CN109576298A - 利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法。本方法既提高了非天然氨基酸引入蛋白的效率，同时提高了含非天然氨基酸的全长融合蛋白的产量，其具体实验过程如下：将表达目的蛋白的质粒首先在大肠杆菌细胞中扩增，随后提取质粒并进行定点突变，得到突变的重组质粒，接下来将突变的重组质粒与辅助质粒一起转化到大肠杆菌感受态细胞中，最后通过向含非天然氨基酸的培养基中加入不同浓度和种类的透性化试剂来提高非天然氨基酸引入蛋白的效率。

Description

利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法
技术领域
本发明属于蛋白质化学领域，涉及一种利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法。
背景技术
生物体通过蛋白质执行多种复杂的生命活动，比如信号传导,神经传递等等，它们几乎参与了所有的生命过程。众所周知，生物体内所有蛋白质都是由三联密码子编码的20种天然氨基酸所组成的，这些天然的氨基酸携带有一些种类有限的基团如巯基、羧基、氨基和芳香基等；由于目前的蛋白质修饰方法大都依赖于天然氨基酸的仅有的功能基团,因此很容易形成标记蛋白质的异质混合物。随着遗传密码扩展技术的出现和发展，在体内利用琥珀终止密码子和正交的tRNA/氨酰合成酶将带有特定功能基团的非天然氨基酸位点特异性的掺入蛋白质，已成为蛋白质修饰的有力工具,通过这一技术已经将携带叠氮、炔基、醛基、磷酸基等多种功能基团的非天然氨基酸成功的引入蛋白质中，实现了对目标蛋白的定点标记，便于人们更好的研究蛋白质。
尽管遗传密码子扩展技术在蛋白间相互作用、蛋白质结构和功能等多个领域获得了广泛的应用前景，但由于非天然氨基酸进入细胞的传质阻力以及释放因子的竞争性结合琥珀终止密码子导致引入效率较低，从而使得全长蛋白质产率大大下降，这极大限制了这项技术在生产中的应用。为了解决非天然氨基酸插入效率低的问题,提高非天然氨基酸的插入效率,实现其在细胞内高效引入,本发明提供了一种利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法。细胞透性化处理法在蛋白表达特别是微生物发酵中被广泛应用，但其在非天然氨基酸表达系统中的应用未见报道，它可以在不破坏细胞有机整体结构的情况下改善细胞被膜的通透性(减小细胞膜的传质阻力)，使得小分子物质和一些较大分子物质能够自由进出细胞，从而提高细胞催化效率。
发明内容
在现有技术方法的基础上，本发明的目的在于提供一种利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
通过将表达目的蛋白的质粒进行定点突变，得到突变的重组质粒，随后将突变的重组质粒与辅助质粒一起转化到大肠杆菌表达细胞中，接下来通过在含非天然氨基酸的培养基中添加不同浓度和种类的透性化试剂来增加细胞膜通透性进而间接提高非天然氨基酸引入蛋白的效率。本方案在保持细胞活性的同时，提高了非天然氨基酸引入蛋白的效率，使获得高产量全长的融合蛋白成为可能，同时大大降低了生产成本。
本方案主要包括如下步骤：
步骤一、含有蛋白编码序列的质粒转化进入大肠细菌感受态细胞进行扩增；
步骤二、提取含有蛋白编码序列的质粒，并进行检验；
步骤三、将质粒上蛋白编码序列中的选定位点突变为琥珀无义密码子，得到突变质粒；
步骤四、将突变质粒与辅助质粒共转化到大肠杆菌感受态细胞中；
步骤五、在非天然氨基酸存在下，通过加入细胞透性化试剂对突变质粒的表达进行优化，以提高非天然氨基酸引入融合蛋白的效率；
步骤六、通过荧光或质谱鉴定非天然氨基酸的是否引入蛋白中。
进一步的改进，所述步骤五中，透性化试剂包括异丙醇、甘油和二甲基亚砜
附图说明
图1是本发明的实验流程图；
图2是本发明优选实例的质粒图谱；(A)是pGEX-6p-1-PHD3-Bromo质粒图谱，其中编码PHD3-Bromo的基因片段通过BamHI和XhoI限制性内切酶位点构建到载体GEX-6P-1，融合蛋白表达后其N端含有GST标签同时C末端又含有6His标签；位于蛋白C端的GST标签可通过HRV3C酶切除去；该质粒含有氨苄抗性。(B)是辅助质粒pEvol-AzF图谱,它包含有两个相同的氨酰tRNA合成酶基因，其中一个基因可被L(+)-arabinose诱导表达，另一个基因和编码tRNA的基因一样是组成性表达，该质粒含有氯霉素抗性基因。
图3是本发明优选实例的pGEX-6p-1-PHD3-Bromo质粒鉴定结果图；泳道1：DL15000DNA marker；泳道2：未用限制性内切酶消化的质粒；泳道3：用BamHI和XhoI消化的质粒；箭头指示的是PHD3-Bromo基因片段。
