ES2338497T3 - Receptores gustativos t1r1 y genes que codifican los mismos. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor gustativo T1R1 que tiene al menos una identidad de secuencia del 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con el polipéptido contenido en la SEC ID Nº: 17.
Description
Receptores gustativos T1R1 y genes que codifican
los mismos.
La invención se refiere a receptores
quimiosensoriales de mamíferos recientemente identificados acoplados
a proteínas G, a la familia de dichos receptores y a los genes y
ADNc que codifica dichos receptores. Más particularmente, la
invención se refiere a receptores quimiosensoriales de mamíferos
recientemente identificados acoplados a proteínas G activos en la
señalización del gusto, a una familia de dichos receptores, a los
genes y ADNc que codifica dichos receptores y a métodos de uso de
dichos receptores, genes y ADNc en el análisis y descubrimiento de
moduladores gustativos.
El sistema gustativo proporciona información
sensorial acerca de la composición química del mundo exterior. La
transducción gustativa es una de las formas más sofisticadas de
sensación activada por productos químicos en los animales. Hasta
ahora, los medios mediante los cuales se producen las sensaciones
gustativas continúan sin entenderse bien. Véase, por ejemplo,
Margolskee, BioEssays, 15: 645-50 (1993);
Avenet et al., J. Membrane Biol.,
112:1-8 (1989). La señalización gustativa se
encuentra en todo el reino animal, desde los simples metazoos a los
vertebrados más complejos. Se cree que en la sensación gustativa
participan distintas rutas de señalización. Se cree que los
receptores median estas rutas, es decir, receptores metabotrópicos o
ionotrópicos. Las células que expresan receptores gustativos,
cuando se exponen a determinados estímulos químicos, producen la
sensación gustativa mediante despolarización para generar un
potencial de acción, que se piensa que desencadena la sensación. Se
piensa que este hecho desencadena la liberación de neurotransmisores
en la sinapsis neuronal aferente gustativa, iniciando de esta
manera la señalización a través de las rutas neuronales que median
la percepción gustativa. Véase, por ejemplo, Roper, Ann. Rev.
Neurosci., 12: 329-53 (1989).
Así pues, los receptores gustativos reconocen
específicamente moléculas que provocan la sensación específica
gustativa. Estas moléculas también se denominan en este documento
"sustancias gustativas". Muchos receptores gustativos
pertenecen a la superfamilia de receptores de 7 dominios
transmembrana (Hoon et al., Cell 96: 451 (1999);
Adler et al., Cell 100: 693 (2000)), también conocidos
como receptores acoplados a proteína G (GPCR). Se piensa que las
proteínas de canal median otros gustos. Los receptores acoplados a
proteína G controlan muchas funciones fisiológicas, tales como la
función endocrina, la función exocrina, la frecuencia cardiaca, la
lipólisis, el metabolismo de hidratos de carbono y la señalización
transmembrana. El análisis bioquímico y la clonación molecular de
varios de dichos receptores han revelado muchos principios básicos
con respecto a la función de estos receptores.
Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.691.188 describe cómo tras la unión del GPCR a un ligando,
presumiblemente el receptor experimenta un cambio conformacional lo
que conduce a la activación de la proteína G. Las proteínas G están
formadas por tres subunidades: una subunidad \alpha unida a un
nucleótido guanilo, una subunidad \beta y una subunidad \gamma.
Las proteínas G alternan entre dos formas, dependiendo de si en la
subunidad \alpha está unido GDP o GTP. Cuando está unido el GDP,
la proteína G existe como un heterotrímero: el complejo
G\alpha\beta\gamma. Cuando está unido el GTP, la subunidad a
se disocia del heterotrímero, dando un complejo G\beta\gamma.
Cuando un complejo G\alpha\beta\gamma se asocia operativamente
con un receptor activado acoplado a proteína G en una membrana
celular, la velocidad de intercambio del GTP para unirse al GDP
aumenta y la velocidad de disociación del enlace de la subunidad
G\alpha del complejo G\alpha\beta\gamma aumenta. La
subunidad G\alpha libre y el complejo G\beta\gamma son por
tanto capaces de transmitir una señal a elementos aguas abajo de
una diversidad de rutas de transducción de señal. Estos
acontecimientos constituyen la base de una multiplicidad de
fenómenos de diferente señalización celular, que incluyen por
ejemplo, el fenómeno de señalización que se identifica como
percepciones sensoriales neurológicas tales como el gusto y/o el
olfato.
Se piensa que los mamíferos tienen cinco
modalidades gustativas básicas: dulce, amargo, ácido, salado y umami
(el sabor del glutamato monosódico). Véase, por ejemplo, Kawamura
et al., Introduction to Umami: A Basic Taste (1987);
Kinnamon et al., Ann. Rev. Physiol., 54:
715-31 (1992); Lindemann, Physiol. Rev., 76:
718-66 (1996); Stewart et al., Am. J.
Physiol., 272: 1-26 (1997). Numerosos estudios
fisiológicos en animales han demostrado que las células receptoras
gustativas pueden responder de manera selectiva a diferentes
estímulos químicos. Véase, por ejemplo, Akabas et al.,
Science, 242: 1047-50 (1988); Gilbertson
et al., J. Gen. Physiol., 100: 803-24
(1992); Bernhardt et al., J. Physiol., 490:
325-36 (1996); Cummings et al., J.
Neurophysiol., 75: 1256-63 (1996).
En mamíferos, las células receptoras gustativas
se agrupan en botones gustativos que están distribuidos en
diferentes papilas en el epitelio de la lengua. Las papilas
circunvaladas, localizadas en la parte más posterior de la lengua,
contienen de cientos a miles de botones gustativos. A diferencia,
las papilas foliadas, localizadas en el borde lateral posterior de
la lengua, contienen de decenas a cientos de botones gustativos.
Adicionalmente, las papilas fungiformes, localizadas en la parte
delantera de la lengua, contienen únicamente un solo o algunos
botones gustativos.
Cada botón gustativo, dependiendo de la especie,
contiene de 50-150 células, incluyendo células
precursoras, células de soporte y células receptoras gustativas.
Véase, por ejemplo, Lindemann, Pysiol. Rev., 76:
718-66 (1996). Las células receptoras se enervan en
su base por terminaciones nerviosas aferentes que transmiten
información a los centros gustativos del córtex a través de la
sinapsis en el tronco cerebral y el tálamo. Para comprender la
función, regulación y percepción del sentido del gusto, es
importante aclarar los mecanismos de señalización de las células
gustativas y el procesamiento de la información.
Aunque se sabe mucho sobre la psicofísica y la
fisiología de la función de las células gustativas, se sabe muy
poco sobre las moléculas y las rutas que median su respuesta de
señalización sensorial. La identificación y el aislamiento de
nuevos receptores gustativos y de moléculas señalizadoras gustativas
podrían permitir nuevos métodos de modulación química y genética de
las rutas de transducción gustativa. Por ejemplo, la disponibilidad
de moléculas receptoras y de canal podría permitir la identificación
de agonistas, antagonistas, agonistas inversos y moduladores de
actividad gustativa de elevada afinidad. Dichos componentes de
modulación gustativa podrían ser útiles en la industria
farmacéutica y alimentaria para mejorar el gusto de una diversidad
de productos de consumo o para bloquear gustos indeseables, por
ejemplo, en determinados compuestos farmacéuticos.
Actualmente se conocen las secuencias completas
o parciales de numerosos receptores quimiosensoriales en seres
humanos y otros eucariotas. Véase, por ejemplo, Pilpel, Y. y Lancet,
D., Protein Science, 8: 969-977 (1999);
Mombaerts, P., Annu, Rev. Neurosci., 22: 487.50 (1999).
Véanse también, los documentos EPO867508A2, US 5874243, WO 92/17585,
WO 95/18140, WO 97/17444, WO 99/67282. Debido a la complejidad de
las interacciones receptor-ligando, y más
particularmente de las interacciones
receptor-sustancia gustativa, existe una carencia de
información sobre el reconocimiento
ligando-receptor. En parte, la presente invención
aborda la necesidad de entender mejor las interacciones entre los
receptores quimiosensoriales y los estímulos químicos. La presente
invención también proporciona, entre otras cosas, nuevos receptores
quimiosensoriales y métodos para utilizar dichos receptores, y los
genes y los ADNc que codifican dichos receptores, para identificar
moléculas que puedan usarse para modular la transducción
quimiosensorial, tal como la sensación gustativa.
La invención se refiere a una nueva familia de
receptores acoplados a proteína G, y a los genes y a los ADNc que
codifican dichos receptores. Se piensa que los receptores
intervienen principalmente en la transducción del gusto dulce, pero
también pueden intervenir en las señales de transducción de otras
modalidades gustativas.
La invención proporciona una secuencia aislada
de ácido nucleico que codifica un polipéptido receptor gustativo
T1R1 que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos el
90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el
98% o al menos el 99% con el polipéptido contenido en la SEC ID Nº:
17.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un polipéptido T1R1 codificado por la secuencia aislada
de ácido nucleico de la invención.
Además, la presente invención proporciona un
ensayo para identificar un compuesto que modula la transducción
gustativa que comprende: (i) poner en contacto un polipéptido T1R1
de acuerdo con la invención con un supuesto modulador gustativo; y
(ii) detectar si dicho compuesto se une específicamente a dicho
polipéptido T1R1.
Se proporcionan métodos para representar la
percepción del gusto y/o para predecir la percepción del gusto en
un mamífero, incluyendo un ser humano. Preferiblemente, dichos
métodos pueden realizarse usando los receptores y genes que
codifican a dichos receptores descritos en este documento.
Otro objeto de la descripción es proporcionar
una nueva familia de receptores acoplados a proteína G en mamíferos,
en este documento denominados como T1R, activos en la percepción
gustativa. Otro objeto de la invención es proporcionar fragmentos y
variantes de dichos T1R que conservan actividad de unión a
sustancias gustativas.
Otro objeto de la descripción es proporcionar
secuencias de ácido nucleico o moléculas que codifican dichos T1R,
fragmentos o variantes de los mismos.
Otro objeto más de la descripción proporcionar
vectores de expresión que incluyen secuencias de ácidos nucleicos
que codifican dichos T1R, o fragmentos o variantes de los mismos,
que están unidos operativamente a al menos una secuencia reguladora
tal como un promotor, potenciador u otra secuencia implicada en la
transcripción y/o traducción génica positiva o negativa.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar células humanas o no humanas que expresen
funcionalmente al menos uno de dichos T1R, o fragmentos o variantes
de los mismos.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar proteínas o polipéptidos de fusión a T1R que incluyan
al menos un fragmento de al menos uno de dichos T1R.
Otro objeto de la descripción es proporcionar
una molécula aislada de ácido nucleico que codifique un polipéptido
de T1R que comprenda una secuencia de ácido nucleico que sea
idéntica al menos el 50%, preferiblemente el 75%, 85%, 90%, 95%,
96%, 97%, 98% o el 99% a una secuencia de ácido nucleico
seleccionada del grupo que consiste en: las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 9,
11, 13, 15, 16, 20 y variantes de las mismas modificadas de manera
conservativa.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar una molécula aislada de ácido nucleico que comprenda
una secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido que
tenga una secuencia de aminoácidos idéntica al menos del 35 al 50%
y preferiblemente al 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste
en: las SEC ID Nº: 4, 10, 12, 14, 17 y variantes de las mismas
modificadas de manera conservativa, en la que el fragmento tiene al
menos una longitud de 20, preferiblemente 40, 60, 80, 100, 150, 200
ó 250 aminoácidos. Opcionalmente, el fragmento puede ser un
fragmento antigénico que se une a un anticuerpo
anti-T1R.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar un polipéptido aislado que comprenda una variante de
dicho fragmento, en la que exista una variación de al menos 10,
preferiblemente 5, 4, 3, 2 ó 1 resto aminoacídico.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar agonistas o antagonistas de dichos T1R o fragmentos o
variantes de los mismos.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar métodos para representar la percepción del gusto y/o
para predecir la percepción del gusto en un mamífero, incluyendo un
ser humano. Preferiblemente, dichos métodos pueden realizarse
mediante el uso de los T1R, o fragmentos o variantes de los mismos y
los genes que codifican dichos T1R, o fragmentos o variantes de los
mismos, descritos en este documento.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar nuevas moléculas o combinaciones de moléculas que
provoquen una percepción gustativa predeterminada en un mamífero.
Dichas moléculas o composiciones pueden generarse determinando un
valor de percepción gustativa en un mamífero para una molécula o
combinaciones de moléculas conocidas; determinando un valor de
percepción gustativa en un mamífero para una o más moléculas o
combinaciones de moléculas desconocidas; comparando el valor de la
percepción gustativa en un mamífero para una o más composiciones
desconocidas con respecto al valor de la percepción gustativa en un
mamífero para una o más composiciones conocidas; seleccionando una
molécula o combinación de moléculas que provoquen una percepción
gustativa predeterminada en un mamífero; y combinando dos o más
moléculas o combinaciones de moléculas desconocidas para formar una
molécula o combinación de moléculas que provoquen una percepción
gustativa predeterminada en un mamífero. La etapa de combinación
produce una sola molécula o una combinación de moléculas que
provocan una percepción gustativa predeterminada en un
mamífero.
Es aún otro objeto de la descripción
proporcionar un método de identificación de uno o más compuestos
para determinar la presencia de un gusto detectable por un
mamífero, que comprenda: una etapa de poner en contacto dicho uno o
más compuestos con al menos uno de los T1R fragmentos o variantes de
los mismos descritos en este documento, en el que preferiblemente
el mamífero sea un ser humano.
Es otro objeto de la descripción proporcionar un
método para estimular un gusto, que comprenda las etapas de: para
cada uno de una pluralidad de los T1R, o fragmentos o variantes de
los mismos descritos en este documento, preferiblemente los T1R de
seres humanos, determinar el grado en el que el T1R interacciona con
la sustancia gustativa; y combinar una pluralidad de compuestos,
teniendo cada uno una interacción previamente determinada con uno o
más de los T1R, en cantidades que juntos proporcionen un perfil de
estimulación del receptor que mimetice el perfil para el gusto. La
interacción de una sustancia gustativa con un T1R puede determinarse
usando cualquiera de los ensayos de unión o indicadores descritos
en este documento. La pluralidad de compuestos puede después
combinarse para formar una mezcla. Si se desea, uno o más de la
pluralidad de los compuestos puede combinarse de manera covalente.
Los compuestos combinados estimulan sustancialmente a todos, o al
menos al 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o al 90%, los receptores que
estimula sustancialmente la sustancia gustativa.
En otro aspecto más se proporciona un método en
el que se ensaya una pluralidad de compuestos convencionales frente
a una pluralidad de los T1R, o fragmentos o variantes de los mismos,
para determinar el grado en el que interacciona cada uno de los T1R
con cada compuesto convencional, generando de esta manera un perfil
de estimulación del receptor para cada compuesto convencional.
Estos perfiles de estimulación del receptor pueden almacenarse en
una base de datos relacional o en un medio de almacenamiento de
datos. El método puede comprender adicionalmente proporcionar un
perfil de estimulación del receptor deseado para un gusto; comparar
el perfil de estimulación del receptor deseado con la base de datos
relacional; y determinar una o más combinaciones de compuestos
convencionales que más se ajusten al perfil de estimulación del
receptor deseado. El método puede comprender adicionalmente
combinar compuestos convencionales en una o más de las combinaciones
determinadas para estimular el gusto.
Es otro objeto de la descripción proporcionar un
método para representar la percepción gustativa de una sustancia
gustativa particular en un mamífero, que comprende las etapas de:
proporcionar valores X_{1} a X_{n} representativos de la
estimulación cuantitativa de cada uno de los n T1R de dicho
vertebrado, en el que n es superior o igual a 2; y generar a
partir de dichos valores una representación cuantitativa de la
percepción gustativa. Los T1R pueden ser en un receptor gustativo
descrito en este documento o fragmentos o variantes de los mismos,
la representación puede constituir un punto o un volumen en el
espacio n dimensional, puede constituir un gráfico o un
espectro y puede constituir una matriz o representaciones
cuantitativas. Además, la etapa de proporcionar puede comprender
poner en contacto una pluralidad de los T1R o fragmentos o variantes
de los mismos producidos de manera recombinante, con una
composición del ensayo y medir cuantitativamente la interacción de
dicha composición con dichos
receptores.
receptores.
Otro objeto más de la descripción es
proporcionar un método para predecir la percepción gustativa en un
mamífero generada por una o más moléculas o combinaciones de
moléculas que producen la percepción gustativa desconocida en un
mamífero, que comprende las etapas de: proporcionar valores X_{1}
a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de cada
uno de los n T1R de dicho vertebrado, en el que n es
superior o igual a 1; para una o más moléculas o combinaciones de
moléculas que producen la percepción gustativa conocida en un
mamífero, y generar a partir de dichos valores una representación
cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para una o
más moléculas o combinaciones de moléculas que producen la
percepción gustativa conocida en un mamífero, proporcionar valores
X_{1} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa
para cada uno de los n T1R de dicho vertebrado, en el que
n es superior o igual a 2; para una o más moléculas o
combinaciones de moléculas que producen la percepción gustativa
desconocida en un mamífero; y generar a partir de dichos valores
una representación cuantitativa de la percepción gustativa en un
mamífero para una o más moléculas o combinaciones de moléculas que
producen la percepción gustativa desconocida en un mamífero y
predecir la percepción gustativa en un mamífero generada por una o
más moléculas o combinaciones de moléculas que producen la
percepción gustativa desconocida en un mamífero comparando la
representación cuantitativa de la percepción gustativa en un
mamífero para una o más moléculas o combinaciones de moléculas que
producen la percepción gustativa desconocida en un mamífero con
respecto a la representación cuantitativa de la percepción
gustativa en un mamífero para una o más moléculas o combinaciones de
moléculas que produce la percepción gustativa desconocida en un
mamífero. Los T1R usados en este método pueden incluir un receptor
gustativo o fragmento o variante del mismo, descrito en este
documento.
La Figura 1 es una criosección de lengua
congelada de ratones que muestra la expresión del gen T1R3 en los
botones gustativos de las papilas circunvaladas de ratones por
hibridación in situ. Las células receptoras gustativas
seleccionadas que expresan T1R3 se marcan con flechas.
La descripción proporciona de esta manera
moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican receptores
acoplados a proteínas G ("GPCR") específicos de células
gustativas y los polipéptidos que codifican. Estas moléculas de
ácido nucleico y los polipéptidos que codifican son miembros de la
familia T1R de los GPCR específicos de células gustativas. Los
miembros de la familia T1R de los GPCR específicos de células
gustativas se identifican en Hoon et al., Cell, 96:
541-551 (1999), y en los documentos WO 00/06592 y WO
00/06593.
Más particularmente, la descripción proporciona
ácidos nucleicos que codifican una nueva familia de GPCR específicos
de células gustativas. Estos ácidos nucleicos y los receptores que
codifican se denominan como miembros de la familia "T1R" de
los GPCR específicos de células gustativas. En realizaciones
particulares, los miembros de la familia T1R incluyen rT1R3, mT1R3,
hT1R3 y hT1R1. Aunque sin desear ceñirse a una teoría, se cree que
estos GPCR específicos de células gustativas son componentes de la
ruta de transducción gustativa y pueden participar en la detección
gustativa de sustancias dulces y/u otras modalidades gustativas.
Además, se cree que los miembros de la familia
T1R pueden actuar en combinación con otros miembros de la familia
T1R, con otros GPCR específicos de células gustativas o con una
combinación de los mismos, para efectuar de esta manera la
transducción gustativa quimiosensorial. Por ejemplo, se cree que
T1R1 y T1R3 pueden coexpresarse dentro del mismo tipo celular
receptor gustativo y los dos receptores pueden interaccionar
físicamente para formar un receptor gustativo heterodimérico. Como
alternativa, T1R1 y T1R3 pueden unirse independientemente al mismo
tipo de ligando y su unión combinada puede dar lugar a una sensación
gustativa específica percibida.
Estos ácidos nucleicos proporcionan sondas
valiosas para la identificación de células gustativas, ya que los
ácidos nucleicos se expresan específicamente en las células
gustativas. Por ejemplo, pueden usarse sondas para polipéptidos y
proteínas T1R para identificar células gustativas presentes en las
papilas foliadas, circunvaladas y fusiformes, así como células
gustativas presentes en la geschmackstreifen (franja del sabor), en
la cavidad oral, el epitelio gastrointestinal y en la epiglotis.
Pueden servir como herramientas para la generación de mapas
topográficos gustativos que aclaren la relación entre las células
gustativas de la lengua y las neuronas sensoriales gustativas que
conducen a los centros gustativos en el cerebro. En particular,
pueden usarse métodos de detección de los T1R para identificar
células gustativas sensibles a sustancias gustativas dulces u otras
modalidades específicas de sustancias gustativas. Además, los ácidos
nucleicos y las proteínas que codifican pueden usarse como sondas
para analizar comportamientos inducidos por el gusto. También, puede
usarse la locación cromosómica de los genes que codifican los T1R
humanos para identificar enfermedades, mutaciones y rasgos causados
por y asociados con los miembros de la familia de T1R.
Los ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos y las proteínas T1R de la invención pueden aislarse a
partir de una diversidad de fuentes, modificación genética,
amplificación, síntesis y/o expresión recombinante de acuerdo con
los métodos descritos en el documento WO 00/035374.
