CN116589594B - 基于截短的人甜味受体膜外域的生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于截短的人甜味受体膜外域的生物传感器及其应用。该生物传感器为一种融合蛋白，具有以下结构：从N末端至C末端依次为红色荧光蛋白、连接域1、截短的人甜味受体T1R2或T1R3膜外域、连接域2、绿色荧光蛋白；其中，所述连接域1和连接域2为DT和LRP；QE和AAL；DS和PLD；或DE和GHR。该生物传感器可以用于定性检测甜味物质。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术，尤其涉及基于截短的人甜味受体膜外域的生物传感器及其应用。
背景技术
甜味是五种基本味觉之一，用来评估食物中的能量含量。甜味的处理始于呈味物质与聚集在舌头上的味觉受体细胞(Taste Receptor Cells，TRCs)的特异性结合，II型TRCs表达G蛋白偶联受体(GPCRs)，专门用于检测甜味、鲜味和苦味。当被特定物质激活时，TRCs能通过传入纤维将信息传递到与味觉处理相关的特定脑区。由于品尝甜味食物能给人带来愉悦感，这使得甜味在进化过程中得到支持，也因此在全球范围内有了越来越多的与肥胖相关的病例。19世纪以来，科学家们致力于寻找和开发高效且低热量的甜味物质作为糖类的替代品，应用到生产生活的各个方面。因此，采用工程学的方法来模拟人类的味觉感受系统，评估食品中的甜味物质在食品、医疗等多个领域都具有重要的意义和广阔的应用前景。
人类的味觉感受系统无疑是最快速且灵敏的，能够特异性地识别环境中不同味道的物质。人体的感官评价也是最常见的味觉评价方法。而基于个体差异所造成的味觉敏感性偏差带来的局限性以及大量检测样本产生的需求性催生了各种客观的检测和评价甜味物质的方法，包括高效液相色谱法、表面等离子共振光谱法以及基于电化学和脂质聚合物膜的传感器。这些系统和方法大多采用分析化学的形式来实现仿生味觉的感知，需要化学物质与味觉味道的先验经验，通常具有较低的选择性，不能正确模拟人类味觉系统的多种自然特征。近年来，随着光电技术、信息技术与生物技术的快速发展，衍生出了一种相互融合的方法来感知和检测各种物质，比如利用荧光技术开发的基于分子和细胞层面的各种神经递质探针和钙离子探针，被广泛应用于生物研究和医学检测当中。
荧光共振能量转移(FRET)是指两个能量相当的荧光分子在距离靠近时发生的能量转移现象，其中一个荧光分子的发射光谱与另一个荧光分子的激发光谱相重叠，两者发生能量传递后，一方的荧光减弱，另一方的荧光则会增强。基于FRET的生物传感器构建也应运而生，它相比于基于单荧光分子的探针，在检测上更为灵敏和准确。因此，基于FRET系统和人类味觉感受域有望构建出可基因编码的、荧光指示的仿生味觉感知分子来模拟人类味觉的感知过程，并通过不断的基因编码优化和连接域(Linker)的筛选，构建出一种有效的生物传感器用于检测各种甜味物质，应用到食品、医药等多个产业中。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于截短的人甜味受体膜外域的生物传感器，该生物传感器为一种融合蛋白，具有以下结构：从N末端至C末端依次为红色荧光蛋白、连接域1、截短的人甜味受体T1R2或T1R3膜外域、连接域2、绿色荧光蛋白；其中，所述连接域1和连接域2为DT和LRP；QE和AAL；DS和PLD；或DE和GHR。
在一个实施方案中，所述截短的人甜味受体T1R3膜外域的氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：1或SEQ NO：3；所述截短的人甜味受体T1R2膜外域的氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：2。
在一个实施方案中，所述红色荧光蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：4。
在一个实施方案中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：5。
在一个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：6、7、8或9所示。
在一个实施方案中，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中的SEQ NO：10、11、12或13所示。
本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体，其含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的又一个目的是提供一种重组菌株，其含有所述的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供所述的融合蛋白作为生物传感器的用途。
在一个实施方案中，所述生物传感器用于定性检测甜味物质。
本发明的生物传感器能检测包括但不限于葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖、安赛蜜、乳糖、纽甜等多种甜味物质。
附图说明
图1是采用徕卡荧光显微镜拍摄的含重组表达载体pNCS-mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S12序列，膜外域两端的连接域是DS和PLD时)的大肠杆菌在明场及荧光下的成像图。
图2是融合蛋白mScarlet+DT+S4+LRP+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是DT和LRP)与安赛蜜、乳糖和三氯蔗糖反应时的光谱图。
图3是融合蛋白mScarlet+DT+S4+LRP+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是DT和LRP)响应不同浓度的安赛蜜、乳糖和三氯蔗糖的折线图。