图4是本发明优选实例的定点突变质粒GEX-6p-1-PHD3-BromoA1650AzF和pEvol-Az共转化BL21(DE3)细胞的的结果图；(A)质粒定点突变的PCR结果；泳道1：DL 15000DNAmarker；泳道2：编码PHD3-Bromo蛋白的基因，(B)GEX-6p-1-PHD3-BromoA1650AzF和辅助质粒pEvol-Az共转化BL21(DE3)后菌落PCR鉴定结果；泳道1：Trans 2k plus II DNA marker；泳道2：编码PHD3-Bromo蛋白的基因，其长度为699bp；泳道3：编码组成性氨酰tRNA合成酶基因。泳道4：编码诱导性氨酰tRNA合成酶基因，长度约为1189bp。
图5是本发明优选实例的透性化试剂处理后非天然氨基酸引入蛋白PHD3-Bromo中的表达水平检测；箭头代表引入非天然氨基酸的融合蛋白，引入效率越高，最终得到的全长的融合蛋白含量越高，值得注意的是，在每一泳道中的上样量是相等的。(A)不同浓度的异丙醇处理对PHD3-BromoA1650AzF表达水平的影响；(B)不同浓度的二甲基亚砜处理对PHD3-BromoA1650AzF表达水平的影响；(C)不同浓度的甘油处理对PHD3-BromoA1650AzF表达水平的影响；(D)蛋白免疫印迹检测相同浓度的不同透性化试剂处理对PHD3-Bromo中的表达水平的影响；(E)Image J对(D)图条带进行相对蛋白含量分析；在定量分析时，以(D)图中泳道1的条带灰度为参照，灰度值越大，全长的融合蛋白含量越高，非天然氨基酸引入效率越高。
图6本发明优选实例的非天然氨基酸引入蛋白PHD3-Bromo中的鉴定结果。左图是聚丙烯酰胺凝胶荧光图，箭头代表引入非天然氨基酸的蛋白与DBCO标记的Cy3荧光分子通过点击化学反应形成的共价连接产物，右图是将左图凝胶考马斯亮蓝染色后的图像，箭头指示含非天然氨基酸的蛋白与Cy3荧光分子的连接物。
具体实施方式：
本方法涉及一种利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法，这种方法在保持细胞活性的同时提高了非天然氨基酸引入蛋白的效率，使获得大量含非天然氨基酸的融合蛋白成为可能，同时大大降低了成本。
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
优选的实例：
质粒和菌株：
质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo来自于北京师范大学；辅助质粒pEvol-AzF购自Addgene；大肠杆菌感受态细胞DH5a和BL21(DE3)购自北京全式金公司。
培养基及试剂：
LB培养基、DBCO-Cy3购自北京达科为生物技术有限公司、非天然氨基酸4-叠氮-苯丙氨酸(AzF)购自MedChemExpress公司，Anti-6X His tag抗体购自Abcam公司，HRP山羊抗兔二抗购自中山金桥公司，Omega质粒提取试剂盒购自北京鸿跃科技有限公司、定点突变试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。
仪器：
恒温摇床，垂直电泳系统，水平电泳系统，高速冷冻离心机，金属浴，全能成像仪
主要步骤包括：重组质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5a进行扩增，提取扩增的质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo进行酶切鉴定，随后对重组质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo进行定点突变(突变位点位于第1650位的丙氨酸上)，定点突变后的质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo经测序鉴定后与辅助质粒pEvol-AzF共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经菌落PCR鉴定后筛选阳性克隆，最后在非天然氨基酸存在下，通过向培养基加入透性化试剂来促进非天然俺高校引入蛋白中。
第一步：通过热激法将重组质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5a。具体操作如下：取50-100ng质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo加入到含DH5a感受态细胞的离心管中，冰上放置30分钟，随后在42℃下热激90秒后立即取出放于冰上2分钟，最后向离心管中加入500μl LB液体培养基。将离心管置于摇床中37℃、220rpm转速下培养1小时左右。培养完毕，取200μl培养物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，将平板置于37℃条件下倒置培养12-16h后可见单个的菌落。