La invención también proporciona métodos de
selección para moduladores, por ejemplo, activadores, inhibidores,
estimuladores, potenciadores, agonistas y antagonistas de estos
nuevos GPCR específicos de células gustativas. Dichos moduladores
de la transducción gustativa son útiles para la modulación
farmacológica, química y genética de las rutas de señalización del
gusto. Estos métodos de selección pueden usarse para identificar
antagonistas y agonistas de afinidad elevada de la actividad
celular gustativa. Estos compuestos moduladores pueden usarse por
tanto en la industria alimentaria y farmacéutica para personalizar
el gusto, por ejemplo, para modular el gusto dulce de los alimentos
o fármacos.
Por tanto, la descripción proporciona ensayos
para detectar y caracterizar la modulación gustativa, donde los
miembros de la familia T1R actúan como moléculas indicadoras
directas o indirectas del efecto de moduladores en la transducción
gustativa. Los GCPR pueden usarse en ensayos para, por ejemplo,
medir cambios en la unión a ligando, concentración iónica,
potencial de membrana, flujo de corriente, flujo iónico,
transcripción, transducción de señal, interacciones receptor con
ligando, concentraciones del segundo mensajero, in vitro,
in vivo y ex vivo. En una realización, los miembros
de la familia de T1R pueden usarse como indicadores indirectos
mediante la unión a una segunda molécula informadora tal como una
proteína fluorescente verde (véase, por ejemplo, Mistili &
Spector, Nature Biotechnology, 15: 961-964
(1997)). En otra realización, los miembros de la familia T1R pueden
expresarse de manera recombinante en células y la modulación de la
transducción del gusto por medio de la actividad GPCR puede
ensayarse midiendo cambios en los niveles del Ca^{2+} y otros
mensajes intracelulares tales como AMPc, GMPc o IP3.
En determinadas realizaciones, un dominio de un
polipéptido T1R, por ejemplo, un dominio extracelular, transmembrana
o intracelular, se fusiona a un polipéptido heterólogo, formando de
esta manera un polipéptido quimérico, por ejemplo, un polipéptido
quimérico con actividad GPCR. Dichos polipéptidos quiméricos son
útiles en ensayos, por ejemplo, para identificar ligandos,
agonistas, antagonistas u otros moduladores de un polipéptido T1R.
Además, dichos polipéptidos quiméricos son útiles para crear nuevos
receptores gustativos con nueva especificidad de unión a ligando,
modos de regulación, rutas de transducción de señal u otras dichas
propiedades, o para crear nuevos receptores gustativos con nuevas
combinaciones de especificidad de unión a ligando, modos de
regulación, rutas de transducción de señal, etc.
En una realización, un polipéptido T1R se
expresa en una célula eucariota como un receptor quimérico con una
secuencia chaperona, heteróloga que facilita el tránsito de la
membrana plasmática o la maduración y dirección a través de la ruta
secretora. La secuencia heteróloga opcional puede ser una secuencia
de rodopsina, tal como un fragmento N-terminal de
una rodopsina. Dichos receptores T1R quiméricos pueden expresarse en
cualquier célula eucariota, tal como en las células
HEK-293. Preferiblemente, las células comprenden una
proteína G, por ejemplo G\alpha15 o G\alpha16 u otro tipo de
proteína G promiscua capaz de emparejarse con un amplio intervalo
de GPCR quimiosensoriales con una ruta de señalización intracelular
o con una proteína de señalización tal como una fosfolipasa C. La
activación de dichos receptores quiméricos en dichas células puede
detectarse usando cualquier método convencional, tal como
detectando cambios en el calcio intracelular detectando la
fluorescencia dependiente de FURA-2 en la célula. Si
las células hospedadoras preferidas no expresan una proteína G
apropiada, pueden transfectarse con un gen que codifique una
proteína G promiscua.
Los métodos de ensayo para moduladores de la
transducción gustativa incluyen ensayos de unión a ligando in
vitro usando: polipéptidos T1R, partes de los mismos, es decir,
el dominio extracelular, la región transmembrana o combinaciones de
estos, o proteínas quiméricas que comprenden uno o más dominios de
un miembro de la familia T1R; oocitos o células de cultivo tisular
que expresan polipéptidos T1R, fragmentos o proteínas de fusión;
fosforilación y desfosforilación de los miembros de la familia T1R;
unión de la proteína G a los GPCR; ensayos de unión a ligando;
cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; ensayos de
flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares
tales como GMPc, CAMP y trifosfato inositol (IP3); cambios en los
niveles de calcio intracelular y liberación neurotransmisora.
Además, la descripción proporciona métodos para
detectar la expresión de ácidos nucleicos y proteínas T1R, que
permiten la investigación de la regulación de la transducción
gustativa y la identificación específica de las células receptoras
gustativas. Los miembros de la familia T1R también proporcionan
sondas útiles de ácidos nucleicos para investigaciones forenses y
de paternidad. Los genes T1R también son útiles como sondas de
ácidos nucleicos para identificar células receptoras gustativas,
tales como células receptoras gustativas en las papilas foliadas,
fungiformes, circunvaladas, en la franja del sabor
(geschmackstreigen) y en la epiglotis. Los receptores T1R también
pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales y policlonales
útiles para la identificación de células receptoras gustativas. Las
células receptoras gustativas pueden identificarse usando técnicas
tales como transcripción inversa y amplificación de ARNm,
aislamiento de ARN total o poli A+ARN, transferencia de northern,
transferencia puntual, hibridación in situ, protección
ARNasa, digestión S1, sondeo por micro matriz del ADN,
transferencias de western y similares.
Funcionalmente, los polipéptidos T1R comprenden
una familia de receptores acoplados a proteínas G asociados a siete
dominios transmembrana, que se cree que participan en la
transducción gustativa y que pueden interaccionar con una proteína
G para mediar la transducción de la señal gustativa (véase, por
ejemplo, Fong. Cell Signal, 8: 217 (1996); Baldwin, Curr.
Opin. Cell Biol., 6: 180 (1994)). Estructuralmente, las
secuencias de nucleótidos de los miembros de la familia T1R pueden
codificar polipéptidos relacionados que comprenden un dominio
extracelular, siete dominios transmembrana y un dominio
citoplásmico. Los genes de la familia T1R relacionados de otras
especies comparten una identidad de secuencia de nucleótidos de al
menos aproximadamente el 50%, y opcionalmente el 60%, 70%, 80% o
90% a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50
nucleótidos de longitud, opcionalmente 100, 200, 500 o más
nucleótidos de longitud con las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 9, 11, 13, 15,
16, 20 o variantes de las mismas modificadas de manera
conservativa, o codifican polipéptidos que comparten una identidad
de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente del 35 al
50%, y opcionalmente el 60%, 70%, 80% o 90% a lo largo de una
región de aminoácidos de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de
longitud, opcionalmente de 50 a 100 aminoácidos de longitud con la
SEC ID Nº: 4, 10, 12, 14, 17 o variantes de las mismas modificadas
de manera conservativa.
También se han identificado varias secuencias
consenso de aminoácidos o dominios que son característicos de los
miembros de la familia T1R. Por ejemplo, los miembros de la familia
T1R comprenden típicamente una secuencia que tiene al menos
aproximadamente el 50%, opcionalmente el 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95-99% o superior, de identidad con
respecto a las secuencias consenso 1 y 2 de T1R (SEC ID Nº: 18 y 19,
respectivamente). Estos dominios conservados pueden usarse por
tanto para identificar miembros de la familia T1R, mediante
identidad, hibridación específica o amplificación o por anticuerpos
de unión específica provocados contra un dominio. Dichas secuencias
consenso de T1R tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:
Secuencia Consenso 1 de la Familia T1R 1: (SEC
ID Nº: 18)
- (TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia Consenso 2 de la Familia T1R 1: (SEC
ID Nº: 19)
- (LQ)P(EGT)(NCR)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)
\vskip1.000000\baselineskip
Estas secuencias consenso se incluyen en las
descubiertas en los polipéptidos T1R descritos en este documento,
pero puede esperarse que los miembros de la familia T1R de otros
organismos comprendan secuencias consenso que tengan
aproximadamente una identidad del 75% o más con respecto a las
secuencias consenso incluidas descritas específicamente en este
documento.
Para identificar variantes polimórficas,
homólogos interespecie y alelos de los miembros de la familia T1R
pueden usarse regiones específicas de las secuencias de nucleótidos
y de aminoácidos de T1R. Esta identificación puede realizarse in
vitro, por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas o
PCR (por ejemplo, usando cebadores que codifiquen las secuencias
consenso T1R identificadas anteriormente) o usando la información
de secuencia de un sistema informático para realizar la comparación
con otras secuencias de nucleótidos. Los alelos de genes T1R
diferentes en una población de especie única también será útil para
determinar si las diferencias en las secuencias alélicas se
correlacionan con respecto a las diferencias en la percepción
gustativa entre miembros de la población. La amplificación clásica
de tipo PCR y las técnicas de clonación son útiles para aislar
ortólogos, por ejemplo, cuando los cebadores degenerados son
suficientes para detectar genes relacionados a través de especies,
los cuales típicamente tienen un mayor nivel de identidad relativa
con respecto a los miembros parálogos de la familia T1R dentro de
una sola especie.
Por ejemplo, para amplificar y clonar genes T1R3
de genomas de diferentes mamíferos pueden usarse cebadores
degenerados SAP0077 (SEC ID Nº 5) SAP0079 (SEC ID Nº 6). A
diferencia, los genes de una sola especie que están relacionados
con T1R3 se identifican mejor usando un modelo de secuencia de
reconocimiento por ordenador para buscar secuencias relacionadas.
Típicamente, la identificación de variantes polimórficas y alelos de
los miembros de familia T1R puede realizarse comparando una
secuencia de aminoácidos de aproximadamente 25 aminoácidos o más,
por ejemplo, de 50-100 aminoácidos. La identidad de
aminoácidos de aproximadamente al menos del 35 al 50%, y
opcionalmente el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,
95-99% o superior demuestra típicamente que una
proteína es una variante polimórfica, un homólogo interespecie o un
alelo de un miembro de la familia T1R. La comparación de secuencias
puede realizarse usando cualquiera de los algoritmos de comparación
de secuencias descritos a continuación. Los anticuerpos que se unen
específicamente a polipéptidos T1R o a una región conservada de los
mismos pueden usarse para identificar alelos, homólogos interespecie
y variantes polimórficas.
Las variantes polimórficas, los homólogos
interespecie y los alelos de los genes T1R pueden confirmarse
examinando la expresión específica de la célula gustativa de un
supuesto polipéptido T1R. Típicamente, los polipéptidos T1R que
tienen una secuencia de aminoácidos descrita en este documento
pueden usarse como un control positivo en comparación con el
supuesto polipéptido T1R para demostrar la identificación de una
variante polimórfica o alelo del miembro de la familia T1R. Se
espera que las variantes polimórficas, alelos y homólogos
interespecie conserven la estructura de siete dominios
transmembrana de un receptor acoplado a proteína G. Para detalles
adicionales, véase el documento WO 00/06592, que describe miembros
de la familia de T1R relacionados, GPCR-B3s.
Los receptores GPCR-B3 se
denominan en este documento como rT1R1 y mT1R1. Adicionalmente,
véase el documento WO 00/06593 que también describe los miembros de
la familia T1R relacionados, GPCR-B4s.
Los receptores GPCR-B4 se
denominan en este documento como rT1R2 y mT1R2.
La información de la secuencia de aminoácidos y
de nucleótidos para los miembros de la familia T1R también puede
usarse para construir modelos de polipéptidos específicos de células
gustativas en un sistema informatizado. Estos modelos pueden usarse
posteriormente para identificar compuestos que pueden activar o
inhibir proteínas receptoras de T1R. Dichos compuestos que modulan
la actividad de los miembros de la familia T1R pueden usarse
después para investigar la función de los genes y receptores de T1R
en la transducción gustativa.
La presente invención también proporciona
ensayos, preferiblemente ensayos de alto rendimiento, para
identificar moléculas que interaccionan con y/o modulan un
polipéptido T1R. En numerosos ensayos, se usa un dominio particular
de un miembro de la familia T1R, por ejemplo, un dominio o región
extracelular, transmembrana o intracelular. En numerosas
realizaciones, un dominio extracelular, región transmembrana o
combinación de los mismos puede unirse a un sustrato sólido, y
usarse, por ejemplo, para aislar ligandos, agonistas, antagonistas,
o cualquier otra molécula que pueda unirse a y/o modular la
actividad de un polipéptido T1R.
En otro aspecto de la descripción, se
proporciona un nuevo gen GPCR humano de la familia T1R, denominado
hTIR3. El gen hT1R3 se identificó a partir de la base de datos de
la secuencia genómica humana incluyendo la división HTGS del
GenBank. En las SEC ID Nº: 1-4 se proporcionan los
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos traducida conceptualmente
para hT1R3. El receptor de hT1R3 se identificó en el clon genómico
BAC parcialmente secuenciado RP5-89003 (número de
acceso de la base de datos AL139287) debido a su similitud de
secuencia con el receptor gustativo candidato de rata rT1R1 (número
de acceso AF127389). Como referencia, la identidad por parejas entre
las secuencias de proteínas del predicho hT1R3 y rT1R1 es
aproximadamente del 34%. Las comparaciones de las secuencias con
miembros adicionales de la Familia C de GPCR (que incluye los
receptores sensibles a calcio, supuestos receptores de feromonas
V2R, receptores de GABA-B, receptores gustativos del
pescado y receptores de glutamato metabotrópicos) indican que
probablemente hT1R3 pertenece al subgrupo de la Familia C definido
por T1R1 y un segundo receptor gustativo candidato de rata (rT1R2,
número de acceso AF127390).
La invención proporciona el ortólogo humano,
denominado hT1R1, de un receptor gustativo de rata, denominado
rT1R1. Los productos génicos de rT1R1 y hT1R1 tienen una identidad
aproximada del 74%. Se ha descrito el gen de ratón, mT1R1 véase
Hoon et al., Cell, 96: 541-551 (2000)
y mapea en un intervalo cromosómico homólogo al intervalo que
contiene hT1R1. Las secuencias de nucleótidos y hT1R1 traducidas
conceptualmente se describen en este documento como las SEC ID Nº:
15 y 16, respectivamente.
Aunque sin desear ligarse a una teoría
particular, se supone que la familia de receptores T1R participa en
la transducción del gusto dulce debido al enlace de mT1R3 con el
locus Sac, un locus en el extremo distal del cromosoma
cuatro que influye en el gusto dulce. También se ha indicado que el
T1R3 humano se localiza en 1p36.2-1p36.33, una
región que presenta sintenia conservada con el intervalo de ratón
que contiene Sac y T1R1. Sin embargo, los receptores de tipo
T1R pueden mediar otras modalidades gustativas, tales como amargo,
umami, ácido y salado.
Dentro del alcance de la invención se prevén
diversas mutaciones y sustituciones conservativas. Por ejemplo,
estaría dentro del nivel del experto en la materia realizar
sustituciones de aminoácidos usando protocolos conocidos de
tecnología genética recombinante incluyendo PCR, clonación de genes,
mutagénesis de ADNc dirigida a sitio, transfección de células
hospedadoras y transcripción in vitro. Las variantes podrían
después seleccionarse para determinar la actividad funcional del
GPCR específica de las células gustativas.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas y
polipéptidos T1R de la invención pueden identificarse por supuesta
traducción de las secuencias que codifican los ácidos nucleicos.
Estas diversas secuencias de aminoácidos y las secuencias que
codifican los ácidos nucleicos pueden compararse una con otras o con
otras secuencias de acuerdo con varios métodos.
Por ejemplo, en la comparación de secuencias,
típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia,
con la que se comparan las secuencias del ensayo. Cuando se usa un
algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y
de referencia se introducen en un ordenador, se designan las
coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los
parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Pueden usarse
los parámetros del programa por defecto, como se describe a
continuación para los programas BLASTN y BLASTP, o pueden diseñarse
parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia
después calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las
secuencias del ensayo con respecto a la secuencia de referencia,
basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se usa
en este documento, incluye la referencia para un segmento de una
cualquiera de varias posiciones contiguas seleccionadas del grupo
que consiste de 20 a 600, habitualmente aproximadamente de 50 a
aproximadamente 200, más habitualmente aproximadamente de 100 a
aproximadamente 150 en la que una secuencia puede compararse con
una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas
después de que dos secuencias estén alineadas óptimamente. Los
métodos de alineamiento de secuencias para comparar se conocen en
la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparar puede
realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local
de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981),
mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman
& Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el
método de similitud de búsqueda de Pearson & Lipman, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones
informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en
el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group,
575 Science Dr., Madison, WI) o mediante el alineamiento manual e
inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocolos in
Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995
suplemento)).
Un ejemplo preferido de un algoritmo que es
adecuado para determinar el porcentaje de identidad secuencia y la
similitud de secuencia es el algoritmo de BLAST y BLAST 2.0, que se
describen en Atlschul et al., Nuc. Acids Res. 25:
3389-3402 (1977) y Altschul et al., J.
Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente.
El programa informático para realizar análisis BLAST se encuentra
disponible públicamente a través del National Center for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de
secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de
longitud W en la secuencia problema, que corresponden o satisfacen
alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con
una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de
datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabras cercanas
(Atlschul et al., Altschul et al., Nuc. Acids
Res. 21: 3389-3402 (1977) y Altschul et
al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)).
Estos aciertos iniciales de palabras vecinas actúan como semillas
para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP que los contienen.
Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo
largo de cada secuencia tanto como pueda incrementarse la puntuación
de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se
calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M
(puntuación de recompensa para un par de restos de coincidencia;
siempre >0) y N (puntuación de castigo para restos no
coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se
usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación
acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada
dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento
acumulativa disminuye en la cantidad X desde su máximo valor
conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o a un valor
menor, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos
de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier
secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan
la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN
(para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de
palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una
comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el
programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3, y
expectativa (E) de 10 y alineamientos de matriz de puntuación
BLOSUM62 (véase Henikoff & Henifokk, Proc. Natl. Acad Sci.
USA 89: 10915 (1989)) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5,
N=-4 y una comparación de ambas cadenas.
Otro ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP.
PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un
grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos,
emparejados para demostrar la relación y el porcentaje de identidad
de secuencia. También representa un denominado "árbol" o
"dendrograma" que muestra la relación de agrupamiento usada
para crear el alineamiento (véase, por ejemplo, la Figura 2). PILEUP
usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de
Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:
351-360 (1987). El método usado es similar al
método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:
151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300
secuencias, cada una de ellas con una longitud máxima de 5000
nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento
múltiple comienza con el alineamiento emparejado de dos secuencias
más similares, que producen un agrupamiento de dos secuencias
alineadas. Este agrupamiento se alinea después con la siguiente
secuencia más relacionada o agrupamiento de secuencias alineadas.
Dos grupos de secuencias se alinean mediante una extensión simple
del alineamiento emparejado de dos secuencias individuales. El
alineamiento final se consigue mediante una serie de alineamientos
emparejados progresivos. El programa se realiza designando
secuencias específicas y sus coordinados de aminoácidos o
nucleótidos para regiones de comparación de secuencia y designando
los parámetros del programa. Usando PILEUP, se compara una secuencia
de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el
porcentaje de identidad de secuencia relacionada usando los
siguientes parámetros: peso del hueco por defecto (3.00), peso de
longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos terminales ponderados.
PILEUP puede obtenerse del paquete informático de análisis de
secuencia GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Deveraux et al.,
Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984))
codificada por los genes obtenidos por la traducción conceptual de
los marcos de lectura abiertos correspondientes. La comparación de
estas secuencias de proteínas con todas las proteínas conocidas en
las bases de datos de secuencias públicas usando el algoritmo BLASTP
reveló su fuerte homología con los miembros de la familia T1R,
teniendo cada una de las secuencias de la familia T1R una identidad
de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente del 35 al
50%, y preferiblemente al menos el 55%, al menos el 60%, al menos
el 65% y más preferiblemente al menos el 70% con al menos un miembro
conocido de la familia.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usa en este documento, los siguientes
términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que
se indique otra cosa.
Las "células gustativas" incluyen células
neuroepiteliales que se organizan en grupos para formar botones
gustativos de la lengua, por ejemplo, células foliadas, fungiformes
y circunvaladas (véase por ejemplo Roper et al., Ann. Rev.
Neurosci. 12:329-353 (1989)). Las células gustativas
también se encuentran en el paladar y otros tejidos, tales como el
esófago y el estómago.
"T1R" se refiere a uno o más miembros de
una familia de receptores acoplados a proteína G que se expresan en
las células gustativas tales como células foliadas, fungiformes y
circunvaladas, así como en células del paladar, y esófago (véase,
por ejemplo, Hoon et al., Cell,
96:541-551 (1999). Los miembros de esta familia
también se denominan como GPCR-B3 y TR1 en el
documento WO 00/06592 así como GPCR-B4 y TR2 en el
documento WO 00/06593. Los GPCR-B3 en este
documento también se denominan rT1R1 y los GPCR-B4
se denominan rT1R2. Las células receptoras gustativas también
pueden identificarse en base a la morfología (véase por ejemplo
Roper, anteriormente) o mediante la expresión de proteínas
expresadas específicamente en las células gustativas. Los miembros
de la familia T1R pueden tener la capacidad de actuar como
receptores para la transducción del gusto dulce o para distinguir
entre otras diversas modalidades gustativas.
Los ácidos nucleicos "T1R" codifican una
familia de los GPCR con siete regiones transmembrana que tienen
"actividad receptora acoplada a proteína G", por ejemplo,
pueden unirse a proteínas G en respuesta al estímulo extracelular y
promover la producción de mensajeros segundos tales como IP3, AMPc,
CMPc y Ca^{2+} mediante la estimulación de enzimas tales como
fosfolipasa C y adenilato ciclasa (para una descripción de la
estructura y función de las GPCR, véase, por ejemplo, Fong,
anteriormente, y Baldwin, anteriormente). Una sola
célula gustativa puede contener muchos polipéptidos T1R
distintos.