图4是融合蛋白mScarlet+QE+S4+AAL+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是QE和AAL)与安赛蜜、葡萄糖和蔗糖反应时的光谱图。
图5是融合蛋白mScarlet+QE+S4+AAL+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是QE和AAL)响应不同浓度的安赛蜜、葡萄糖和蔗糖的折线图。
图6是融合蛋白mScarlet+DE+S11+GHR+cpGFP(截短的人甜味受体T1R2膜外域S11序列，膜外域两端的连接域是DE和GHR)与三氯蔗糖反应时的光谱图。
图7是融合蛋白mScarlet+DE+S11+GHR+cpGFP(截短的人甜味受体T1R2膜外域S11序列，膜外域两端的连接域是DE和GHR)响应不同浓度三氯蔗糖的折线图。
图8是融合蛋白mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S12序列，膜外域两端的连接域是DS和PLD时)与纽甜和三氯蔗糖反应时的光谱图。
图9是融合蛋白mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S12序列，膜外域两端的连接域是DS和PLD时)响应不同浓度纽甜和三氯蔗糖的折线图。
图10是融合蛋白mScarlet+EE+S4+YSI+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是EE和YSI时)与三氯蔗糖、蔗糖和葡萄糖反应时的光谱图。
图11是融合蛋白mScarlet+EE+S4+YSI+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是EE和YSI时)响应不同浓度三氯蔗糖、蔗糖和葡萄糖的折线图。
具体实施方式
为了更好地阐述本发明的目的、完整技术路线以及优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作出进一步详细的说明。但以下描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不包含全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有进行创造性劳动所取得的其他实施例，均属于本发明的保护范围。
在以下描述的实施例中，若无特别说明，所使用的常规方法都为本领域技术人员公认或普遍使用的技术手段，本发明的实施例中所使用的仪器、试剂、耗材等都可通过正规的商业途径获得。
本发明所涉及的基于人甜味受体T1R2、T1R3膜外域构建的生物传感器是针对人甜味受体T1R2、T1R3截短的膜外域进行改造获得的重组蛋白，所述改造包括对T1R2、T1R3膜外域的不同位置进行不同长度的截短、在截短的T1R2和T1R3蛋白两侧分别插入红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白、截短的T1R2和T1R3蛋白与荧光蛋白之间采用不同种类的氨基酸作为连接域。
所述生物传感器能够定性地检测所述截短的人甜味受体T1R2、T1R3膜外域与甜味物质的结合。
本发明利用人甜味受体T1R2、T1R3感受甜味物质并发生构象改变的特点，利用与人甜味受体T1R2、T1R3膜外域相偶联的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白将人甜味受体T1R2、T1R3膜外域的构象变化转换为光学信号的变化，根据光学信号的变化比率来检测甜味物质的存在及其浓度范围。基于以上原理来构建基于FRET和截短的人甜味受体膜外域的生物传感器以及利用该探针来检测甜味物质的方法。
实施例1：基于截短的人甜味受体T1R2、T1R3膜外域的生物传感器
步骤一：截取人甜味受体T1R2、T1R3膜外域，通过几个氨基酸作为连接域分别连接红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因，并一起克隆到大肠杆菌原核表达载体中，构建相应的融合蛋白表达质粒。
其中，人甜味受体T1R3截短的膜外域序列分别为S4和S12，S4的序列为序列表中的SEQ NO:1：
GSRDIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPQVSYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDRVQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSIFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLGKVQDVLHQVNQSSVQVVLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAW；
S12的序列为序列表中的SEQ NO:3：
GSRDIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPQVSYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDRVQ。
人甜味受体T1R2截短的膜外域序列为S11，S11的序列为序列表中的SEQ NO:2：
PIQEDYSNYISRVVAVIGPDNSESVMTVANFLSLFLLPQITYSAISDELRDKVRFPALLRTTPSADHHIEAMVQLM。
红色荧光蛋白是mScarlet，其序列为序列表中的SEQ NO:4：
VSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHS。
绿色荧光蛋白来源于循环重排的cpGFP，其序列为序列表中的SEQNO:5：
SVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGTGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDG。
在本发明中，所有的分子克隆都采用序列互补的方式来实现片段之间的重组连接。将15-20个碱基的互补序列设计在引物上实现有效的拼接。所有的引物均订购于擎科生物，采用PAGE方式纯化，用超纯水稀释成10μM。所有的重组克隆均由擎科生物进行测序鉴定，并以质粒的形式进行样品返还。
采用pNCS载体作为出发载体进行构建，该载体为常见的原核系统表达载体，抗性为氨苄青霉素。截短的人甜味受体T1R2和T1R3膜外域基因部分扩增于T1R2和T1R3全长人类基因组cDNA(Addgene,#113944,#113948)。截短是指删除部分序列。红色荧光蛋白mScarlet模板源自pmScarlet_C1(#85042,Addgene)，绿色荧光蛋白cpGFP源自msfGFP(#91902，Addgene)，pNCS载体模板源自Twitch-GR(#173044，Addgene)。
所有的PCR均为25μl反应体系(模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，酶(Vazyme#P520)12.5μl，超纯水9.5μl)，按正常的反应程序进行扩增。扩增完成后通过琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行回收、纯化。
扩增S4、S12序列的模板为#113948，Addgene。扩增S11序列的模板为#113944,Addgene。
红色荧光蛋白扩增引物序列为：上游引物5’-ACGATGACGATAAGGATCCGGTGAGCAAGGGCGAGGCAGT-3’，下游引物5’-AGCATCGGAGTGGCGGCCCTCGGA-3’。
绿色荧光蛋白扩增引物序列为：上游引物5’-CCTCTGGCCAGTGTT CAAC-3’,下游引物5’-CAAGCTTCGAATTCATTAACCATCTTCGACA TTATGTCG-3’。
S4序列的扩增引物为：上游5’-GAGGGCCGCCACTCCGATGCTGGTAGTAGGGACATAGCCGCCTAC-3’，下游5’-AGTTGAACACTGGCCAGAGGCCACGCCTCGCTCGCTACCCATAC-3’。
S11序列的扩增引物为：上游5’-AGGGCCGCCACTCCGATGCTCC CATCCAAGAGGACTACAG-3’，下游5’-GATCAGCCAGTTGAACACT GGCCAGAGGCATAAGCTGCACCATGGCCTC。
S12序列的扩增引物为：上游5’-CTCCGAGGGCCGCCACTCCGATGCTGGTAGTAGGGACATAGCCGCCTAC-3’，下游5’-GATCAGCCAG TTGAACACTGGCCAGAGGTTGTACCCTATCGCTTGGAAC-3’。
pNCS载体的扩增引物为：上游引物5’-TAATGAATTCGAAGCTTG ATCCGG-3’，下游5’-CGGATCCTTATCGTCATCGTC-3’。
PCR反应程序为95℃预变性5分钟，(95℃变性40秒，65℃退火40秒，72℃延伸1分钟)以上过程循环35次，72℃延伸10分钟。
利用同源重组的方式进行片段连接。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在365nm长波紫外灯下，用干净刀片将目的条带切下，通过擎科生物的DNA凝胶回收试剂盒(TSP601-200)对目的条带进行回收。用诺唯赞的多片段连接试剂盒(C113)对各个片段进行连接分别获得重组表达载体pNCS-mScarlet+DT+S4+LRP+cpGFP、pNCS-mScarlet+QE+S4+AAL+cpGFP、pNCS-mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP、pNCS-mScarlet+DE+S11+GHR+cpGFP和pNCS-mScarlet+EE+S4+YSI+cpGFP。
步骤二：将上述步骤构建的重组表达载体分别转入DH5α化学感受态细胞中，让其在含有氨苄青霉素抗性的LB固体琼脂平板中过夜生长，直至长出单个克隆。对单个克隆进行测序。
具体实施步骤为：
1.将DH5α化学态细胞从-80℃冰箱取出，提前置于冰上解冻。
2.取2μl测序正确的重组质粒加入到50μl化学感受态细胞中，于冰上静置30分钟。
3.将第二步中的混合物放入42℃的水浴锅中热激45秒。
4.热激结束立即取出混合物放置在冰上2-3分钟。
5.在细胞混合物中加入300μl SOC培养基，于37℃恒温摇床进行复苏45-60分钟，摇床转速设置为250r.p.m。
6.复苏结束后将适量菌液涂布于含有氨苄抗性的LB固体琼脂平板上。
7.将平板倒置放于37℃恒温培养箱中进行过夜培养。
图1示出了采用徕卡荧光显微镜拍摄的含重组表达载体pNCS-mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S12序列，膜外域两端的连接域是DS和PLD时)的大肠杆菌在明场及荧光下的成像图。