第二步：提取质粒pGEX-6p-1-PHD3-Bromo并进行酶切鉴定。具体操作如下：从第一步中的平板上挑取单菌落于5ml LB液体培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素)中，220rpm，37℃培养过夜，此时可得到浑浊的菌液；随后使用Omega质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒PGEX-6p-1-PHD3-Bromo，提取方法见质粒提取试剂盒说明书；提取的质粒用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切，酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
第三步：质粒PGEX-6p-1-PHD3-Bromo定点突变是通过翊圣点突变试剂盒完成的；本实施例中使用一对定点突变引物，将MLL1PHD3-Bromo第1650为的丙氨酸(简写为A)的密码子突变为琥珀无义密码子(TAG)，突变后的的质粒简写为PGEX-6p-1-PHD3-BromoA1650AzF，通过转化到DH5a进行质粒扩增。
第四步：通过热激法将定点突变的重组质粒PGEX-6p-1-PHD3-BromoA1650AzF和pEvol-AzF共转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，具体操作如下：各取50-100ng定点突变质粒pGEX-6p-1-PHD3-BromoA1650AzF和质粒pEvol-AzF加入到含BL21(DE3)感受态细胞的离心管中，冰上放置30分钟，随后在42℃下热激90s后立即取出放于冰上2分钟，最后向离心管中加入500ml LB液体培养基。将离心管置于摇床中37℃、220rpm转速下培养大约1小时。培养完毕，取200ml培养物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的LB固体平板上，将平板置于37℃条件下倒置培养12-16小时后可见单个的菌落。
挑取单菌落，接入5ml含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm转速下培养过夜，随后用PCR鉴定质粒共转化是否成功。
第五步：通过透性化试剂添加优化含非天然氨基酸蛋白PHD3-BromoA1650AzF的表达。具体操作如下：将第四步中PCR鉴定为阳性的单克隆菌液接种于3ml新鲜的LB液体培养基(已含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素)中，37℃，220rpmn条件下培养至OD600为0.6-0.8之间时，首先加入IPTG、Arabinose、AzF和ZnCI2(ZnCI2作用是提供蛋白PHD3-Bromo折叠所需要的锌离子)，随后加入不同的透性化试剂(见下表)以优化非天然氨基酸蛋白的表达，随后培养物继续在在25℃，220rpm条件下继续培养12小时，培养结束后，分别从每一试管中取相同体积的样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹检测含非天然氨基酸蛋白的表达水平。值得注意的是，在本实施例中为了减少实验误差，每一个测试条件重复了3次实验。
第六步：通过荧光或质谱鉴定非天然氨基酸是否引入蛋白中。具体操作如下：含非天然氨基酸的融合蛋白表达后，在其N端含有GST标签，C端含有6His标签，分子量约为55kD；在进行鉴定之前，首先通过镍柱分离融合蛋白，接着使用超滤管更换蛋白缓冲液为PBS，随后将蛋白与GST柱结合，最后使用HRV 3C蛋白酶柱上消化以去除GST标签，不含GST标签的蛋白分子量约为28kD。切除GST标签的蛋白与DBCO标记的Cy3荧光分子混合室温反应1小时，则引入非天然氨基酸的蛋白将被荧光分子标记，通过点击化学反应共价连接，从而直接通过荧光检测目的蛋白条带，然而，未成功引入非天然氨基酸的蛋白将不能通过点击化学被荧光分子Cy3标记，从而观察不到带有荧光的目的蛋白条带。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、含有蛋白编码序列的质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5a进行扩增；
步骤二、提取含有蛋白编码序列的质粒，并进行鉴定；
步骤三、对质粒上蛋白编码序列中的特定位点进行定点突变，得到突变质粒；
步骤四、将突变质粒与辅助质粒共转化到大肠杆菌感受态细胞中；
步骤五、在非天然氨基酸存在下，通过加入透性化试剂对突变质粒的表达进行优化，以提高非天然氨基酸引入融合蛋白的效率；
步骤六、通过荧光或者质谱鉴定非天然氨基酸的是否引入蛋白中。
2.如权利要求1所述的利用细胞透性化处理提高非天然氨基酸引入蛋白效率的方法，其特征在于，所述步骤五中，透性化试剂包括异丙醇、甘油和二甲基亚砜。
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CN112375774A (zh) * 2020-10-26 2021-02-19 浙江新码生物医药有限公司 一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法
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