El término familia "T1R" por lo tanto se
refiere a variantes, alelos, mutantes polimórficos y homólogos
interespecie que: (1) tienen una identidad de secuencia de amino
ácidos de al menos aproximadamente del 35 al 50%, opcionalmente
aproximadamente una identidad de secuencia de aminoácidos de 60, 75,
80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99% con las SEC ID Nº: 4, 10, 12, 14 ó
17, sobre una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos,
opcionalmente 50-100 aminoácidos; (2) se unen
específicamente a anticuerpos provocados frente un inmunógeno que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste en las SEC ID Nº: 4, 10, 12, 14, 17 y variantes de las
mismas modificadas de manera conservativa; (3) los codifica una
molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente (con un
tamaño de al menos aproximadamente 100, opcionalmente al menos
aproximadamente 500-1000 nucleótidos) en
condiciones de hibridación rigurosas a una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 9, 11, 13, 15,
16, 20 y variantes de las mismas modificadas de manera conservativa;
(4) comprenden una secuencia con una identidad de secuencia de
aminoácidos de al menos aproximadamente del 35 al 50% seleccionada
del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 4, 10, 12, 14 ó 17; ó (5)
se amplifican mediante cebadores que se hibridan específicamente en
condiciones de hibridación rigurosas con la misma secuencia que los
conjuntos de cebadores degenerados que codifican las SEC ID Nº: 7, 8
y variantes de las mismas modificadas de manera conservativa.
Topológicamente, determinados GPCR
quimiosensoriales tienen un "dominio
N-terminal", "dominios extracelulares";
"dominios transmembrana" que comprenden siete regiones
transmembrana y los correspondientes bucles citoplásmicos y
extracelulares; "dominios citoplásmicos" y un "domino
C-terminal" (véase, por ejemplo,
Hoon et al., Cell, 96:541-551 (1999);
Buck & Axel, Cell, 65:175-187 (1991)).
Estos dominios pueden identificarse estructuralmente usando métodos
conocidos por los expertos en la materia, tal como programas de
análisis de secuencia que identifican dominios hidrófobos e
hidrófilos (véase, por ejemplo Stryer, Biochemistry,
(3rd ed. 1988); véase también cualquiera de los números de
Internet en base a programas de análisis de secuencia, tales como
los encontrados en dot.imgen.bcm.tmc.edu). Dichos dominios son
útiles para preparar proteínas quiméricas y para ensayos in
vitro de la invención, por ejemplo, ensayos de unión a
ligando.
"Dominios extracelulares" se refiere por lo
tanto a los dominios de los polipéptidos T1R que sobresalen de la
membrana celular y quedan expuestos en la superficie extracelular de
la célula. Dichos dominios generalmente incluyen el "dominio
N-terminal" que se expone en la superficie
extracelular de la célula, y opcionalmente puede incluir partes de
los bucles extracelulares del dominio transmembrana que se exponen
en la superficie extracelular de la célula, es decir, los bucles
entre regiones transmembrana 2 y 3, entre regiones transmembrana 4
y 5 y entre regiones transmembrana 6 y 7.
La región "dominio
N-terminal" comienza en el extremo N y se
extiende hasta una región cerca del inicio del dominio
transmembrana. Más particularmente, en una realización de la
invención, este dominio comienza en el extremo N y acaba
aproximadamente en el ácido glutámico conservado en la posición
aminoacídica 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. La
región correspondiente a los aminoácidos 1-580 de la
SEC ID 40 es una realización particular de un dominio extracelular
que se prolonga ligeramente dentro del dominio transmembrana. Estos
dominios extracelulares son útiles para realizar ensayos in
vitro de unión a ligando, tanto en fase soluble como sólida.
Además, las regiones transmembrana, descritas a continuación,
también pueden unirse a cualquier ligando en combinación con el
dominio extracelular y por lo tanto son útiles para realizar ensayos
in vitro de unión a ligando.
El "dominio transmembrana", que comprende
las siete "regiones transmembrana", se refiere al dominio de
los polipéptidos T1R que están dentro de la membrana plasmática y
también puede incluir los bucles citoplásmicos (intracelulares) y
extracelulares correspondientes. En una realización, esta región
corresponde al dominio de los miembros de la familia de T1R que
comienza aproximadamente en el resto del ácido glutámico conservado
en la posición aminoacídica 563 más o menos 20 aminoácidos y acaba
aproximadamente en el resto aminoacídico conservado de tirosina
conservada en la posición 812 más o menos aproximadamente 10
aminoácidos. Las siete regiones transmembrana y los bucles
extracelulares y citoplásmicos pueden identificarse usando métodos
convencionales, como se describe en Kyte & Doolittle, J.
Mol, Biol, 157:105-32 (1982)), o en Stryer,
anteriormente.
Los "dominios citoplásmicos" se refiere a
los dominios de los polipéptidos T1R orientados hacia el interior
de la célula, por ejemplo el "dominio C terminal" y los bucles
intracelulares del dominio transmembrana, por ejemplo, el bucle
intracelular entre regiones transmembrana 1 y 2, el bucle
intracelular entre regiones transmembrana 3 y 4 y el bucle
intracelular entre regiones transmembrana 5 y 6. "El dominio C
terminal" se refiere a la región que abarca el extremo del
último dominio transmembrana y el extremo C de la proteína y que
normalmente se localiza dentro del citoplasma. En una realización,
esta región comienza en el resto aminoacídico conservado de
tirosina en la posición 812 más o menos aproximadamente 10
aminoácidos y continúa hasta el extremo C del polipéptido.
La expresión "región de unión a ligando" o
"dominio de unión a ligando" se refiere a secuencias derivadas
de un receptor quimiosensorial, particularmente un receptor
gustativo, que sustancialmente incorpora al menos el dominio
extracelular del receptor. En una realización, el dominio
extracelular de la región de unión a ligando puede incluir el
domino N-terminal y, opcionalmente, partes del
dominio transmembrana, tales como los bucles extracelulares del
dominio transmembrana. La región de unión a ligando puede ser capaz
de unirse a un ligando, y más particularmente a una sustancia
gustativa.
La frase "efectos funcionales" en el
contexto de ensayos para ensayar compuestos que modulan miembros de
la familia T1R que intervienen en la traducción gustativa incluye
la determinación de cualquier parámetro que está directa o
indirectamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos
funcionales, físicos y químicos. Esto incluye la unión a ligando,
cambios en el flujo iónico, potencial de membrana, flujo de
corriente, transcripción, unión a proteína G, fosforilación o
desfosforilación del GPCR, señal de transducción, interacciones
ligando-receptor, concentraciones del segundo
mensajero (por ejemplo, AMPc, GMPc, IP3 o Ca^{2}+
intracelular), in vitro, in vivo, y ex vivo y
también incluye otros efectos fisiológicos que aumentan o disminuyen
la liberación del neurotransmisor u hormona.
En el contexto de los ensayos por
"determinación del efecto funcional" se refiere a ensayos para
un compuesto que aumentan o disminuyen un parámetro que está
directa o indirectamente bajo la influencia de un miembro de la
familia de T1R, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y
químicos. Dichos efectos funcionales pueden medirse por cualquiera
de los medios conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo,
cambios en las características espectroscópicas (por
ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice refractivo),
propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o
de solubilidad, pinzamiento zonal, colorantes potenciométricos,
corrientes de célula entera, salida de radioisótopo, marcadores
inducibles, expresión génica de T1R en oocitos; expresión de T1R en
células de cultivo tisular; activación transcripcional de genes de
T1R; ensayos de unión a ligando; cambios de tensión, potencial de
membrana y conductancia; ensayos de flujo iónico; cambios en
segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc, GMPc y
trifosfato inositol (IP3); cambios en los niveles de calcio
intracelular; liberación neurotransmisora y similares.
Los términos "inhibidores",
"activadores", y "moduladores" de genes o proteínas de T1R
se usan de manera intercambiable para referirse a moléculas
inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas usando ensayos
in vitro e in vivo para la transducción gustativa,
por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y
miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen
a, estimulan en bloque total o parcialmente, disminuyen, impiden,
retardan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan
disminuyendo la transducción gustativa, por ejemplo, antagonistas.
Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen a,
estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la
activación, sensibilizan o regulan aumentando la transducción
gustativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen
compuestos que, por ejemplo, modifican la interacción de un
receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o
inhibidores (por ejemplo ebnerina y otros miembros de la
familia portadora hidrófoba); proteínas G; quinasas (por ejemplo,
homólogos de rodopsina quinasa y quinasas del receptor beta
adrenérgico implicadas en la desactivación y desensibilización de un
receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan
receptores. Los moduladores pueden incluir versiones modificadas
genéticamente de miembros de la familia de T1R, por ejemplo, con
actividad modificada, así como ligandos, antagonistas, agonistas de
origen natural y sintéticos, pequeñas moléculas químicas y
similares. Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen,
por ejemplo, la expresión de miembros de la familia de T1R en
células o membranas celulares, la aplicación de supuestos compuestos
moduladores en presencia o ausencia de sustancias gustativas, por
ejemplo, sustancias gustativas dulces y después determinar los
efectos funcionales en la transducción gustativa, como se ha
descrito anteriormente. Las muestras o los ensayos que comprenden
los miembros de la familia T1R que se tratan con un activador,
inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras de control
sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de
modulación. A las muestras de control (no tratadas con moduladores)
se les asigna un valor de actividad T1R relativo del 100%. La
inhibición de un T1R se consigue cuando el valor de actividad de T1R
con respecto al control es de aproximadamente el 80%, opcionalmente
el 50% o del 25-0%. La activación de un T1R se
consigue cuando el valor de actividad de T1R con respecto al
control es el 110%, opcionalmente el 150%, opcionalmente el
200-500% o superior a
1.000-3.000%.
Las expresiones "purificado",
"sustancialmente purificado", y "aislado" como se usa en
este documento se refiere al estado de estar libre de otros
compuestos diferentes con los que el compuesto de la invención está
normalmente asociado en su estado natural, de manera que el objeto
"purificado", "sustancialmente purificado", y
"aislado" comprende al menos el 0,5%, 1%, 5%, 10% o 20%, y más
preferiblemente al menos el 50% o el 75% de la masa, por peso, de
una muestra determinada. En una realización preferida, estas
expresiones se refieren al compuesto de la invención que comprende
al menos el 95% de la masa, por peso, de una muestra determinada.
Como se usa en este documento, las expresiones "purificado",
"sustancialmente purificado", y "aislado", cuando se
refieren a un ácido nucleico o proteína, de ácidos nucleicos o
proteínas, también se refiere a un estado de purificación o
concentración diferente al que ocurre de manera natural en el
mamífero, especialmente en el cuerpo humano. Cualquier grado de
purificación o concentración superior al que ocurre de manera
natural en el mamífero, especialmente el cuerpo humano, incluyendo
(1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o
(2) la asociación con estructuras o compuestos con los que no se
encuentra normalmente asociado en el mamífero, especialmente el
cuerpo humano, se encuentra dentro del significado de
"aislado". De acuerdo con una diversidad de métodos y procesos
conocidos por los expertos en la materia, el ácido nucleico o
proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en
este documento, pueden aislarse o asociarse de otra manera con
estructuras o compuestos con los que normalmente no están asociados
de manera natural.
Como se usa en este documento, el término
"aislado", cuando se refiere a un ácido nucleico o polipéptido
se refiere a un estado de purificación o concentración diferente al
que ocurre de manera natural en el mamífero, especialmente en el
cuerpo humano. Cualquier grado de purificación o concentración
superior al que ocurre de manera natural en el cuerpo, incluyendo
(1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados de
origen natural o (2) la asociación con estructuras o compuestos con
los que no se encuentra normalmente asociado en el cuerpo está
dentro del significado de "aislado" como se usa en este
documento. De acuerdo con una diversidad de métodos y procesos
conocidos por los expertos en la materia, los ácidos nucleicos o
polipéptidos descritos en este documento pueden aislarse o
asociarse de otra manera con estructuras o compuestos con los que
normalmente no están asociados de manera natural.
Como se usa en este documento, los términos
"amplificar" y "amplificación" se refieren al uso de
cualquier metodología de amplificación adecuada para generar o
detectar ácidos nucleicos expresados de manera natural o
recombinante, como se describe con detalle, a continuación. Por
ejemplo, la invención proporciona métodos y reactivos (por
ejemplo, pares de cebadores oligonucleotídicos degenerados
específicos) para amplificar (por ejemplo, por reacción en
cadena de la polimerasa, PCR) ácidos nucleicos (por ejemplo,
ADNc) recombinantes o expresados de manera natural (por
ejemplo ARNm o genómico) de la invención (por ejemplo
secuencias de la invención de unión a sustancias gustativas) in
vivo o in vitro.
La expresión "receptor
7-transmembrana" significa un polipéptido que
pertenece a una superfamilia de proteínas transmembrana que tienen
siete dominios que incluye siete veces la membrana plasmática (por
tanto, los siete dominios se denominan dominios
"transmembrana" o "TM" de TM I a TM VII). Cada una de las
familias de receptores olfativos y de determinados receptores
gustativos pertenece a esta superfamilia. Los polipéptidos del
receptor 7-transmembrana tienen estructuras
primarias secundarias y terciarias similares y características, como
se describe con detalle a continuación.
El término "biblioteca" significa una
preparación que es una mezcla de diferentes moléculas polipeptídicas
o de ácidos nucleicos, tales como la biblioteca de dominios de
unión a ligando del receptor gustativo particularmente
quimiosensorial, generada por la amplificación de ácidos nucleicos
con pares de cebadores degenerados o una colección de vectores
aislada que incorpora los dominios de unión a ligando amplificados o
una mezcla de células transfectadas aleatoriamente cada una de
ellas con al menos un vector que codifica un receptor gustativo.
La expresión "ácido nucleico" o
"secuencia de ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido
desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de cadena
monocatenaria o bicatenaria. El término incluye ácidos nucleicos, es
decir, oligonucleótidos, que contienen análogos de nucleótidos
naturales conocidos. El término también incluye estructuras
similares a ácidos nucleicos con esqueletos sintéticos (véase por
ejemplo, Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach,
ed. F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategic
Annals of the N.Y. Academy of Sciences, Vol. 600, Eds.
Baserga et al (NYAS 1992) Milligan J. Med, Chem.
36:1923-1937 (1993); Antisense Research and
Applications (1993, CRC Press), WO 97/03211; WO 96739154; Mata,
Toxicol Appl Pharmacol. 144:189-197 (1997);
Strauss-Soukup, Biochemistry
36:8692-8698 (1997); Samstag, Antisense Nucleic
Acid Drug Dev, 6:153-156 (1996)).
A menos que se indique otra cosa, una secuencia
particular de ácido nucleico también incluye implícitamente
variantes de la misma modificada de manera conservativa (por
ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias
complementarias, así como la decencia explícitamente indicada.
Específicamente, pueden conseguirse sustituciones de codones
degenerados generando, por ejemplo, secuencias en las que la tercera
posición de uno o más codones seleccionados se sustituye por restos
desoxiinosina y/o bases mezcladas (Bateer et al., Nucleic
Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J Biol.
Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolizn et
al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)).
El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con genes,
ADNc, ARNm, oligonucleótidos y polinucleótidos.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se usan de manera intercambiable en este documento
para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Los términos
se refieren a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos
aminoacídicos es un mimético químico artificial de un aminoácido de
origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos
de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no
natural.
La expresión "dominio de translocación de la
membrana plasmática" o simplemente "dominio de
translocación" significa un dominio polipeptídico que, cuando se
incorpora en el extremo amino de una secuencia que codifica un
polipéptido, puede servir como "chaperona" (acompañante) o
"translocar" la proteína híbrida ("fusión") hacia la
membrana plasmática celular con gran eficacia. Por ejemplo, un
"domino de translocación" puede proceder del extremo amino del
polipéptido del receptor de rodopsina bovino, un receptor de 7
dominios transmembrana. Sin embargo, puede usarse la rodopsina de
cualquier mamífero, de manera que puede facilitarse la translocación
de otras secuencias. Por tanto, el dominio de translocación es
particularmente eficaz en la translocación de proteínas de fusión
de 7 dominios transmembrana hacia la membrana plasmática y una
proteína (por ejemplo, un polipéptido de receptor gustativo)
que comprenda un dominio de translocación amino terminal se
transportará a la membrana plasmática de manera más eficaz que sin
el dominio. Sin embargo, si el dominio N-terminal
del polipéptido es activo en la unión, puede preferirse el uso de
otros dominios de translocación.
El "dominio de translocación", "dominio
de unión a ligando" y composiciones de receptores quiméricos como
se describe en este documento también incluyen "análogos", o
"variantes conservativas" y "miméticos" ("péptido
miméticos") con estructuras y actividad que sustancialmente
corresponden a las secuencias ejemplares. Por tanto, las
expresiones "variante conservativa" o "análogo" o
"mimético" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos modificada, de manera que el cambio (o los cambios)
no modifican sustancialmente la estructura y/o actividad del
polipéptido (de las variantes conservativas), como se define en este
documento. Esto incluye variaciones de una secuencia de aminoácidos
modificada de manera conservativa, es decir sustituciones,
adiciones o deleciones de aquellos restos aminoacídicos que no son
críticos para actividad de la proteína, o la sustitución de
aminoácidos por restos que tienen propiedades similares (por
ejemplo, ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente,
polares o no polar, etc.) de manera que las sustituciones de
aminoácidos incluso críticos no modifica sustancialmente la
estructura y/o la actividad.
Más particularmente, las "variantes
modificadas de manera conservativa" se aplican tanto a las
secuencias de aminoácidos como a las de los ácidos nucleicos. Con
respecto a las secuencias de ácido nucleico en particular, las
variantes modificadas de manera conservativa se refiere a aquellos
ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas
o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no
codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias
esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código
genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente
idénticos codifican cualquier proteína determinada.
Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y
GCU codifican el aminoácido alanina. Por tanto, en cualquier
posición en la que un codon especifique una alanina, el codon puede
modificarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos
sin alterar el polipéptido codificado.
Dichas variaciones de los ácidos nucleicos son
"variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones
modificadas de manera conservativa. En este documento cada secuencia
de ácido nucleico que codifica un polipéptido también describe cada
posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto en la
materia reconocerá que en un ácido nucleico cada codon (excepto
AUG, que generalmente es el único codon para la metionina y TGG,
que generalmente es el único codon para el triptófano) puede
modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por
consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que
codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia
descrita.
En la técnica se conocen bien las tablas de
sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos de
funcionalidad similar. Por ejemplo, una directriz ejemplar para
seleccionar sustituciones conservativas incluye (restos originales
seguido de sustituciones ejemplares): ala/gly o ser, arg/Iys;
asn/gln o his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala o pro;
his/asn o gln; ile/leu o val; leu/ile o val; lys/arg o gln o glu;
met/leu o tyr o ile; phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser;
trp/tyr; tyr/trp o phe; val/ile o leu. Una directriz ejemplar
alternativa usa los seis grupos siguientes, conteniendo cada uno
aminoácidos que son sustituciones conservativas con respecto al
otro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico
(D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4)
Arginina (R), Lisina (I); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina
(M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano
(W); (véase también, por ejemplo, Creighton, Proteins,
W.H. Freeman and Company (1984); Schultz and Schimer, Principles
of Protein Structure, Springer-Vrlag (1979)).
Un experto en la materia apreciará que las sustituciones indicadas
anteriormente no son las sustituciones conservativas únicamente
posibles. Por ejemplo, para algunos propósitos, se puede considerar
a todos los aminoácidos cargados como sustituciones conservativas
para los demás tanto si son positivos como negativos. Además, las
sustituciones, deleciones o adiciones individuales que modifican,
añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de
aminoácidos en una secuencia codificada también pueden considerarse
"variaciones modificadas de manera conservativa".
Los términos "mimético" y
"peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético
que tiene sustancialmente las mismas características estructurales
y/o funcionales de los polipéptidos, por ejemplo, dominios de
translocación, dominios de unión a ligando o receptores quiméricos
de la invención. El mimético puede estar completamente formado por
análogos de aminoácidos sintéticos, no naturales o pueden ser una
molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales
y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. El mimético
puede incorporar también cualquier cantidad de sustituciones
conservativas de aminoácidos naturales siempre que dichas
sustituciones tampoco modifiquen sustancialmente la estructura y/o
actividad del mimético.
Como en el caso de los polipéptidos de la
invención que son variantes conservativas, la experimentación
rutinaria determinará si un mimético está dentro del alcance de la
invención, es decir, que su estructura y/o función no esté
sustancialmente modificada. Las composiciones miméticas
polipeptídicas pueden contener cualquier combinación de componentes
estructurales no naturales, que típicamente son de tres grupos
estructurales: a) grupos de enlace a restos distintos de los
enlaces de unión amina naturales ("enlace peptídico"); b)
restos no naturales en lugar de restos aminoacídicos de origen
natural; o c) restos que inducen mimetismo estructural secundario,
es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria,
por ejemplo, un giro beta, un giro gama, una lámina beta,
una conformación de hélice alfa y similares. Un polipéptido puede
caracterizarse como un mimético cuando todos o algunos de sus
restos están unidos por medios químicos distintos de los enlaces
peptídicos naturales. Los restos peptidomiméticos individuales
pueden unirse por enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o
medios de acoplamiento, tales, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres
de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales,
N,N'-dicloxihexilcarbodiimida (DCC) o
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de
enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de unión amina
tradicionales ("enlace peptídico") incluyen, por
ejemplo, quetometileno (por ejemplo,
-C(=O)-CH_{2}- para -C(=O)-NH-),
aminometileno (CH_{2}-NH), etileno, olefina
(CH=CH), éter (CH_{2}-O), tioéter
(CH_{2}-S), tetrazol (CN_{4}), tiazol,
retroamida, tioamida o éster (véase, por ejemplo Spatola,
Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and
Proteins, Vol. 7, págs. 267-357, "Peptide
Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY (1983)). Un
polipéptido también puede caracterizarse como un mimético
conteniendo todos o algunos restos no naturales en lugar de restos
aminoacídicos de origen natural; los restos no naturales se
describen bien en la bibliografía científica y de patentes.
