2胞外域，第834、835和836位的脯氨酸(P)、亮氨酸(L)和丙氨酸(A)为连接域2，第837位的丝氨酸(S)-1082甘氨酸(A)为绿色荧光蛋白。
1.6表达对比例的融合蛋白
1)将测序正确的重组质粒，重新转化一次，挑取单克隆，接种于3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12h，然后以1：100的比例接种到100mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养，在37℃200rpm摇床上培养12h。
取少量菌液5-10μl体积的菌液放入载玻片上，盖上盖玻片，先用荧光显微镜观察红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白是否表达，结果如图3：在488通道显示绿色荧光蛋白表达的信号，在594通道下显示红色荧光蛋白表达的信号。红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白基本重合。
2)将100mL菌液分装到两个50mL离心管中，在4℃12000rpm条件下离心5min，去掉上清，使液体摒弃干净。收集细菌沉淀，并在电子天平上称量沉淀重量。
3)按照1g沉淀加入10mL细菌活性蛋白抽提试剂(碧云天：BeyoLyticTM细菌活性蛋白抽提试剂)的比例，在0.5g沉淀中加入5mL细菌裂解液。在100rpm的室温摇床上裂解30min，然后在4℃12000rpm条件下离心5min，收集蛋白上清，对收集的蛋白溶液进行光谱测试。
1.7对比例的融合蛋白与葡萄糖反应的光谱测试
1)不同浓度的葡萄糖配制：称取0.9g
葡萄糖溶解在5mL超纯水中，配制成终浓度为1M葡萄糖溶液。然后取100μl 1M葡萄糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成100mM葡萄糖溶液。然后取100μl 100mM葡萄糖溶液，加入900μl超纯水中，混合均匀配制成10mM葡萄糖溶液。
2)将蛋白上清溶液添加到384孔板的四个孔中，每孔加入100μl蛋白样本，然后，再分别加入1μl超纯水、1μl 10mM葡萄糖溶液、1μl 100mM葡萄糖溶液、1μl 1M葡萄糖溶液。
3)在室温摇床上以100rpm的转速，混匀液体10min，然后用光谱仪测试光谱。
4)将检测的数据导入GraphPad软件，绘制荧光蛋白的荧光吸收光谱图。然后用Matlab软件计算每组结果数据：mScarlet/cpGFP比值计算FRET效率，用GraphPad软件绘制不同浓度葡萄糖溶液作用时的FRET变化比率。
结果如图9所示，对比例的融合蛋白与不同浓度葡萄糖反应的光谱，红色荧光蛋发射峰不明显。根据光谱图计算的FRET也没有变化。具体FRET数据为，在葡萄糖浓度为100uM时变化为0.97594763％，葡萄糖浓度为1mM时变化为0.977195205％，葡萄糖浓度为10mM时变化为0.984146025％。
Claims (9)
1.一种融合蛋白，具有以下结构：
人甜味受体蛋白T1R3的N末端通过连接子1与红色荧光蛋白连接、人甜味受体蛋白T1R3的C末端通过连接子2与绿色荧光蛋白连接，
其中，所述人甜味受体蛋白T1R3的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子1为天冬氨酸-丙氨酸；所述连接子2为脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：6所示。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：7所示。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：2。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中的SEQ NO：1所示。
7.一种重组表达载体，含有编码权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
8.一种重组菌株，其含有权利要求7所述的重组表达载体。
9.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白作为用于检测糖类物质的生物传感器的用途。
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