步骤三：挑取单个克隆至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，直至菌液变得浑浊；将扩大培养后的菌液进行离心，弃上清留取沉淀，加入细菌活性蛋白抽提试剂碧云天(P0013Q)进行裂解，再次离心后取上清即为可溶性的融合蛋白的溶液，分别获得融合蛋白mScarlet+DT+S4+LRP+cpGFP(氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：6；核苷酸序列为序列表中的SEQ NO：10)、mScarlet+QE+S4+AAL+cpGFP(其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：7；核苷酸序列为序列表中的SEQ NO：11)、mScarlet+DE+S11+GHR+cpGFP(其氨基酸序列为序列表中的SEQNO：8；核苷酸序列为序列表中的SEQ NO：12)、mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP(其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：9；核苷酸序列为SEQ NO：13)、和mScarlet+EE+S4+YSI+cpGFP的溶液(其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO：14)。
具体实施步骤为：
1.在摇菌管中加入2-3mL添加氨苄青霉素(1:1000)的LB液体培养基，挑取过夜培养后平板上的单克隆至摇菌管中，摇菌管置于37℃恒温摇床中过夜培养。
2.取2mL菌液至离心管中，16000g室温离心2分钟，弃上清液。
3.在沉淀中加入200μl细菌活性蛋白提取试剂，温和涡旋或用枪头吹吸使沉淀完全溶解。
4.加入裂解液的细菌沉淀于振荡器上室温裂解30分钟，以保证上清液中有足够的被裂解的蛋白。
5.将混合液于16000g、4℃离心5分钟，以最大程度地避免蛋白被降解，保障蛋白的活性和稳定性。
6.离心后吸取上清液即为融合蛋白的溶液。
步骤四：在光谱仪下检测步骤三获得的融合蛋白的溶液在510nM和610nM处的激发峰和发射峰；在融合蛋白的溶液中分别添加不同种类和浓度的甜味物质，在振荡器中反应一段时间以后，再次通过光谱仪检测510nM和610nM处的激发峰和发射峰。
具体实施步骤为：
1.取50μl融合蛋白的溶液于384孔板中，在光谱仪下收集由510nM激发的发射光谱以及610nM处的吸收光谱，R0为每个融合蛋白在本底水平下510nM处激发峰的荧光强度与610nM处发射峰的荧光强度的比值。
2.每孔添加甜味物质后，将384孔板于振荡器上室温振荡孵育5-10分钟，在光谱仪下收集由510nM处激发的发射光谱以及610nM处的发射光谱。
3.计算得到的△R(△FRET)＝(R-R0)/R0表示加入某种甜味物质后改变的荧光强度比率，即两个荧光分子发生荧光共振能量转移的比率，其中R0为基础条件下610nM处的发射峰与510nM处的激发峰的比值，R为加入甜味物质时610nM处的发射峰与510nM处的激发峰的比值。随着甜味物质浓度的增加，510nM处的荧光强度呈现降低趋势，导致△FRET比值呈现上升趋势。
步骤五：对步骤四中提取到的光谱波长及光强对应的数据用MATLAB软件(用于科学研究与工程应用分析和设计的商业化算术运算软件)进行分析处理，获取相对应的R及R0值。所有的光谱图和折线图均通过Prism 8.0软件制作完成。
如图2和3所示，融合蛋白mScarlet+DT+S4+LRP+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是DT和LRP)响应不同浓度的安赛蜜、乳糖和三氯蔗糖，当安赛蜜的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为10.07％；当乳糖的浓度为20mM时，△FRET比率值最大，为8.83％；当三氯蔗糖的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为14.88％。
如图4和5所示，融合蛋白mScarlet+QE+S4+AAL+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S4序列，膜外域两端的连接域是QE和AAL)响应不同浓度的安赛蜜、葡萄糖和蔗糖。当安赛蜜的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为17.98％；当葡萄糖的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为14.40％；当蔗糖的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为15.17％。
如图6和7所示，融合蛋白mScarlet+DE+S11+GHR+cpGFP(截短的人甜味受体T1R2膜外域S11序列，膜外域两端的连接域是DE和GHR)响应不同浓度三氯蔗糖的折线图。当三氯蔗糖的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为19.38％。
如图8和9所示，融合蛋白mScarlet+DS+S12+PLD+cpGFP(截短的人甜味受体T1R3膜外域S12序列，膜外域两端的连接域是DS和PLD时)响应不同浓度纽甜和三氯蔗糖的折线图。当纽甜的浓度为5mM时，△FRET比率值最大，为7.85％；当三氯蔗糖的浓度为100mM时，△FRET比率值最大，为13.94％。
如图10和11所示，融合蛋白mScarlet+EE+S4+YSI+cpGFP与不同浓度三氯蔗糖、蔗糖和葡萄糖几乎不响应。
Claims (5)
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ NO：6、7、8或9所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中的SEQ NO：10、11、12或13所示。
3.一种重组表达载体，其含有编码权利要求1-2中任一项所述融合蛋白的核苷酸序列。
4.一种重组菌株，其含有权利要求3所述的重组表达载体。
5.权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白作为用于定性检测甜味物质的生物传感器的用途。
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