Un "marcador" o un "resto detectable"
es una composición detectable por medios espectroscópicos,
fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo,
los marcadores útiles incluyen ^{32}P, colorantes fluorescentes,
reactivos de densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, como
las comúnmente usadas en un ELISA), biotina, digoxigenina o
haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por
ejemplo, incorporando una radiomarca en el polipéptido o usarse
para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el
péptido.
Un "oligonucleótido o sonda de ácidos
nucleicos marcado" es uno que se une, de manera covalente,
mediante un conector o un enlace químico, o de manera no covalente,
mediante enlaces iónicos, van der Waals, electrostáticos o
hidrógeno a una etiqueta de manera que la presencia de la sonda
puede detectarse detectando la presencia del marcador unido a la
sonda.
Como se usa en este documento un
"oligonucleótido o sonda de ácidos nucleicos" se define como un
ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de
secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlaces
químicos, normalmente mediante pares de bases complementarias,
normalmente mediante la formación de enlaces de hidrógeno. Como se
usa en este documento, una sonda puede incluir bases naturales (es
decir, A, G, C o T) o modificadas
(7-deazaguanosina, inosina, etc.). Además, en una
sonda las bases pueden unirse mediante un enlace distinto a un
enlace fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación.
Por tanto, por ejemplo, las sondas pueden ser ácidos nucleicos
peptídicos en los que las bases constituyentes están unidas por
enlaces peptídicos en lugar de por enlaces fosfodiéster. Un experto
en la técnica entenderá que las sondas pueden unirse a secuencias
diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de
la sonda dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de
hibridación. Las sondas opcionalmente se marcan directamente con
isótopos, cromóforos, luminóforos, cromógenos o se marcan
indirectamente tal como con biotina a la cual posteriormente puede
unirse un complejo de estreptavidina. Ensayando la presencia o la
ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de
la secuencia o subsecuencia seleccionada.
El término "heterólogo" cuando se usa con
respecto a partes de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico
comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma
relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico
se produce típicamente de manera recombinante, teniendo dos o más
secuencias de genes no relacionados dispuestas para formar un nuevo
ácido nucleico funcional, por ejemplo un promotor de una fuente y
una región codificante de otra fuente. De manera similar, una
proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más
subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en
la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
Un "promotor" se define como un conjunto de
secuencias de ácido nucleico que dirigen la transcripción del ácido
nucleico. Como se usa en este documento, un promotor incluye
secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio
de la transcripción, tales como, en el caso de un promotor de tipo
polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye
opcionalmente elementos represores o potenciadores dístales, que
pueden situarse tanto como a varios miles de pares de bases del
sitio de inicio de la transcripción. Un promotor
"constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de
las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor
"inducible" es un promotor que es activo bajo regulación
ambiental o de desarrollo. La expresión "unido operativamente"
se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de
expresión de un ácido nucleico (tal como un promotor o conjunto de
sitios de unión al factor de transcripción) y una segunda secuencia
de ácido nucleico, en el que la secuencia de control de expresión
dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la
segunda secuencia.
Como se usa en este documento,
"recombinante" se refiere a un polinucléotido sintetizado o de
otra manera manipulado in vitro (por ejemplo
"polinucleótido recombinante"), a métodos de uso de
polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en
células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína
recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante.
Los "Medios recombinantes" también incluyen el ligamiento de
ácidos nucleicos que tienen diversas regiones codificantes o
dominios o secuencias promotoras de diferentes fuentes en un casete
o vector de expresión para la expresión de, por ejemplo, la
expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que
comprende un domino de translocación de la invención y una secuencia
de ácidos nucleicos amplificada usando un cebador de la
invención.
La frase "se hibrida selectivamente (o
específicamente) a" se refiere a la unión, duplexado o
hibridación de una molécula únicamente a una secuencia de
nucleótidos particular en condiciones rigurosas de hibridación
cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por
ejemplo, ADN o ARN celular total o biblioteca).
La frase "condiciones rigurosas de
hibridación" se refiere a condiciones en las que una sonda
hibridará con su secuencia diana, típicamente en una mezcla
compleja de ácido nucleico pero no con otras secuencias. Las
condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en
diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan
específicamente a temperaturas elevadas. En Tijssen, Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation
with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and
the strategy of nucleic acid assays" (1993), se encuentra una
guía exhaustiva sobre hibridación de ácidos nucleicos. Generalmente,
las condiciones rigurosas se seleccionan para ser de
aproximadamente 5-10ºC inferiores al punto de fusión
térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica
definida. El Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y
concentración de ácido nucleico definidos) en la que el 50% de las
sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia
diana en equilibrio (ya que, a Tm, están presentes secuencias diana
en exceso, el 50% de las sondas se ocupan en equilibrio). Las
condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de
sal es menor de aproximadamente 1,0 M de ión sodio, típicamente
aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de ión sodio (u
otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos
aproximadamente de 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50
nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas
(por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). Las condiciones
rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes
desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación
selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el
fondo, opcionalmente 10 veces el fondo de hibridación. Las
condiciones de hibridación rigurosas ejemplares pueden ser las
siguientes: formamida al 50%, SSC 5x y SDS al 1%, incubando a 42ºC,
o, SSC 5x, SDS al 1%, incubando a 65ºC, con lavado en SSC 0,2x y SDS
al 0,1% a 65ºC.
Dichas hibridaciones y etapas de lavado pueden realizarse durante, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 minutos o más.
Dichas hibridaciones y etapas de lavado pueden realizarse durante, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 minutos o más.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí
en condiciones rigurosas se encuentran aún sustancialmente
relacionados si los polipéptidos que los codifican se encuentran
sustancialmente relacionados. Esto se produce, por ejemplo, cuando
se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración máxima
de codones permitida por el código genético. En dichos casos, los
ácidos nucleicos típicamente se hibridan en condiciones de
hibridación moderadamente rigurosas. Las "condiciones de
hibridación moderadamente rigurosas" ejemplares incluyen una
hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS 1% a
37ºC y un lavado en SSC 1X a 45º. Dichas etapas de hibridación y de
lavado pueden realizarse durante, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30,
60, minutos o más. Una hibridación positiva es al menos el doble
del nivel de fondo. Los expertos en la materia reconocerán
fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado
alternativas para proporcionar condiciones de rigurosidad
similares.
"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido
que comprende una región flanqueante de un gen o de inmunoglobulina
o fragmentos del mismo que se une y reconoce específicamente a un
antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen genes
de la región constante de kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon
y mu, así como los miles de genes de la región variable de la
inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o
lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa,
delta o épsilon, que a su vez definen las clases de
inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Una unidad estructural (anticuerpo) de
inmunoglobulina ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está
compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas
idénticas, teniendo cada par una cadena "ligera"
(aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente
50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una
región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos
principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Los
términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH)
se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.
Un "anticuerpo quimérico" es una molécula
de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una parte de la
misma, se modifica, se sustituye o se intercambia de manera que el
sitio de unión al antígeno (región variable) está unido a una
región constante de una clase diferente o modificada, especie y/o
función efectora o una molécula totalmente diferente que confiere
nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima,
toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la
región variable, o una parte de la misma, se modifica, se sustituye
o se intercambia por una región variable que tiene una especificidad
antigénica modificada o diferente.
Un anticuerpo "anti-T1R" es
un anticuerpo con fragmento de anticuerpo que se une específicamente
a un polipéptido codificado por un gen T1R, un ADNc o una
subsecuencia de los mismos.
El término "inmunoensayo" es un ensayo que
usa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno. El
inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión
específicas de un anticuerpo particular para aislar, conducir y/o
cuantificar el antígeno.
La frase "se une específicamente (o
selectivamente)" a un anticuerpo o, "específicamente (o
selectivamente) inmunoreactivo con", cuando se refiere a una
proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que determina
la presencia de la proteína en una población heterogénea de
proteínas u otros agentes biológicos. Por tanto, en las condiciones
de inmunoensayo indicadas, los anticuerpos específicos se unen a una
proteína particular al menos dos veces el fondo y no se unen
sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas
presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en
dichas condiciones puede necesitar que se seleccione un anticuerpo
para determinar su especificidad para una proteína en particular.
Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales
provocados para un miembro de la familia de T1R a partir de especies
específicas tales como rata, ratón o ser humano para obtener
únicamente aquellos anticuerpos policlonales que inmunoreaccionen
específicamente con el polipéptido T1R o una parte inmunogénica del
mismo y no con otras proteínas, excepto para ortólogos o variantes
polimórficas y alelos del polipéptido T1R. Esta selección puede
conseguirse sustrayendo anticuerpos que reaccionan en cruzado con
moléculas T1R de otras especies u otras moléculas T1R. Los
anticuerpos también pueden seleccionarse para que reconozcan
únicamente los miembros de la familia GPCR de T1R pero no a los
GPCR de otras familias. Puede usarse una diversidad de formatos de
inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que inmunoreaccionen
específicamente con una proteína en particular. Por ejemplo,
rutinariamente se usan inmunoensayos ELISA en fase sólida para
seleccionar anticuerpos que inmunoreaccionan específicamente con una
proteína (véase, por ejemplo., Harlow & Lane, Antibodies, A
Laboratory Manual, (1988), para una descripción de formatos y
condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la
inmunoreactividad específica). Típicamente una reacción específica
o selectiva será al menos dos veces la señal o interferencia de
fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo.
La frase "se asocia selectivamente con" se
refiere a la capacidad de un ácido nucleico para "hibridarse de
manera selectiva" con otro como se define anteriormente, o la
capacidad de un anticuerpo para "unirse selectivamente (o
específicamente)" a una proteína, como se define
anteriormente.
La expresión "vector de expresión" se
refiere a cualquier sistema de expresión recombinante con el
propósito de expresar una secuencia de ácido nucleico de la
invención in vitro o in vivo, de manera constitutiva o
inducible, en cualquier célula, incluyendo células procariotas,
levaduras, hongos, plantas, insectos o mamíferos. El término
incluye sistemas de expresión lineal o circular. El término incluye
sistemas de expresión que permanecen episomales o se integran en el
genoma de la célula. Los sistemas de expresión pueden tener la
capacidad de auto replicarse o no, es decir, conducir únicamente la
expresión transitoria en una célula. El término incluye
"casetes" de "expresión recombinante" que contienen
únicamente los elementos mínimos necesarios para la transcripción
del ácido nucleico recombinante.
Por "célula hospedadora" se refiere a una
célula que contiene un vector de expresión y da soporte a la
replicación o expresión del vector de expresión. Las células
hospedadoras pueden ser células procariotas, tales como E.
coli o células eucariotas tales como levaduras, insectos,
anfibios, o células de mamíferos tales como células CHO, HeLa,
HEK-293 y similares, por ejemplo, células
cultivadas, explantes y células in vivo.
El aislamiento y expresión de los T1R, o
fragmentos o variantes de los mismos de la invención pueden
realizarse como se describe a continuación. Para la amplificación
de ácidos nucleicos que codifican regiones de unión a ligando del
receptor gustativo pueden usarse cebadores de PCR y opcionalmente
pueden generarse genotecas de estos ácidos nucleicos. Después
pueden usarse vectores de expresión individuales o genotecas de
vectores de expresión para infectar o transfectar células
hospedadoras para la expresión funcional de estos ácidos nucleicos
o genotecas. Estos genes y vectores pueden prepararse y expresarse
in vitro o in vivo. Un experto en la materia
reconocerá que pueden obtenerse fenotipos deseados para modificar y
controlar la expresión de los ácidos nucleicos modulando la
expresión o actividad de los genes y ácidos nucleicos (por ejemplo,
promotores, potenciadores y similares) en los vectores de la
invención. Puede usarse cualquiera de los métodos conocidos
descritos para aumentar o disminuir la expresión o la actividad. La
invención puede llevarse a la práctica junto con cualquier método o
protocolo conocido en la técnica, que se describa bien en la
bibliografía científica y de patentes.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la
invención y otros ácidos nucleicos usados para llevar a la práctica
esta invención, ya sea ARN, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o
híbridos de los mismos, pueden aislarse de una diversidad de
fuentes, modificarse por ingeniería genética, amplificarse y/o
expresarse de manera recombinante. Puede usarse cualquier sistema
de expresión recombinante, incluyendo, además de células de
mamíferos, por ejemplo, bacterias, levaduras, insectos o sistemas
vegetales.
De manera alternativa, estos ácidos nucleicos
pueden sintetizarse in vitro por técnicas de síntesis
químicas bien conocidas, como se describe, por ejemplo, en
Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 47:
411-418 (1982); Adams, Am. Chem. Soc.
105:661 (1983); Belousov, Nucleic Acids Res. 25:
3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol.
Med. 19:373-380 (1995); Blommers,
Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang,
Meth. Enzymol 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol
68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); la
Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066. Los fragmentos de ADN
bicatenario pueden obtenerse por tanto sintetizando la cadena
complementaria e hibridando las cadenas entre sí en condiciones
apropiadas o añadiendo la cadena complementaria usando ADN
polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.
Las técnicas para la manipulación de ácidos
nucleicos, tales como, por ejemplo, la generación de mutaciones en
secuencias, subclonación, sondas de marcaje, secuenciación,
hibridación y similares se describen bien en la bibliografía
científica y de patentes. Véase, por ejemplo, Sambrook, ed.,
Molecular Cloning: a Laboratory manual (2nd ed.), Vols.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current
Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons,
Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I,
Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.
(1993).
Los ácidos nucleicos, vectores, cápsides,
polipéptidos y similares pueden analizarse y cuantificarse por
cualquiera de los diversos medios generales bien conocidos por los
expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, métodos
bioquímicos analíticos tales como NMR, espectrofotometría,
radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC)
y cromatografía por hiperdifusión, diversos métodos inmunológicos,
por ejemplo, reacciones de precipitinas en gel o en líquido,
inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA),
ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos
inmuno-fluorescentes, análisis de Southern, análisis
de Northern, análisis de transferencia en mancha, electroforesis en
gel (por ejemplo, SDS-PAGE), RT-PCR,
PCR cuantitativa, otros métodos de amplificación de ácidos
nucleicos o dianas o señales, radiomarcaje, recuento por centelleo y
cromatografía de afinidad.
Pueden usarse cebadores de oligonucleótidos para
amplificar fragmentos de ácidos nucleicos que codifican regiones de
unión a ligando del receptor gustativo. Los ácidos nucleicos
descritos en este documento también pueden clonarse o medirse
cuantitativamente usando técnicas de amplificación. Los métodos de
amplificación se conocen bien en la técnica e incluyen, por
ejemplo, ensayos de amplificación por reacción en cadena de la
polimerasa, PCR (PCR Protocols, a Guide to Methods and
Applications, ed. Innis. Academia Press, N.Y. (1990) y
Strategies PCR, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.
(1995), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase por
ejemplo, Wu, Genomics 4:560 (1989); Landegren, Science
241:1077 (1988); Barringer, Gene 89:117 (1990));
amplificación mediante transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)); y replicación de
secuencia auto sostenida (véase, por ejemplo, Guatelli, Proc.
Natl. Acad. Sci, USA 87:1874 (1990)); amplificación de la
replicasa Q Beta (véase, por ejemplo, Smith, J, Clin.
Microbiol. 35:1477-1491 (1997)); ensayo de la
replicasa Q-beta automatizado (véase, por
ejemplo, Burg, Mol. Cell Probes 10:257-271
(1996)) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo,
NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger,
Methods Enzymol 152: 307-316 (1987);
Sambrook; Ausubel; y las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y
4.683.202; Sooknanan, Biotechnology 13:
563-564 (1995). Los cebadores pueden diseñarse para
conservar la secuencia original del receptor
7-transmembrana "donante". De manera
alternativa, los cebadores pueden codificar restos aminoacídicos
que son sustituciones conservativas (por ejemplo, restos hidrófobos
para hidrófobos, véase el argumento anterior) o sustituciones
benignas funcionales (por ejemplo no impiden la inserción en la
membrana plasmática, ni causan la escisión por peptidasas, ni
causan plegamiento anómalo del receptor y similares). Una vez
amplificados, los ácidos nucleicos tanto individuales como
genotecas, pueden clonarse de acuerdo con métodos conocidos en la
técnica, si se desea, en cualquiera de una diversidad de vectores
usando métodos biológicos moleculares rutinarios; en la Patente de
Estados Unidos Nº 5.426.039 se describen, por ejemplo, métodos para
la clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados.
Los pares de cebadores pueden diseñarse para
amplificar selectivamente regiones de unión a ligando de los
miembros de la familia de T1R. Estas regiones pueden variar para
diferentes ligandos o sustancias gustativas. Por tanto, lo que
puede ser una región de unión mínima para una sustancia gustativa
puede ser demasiado restrictiva para una segunda sustancia
gustativa. Por consiguiente, pueden amplificarse regiones de unión a
ligando de diferentes tamaños que comprenden diferentes estructuras
de dominio extracelulares.
En la técnica se conocen bien paradigmas para
diseñar pares de cebadores degenerados. Por ejemplo, está disponible
un programa informático de estrategia (CODEHOP) Cebador
Oligonucleotídico Híbrido DEgenerado COnsenso como
http://blocks.fhcrc.org/codehop.html, y que está directamente
vinculado con el sitio de alineamiento de secuencias múltiples
BlockMaker para predecir el cebador hibrido comenzando con una serie
de secuencias de proteínas relacionadas, como las regiones de unión
a ligando de receptores gustativos conocidos (véase, por ejemplo,
Rose, Nucleic Acids Res. 26:1628-1635 (1998); Singh,
Biotechniques 24:318-319 (1998)).
En la técnica se conocen medios para sinterizar
pares de cebadores oligonucleotídicos. Pueden usarse pares de bases
"naturales" o sintéticos. Por ejemplo, el uso de nucleobases
artificiales ofrece un enfoque versátil para manipular secuencias
de cebadores y generar una mezcla más compleja de productos de
amplificación. Diversas familias de nucleobases artificiales son
capaces de adoptar orientaciones de enlaces de hidrógeno múltiples
mediante rotaciones de enlaces internos para proporcionar medios de
reconocimiento moleculares degenerados. La incorporación de estos
análogos en una sola posición de un cebador PCR permite la
generación de una genoteca compleja de productos de amplificación.
Véase, por ejemplo, Hoops, Nucleic Acids Res. 25:
4866-4871 (1997). También pueden usarse moléculas
no polares para mimetizar la forma de las bases naturales del ADN.
Una forma de enlace no hidrógeno que imita a la adenina puede
replicarse de manera eficaz y selectiva frente a una forma no polar
que imita la timina (véase, por ejemplo, Morales, Nat.
Struct. Biol. 5:950-954 (1998)). Por ejemplo,
dos bases degeneradas pueden ser la base de pirimidina 6H,
8H-3,4-dihidropirimido
[4,5-c][1,2]oxaizin-7-ona
o la base de purina
N6-metoxi-2,6-diammopurina
(véase, por ejemplo, Hill, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:4258-4263 (1998)). Los cebadores degenerados
ejemplares de la invención incorporan el análogo nucleobase
5'-Dimetoxitritil-N-benzoil-2'-desoxi-Citidina,3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-
fosforamidita (la expresión "P" en las secuencias, véase
anteriormente). Estos enlaces de hidrógeno análogos a la pirimidina
con purinas incluyen restos A y G.
Las variantes polimórficas, alelos y homólogos
interespecie que son sustancialmente idénticos a un receptor
gustativo descrito en este documento pueden aislarse usando las
sondas de ácidos nucleicos descritas anteriormente. De manera
alternativa, para clonar polipéptidos de T1R y variantes
polimórficas, alelos y homólogos interespecie de los mismos pueden
usarse genotecas de expresión mediante la detección de homólogos
expresados inmunológicamente con antisuero o anticuerpos
purificados preparados contra un polipéptido de T1R, que también
reconoce y se une selectivamente al homólogo de T1R.
Los ácidos nucleicos que codifican regiones de
unión a ligando de receptores gustativos pueden generarse por
amplificación (por ejemplo, PCR) de secuencias de ácidos nucleicos
apropiadas usando pares de cebadores degenerados. El ácido nucleico
amplificado puede ser ADN genómico de cualquier célula o tejido o
ARNm o ADNc procedente de células que expresan el receptor
gustativo.
En una realización, pueden construirse
secuencias codificantes de proteínas híbridas que comprenden ácidos
nucleicos que codifican los T1R fusionados a secuencias de
translocación. También se proporcionan T1R híbridos que comprenden
los motivos de translocación y dominios de unión a sustancias
gustativas de otras familias de receptores quimiosensoriales,
particularmente receptores gustativos. Estas secuencias de ácidos
nucleicos pueden unirse operativamente a elementos de control
transcripcionales o traduccionales, por ejemplo, secuencias de
iniciación de la transcripción y traducción, promotoras y
potenciadoras, secuencias de terminación de la transcripción y
traducción, secuencias de poliadenilación y otras secuencias útiles
para la transcripción del ADN en ARN. En la construcción de
casetes, vectores y transgénicos de expresión recombinante puede
emplearse un fragmento promotor para dirigir la expresión del ácido
nucleico deseado en todas las células o tejidos deseados.
En otra realización, las proteínas de fusión
pueden incluir secuencias de translocación C- o
N-terminales. Adicionalmente, las proteínas de
fusión pueden comprender elementos adicionales, por ejemplo, para la
detección, purificación de proteínas u otras aplicaciones. Los
dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por
ejemplo, péptidos quelantes metálicos tales como colas de
polihistidina, módulos de histidina-triptófano u
otros dominios que permiten la purificación en metales
inmovilizados; proteínas de unión a maltosa; dominios de proteína A
que permiten la purificación en inmunoglobulinas inmovilizadas; o el
dominio utilizado en el sistema de purificación por
afinidad/extensión con FLAGS (Immunex Corp, Seatle WA).
La inclusión de secuencias conectoras de
escisión tales como el Factor Xa (véase, por ejemplo, Ottavi,
Biochimie 80: 289-293 (1998)), el motivo de
reconocimiento de subtilina proteasa (véase, por ejemplo, Polyak,
Protein Eng. 10:615-619 (1997));
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA), y similares, entre el
dominio de translocación (para la expresión eficaz en la membrana
plasmática) y el resto del polipéptido recién traducido puede ser
útil para facilitar la purificación. Por ejemplo, una construcción
puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido unida a seis restos de histidina seguido por una
tiorredoxina, un sitio de escisión enteroquinasa (véase, por
ejemplo, Williams, Biochemistry 34:1797-1797
(1995)), y un dominio de translocación C-terminal.
Los restos de histidina posibilitan la detección y purificación
mientras que el sitio de escisión enteroquinasa proporciona un
medio para purificar la proteína (o proteínas) deseada del resto de
la proteína de fusión. En la bibliografía científica y de patentes,
véase, por ejemplo, Kroll, DNA Cell. Biol. 12:
441-53 (1993) se describe bien la tecnología
perteneciente a vectores que codifican proteínas de fusión y la
aplicación de proteínas de fusión.
Los vectores de expresión, tanto vectores de
expresión individuales como bibliotecas de vectores de expresión,
que comprenden el dominio de unión a ligando que codifica secuencias
pueden introducirse en un genoma o en el citoplasma o un núcleo de
una célula y expresarse mediante una diversidad de técnicas
convencionales, bien descritas en la literatura científica y de
patentes. Véase, por ejemplo, Roberts, Nature
328:731 (1987); Berger supra; Schneider,
Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Sambrook;
Tijssen; Ausubel. Con respecto a métodos biológicos conocidos, la
información de los productos de los fabricantes de reactivos
biológicos y equipo experimental también proporciona información.
Los vectores pueden aislarse de fuentes naturales, obtenidas de
fuentes tales como bibliotecas de la ATCC o del GenBank, o
prepararse por métodos sintéticos o recombinantes.
Los ácidos nucleicos pueden expresarse en
casetes y vectores o virus de expresión, que se expresan en las
células de manera estable o transitoria (por ejemplo, sistemas de
expresión episomal). Pueden incorporarse marcadores de selección en
los casetes y vectores de expresión para conferir un fenotipo
seleccionable en células y secuencias transformadas. Por ejemplo,
los marcadores de selección pueden codificar el mantenimiento y
replicación episomal de manera que no es necesaria la integración en
el genoma hospedador. Por ejemplo, el marcador puede codificar
resistencia a antibióticos (por ejemplo, cloranfenicol, kanamicina,
G18, bleomicina, higromicina) o resistencia a herbicidas (por
ejemplo, clorosulfuron o Basta) para permitir la selección de
aquellas células transformadas con las secuencias de ADN que se
desea (véase, por ejemplo, Blondelet-Rouault,
Gene 190: 315-317 (1997); Aubrecht, J.
Pharmacol. Exp. Ther. 281: 992-997 (1997)).
Debido a que los genes marcadores seleccionables confieren
resistencia a sustratos de tipo neomicina o higromicina solamente
pueden utilizarse en cultivos de tejido, también pueden usarse
genes quimioresistentes como marcadores seleccionables in
vitro e in vivo.
Una secuencia quimérica de ácido nucleico puede
codificar un dominio de unión a ligando de T1R dentro de cualquier
polipéptido 7-transmembrana. Como los polipéptidos
del receptor 7-transmembrana tienen secuencias
primarias y estructuras secundarias y terciarias similares, los
dominios estructurales (por ejemplo, dominio extracelular, dominios
TM, dominio citoplásmico, etc.) pueden identificarse fácilmente
mediante análisis de secuencia. Por ejemplo, el modelado por
homología, el análisis de Fourier y la detección de la periodicidad
helicoidal pueden identificar y caracterizar los siete dominios con
una secuencia del receptor 7-transmembrana. Pueden
usarse algoritmos de Transformación Rápida de Fourier (FFT) para
evaluar los periodos dominantes que caracterizan perfiles de la
hidrofobicidad y variabilidad de las secuencias analizadas. El
aumento de detección de periodicidad y el índice de periodicidad
helicoidal alpha se puede hacer por, por ejemplo, Donnelly,
Protein Sci. 2:55-70 (1993). En la técnica
se conocen bien otros algoritmos de alineamiento y modelado, véase,
por ejemplo, Peitsch, Receptor Channels:
161-164 (1996); kyte & Doolittle, J. Md.
Bio., 157:105-135 (1982); Cronet, Protein Eng.
6:59-64 (1993) (homology and "discover
modeling"); http://bioinfo.weizmann.ac.il/.
La presente descripción también incluye no
solamente el ADN y las proteínas que tienen las secuencias de
aminoácidos y ácidos nucleicos específicas, sino también fragmentos
de ADN, particularmente fragmentos de, por ejemplo, 40, 60, 80,
100, 150, 200, ó 250 nucleótidos, o más, así como fragmentos de
proteínas de, por ejemplo, 10, 20, 30, 50, 70, 10, ó 150
aminoácidos, o más. Opcionalmente, los fragmentos de ácido nucleico
pueden codificar un polipéptido antigénico que puede unirse a un
anticuerpo provocado contra un miembro de la familia de T1R.
Adicionalmente, un fragmento de proteína puede ser opcionalmente un
fragmento antigénico que puede unirse a un anticuerpo provocado
contra un miembro de la familia de T1R.
También se contemplan proteínas quiméricas, que
comprenden al menos 10, 20, 30, 50, 70, 100 o 150 amino ácidos, o
más, de uno de al menos uno de los polipéptidos de T1R descritos en
este documento, acoplados a amino ácidos adicionales que
representan todo o parte de otro GPCR, preferiblemente un miembro de
la superfamilia 7 transmembrana. Estas quimeras pueden prepararse
de los presentes receptores y otro GPCR, o pueden prepararse
combinando dos o más de los presentes receptores. En una
realización, una parte de la quimera corresponde a, o procede del
dominio extracelular de un polipéptido de T1R de la invención. En
otra realización, una parte de la quimera corresponde a, o procede
del dominio extracelular y uno o más de los dominios transmembrana
de un polipéptido de T1R descrito en este documento, y la parte o
partes restantes pueden proceder de otro GPCR. En la técnica se
conocen bien los receptores quiméricos y también se conocen bien las
técnicas para crearlos y la selección y limites de dominios o
fragmentos de receptores acoplados a proteína G para incorporarlos
en su interior. Por tanto, este conocimiento de los expertos en la
materia puede usarse fácilmente para crear dichos receptores
quiméricos. El uso de dichos receptores quiméricos puede
proporcionar, por ejemplo, una selección gustativa característica
de uno de los receptores especialmente descrito en este documento,
acoplado con la transducción de señal característica de otro
receptor, tal como un receptor bien conocido usado en sistemas de
ensayo de la técnica anterior.
Por ejemplo, un dominio tal como un dominio de
unión a ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembrana,
un dominio citoplasmático, un dominio N-terminal, un
domino C-terminal o cualquier combinación de los
mismos, puede unirse covalentemente a una proteína heteróloga. Por
ejemplo, un dominio extracelular de T1R puede unirse a un dominio
transmembrana de GPCR heterólogo, o un dominio extracelular de GPCR
heterólogo puede unirse a un dominio transmembrana de T1R. Otras
proteínas heterólogas de elección pueden incluir, por ejemplo,
proteína verde fluorescente, \beta-gal, receptor
de glutamato, y la presecuencia de rodopsina.
Dentro del alcance de la invención también se
encuentran las células hospedadoras para la expresión de los T1R, o
variantes de la invención. Para obtener niveles de expresión
elevados de un gen o ácido nucleico clonado, tal como los ADNc que
codifican los T1R, o variantes en la invención, un especialista
típicamente subclona la secuencia de ácido nucleico de interés en
un vector de expresión que contiene un promotor sólido para dirigir
la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción, y
para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión
al ribosoma para iniciar la translación. Los promotores bacterianos
adecuados se conocen bien en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Sambrook et al. Sin embargo, pueden usarse
sistemas de expresión eucariotas o bacterianos.
Puede usarse cualquiera de los procedimientos
bien conocidos para la introducción de secuencias de nucleótidos
extraños en células hospedadoras. Estos incluyen el uso de
transfección mediante fosfato de calcio, polibreno, fusión de
protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores
plasmáticos, vectores virales y cualquiera de los otros métodos
bien conocidos para introducir AND, ADNc, ADN sintético genómico
clonado u otro material genético extraño en una célula hospedadora
(véase, por ejemplo, Sambrook et al.). Sólo es
necesario que el procedimiento de modificación por ingeniería
genética particular usado pueda introducir satisfactoriamente al
menos una molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora que
pueda expresar el T1R, el fragmento o la variante de interés.
Después de introducir el vector de expresión en
las células, las células transfectadas se cultivan en condiciones
que favorecen la expresión del receptor, fragmento, o variante de
interés, que luego se recupera del cultivo usando técnicas
convencionales. Ejemplos de dichas técnicas se conocen bien en la
técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/06593.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la detección de genes de T1R y
expresión de genes usando tecnología de hibridación de ácidos
nucleicos, también pueden usarse inmunoensayos para detectar los
T1R, por ejemplo, para identificar células receptoras gustativas y
variantes de los miembros de la familia de T1R. Pueden usarse
inmunoensayos para analizar cuantitativamente o cualitativamente
los TR1.Una visión de conjunto de la tecnología que puede aplicarse
puede encontrarse en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual (1988).
Los expertos en la materia conocen métodos de
producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan
específicamente con un miembro de la familia de T1R (véase,
por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology
(1991); Harlow & Lane, anteriormente; Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986);
y Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497
(1975)). Dichas técnicas incluyen la preparación de anticuerpos por
selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes
en fagos o vectores similares, así como la preparación de
anticuerpos policlonales y monoclonales inmunizando conejos o
ratones (véase, por ejemplo, Huse et al.,
Science, 246:1275-1281 (1989); Ward et
al. Nature, 341:544-546 (1989)).
Pueden usarse varios inmunógenos que comprenden
T1R para producir anticuerpos reactivos específicamente con un
miembro de la familia de T1R. Por ejemplo, un polipéptido de T1R
recombinante, o un fragmento antigénico del mismo, puede aislarse
como se ha descrito en este documento. Las regiones antigénicas
adecuadas incluyen, por ejemplo, las secuencias consenso que
se usan para identificar miembros de la familia de T1R. Las
proteínas recombinantes pueden expresarse en celular eucariotas o
procariotas como se ha descrito anteriormente, y purificarse como
se ha descrito anteriormente en general. La proteína recombinante es
el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos
monoclonales o policlonales. Como alternativa, puede usarse un
inmunógeno un péptido sintético procedente de las secuencias
descritas en este documento y conjugarse con una proteína
transportadora. Las proteínas de origen natural también pueden
usarse tanto en forma pura como impura. El producto se inyecta
luego en un animal que puede producir anticuerpos. Pueden generarse
anticuerpos monoclonales o policlonales, para usar posteriormente
en inmunoensayos para cuantificar la proteína.
Los expertos en la materia conocen métodos de
producción de anticuerpos policlonales. Por ejemplo, una cepa
endogámica de ratones o conejos se inmuniza con la proteína usando
un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un
protocolo de inmunización convencional. La respuesta inmune del
animal frente a la preparación inmunógena se controla tomando
extracciones de sangre de ensayo y determinando el título de la
reactividad para el T1R. Cuando se obtienen apropiadamente títulos
elevados de anticuerpo para el inmunógeno, se extrae la sangre del
animal y se prepara antisuero. Si se desea se puede hacer un
fraccionamiento adicional del antisuero para enriquecer la
reactividad de los anticuerpos para la proteína (véase Harlow
& Lane, anteriormente).
Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse
mediante diversas técnicas familiares para los expertos en la
técnica. En resumen, pueden inmortalizarse células esplénicas de un
animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente por fusión
con una celular de mieloma (véase Kohler & Milstein,
Eur. J. Immunol., 6:511-519 (1976)). Los
métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación
con Virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos
bien conocidos en la técnica. Las colonias que proceden de células
inmortalizadas sencillas se exploran para la producción de
anticuerpos de especificidad y afinidad deseada para el antígeno, y
el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producido por dichas
células puede potenciarse mediante diversas técnicas, incluyendo la
inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como
alternativa, pueden aislarse secuencias de ADN que codifican un
anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo mediante la
exploración de una genoteca de ADN de células B humanas de acuerdo
con el protocolo general descrito por Huse et al.,
Science, 246:1275-1281 (1989).
Los anticuerpos monoclonales y el suero
policlonal se recogen y se titulan frente a la proteína inmunógena
en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con
el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. Típicamente, el
antisuero policlonal con una titulación de 104 o superior se
selecciona y se ensaya para su reactividad cruzada frente a
polipéptidos no T1R, o incluso con otros miembros de la familia de
T1R u otras proteínas relacionadas de otros organismos, usando un
inmunoensayo de unión competitivo. El antisuero policlonal
especifico y los anticuerpos monoclonales habitualmente se unirán
con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, más habitualmente al
menos aproximadamente 1 pM, opcionalmente al menos aproximadamente
0,1 pM o mejor, y opcionalmente 0,01 pM o mejor.
Una vez que están disponibles los anticuerpos
específicos del miembro de la familia T1R, pueden detectarse
proteínas y fragmentos de proteína individuales de T1R mediante
cualquiera de una diversidad de métodos de inmunoensayo. Para
revisión de procedimientos inmunológicos e inmunoensayos, véase
Basic and Clinical Immunology (Sitites & Terr eds., 7^{a}
ed. 1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención
pueden realizarse en cualquiera de las diversas configuraciones,
que se revisan exhaustivamente en Enzyme Immunoassay (Maggio,
ed., 1980); y Harlow & Lane, anteriormente.
Las proteínas, fragmentos y variantes de T1R
pueden detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios
ensayos de unión inmunológicos bien identificados (véanse, por
ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.366241; 4.376.110;
4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de inmunoensayos en
general, véase también Methods in Cell Biology: Antibodies in
Cell Biology, vol. 37 (Asai, ed. 1993); Basic and
Clinical Immunology (Sitites & Terr, eds., 7^{a} ed.
1991). Los ensayos de unión inmunológicos (o inmunoensayos)
típicamente usan un anticuerpo que se une específicamente a una
proteína o antígeno de elección (en este caso un miembro de la
familia de T1R o una subsecuencia antigénica del mismo). El
anticuerpo (por ejemplo, anti-T1R) puede producirse
mediante cualquiera de una diversidad de medios bien conocidos por
los expertos en la materia y como se ha descrito anteriormente.
Con frecuencia los inmunoensayos también usan un
agente de marcaje que se une específicamente a y marcan el complejo
formado por el anticuerpo y el antígeno. El agente de marcaje puede
ser por sí mismo uno de los restos que comprenden el complejo
anticuerpo/antígeno. Por tanto, el agente de marcaje puede ser un
polipéptido de T1R marcado o un anticuerpo anti-T1R
marcado. Como alternativa, el agente de marcaje puede ser un tercer
resto, tal como un anticuerpo secundario, que se une
específicamente al complejo anticuerpo/T1 R (un anticuerpo
secundario es típicamente especifico para anticuerpos de las
especies de las que procede el primer anticuerpo). Otras proteínas
que pueden unirse específicamente a regiones constantes de
inmunoglobulina, tales como proteína A o proteína G también pueden
usarse como agentes de marcaje. Estas proteínas muestran una fuerte
reactividad no inmunogénica con regiones constantes de
inmunoglobulina de una diversidad de especies (véase, por
ejemplo, Kronval et al., J. Immunol.,
111:1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J.
Immunol., 135:2589-2542 (1985)). El agente de
marcaje puede modificarse con un resto detectable, tal como biotina,
al que puede unirse específicamente otra molécula, tal como
estreptavidina. En la técnica los expertos en la materia conocen una
diversidad de restos detectables.
En el transcurso de los ensayos, pueden
necesitarse etapas de incubación y/o de lavado después de cada
combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de
aproximadamente 5 segundos a varias horas, opcionalmente de
aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo,
el tiempo de incubación dependerá del formato del ensayo, antígeno,
volumen de la solución, concentraciones, y similar. Habitualmente,
los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque
pueden realizarse en un intervalo de temperaturas, tal como de 10ºC
a 40ºC.
Los inmunoensayos para detectar un polipéptido
de T1R en una muestra, pueden ser competitivos y no competitivos.
Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que la cantidad
de antígeno se mide directamente. En un ensayo de tipo
"sándwich" preferido, por ejemplo, los anticuerpos
anti-T1R pueden unirse directamente a un sustrato
sólido sobre el que se encuentran inmovilizados. Estos anticuerpos
inmovilizados capturan luego el polipéptido de T1R presente en una
muestra de ensayo. El polipéptido de T1R inmovilizado de esta manera
se une después mediante un agente de marcaje, tal como un segundo
anticuerpo de T1R que lleva una etiqueta. Como alternativa, el
segundo anticuerpo puede no estar marcado, pero a su vez, puede
unirse por un tercer anticuerpo marcado especifico para anticuerpos
de la especie de la que procede el segundo anticuerpo. El segundo o
tercer anticuerpo se modifica típicamente con un resto detectable,
tal como biotina, al cual se une específicamente otra molécula, por
ejemplo estreptavidina, para proporcionar un resto detectable.
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En ensayos competitivos, la cantidad de
polipéptido de T1R presente en la muestra se mide indirectamente
midiendo la cantidad de un polipéptido de T1R (exógeno) añadido,
conocido desplazado (compitió fuera) de un anticuerpo
anti-T1R por el polipéptido de T1R desconocido
presente en una muestra. En un ensayo competitivo, a la muestra se
le añade una cantidad conocida de polipéptido de T1R y después se
pone en contacto la muestra con un anticuerpo que se une
específicamente al T1R. La cantidad de polipéptido exógeno de T1R
que se une al anticuerpo es inversamente proporcional a la
concentración de polipéptido de T1R presente en la muestra. En una
realización particularmente preferida, el anticuerpo se inmoviliza
en un sustrato sólido. La cantidad de polipéptido de T1R unido al
anticuerpo puede determinarse midiendo la cantidad de polipéptido
de T1R presente en un complejo T1R/anticuerpo, o como alternativa
midiendo la cantidad de proteína restante que no ha formado
complejo. La cantidad de polipéptido de T1R puede detectarse
proporcionando una molécula de T1R marcada.
Otro ensayo competitivo preferido es el ensayo
de inhibición con haptenos. En este ensayo el polipéptido de T1R
conocido se inmoviliza en un sustrato sólido. A la muestra se le
añade una cantidad conocida de anticuerpo anti-T1R
y después la muestra se pone en contacto con el T1R inmovilizado. La
cantidad de anticuerpo anti-T1R unida al
polipéptido de T1R inmovilizado conocido es inversamente
proporcional a la cantidad de polipéptido de T1R presente en la
muestra. De nuevo, la cantidad de anticuerpo inmovilizado puede
detectarse detectando la fracción inmovilizada del anticuerpo o la
fracción del anticuerpo que permanece en solución. La detección
puede ser directa cuando se marca el anticuerpo o indirecta
añadiendo posteriormente un resto marcado que se une
específicamente al anticuerpo como se ha descrito anteriormente.
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También pueden usarse inmunoensayos en el
formato de unión competitiva para determinaciones de reactividad
cruzada. Por ejemplo, una proteína codificada, al menos
parcialmente, por las secuencias de ácido nucleico descritas en
este documento puede inmovilizarse en un soporte sólido. Las
proteínas (por ejemplo, polipéptidos de T1R y homólogos) se añaden
al ensayo que compite por la unión del antisuero para el antígeno
inmovilizado. La capacidad de las proteínas añadidas para competir
por la unión del antisuero a la proteína inmovilizada se compara
con la capacidad del polipéptido de T1R codificado por las
secuencias de ácido nucleico descritas en este documento para
competir con el mismo. El porcentaje de
reactividad-cruzada para las proteínas anteriores
se calcula, usando cálculos convencionales. Los antisueros con menos
del 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas
añadidas enumeradas anteriormente se seleccionan y se agrupan. Los
anticuerpos de reacción cruzada se eliminan opcionalmente del
antisuero agrupado por inmunoabsorción con las proteínas
consideradas añadidas, por ejemplo, homólogos relacionados
vagamente. Además, en determinaciones de reactividad cruzada pueden
usarse péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que
representan motivos conservados que se usan para identificar
miembros de la familia de T1R.
El antisuero inmunoabsorbido y agrupado se usa
después en un inmunoensayo de unión competitiva como se ha descrito
anteriormente para comparar una segunda proteína, que se piensa que
tal vez es un alelo o variante polimórfica de un miembro de la
familia de T1R, para la proteína inmunógena (es decir, polipéptido
de T1R codificado por las secuencias de ácido nucleico descritas en
este documento). Para hacer esta comparación, cada una de las dos
proteínas se ensaya en un amplio intervalo de concentraciones y se
determina la cantidad de cada proteína necesaria para inhibir el
50% de la unión del antisuero a la proteína inmovilizada. Si la
cantidad de la segunda proteína necesaria para inhibir el 50% de la
unión 10 veces menor que la cantidad de la proteína codificada por
secuencias de ácido nucleico descritas en este documento necesaria
para inhibir al 50% de la unión, entonces la segunda proteína se
dice que se une específicamente a los anticuerpos policlonales
generados para un inmunógeno de T1R.
Los anticuerpos provocados frente a motivos
conservados de T1R también pueden usarse para preparar anticuerpos
que se unen específicamente únicamente a los GPCR de la familia de
T1R, pero no a los GPCR de otras familias.
Los anticuerpos policlonales que se unen
específicamente a un miembro particular de la familia de T1R pueden
prepararse sustrayendo anticuerpos de reactividad cruzada usando
otros medios de la familia de T1R. De manera similar, pueden
prepararse anticuerpos policlonales específicos de especie. Por
ejemplo, pueden prepararse anticuerpos específicos para T1R1 humano
sustrayendo anticuerpos presentan reactividad cruzada con secuencias
ortólogas, por ejemplo, T1R1 de rata o T1R1 de ratón.
Los análisis de transferencia de Western
(inmunotransferencia) se usan para detectar y cuantificar la
presencia del polipéptido de T1R en la muestra. La técnica
generalmente comprende separar proteínas de la muestra por
electroforesis, en gel basándose en el peso molecular, transferir
las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un
filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o filtros derivatizados
de nylon), e incubar la muestra con el anticuerpo que se unen
específicamente al polipéptido de T1R. Los anticuerpos del
polipéptido anti-T1R se unen específicamente al
polipéptido de T1R en el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden
marcarse directamente o de manera alternativa pueden detectarse
posteriormente usando anticuerpos marcados (por ejemplo,
anticuerpos de oveja anti-ratón marcados) que se
unen específicamente a los anticuerpos anti-T1R.
Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos
liposómicos (LIA), que usan liposomas diseñados para unir moléculas
específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar reactivos o
marcadores encapsulados. Los productos químicos liberados después
se detectan de acuerdo con técnicas convencionales (véase Monroe
et al., Amer. Clin. Prod. Rev.,
5:34-41 (1986)).
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Un experto en la materia apreciará que a menudo
es deseable minimizar la unión no específica en inmunoensayos.
Particularmente, cuando el inmunoensayo implica un antígeno o
anticuerpo inmovilizado en un sustrato sólido es deseable minimizar
la cantidad de unión no específica al substrato. Los expertos en la
materia conocen bien medios de reducción de dicha unión no
específica. Típicamente, esta técnica implica recubrir el substrato
con una composición proteica. En particular, las composiciones de
proteína tales como albúmina de suero bovina (BSA), leche el polvo
desgrasada, y gelatina se usan ampliamente siendo la leche en polvo
la más preferida.
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La marca o grupo detectable en particular usado
en el ensayo no es un aspecto decisivo de la invención, siempre que
no interfiera significativamente con la unión específica del
anticuerpo usado en el ensayo. El grupo detectable puede ser
cualquier material que tenga una propiedad física o química
detectable. Dichos marcadores detectables se han desarrollado bien
en el campo de inmunoensayos y, en general, la mayoría de cualquier
marcador útil en dichos métodos puede aplicarse para la presente
invención. Por tanto, un marcador es cualquier composición
detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos,
inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores
útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por
ejemplo, DYNABEADSTM), colorantes fluorescentes (por ejemplo,
isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina y similares),
radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 1251, 3sS, 14C, o
^{32}P),encimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante,
fosfatasa alcalina y otras habitualmente usadas en un ELISA), y
marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o azúcar
coloreado o perlas de plástico (por ejemplo, poliestireno,
polipropileno, látex, etc.).
El marcador puede acoplarse directa o
indirectamente al componente del ensayo deseado de acuerdo con
métodos bien conocidos en la técnica. Como se ha indicado
anteriormente, puede usarse una amplia diversidad de marcadores,
dependiendo la selección del marcador de la sensibilidad necesaria,
la fácil conjugación con el compuesto, los requisitos de
estabilidad, la instrumentación disponible y los suministros de
eliminación.
Los marcadores no radioactivos frecuentemente
están unidos por medios indirectos. Generalmente, una molécula de
ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula.
El ligando después se une a otras moléculas (por ejemplo,
estreptavidina), que es inherentemente detectable o se une
covalentemente a un sistema de señal, tal como una enzima
detectable, un compuesto fluorescente, un compuesto
quimioluminiscente. Los ligandos y sus dianas pueden usarse en
cualquier combinación adecuada con anticuerpos que reconocen un
polipéptido de T1R, o anticuerpos secundarios que reconocen el
anti-T1R.
Las moléculas también pueden conjugarse
directamente con compuestos que generan señal, por ejemplo, por
conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés
como marcadores serán principalmente hidrolasas, particularmente
fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidasas, particularmente
peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y
sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc.
Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y
2,3-dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol.
Para una revisión de diversos sistemas de marcadores o de
producción de señal que pueden usarse, véase por ejemplo, la Patente
de Estados Unidos Nº 4.391.904.
Los expertos en la técnica conocen bien medios
de marcadores de detección. Por tanto, por ejemplo, cuando el
marcador es un marcador radioactivo, los medios para la detección
incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como en
auto radiografía. Cuando el marcador es un marcador fluorescente,
este puede detectarse excitando el fluorocromo con la longitud de
onda de luz apropiada y detectando la fluorescencia resultante. La
fluorescencia puede detectarse visualmente, por medio de películas
fotográficas, mediante el uso de detectores electrónicos tales como
dispositivos acoplados de carga (CCD) o fotomultiplicadores y
similares. De manera similar, los marcadores enzimáticos pueden
detectarse proporcionando los substratos apropiados para la enzima
y detectando el producto de reacción resultante. Por último pueden
detectarse marcadores colorimétricos simples observando simplemente
el color asociado al marcador. De esta manera, en diversos ensayos
de varilla, el oro conjugado con frecuencia presenta el color rosa,
mientras que diversas perlas conjugadas presentan el color de la
perla.
Algunos formatos de ensayo no necesitan usar
componentes marcados. Por ejemplo, pueden usarse ensayos de
aglutinación para detectar la presencia de los anticuerpos diana.
En este caso, las muestras que comprenden los anticuerpos diana
aglutinan las partículas recubiertas con antígeno. En este formato,
ninguno componente necesita marcarse y la presencia del anticuerpo
diana se detecta por simple inspección visual.
A continuación se describen composiciones y
métodos para determinar si un compuesto del ensayo se une
específicamente a un receptor quimiosensorial de la invención,
tanto in vitro como in vivo. Muchos aspectos de la
fisiología celular pueden controlarse para ensayar el efecto de la
unión a ligando a un polipéptido de T1R de la invención. Estos
ensayos pueden realizarse en células intactas que expresan un
receptor quimiosensorial, en células permeabilizadas, o en
fracciones de membrana producidas por métodos convencionales.
Los receptores gustativos se unen a sustancias
gustativas e inician la transducción del estimulo químico en
señales eléctricas. Una proteína G activada o inhibida modificará a
su vez las propiedades de las enzimas, canales y otras proteínas
efectoras diana. Algunos ejemplos son la activación de
fosfodiesterasa de GMPc por transducina en el sistema visual,
adenilato ciclasa por la proteína G estimuladora, fosfolipasa C por
Gq y otras proteínas G afines, y modulación de diversos canales por
proteínas Gi y otras proteínas G. Aguas abajo también pueden
examinarse consecuencias tales como la generación de diacil glicerol
e IP3 por fosfolipasa C, y a su vez, para la movilización del
calcio por IP3.
Los polipéptidos o proteínas de T1R del ensayo
se seleccionaran típicamente de un polipéptido que tiene una
secuencia de las SEQ ID Nº: 4, 10, 12, 14, 17, o fragmentos o
variantes de las mismas modificadas de manera conservativa.
Opcionalmente, los fragmentos y variantes pueden ser fragmentos
antigénicos y variantes que se unen a un anticuerpo
anti-T1R.
Como alternativa, las proteínas o polipéptidos
T1R del ensayo pueden proceder de una célula hospedadora eucariota
y pueden incluir una subsecuencia de aminoácidos que tiene una
identidad de secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NOS: 4, 10,
12, 14, 17, o fragmentos o variantes modificadas de las mismas
modificadas de manera conservativa. Generalmente, la identidad de
la secuencia de aminoácidos será al menos del 35 al 50%, u
opcionalmente el 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99%.
Opcionalmente, las proteínas o polipéptidos de T1R de los ensayos
pueden comprender un dominio de una proteína de T1R, tal como un
dominio extracelular, región transmembrana, dominio transmembrana,
dominio citoplásmico, dominio de unión a ligando y similares.
Adicionalmente, como se ha descrito anteriormente, la proteína de
T1R o un dominio de la misma pueden unirse covalentemente a una
proteína heteróloga para crear una proteína quimérica usada en los
ensayos descrito anteriormente.
Los moduladores de la actividad del receptor de
T1R se ensayan usando proteínas o polipéptidos de T1R como se ha
descrito anteriormente, recombinantes o de origen natural. Las
proteínas o polipéptidos de T1R pueden aislarse, expresarse en una
célula, expresarse en una membrana obtenida de una célula,
expresarse en un tejido o en un animal, recombinante o de origen
natural. Por ejemplo, pueden usarse cortes de lengua, células
disociadas de una lengua, células transformadas o membranas. La
modulación puede ensayarse usando uno de los ensayos in
vitro o in vivo descritos en este documento.
La transducción gustativa también puede
examinarse in vitro con reacciones en estado sólido o
soluble, usando un polipéptido de T1R de la invención. En una
realización particular, puede usarse un dominio de unión a ligando
de T1R in vitro en reacciones en estado soluble o sólido para
ensayar la unión a ligando.
Por ejemplo, se predice que el dominio
N-terminal de T1R está implicado en la unión a
ligando. Más particularmente, los T1R que pertenecen a una
subfamilia de GPCR que se caracteriza por segmentos
N-terminal extracelulares grandes, aproximadamente
de 600 aminoácidos. Se piensa que estos segmentos
N-terminal forman, al menos en parte, los dominios
de unión a ligando y por lo tanto son útiles en ensayos bioquímicos
para identificar agonistas y antagonistas de T1R. El dominio de
unión a ligando también puede contener partes adicionales del
dominio extracelular, tales como los bucles extracelulares del
dominio transmembrana. Se han usado ensayos similares con otros
GPCR que están relacionados con los T1R, tales como los receptores
de glutamato metabotrópico (véase, por ejemplo, Han y
Hampson, J. Bio. Chem. 274:10008-10013
(1999)). Estos ensayos pueden implicar desplazar un ligando marcado
radiactivamente o fluorescentemente, medir cambios de la
fluorescencia intrínseca o cambios de la susceptibilidad
proteolítica, etc.
La unión a ligando a un polipéptido de T1R de la
invención puede ensayarse en solución, en una membrana bicapa,
opcionalmente unida a una fase sólida, en una monocapa lipídica o en
vesículas. La unión de un modulador puede ensayarse usando, por
ejemplo, cambios en las características espectroscopias (por
ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice refractivo)
hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas, o propiedades
de solubilidad. Los ensayos de unión preferidos de la invención son
ensayos de unión bioquímicos que usan dominios
N-terminales de T1R solubles recombinantes.
También puede examinarse las interacciones
proteína G-receptor. Por ejemplo, puede examinarse
la unión de la proteína G al receptor, o su liberación del
receptor. Más particularmente, en la ausencia de GTP, un activador
conducirá a la formación de un complejo estrecho de una proteína G
(las tres subunidades) con el receptor. Como se ha indicado
anteriormente, este complejo puede detectarse de diversas maneras.
Un ensayo de este tipo puede modificarse para buscar inhibidores,
por ejemplo, añadiendo un activador para el receptor y la proteína
G en ausencia de GTP, que forma un complejo estrecho y después
explorar los inhibidores examinando la disociación del complejo
receptor-proteína G. En presencia de GTP, la
liberación de la subunidad alfa de la proteína G de las otras dos
subunidades de la proteína G sirve como un criterio de activación.
Una proteína G activada o inhibida modificará a su vez las
propiedades de las enzimas, canales y otras proteínas efectoras
diana.
En otra realización de la invención, puede
usarse un ensayo GTP\gammaS. Como se ha descrito anteriormente,
después de la activación de un GPCR, la subunidad G\alpha del
complejo de la proteína G se estimula para intercambiar el enlace
GDP por GTP. La estimulación mediada por ligando de la actividad de
intercambio de la proteína G puede medirse en un ensayo bioquímico
midiendo la unión de GTP\gamma^{35}S marcado radiactivamente
añadido a la proteína G en presencia de un supuesto ligando.
Típicamente, las membranas que contienen el receptor
quimiosensorial de interés se mezclan con un complejo de proteínas
G. Al ensayo se añaden inhibidores y/o activadores potenciales y
GTP\gammaS, y se mide la unión del GTP\gammaS a la proteína G.
La unión puede medirse mediante recuento por centelleo líquido o
mediante cualquier otro medio conocido en la técnica, incluyendo
ensayos de proximidad de centelleo (SPA). En otros formatos de
ensayo, puede utilizarse GTP\gammaS marcado
fluorescentemente.
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En otra realización, para detectar y controlar
la unión a ligando pueden usarse ensayos de polarización de la
fluorescencia ("FP"). La polarización de la fluorescencia es
una técnica de laboratorio versátil para medir la unión, la
hibridación de ácidos nucleicos y la actividad enzimática en
equilibrio. Los ensayos de polarización de la fluorescencia son
homogéneos ya que no necesitan una etapa de separación tal como
centrifugación, filtración, cromatografía, precipitación o
electroforesis. Estos ensayos se realizan en tiempo real,
directamente en solución y no necesitan una fase inmovilizada. Los
valores de polarización pueden medirse repetidamente y después de
la adición de reactivos ya que la medición de la polarización es
rápida y no destruye la muestra. Generalmente, esta técnica puede
usarse para medir valores de polarización de fluoróforos desde
niveles picomolares bajos a micromolares. Este apartado describe
cómo puede usarse la polarización de la fluorescencia de manera
sencilla y cuantitativa para medir la unión de ligandos a los
polipéptidos de T1R de la invención.
Cuando una molécula marcada fluorescentemente se
excita con luz plana polarizada, emite luz que tiene un grado de
polarización que es inversamente proporcional a su rotación
molecular. Las moléculas grandes marcadas fluorescentemente
permanecen relativamente estacionarias durante el estado excitado (4
nanosegundos en el caso de la fluoresceína) y la polarización de la
luz permanece relativamente constante entre la excitación y la
emisión. Las moléculas pequeñas marcadas fluorescentemente rotan
rápidamente durante el estado excitado y la polarización cambia
significativamente entre la excitación y emisión. Por lo tanto, las
moléculas pequeñas tienen valores de polarización bajos y las
moléculas grandes tienen valores de polarización altos. Por ejemplo,
un oligonucleótido monocatenario marcado con fluoresceína tiene un
valor de polarización relativamente bajo pero cuando se hibrida a
una cadena complementaria, tiene un valor de polarización mayor.
Cuando se usa FP para detectar y controlar la unión de la sustancia
gustativa que puede activar o inhibir los receptores
quimiosensoriales de la invención, pueden usarse sustancias
gustativas marcadas con fluorescencia o sustancias gustativas
auto-fluorescentes.
La polarización (P) de la fluorescencia se
define como:
En la que 100 es la intensidad
de emisión de luz paralela al plano de luz de excitación e
101 es la intensidad de la emisión de luz
perpendicular al plano de luz de excitación. P es la proporción de
las intensidades de luz y es un número adimensional. Junto con
estos ensayos puede usarse, por ejemplo, el sistema Beacon® y Beacon
2000^{TM}. Dichos sistemas típicamente expresan la polarización
en unidades de minipolarización (1 Unidad de Polarización = 1000
Unidades mP).
La relación entre la rotación molecular y el
tamaño se describe mediante la ecuación de Perrin y se remite al
lector a Jolly, M. E. (1191) in Journal of Analytical Toxicology,
pp. 236-240, que proporciona una detallada
explicación de esta ecuación. Brevemente, la ecuación de Perrin
enuncia que la polarización es directamente proporcional al tiempo
de relajación rotacional, el tiempo que tarda una molécula en rotar
a través de un ángulo de aproximadamente 68,5º. El tiempo de
relajación rotacional se relaciona con la viscosidad (\eta),
temperatura absoluta (T), volumen molecular (V), y la constante de
gas (R) mediante la siguiente ecuación:
El tiempo de relajación rotacional es pequeño
(\approx 1 nanosegundo) para moléculas pequeñas (por ejemplo
fluoresceína) y grande (\approx 100 nanosegundos) para moléculas
grandes (por ejemplo inmunoglobulinas). Si la viscosidad y la
temperatura permanecen constantes, el tiempo de relajación
rotacional, y por lo tanto la polarización, están directamente
relacionados con el volumen molecular. Los cambios en el volumen
molecular pueden deberse a interacciones con otras moléculas,
disociación, polimerización, degradación, hibridación, o cambios
conformacionales de la molécula marcada fluorescentemente. Por
ejemplo, la polarización de la fluorescencia se ha usado para medir
la escisión enzimática de polímeros grandes marcados con
fluoresceína por proteasas, DNasas y RNasas. También se ha usado
para medir la unión en equilibrio para interacciones
proteína/proteína, unión anticuerpo/antígeno, y unión
proteína/ADN.
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En otra realización, la invención proporciona
ensayos solubles usando un polipéptido de T1R; o una célula o
tejido que expresan un polipéptido de T1R. En otra realización, la
invención proporciona ensayos in vitro basados en fase
sólida en un formato de alto rendimiento, en el que el polipéptido
de T1R o célula o tejido que expresan el polipéptido de T1R está
unido a un sustrato en fase sólida.
En los ensayos de alto rendimiento de la
invención es posible explorar hasta varios miles de moduladores o
ligandos diferentes en un solo día. En particular, cada pocillo de
una placa de micro titulación puede usarse para procesar un ensayo
distinto frente a un modulador potencial seleccionado o, si van a
observarse efectos del tiempo de concentración o incubación, cada
5-10 pocillos puede ensayar un solo modulador. Por
tanto, una sola placa de micro titulación convencional pueden
ensayar aproximadamente 100 (por ejemplo, 96) moduladores. Si se
usan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede ensayar
fácilmente de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500
compuestos diferentes. También es posible ensayar compuestos
múltiples en cada pocillo de la placa. Es posible ensayar varias
placas diferentes por día; ensayar exploraciones de hasta
aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes
es posible usando los sistemas integrados de la invención. Más
recientemente, se han desarrollado enfoques micro fluidícos para
manipulación de reactivos.
La molécula de interés puede unirse al
componente en estado sólido, directamente o indirectamente, mediante
enlace covalente o no covalente, por ejemplo mediante una etiqueta.
La etiqueta puede ser cualquiera de una diversidad de componentes.
En general, una molécula que se une a la etiqueta (un agente de
unión a etiqueta) se fija a un soporte sólido y la molécula de
interés etiquetada (por ejemplo, la molécula de transducción
gustativa de interés) se une al soporte sólido por interacción de la
etiqueta y el agente de unión a la etiqueta.
Pueden usarse varias etiquetas y de agentes de
unión a etiquetas, en base a interacciones moleculares conocidas
bien descritas en la bibliografía. Por ejemplo, cuando una etiqueta
tiene un agente de unión natural, por ejemplo, biotina, proteína A
o proteína G, puede usarse junto con agentes de unión a etiqueta
apropiados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de
una inmunoglobulina, etc.). También se encuentran ampliamente
disponibles anticuerpos para moléculas con agentes de unión
naturales tales como biotina y agentes de unión a etiquetas (véase,
SIGMA Immunochemicals 1998 catálogo SIGMA, St. Louis MO).
De manera similar, cualquier compuesto hapténico
o antigénico puede usarse en combinación con un anticuerpo
apropiado para formar un par de agentes de unión etiqueta/etiqueta.
En el mercado se encuentran disponibles cientos de anticuerpos
específicos y en la bibliografía se describe cualquiera de los
anticuerpos adicionales. Por ejemplo, en una configuración común,
la etiqueta es un primer anticuerpo y el agente de unión a etiqueta
es un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo. Además
de las interacciones antígeno-anticuerpo, las
interacciones receptor-ligando también son
apropiadas como pares de agente de unión a etiqueta y etiqueta. Por
ejemplo, agonistas y antagonistas de receptores de la membrana
celular (por ejemplo, interacciones receptor-ligando
celulares tales como transferina, c-kit, ligandos
del receptor viral, aceptores de citocina, receptores de
quimioquina, receptores de interleuquina, receptores y anticuerpos
de inmunoglobulina, la familia cadherina, la familia integrina, la
familia selectina y similares; véase, por ejemplo Pigott y
Power, The Adhesion Molecular Facts Book I (1993)). De manera
similar, toxinas y venenos, epítopes virales, hormonas (por ejemplo,
opiatos, esteroides, etc.), receptores intracelulares (por ejemplo,
que median los efectos de diversos ligandos pequeños, que incluyen
esteroides, hormona tiroidea, retinoides y vitaminas D; péptidos),
fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (configuraciones
poliméricas lineales y cíclicas), oligosacáridos, proteínas,
fosfolípidos y anticuerpos pueden todos interaccionar con diversos
receptores celulares.
También pueden formar una etiqueta o un agente
de unión a etiqueta apropiado polímeros sintéticos, tales como
poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas,
polietileniminas, sulfuro de poliarileno, polisiloxanos,
poliimidas, y poliacetatos. Muchos otros pares de agentes de unión
etiqueta/etiqueta también son útiles en sistemas de ensayo
descritos en este documento, como seria evidente para un experto en
la materia después de revisar esta descripción.
Los conectores comunes tales como péptidos,
poliéteres y similares también pueden servir como etiquetas e
incluyen secuencias polipeptídicas, tales como secuencias poli gly
de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Los especialistas en
la técnica conocen dichos conectores flexibles. Por ejemplo,
conectores poli(etilenglicol) están disponibles de
Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos conectores
opcionalmente tiene enlaces amida, enlaces sulfidrilo o enlaces
heterofuncionales.
Los agentes de unión a etiquetas se fijan a
sustratos sólidos usando diversos métodos actualmente disponibles.
Los sustratos sólidos comúnmente se derivatizan o funcionalizan
exponiendo toda o una parte del sustrato a un reactivo químico que
fija un grupo químico a la superficie que reacciona con una parte
del agente de unión a etiqueta. Por ejemplo, grupos que son
adecuados para unirse a una parte de cadena larga incluirían aminas,
hidroxilo, tiol y grupos carboxilos. Los aminoalquilsilanos e
hidroxialquilsilanos pueden usarse para funcionalizar una
diversidad de superficies, tales como superficies vítreas. La
construcción de matrices biopoliméricas de fase sólida se describe
bien en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Merrifield,
J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963) (que
describe la síntesis en fase sólida de, por ejemplo,
péptidos); Geysen et al., J. Immun. Meth., 102:
259-274 (1987) (que describe la síntesis de
componentes en fase sólida en salientes poliacrílicos (pins));
Frank & Doring, Tetrahedron, 44: 60316040 (1988) (que
describe la síntesis de diversas secuencias peptídicas en discos de
celulosa); Fodor et al., Science 251:
767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical
Chemistry, 39(4); 718-719 (1993); y
Kozal et al., Nature Medicine, 2(7): 753759
(1996) (todos describen matrices de biopolímeros fijados a
sustratos sólidos). Los enfoques no químicos para fijar agentes de
unión de etiquetas a sustratos incluyen otros métodos habituales,
tales como calor, reticulación por radiación UV y similares.
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Otro ensayo para compuestos que modulan la
actividad del polipéptido de T1R implica el diseño de los compuestos
ayudados por ordenador, en los que se usa un sistema informático
para generar una estructura tridimensional de un polipéptido de T1R
en base a la información estructural codificada por su secuencia de
aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de entrada interacciona
directa y activamente con un algoritmo preestablecido en un
programa informático para producir modelos estructurales
secundarios, terciarios y cuaternarios de la proteína. Los modelos
de la estructura de la proteína se examinan después para identificar
regiones de la estructura que tienen la capacidad de unirse, por
ejemplo, ligandos. Estas regiones se usan después para identificar
ligandos que se une a la proteína.
El modelo estructural tridimensional de la
proteína se genera introduciendo en el sistema informático
secuencias de aminoácidos de la proteína de al menos 10 restos
aminoacídicos o secuencias del ácido nucleico correspondientes que
codifican un polipéptido de T1R. La secuencia de nucleótidos que
codifica el polipéptido de T1R o la secuencia de aminoácidos de
estos, puede ser cualquier secuencia descrita en este documento y
versiones conservativamente modificadas de estas.
La secuencia de aminoácidos representa la
secuencia o subsecuencia primaria de la proteína, que codifica la
información estructural de la proteína. Al menos 10 restos de la
secuencia de aminoácidos (o una secuencia de nucleótidos que
codifica 10 aminoácidos) se introducen en el sistema informático
desde el teclados del ordenador, sustratos legibles que incluyen,
pero sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (por
ejemplo disquetes magnéticos, cintas, cartuchos y microplacas),
medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), información distribuida por
sitios de internet y por RAM. El modelo estructural tridimensional
de la proteína después se genera por la interacción de la secuencia
de aminoácidos y el sistema informático, usando programas
informáticos conocidos por los expertos en la materia.
La secuencia de aminoácidos representa una
estructura primaria que codifica la información necesaria para
formar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la
proteína de interés. El programa informático busca determinados
parámetros codificados por la secuencia primaria para generar el
modelo estructural. Estos parámetros se denominan "términos de
energía" y principalmente incluyen potenciales electroestáticos,
potenciales hidrófobos, superficies accesibles disolventes y unión
a hidrógeno. Los términos de energía secundarios incluyen
potenciales de van der Waals. Las moléculas biológicas forman las
estructuras que minimizan los términos de energía de un modo
acumulativo. El programa informático usa por lo tanto estos términos
codificados por la estructura primaria o secuencia de aminoácidos
para crear el modelo estructural secundario.
La estructura terciaria de la proteína codifica
por la estructura secundaria se forma después basándose en los
términos de energía de la estructura secundaria. El usuario en este
punto puede introducir variables adicionales tales como si la
proteína es de unión a membrana o soluble, su localización en el
cuerpo, y su localización celular, por ejemplo,
citoplásmica, superficie o núcleo. Estas variables junto con los
términos de energía de la estructura secundaria se usan para formar
el modelo de la estructura terciaria. En el modelado de la
estructura terciaria, el programa informático compara caras
hidrófobas de la estructura secundaria con iguales y caras
hidrófilas de la estructura secundaria con iguales.
Una vez que se ha generado la estructura, las
regiones potenciales de unión a ligando se identifican por el
sistema informatizado. Las estructuras tridimensionales para
ligandos potenciales se generan introduciendo las secuencias de
aminoácidos o de nucleótidos o fórmulas químicas de compuestos, como
se ha descrito anteriormente. La estructura tridimensional del
ligando potencial después se compara con la del polipéptido de T1R
para identificar ligandos que se unen a la proteína. La afinidad de
unión entre la proteína y los ligandos se determina usando términos
de energía para determinar los ligandos que tienen una probabilidad
mejorada de unión a la proteína.
Los sistemas informáticos también se usan para
explorar mutaciones, variantes polimórficas, alelos y homólogos
interespecie de genes de T1R. Dichas mutaciones pueden asociarse con
estados de enfermedades o rasgos genéticos. Como se ha descrito
anteriormente, también puede usarse GeneChip^{TM} y tecnología
relacionada para explorar mutaciones, variantes polimórficas,
alelos y homólogos interespecie. Una vez que las variantes se han
identificado, puede usarse un ensayo de diagnóstico para
identificar pacientes que tienen dichos genes mutados. La
identificación de los genes de T1R mutados implica la recepción de
la entrada de un primer ácido nucleico o secuencia de aminoácidos
de un gen de T1R o versiones modificadas conservativamente del
mismo. La secuencia se introduce en el sistema informático como se
ha descrito anteriormente. La primera secuencia de ácidos nucleicos
o de aminoácidos después se compara con una segunda secuencia de
ácidos nucleicos o de aminoácidos que sustancialmente es idéntica a
la primera secuencia. La segunda secuencia se introduce en el
sistema informático de la manera descrita anteriormente. Una vez
comparadas las secuencias primera y segunda, se identifican las
diferencias de nucleótidos o aminoácidos entre las secuencias.
Dichas secuencias pueden representar diferencias alélicas en
diversos genes de T1R y mutaciones asociadas con estados de
enfermedades y rasgos genéticos.
En una realización, una proteína o polipéptido
de T1R se expresa en una célula eucariota como un receptor
quimérico con una secuencia chaperona heteróloga que facilita su
maduración y dirección mediante la ruta secretora. Dichos
polipéptidos quiméricos de T1R pueden expresarse en cualquier célula
eucariota, tal como células HEK-293.
Preferiblemente, las células comprenden una proteína G funcional,
por ejemplo, G\alpha15, que es capaz de acoplar el
receptor quimérico a una ruta de señalización intracelular o a una
proteína de señalización tal como fosfolipasa C. La activación de
dichos receptores quiméricos en dichas células puede detectarse
usando cualquier método convencional, tal como detectando cambios
en el calcio intracelular detectando en la célula la fluorescencia
dependiente de
FURA-2.
FURA-2.
Los receptores GPCR activados se convierten en
sustratos para quinasas que fosforilan la cola C terminal de
receptor (y posiblemente también otros sitios). Por tanto, los
activadores promoverán la transferencia de 32P de GTP marcado con
gamma al receptor, que puede ensayarse con un contador de centelleo.
La fosforilación de la cola C terminal promoverá la unión de
proteínas de tipo arrestina e interferirán con la unión de proteínas
G. La ruta quinasa/arrestina desempeña un papel clave en la
desensibilización de muchos receptores GPCR. Por ejemplo,
compuestos que modulan la duración de un receptor gustativo que
permanece activo podría ser útil como un medio para prolongar un
gusto deseado o eliminar un gusto indeseado. Para una revisión
general de la señal de la transducción de señal de GPCR y métodos
de ensayo de la transducción de señal, véase, Methods in
Enzymology, vols. 237 y 238 (1994) y volumen 96 (1983); Bourne
et al., Nature, 10:
349-117-27 (1991); Bourne
et al., Nature, 348: 125-32 (1990);
Pitcher et al., Annu. Rev. Biochem., 67:
653-92 (1998).
La modulación de T1R puede ensayarse comparando
la respuesta de un polipéptido de T1R tratado con un supuesto
modulador de T1R para determinar la respuesta de una muestra de
control no tratada. Dichos supuestos moduladores de T1R pueden
incluir sustancias gustativas que pueden inhibir o activar la
actividad del polipéptido de T1R. En una realización, se asigna a
las muestras de control (no tratadas con activadores o inhibidores)
un valor de actividad T1R relativo de 100. La inhibición de un
polipéptido de T1R se consigue cuando el valor de actividad T1R con
respecto al control es aproximadamente del 90%, opcionalmente del
50%, opcionalmente del 25-0%. La activación de un
polipéptido de T1R se consigue cuando el valor relativo de la
actividad T1R con respecto al control es del 110%, opcionalmente
del 150%, 200-500% o 1000-2000%.
Pueden ensayarse cambios en el flujo iónico
determinando cambios de polarización iónica (es decir, potencial
eléctrico) de la célula o membrana que expresa un polipéptido de
T1R. Un medio para determinar cambios en la polarización celular es
midiendo cambios en la corriente (midiendo por lo tanto cambios en
la polarización) con técnicas de pinzamiento de voltaje y
pinzamiento zonal (véase, por ejemplo, el modo "célula
adjunta", el modo "dentro-fuera" y el modo
"célula completa", por ejemplo, Ackerman et al., New
Engl. J. Med. 336:1575-1595 (1997)). Las
corrientes en célula completa se determinan convenientemente usando
el patrón. Otros ensayos conocidos incluyen: ensayos de flujo
iónico radiomarcados y ensayos de fluorescencia que usan colorantes
sensibles a voltaje (véase, por ejemplo,
Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrana
Biol., 88: 67-75 (1988); Gonzales & Tsien,
Chem. Biol., 4: 269277 (1997); Daniel et al., J.
Pharmacol. Meth., 25: 185-193 (1991); Holevinsky
et al., J. Membrana Biology, 137: 59-70
(1994)). Generalmente, los compuestos a ensayar están presentes en
el intervalo de 1 pM a 100 mM.
Los efectos de los compuestos de ensayo después
de la función de los polipéptidos pueden medirse examinando
cualquiera de los parámetros descritos anteriormente. Cualquier
cambio fisiológico adecuado que incida sobre la actividad de GPCR
puede usarse para evaluar la influencia de un compuesto de ensayo en
los polipéptidos de esta invención. Cuando las consecuencias
funcionales se determinan usando células o animales intactos, puede
medirse también una diversidad de efectos tales como liberación del
trasmisor, liberación hormonal, cambios transcripcionales para
marcadores conocidos y no caracterizados (por ejemplo transferencias
de northern), cambios en el metabolismo celular tales como
crecimiento celular o cambios de pH y cambios en los mensajeros
segundos intracelulares tales como Ca^{2+}, IP3, GMPc o AMPc.
Los ensayos preferidos para los GPCR incluyen
células cargadas con iones o colorantes sensibles a voltaje para
revelar actividad receptora. Los ensayos para determinar la
actividad de dichos receptores también pueden usar agonistas y
antagonistas conocidos de otros receptores acoplados a proteína G
como controles negativos o positivos para evaluar la actividad de
los compuestos ensayados. En ensayos para identificar compuestos
moduladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas), los cambios en
el nivel de iones en el citoplasma o el potencial de membrana se
controlarán usando un indicador sensible a iones o fluorescente de
potencial de membrana, respectivamente. Entre los indicadores
sensibles a iones y sondas de potencial que pueden emplearse se
encuentran los descritos en el Catálogo Molecular Probes 1997. Para
receptores acoplados a proteína G, en el ensayo de elección pueden
usarse proteínas G promiscuas tales como G\alpha15 y G\alpha16
(Wilkie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 88:
10049-10053 (1991)). Dichas proteínas G promiscuas
permiten el acoplamiento de un amplio intervalo de receptores.
La activación de receptor típicamente inicia
acontecimientos intracelulares posteriores, por ejemplo,
aumentos en los mensajeros segundos tales como IP3, que liberan
reservas intracelulares de iones calcio. La activación de algunos
receptores acoplados a proteína G estimula la formación de
trifosfato inositol (IP3) mediante la hidrólisis de
fosfatidilinositol mediada por fosfolipasa C (Berridge & Irving,
Nature, 312: 315-21 (1984)). IP3 a su vez
estimula la liberación de reservas de iones calcio intracelular. Por
tanto, para ensayar la función del receptor acoplado a proteína G
puede usarse un cambio en los niveles de iones calcio citoplásmico o
un cambio en los niveles de mensajeros segundos tales como IP3. Las
células que expresan dichos receptores acoplados a proteína G
pueden mostrar niveles de calcio citoplásmico aumentados como
resultado de la contribución de reservas intracelulares y mediante
la activación de canales iónicos, en cuyo caso puede ser deseable
aunque no necesario realizar dichos ensayos en tampones sin calcio,
opcionalmente complementados con un agente quelante tal como EGTA,
para distinguir la respuesta de la fluorescencia resultante de la
liberación del calcio a partir de reservas internas.
Otros ensayos pueden implicar determinar la
actividad de receptores que, cuando se activan, dan lugar a un
cambio en el nivel de nucleótidos cíclicos intracelulares, por
ejemplo, AMPc o GMPc, activando o inhibiendo enzimas tales como
adenilato ciclasa. Existen canales de iones regulados por
nucleótidos cíclicos, por ejemplo, canales de las células bastón
fotorreceptoras y canales de las neuronas olfativas que son
permeables a cationes tras la activación mediante la unión de AMPc
o GMPc (véase, por ejemplo, Altenhofen et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci., 88: 9868-9872 (1991) y Dhallan
et al., Nature, 347:184-187 (1990)).
En casos en los que la activación del receptor da lugar a una
disminución de los niveles de nucleótidos cíclicos, puede ser
preferible exponer las células a agentes que aumentan los niveles
de nucleótidos cíclicos intracelulares, por ejemplo,
forsfocolina, antes de añadir un compuesto
activador-receptor a las células en el ensayo. Para
este tipo de ensayo pueden prepararse células por
co-transfección de una célula hospedadora con ADN
que codifica un canal iónico regulado por nucleótidos cíclicos,
fosfatasa GPCR y ADN que codifica un receptor (por ejemplo,
determinados receptores de glutamato, receptores de acetilcolina
muscarínicos, receptores de dopamina, receptores de serotonina y
similares), que, cuando se activan, causan un cambio en los niveles
de nucleótidos cíclicos en el citoplasma.
En una realización preferida, la actividad del
polipéptido de T1R se mide mediante la expresión de un gen de T1R
en una célula heteróloga con una proteína G promiscua que une el
receptor a una ruta de transducción de señal de fosfolipasa C
(véase Offermanns & Simon, J. Biol. Chem., 270:
15175-15180 (1995)). Opcionalmente la línea celular
es HEK-293 (que no expresa naturalmente genes de
T1R) y la proteína G promiscua es G\alpha15 (Offermanns &
Simon, anteriormente). La modulación de la transducción
gustativa se ensaya midiendo cambios en los niveles de Ca^{2+}
intracelular, que cambian como respuesta a la modulación de la ruta
de transducción de señal de T1R mediante la administración de una
molécula que se asocia con un polipéptido de T1R. Los cambios en
los niveles de Ca^{2+} se miden opcionalmente usando colorantes
indicadores de Ca^{2+} fluorescente y formación de imágenes
fluorométricas.
En una realización, los cambios en el AMPc o
GMPc intracelular pueden medirse usando inmunoensayos. El método
descrito en Offermanns & Simon, J. Bio. Chem., 270:
15175-15180 (1995), puede usarse para determinar el
nivel de AMPc. También, el método descrito en
Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and
Mol. Biol., 11: 159-164 (1994), puede usarse
para determinar el nivel de GMPc. Además, en la Patente de Estados
Unidos 4.115.538 se describe un kit de ensayo para medir AMPc y/o
GMPc.
En otra realización, la hidrólisis del
fosfatidilinositol (PI) puede analizarse de acuerdo con la Patente
de Estados Unidos 5.436.128. En resumen, el ensayo supone el marcaje
de células con 3H-mioinositol durante 48 horas o
más. Las células marcadas se tratan con un compuesto de ensayo
durante 1 hora. Se produce la lisis de las células tratadas y se
realiza la extracción en
agua-metanol-cloroformo después de
separar los fosfatos inositol por cromatografía de intercambio
iónico y se cuantifica por recuento del centelleo. La estimulación
del plegamiento se determina calculando la proporción de cpm en
presencia de agonista, respecto a cpm en presencia del control
tampón. Del mismo modo, la inhibición del plegamiento se determina
calculando la proporción de cpm en presencia de antagonista, con
respecto a cpm en presencia del control tampón (que puede contener o
no un agonista).
En otra realización, los niveles de
transcripción pueden medirse para evaluar los efectos de un
compuesto del ensayo en la transducción de señal. Una célula
hospedadora que contiene un polipéptido de T1R de interés se pone
en contacto con un compuesto del ensayo durante un tiempo suficiente
para efectuar cualquier interacción, y después se mide el nivel de
expresión del gen. La cantidad de tiempo para efectuar dichas
interacciones puede determinarse empíricamente, tal como dejando
transcurrir un tiempo y midiendo el nivel de transcripción como una
función de tiempo. La cantidad de transcripción puede medirse usando
cualquier método que sea adecuado conocido por los expertos en la
materia. Por ejemplo, la expresión de ARNm de la proteína de interés
puede detectarse usando transferencias de northern o sus productos
polipeptídicos pueden identificarse usando inmunoensayos. Como
alternativa, pueden usarse ensayos basados en transcripción que usan
genes indicadores como se describe en la Patente de Estados Unidos
5.436.128.
Los genes indicadores pueden ser, por ejemplo,
cloramfenicol acetiltransferasa, luciferasa,
3-galactosidasa y fosfatasa alcalina.
Adicionalmente, la proteína de interés puede usarse como un
indicador indirecto mediante la unión a un segundo indicador tal
como proteína verde fluorescente (véase, por ejemplo Mistili &
Spector, Nature Biotechnology, 15: 961-964
(1997)).
La cantidad de transcripción después se compara
con la cantidad de transcripción en la misma célula en ausencia del
compuesto del ensayo o puede compararse con la cantidad de
transcripción en una célula sustancialmente idéntica que carece del
polipéptido de T1R de interés. Una célula sustancialmente idéntica
puede obtenerse a partir de las mismas células de las que se han
preparado las células recombinantes pero que no se han modificado
mediante la introducción de ADN heterólogo. Cualquier diferencia en
la cantidad de transcripción indica que el compuesto del ensayo de
alguna manera tiene modificada la actividad del polipéptido de T1R
de interés.
Animales no humanos que expresan una o más
secuencias receptoras quimiosensoriales de la invención, también
puede usarse para ensayos de receptor. Dicha expresión puede usarse
para determinar si un compuesto del ensayo se une específicamente a
un polipéptido gustativo del receptor transmembrana en mamíferos
in vivo poniendo en contacto un animal no humano
transfectado de manera estable o transitoria con un ácido nucleico
que codifica un receptor quimiosensorial o una región de unión a
ligando del mismo con un compuesto del ensayo y determinando si el
animal reacciona al compuesto del ensayo uniendo específicamente el
polipéptido al receptor.
Los animales transfectados o infectados con los
vectores de la invención son particularmente útiles para los
ensayos para identificar y caracterizar ligandos/sustancias
gustativas que pueden unirse a un receptor específico o conjunto de
receptores. Dichos animales infectados por vectores que expresan
secuencias receptoras quimiosensoriales pueden usarse para explorar
in vivo sustancias gustativas y su efecto en, por
ejemplo, la fisiología celular (por ejemplo, en neuronas
gustativas), en el SNC, o comportamiento.
En la técnica se conocen bien medios para
infectar/expresar los vectores y ácidos nucleicos, individualmente
o como bibliotecas. Mediante diversos medios, pueden medirse
diversos parámetros en células individuales, órganos o en animales
completos. Por ejemplo, las secuencias de T1R de la invención pueden
expresarse en tejidos gustativos animales mediante administración
con un agente de infección, por ejemplo un vector de expresión
adenovirus.
Los genes endógenos del receptor quimiosensorial
pueden permanecer funcionales y pueden presentar aún actividad de
tipo silvestre (nativo). En otras situaciones, cuando se desea que
toda la actividad del receptor quimosensorial sea por el receptor
híbrido exógeno introducido, se prefiere el uso de una línea
desactivada (knockout). En la técnica se conocen bien métodos para
la construcción de animales transgénicos no humanos, particularmente
ratones transgénicos y la selección y preparación de construcciones
recombinantes para generar células transformadas.
La construcción de una célula y animal
"knockout" se basa en la premisa de que el nivel de expresión
de un gen en particular en una célula de mamífero puede disminuirse
o anularse completamente introduciendo el genoma una nueva
secuencia de ADN que sirve para interrumpir alguna parte de la
secuencia de ADN del gen a suprimir. También puede usarse la
"inserción atrapa genes" para alterar un gen hospedador y
células madre embriónicas (ES) de ratón pueden usarse para producir
animales transgénicos knockout (véase, por ejemplo, Holzschu,
Transgenic Res 6: 97-106 (1997)). La
inserción del exógeno es típicamente por recombinación homóloga
entre secuencias de ácido nucleico complementario. La secuencia
exógena es alguna parte del gen diana a modificar, tales como
secuencias exónicas, intrónicas o reguladoras de la transcripción, o
cualquier secuencia genómica que es estable para afectar el nivel
de la expresión del gen diana; o una combinación de los mismos. La
dirección de los genes mediante recombinación homóloga en células
madre embriónicas pluripotenciales permiten modificar de manera
precisa la secuencia genómica de interés. Cualquier técnica puede
usarse para crear, explorar, propagar, un animal knockout, por
ejemplo, véase Bijvoet, Hum. Mot. Genet 7:
53-62 (1998); Moreadith, J. Mot. Med, 75:
208-216 (1997); Tojo, Cytotechnology 19:
161-165 (1995); Mudgett, Methods Mot. Biol
48: 167-184 (1995); Longo, Transgenic Res.
6: 321-328 (1997); las Patentes de Estados Unidos Nº
5.616.491; 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992; 5.627.059; 5.272.071;
WO 91/09955; WO93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650.
Los ácidos nucleicos de la invención también
pueden usarse como reactivos para producir células humanas
"knockout" y su progenie. Del mismo modo, los ácidos nucleicos
de la invención también pueden usarse como reactivos para producir
"knock-ins" en ratones. Las secuencias de genes
de T1R de rata o de ser humano pueden reemplazar la T1R ortóloga en
el genoma del ratón. De esta manera, se produce un ratón que expresa
un T1R de rata o de ser humano. Este ratón después puede usarse
para analizar la función de los T1R de rata o de ser humano y para
identificar ligandos para dichos T1R.
Los compuestos ensayados como moduladores de un
miembro de la familia de T1R pueden ser cualquier compuesto químico
pequeño, o una entidad biológica, tal como una proteína, azúcar,
ácido nucleico o lípido. De manera alternativa, los moduladores
pueden ser versiones modificadas genéticamente de un gen de T1R.
Típicamente, los compuestos del ensayo serán moléculas químicas y
péptidos pequeños. Esencialmente en los ensayos de la invención,
puede usarse cualquier compuesto químico como un modulador o ligando
potencial, sin embargo en la mayoría de los casos se usan
compuestos que pueden disolverse en soluciones acuosas u orgánicas
(especialmente basadas en DMSO). Los ensayos se diseñan para
explorar grandes bibliotecas químicas automatizando las etapas del
ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente
para ensayar, que se procesan típicamente en paralelo (por
ejemplo, en formatos de microtitulación o en placas de
microtitulación en ensayos informatizados). Deberá apreciarse que
existen muchos proveedores de compuestos químicos, incluyendo Sigma
(St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO),
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka
Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland) y
similares.
En una realización preferida, los métodos de
exploración de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca
peptídica o química combinatoria que contiene una gran cantidad de
compuestos terapéuticos potenciales (moduladores o compuestos
ligando potenciales). Dichas "bibliotecas combinatorias
químicas" o "bibliotecas de ligandos" se exploran después
en uno o más ensayos, como se describe en este documento, para
identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies o
subclases químicas particulares) que presentan una actividad
característica deseada. Los compuestos identificados de esta manera
pueden servir como "compuestos candidatos" convencionales o
ellos mismos pueden usarse como agentes terapéuticos potenciales o
verdaderos.
Una biblioteca química combinatoria es una
colección de varios compuestos químicos generados por síntesis
química o biológica, combinando una cantidad de "bloques de
construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una
biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca
polipeptídica se forma combinando una serie de bloques de
construcción químicos (aminoácidos) de cualquier manera posible para
una longitud determinada de un compuesto (es decir, el número de
aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Mediante dicha mezcla
combinatoria de bloques de construcción químicos pueden sintetizarse
millones de compuestos químicos.
La preparación y exploración de bibliotecas
químicas combinatorias se conoce bien por los expertos en la
técnica. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero
sin limitación, bibliotecas peptídicas (véase, por ejemplo,
la Patente de Estados Unidos 5.010.175, Furka, Int. J. Pept.
Prot. Res., 37: 487-493 (1991) y Houghton et
al, Nature, 354: 84-88 (1991)). También
pueden usarse otros productos químicos para generar bibliotecas de
diversidad química. Dichos productos químicos incluyen, pero sin
limitación: peptoides (por ejemplo, Publicación PCT Nº WO
91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, Publicación PCT
Nº WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (por
ejemplo, Publicación PCT Nº WO 92/00091), benzodiacepinas (por
ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.288.514), diversómeros
tales como hidantoínas, benzodiacepinas y dipéptidos (Hobbs et
al, Proa Nat Acad. Set, 90: 6909-6913
(1993)), polipéptidos vinilógos (Hagihara et al, J. Amer. Chew.
Soc, 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con
armazón de glucosa (Hirschmann et al, J. Amer. Chem.
Soc, 114: 9217-9218 (1992)), síntesis orgánica
de análogos de bibliotecas de pequeños compuestos (Chen et
al., J. Amer. Chem. Soc, 116: 2661 (1994)),
oligocarbamatos (Cho et al., Science, 261: 1303
(1993)), peptidil fosfonatos (Campbell et al, J, Org.
Chem., 59: 658 (1994)), bibliotecas de ácidos nucleicos
(Ausubel, Berger y Sambrook, todos anteriormente),
bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (Patente de Estados
Unidos 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (Vaughn et al.,
Nature Biotechnology, 14(3):
309-314(1996) y PCT/US96/10287), bibliotecas
de hidratos de carbono (Liang et al., Science, 274;
1520-1522 (1996) y Patente de Estados Unidos
5.593.853), bibliotecas de pequeñas moléculas orgánicas
(benzodiacepinas, Baum, C&EN, 18 enero, pág. 33
(1993); tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de Estados Unidos
5.549.974; pirrolidinas, Patentes de Estados Unidos 5.525.735 y
5.519.134; compuestos morfolino, Patente de Estados Unidos
5.506.337; benzodiacepinas, 5.288.514 y similares).
Los dispositivos para la preparación de
bibliotecas combinatorias se encuentran disponibles (véase, por
ejemplo, 357 MPS, 390 MPS (Advanced Chem Tech, Louisville KY),
Symphony (Rainin, Woburn, MA), 433A (Applied Biosystems, Foster
City, CA), 9050 Plus (Millipore, Bedford, MA)). Además, numerosas
bibliotecas combinatorias se encuentran ellas mismas disponibles en
el mercado (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ;
Tripos, Inc., St. Louis, MO; 3D Pharmaceuticals, Bxton, PA; Martek
Biosciences; Columbia, MD; etc).
En un aspecto de la invención, los moduladores
de T1R pueden usarse en cualquier producto alimentario, dulces,
composiciones farmacéuticas o ingredientes de los mismos para
modular por lo tanto el gusto del producto, la composición o los
ingredientes de una manera deseada. Por ejemplo, a un producto o
composición edulcorante pueden añadirse moduladores de T1R que
potencian la sensación gustativa dulce, al mismo tiempo que para
mejorar el gusto de un producto o composición pueden añadirse
moduladores de T1R que bloquean sensaciones gustativas no
deseables.
La invención también proporciona preferiblemente
métodos para representar la percepción del gusto y/o para predecir
la percepción del gusto en un mamífero, incluyendo en un ser humano.
Preferiblemente, dichos métodos pueden realizarse usando los
receptores y genes que codifican dichos polipéptidos de T1R
descritos en este documento.
También se describe un método de exploración de
uno o más compuestos para determinar la presencia de un gusto
detectable por un mamífero, que comprende: poner en contacto dicho
uno o mas compuestos con los receptores descritos, preferiblemente
en el que el animal es un ser humano. También se describe un método
para representar la percepción gustativa de un gusto particular en
un ser humano, que comprende las etapas de proporcionar valores
X_{l} a X_{n} representativos de la estimulación cuantitativa de
cada uno de los n receptores quimiosensoriales de dicho
vertebrado, en el que n es superior o igual a 2; y generar a
partir de dichos valores una representación cuantitativa de la
percepción gustativa. Los receptores quimiosensoriales pueden ser un
receptor quimiosensorial descrito en este documento, la
representación puede constituir un punto o un volumen en el espacio
n-dimensional, puede constituir un gráfico o un espectro y
puede constituir una matriz de representaciones cuantitativas. La
etapa de proporcionar valores también puede comprender poner en
contacto una pluralidad de receptores quimiosensoriales producidos
de manera recombinante con una composición del ensayo y medir
cuantitativamente la interacción de dicha composición con dichos
receptores.
También se describe un método para predecir la
percepción gustativa en un mamífero generado por una o más
moléculas o combinaciones de moléculas que producen una percepción
gustativa desconocida en un mamífero, que comprende las etapas de:
proporcionar valores X_{l} a X_{n} representativos de la
estimulación cuantitativa de cada uno de los n receptores
quimiosensoriales de dicho vertebrado, en el que n es
superior o igual a 2, para una o más moléculas o combinaciones de
moléculas que producen la percepción gustativa conocida en un
mamífero; y generar a partir de dichos valores una representación
cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para la una
o más moléculas o combinaciones de moléculas que producen la
percepción gustativa conocida en un mamífero, proporcionando
valores X_{l} a X_{n} representativos de la estimulación
cuantitativa de cada uno de los n receptores
quimiosensoriales de dicho vertebrado, en el que n es
superior o igual a 2, para una o más moléculas o combinaciones de
moléculas que producen la percepción gustativa desconocida en un
mamífero; y generar a partir de dichos valores una representación
cuantitativa de la recepción gustativa en un mamífero para la una o
más moléculas o combinaciones de moléculas que producen una
percepción gustativa desconocida en un mamífero y predecir la
percepción gustativa en un mamífero generada por una o más moléculas
o combinaciones de moléculas que producen la percepción gustativa
desconocida en un mamífero comparando la representación
cuantitativa de la percepción gustativa en un mamífero para la una o
más moléculas o combinaciones de moléculas que producen la
percepción gustativa desconocida en un mamífero para la
representación cuantitativa de la percepción gustativa en un
mamífero para la una o más moléculas o combinaciones de moléculas
que producen la percepción gustativa conocida en un mamífero. Los
receptores quimiosensoriales usados en este método pueden incluir
un receptor quimiosensorial descrito en este documento.
En otra realización, se generan nuevas moléculas
o combinaciones de moléculas que provocan una percepción gustativa
predeterminada en un mamífero determinando un valor de percepción
gustativa en un mamífero para una molécula o combinaciones de
moléculas desconocidas como se ha descrito anteriormente; se
determina un valor de percepción gustativa en un mamífero para una
o más moléculas o combinaciones de moléculas desconocidas como se
ha descrito anteriormente; se compara el valor de percepción
gustativa en un mamífero para una o más composiciones desconocidas
con respecto al valor de percepción gustativa en un mamífero para
una o más composiciones conocidas; se selecciona una molécula o
combinaciones de moléculas que provocan una percepción gustativa
predeterminada en un mamífero; y se combinan dos o más moléculas o
combinaciones de moléculas desconocidas para formar una molécula o
combinación de moléculas que provocan una percepción gustativa
predeterminada en un mamífero. La etapa de combinación produce una
sola molécula simple o una combinación de moléculas que provocan una
percepción de gustativa predeterminada en un animal.
En otra realización, se proporciona un método
para estimular un gusto, que comprende las etapas de: para cada uno
de una pluralidad de receptores quimiosensoriales clonados,
preferiblemente receptores humanos, determinar el grado en el que
interacciona el receptor con la sustancia gustativa, y combinar una
pluralidad de compuestos, cada uno con una interacción previamente
determinada con uno o más de los receptores, en cantidades que
juntos proporcionan un perfil de estimulación sobre el -receptor
que mimetiza el perfil de la sustancia gustativa. La interacción de
una sustancia gustativa con un receptor quimiosensorial puede
determinarse usando cualquiera de los ensayos de unión o
indicadores descritos en este documento. La pluralidad de compuestos
puede después combinarse para formar una mezcla. Si se desea, uno o
más de la pluralidad de los compuestos pueden combinarse
covalentemente. Los compuestos combinados sustancialmente estimulan
al menos el 75%, 80% o el 90% de los receptores que estimula
sustancialmente la sustancia gustativa.
En otra realización preferida, se ensaya una
pluralidad de compuestos convencionales frente a una pluralidad de
receptores quimiosensoriales para determinar el grado al cual cada
uno de los receptores interacciona con cada compuesto convencional,
generando por lo tanto un perfil de estimulación sobre el receptor
para cada compuesto convencional. Estos perfiles de estimulación de
los receptores pueden después almacenarse en una base de datos
relacional en un medio de almacenaje de datos. El método puede
comprender adicionalmente proporcionar un perfil de estimulación
sobre el receptor deseado para un gusto; comparar el perfil de
estimulación sobre el receptor deseado con la base de datos
relacional; y determinar una o más combinaciones de compuestos
convencionales que más estrechamente coinciden con el perfil de
estimulación sobre el receptor deseado. El método puede comprender
adicionalmente combinar compuestos convencionales en una o más de
las combinaciones determinadas para estimular el
gusto.
gusto.
Los genes de T1R y sus homólogos son
herramientas útiles para identificar células receptoras
quimiosensoriales, para determinaciones forenses y de paternidad y
para examinar la transducción gustativa. Los reactivos específicos
de los miembros de la familia de T1R que se hibridan específicamente
con los ácidos nucleicos de T1R, tales como sondas y cebadores de
T1R, reactivos específicos de T1R que se unen específicamente a un
polipéptido de T1R, por ejemplo
anticuerpos de T1R se usan para examinar la expresión celular gustativa y la regulación de la transducción gustativa.
anticuerpos de T1R se usan para examinar la expresión celular gustativa y la regulación de la transducción gustativa.
Los expertos en la técnica conocen bien
numerosas técnicas de ensayos de ácidos nucleicos para determinar
la presencia de ADN y ARN para un miembro de la familia de T1R en
una muestra, tales como análisis de Southern, análisis de Northern,
transferencias de mancha, protección de ARNasa, análisis S1,
técnicas de amplificación tales como PCR e hibridación in
situ. En la hibridación in situ, por ejemplo, el ácido
nucleico diana se libera de su entorno celular de manera que queda
disponible para la hibridación con la célula conservando al mismo
tiempo la morfología celular para interpretación y análisis
posteriores. Los siguientes artículos proporcionan una visión de
conjunto de la técnica de hibridación in situ: Singer et
al, Biotechniques, 4: 230250 (1986); Haase et
al., Methods in Virology, vol. VII págs.
189-226 (1984); y Nucleic Acid Hybridization: A
Practical Approach (Names et al., eds. 1987).
Adicionalmente, con las diversas técnicas de inmunoensayo descritas
anteriormente puede detectarse un polipéptido de T1R. La muestra
del ensayo se compara típicamente con un control positivo (por
ejemplo, una muestra que expresa un polipéptido de T1R
recombinante) y con un control negativo.
La presente descripción también proporciona kits
para explorar moduladores de miembros de la familia de T1R. Dichos
kits pueden prepararse a partir de materiales y reactivos fácilmente
disponibles. Por ejemplo, dichos kits pueden comprender cualquiera
o más de los siguientes materiales: ácidos nucleicos o proteínas de
T1R, tubos de reacción, e instrucciones para ensayar la actividad
de T1R. Opcionalmente, el kit contiene un receptor de T1R
biológicamente reactivo. De acuerdo con la presente descripción,
puede prepararse una amplia diversidad de kits y componentes,
dependiendo del uso destinado para el kit y de los requisitos
particulares del usuario.
En las secuencias de proteínas representadas en
este documento, el código X de una letra o Xaa se refiere a
cualquiera de los veinte restos aminoacídicos comunes. En las
secuencias de ADN presentadas en este documento, los códigos N o n
de una letra se refieren a cualquiera de las cuatro bases de
nucleótidos A, T, C, o G.
A continuación se proporciona ADN genómico de
hT1R3 como SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 con secuencias codificantes
predichas (cds) mostradas en negrita. La ruptura entre los cóntigos
5' y 3' se muestra como puntos suspensivos ("........."). Las
cds predichas de hT1R3 se describen en la SEC ID Nº 3. Por último,
se proporciona una secuencia preferida, predicha de aminoácidos de
hT1R3 como SEC ID Nº 4, usando el código de una letra para los
aminoácidos.
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\newpage
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A partir del ADN genómico se aislaron segmentos
de los genes de T1R3 de rata y de ratón por amplificación PCR
usando cebadores degenerados basados en la secuencia humana de T1R3.
Los cebadores degenerados SAP077
(5'-CGNTTYYTNGCNTGGGGNGARCC-3'; SEC
ID Nº 5) y SAP079
(5'-CGNGCNCGRTTRTARCANCCNGG-3'; SEC
ID Nº 6) son complementarios a restos de T1R3 humano RFLAWGEPA
(correspondiente a la SEC ID Nº 7) y PGCYNRAR (correspondiente a la
SEC ID Nº 8), respectivamente. Los productos de PCR se clonaron y
se secuenciaron. El plásmido SAV115 porta un segmento clonado del
gen de T1R3 de ratón y SAV118 porta un segmento del gen de rata.
Estas secuencias, mostradas a continuación, representan claramente
los homólogos de roedores del T1R3 humano, ya que el segmento de
ratón tiene una identidad del 74% con el segmento correspondiente
de T1R3 humano y el segmento de rata tiene una identidad del 80%
con el segmento correspondiente de T1R3 humano. Los segmentos de
ratón y de rata tienen una identidad del 88%. Ninguna otra
secuencia de la base de datos tiene una identidad superior al 40%
con estos segmentos de T1R3.
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Los fragmentos mT1R3 y rT1R3 identificados
anteriormente como las SEC ID Nº 9 y 11 se usaron para explorar una
genoteca de ADNc procedente de tejido gustativo de rata. Se
secuenció un clon positivo y se descubrió que contenía la secuencia
de rT1R3 de longitud completa mostrada anteriormente como SEC ID Nº
13. La comparación de secuencias de las secuencias parciales de
mT1R3 y rT1R3 y la secuencia de hT1R3 de longitud completa
estableció que este ADNc representa el homólogo del hT1R3. Por
ejemplo, la identidad de pares de aminoácidos entre rT1R3 y hT1R3
es aproximadamente del 72%, mientras que la secuencia comentada más
afín en el banco de datos público de secuencias de ADN tiene una
identidad de aproximadamente el 33% con rT1R3.
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El fragmento de T1R3 de ratón descrito
anteriormente contenido en SAV115 se amplificó por PCR usando
cebadores directo M13 e inverso M13 y después se purificó en gel.
El molde de ADN de T1R3 se dispuso en una reacción in vitro
marcada para la transcripción donde se incorporó UTP marcado con
Digoxigenina en una sonda de ARNc antisentido. Esta sonda se
hibridó con tejido gustativo de ratón adulto contenido en las
papilas circunvaladas. La hibridación y la detección de T1R3 in
situ se realizaron siguiendo el protocolo de
Schaeren-Wiemers et al, Histochemistry, 100:
431-400 (1993). En resumen, se seccionó lengua de
ratón recién congelada a 14 \mum y se preparó para la
hibridación. Durante 14 horas a 72ºC se hibridaron 200 ng/ml de la
sonda antisentido de T1R3 marcada con Digoxigenina. La
posthibridación consistió en un lavado de SCC 2x a 72ºC. La
detección de Digoxigenina se realizó incubando con dilución de
anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina
1:5000 seguido de una reacción de 12 horas de la fosfatasa en
NBT/BCIP. La Figura 1 muestra la expresión del gen de T1R3 en
botones gustativos de papilas circunvaladas de ratón.
\newpage
A continuación se proporciona, como SEC ID Nº
15, el ortólogo humano (nº de acceso a la base de datos AL1S9177)
de un receptor gustativo de rata, denominado rT1R1. Las cds
predichas se indican en negrita y algunos intervalos de la
secuencia intrónica se representan como series de N. Los nucleótidos
y las secuencias de hT1R1 traducidas conceptualmente también se
describen en este documento como SEC ID Nº 16 y 17,
respectiva-
mente.
mente.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> SENOMYX, INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RECEPTORES GUSTATIVOS DE T1R Y GENES
QUE LOS CODIFICAN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 301586.EPl/JND/CJS
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-03-07
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/187,546
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
07-03-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/195,536
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
07-04-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/209,840
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-06-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/214,213
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-06-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/226,448
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-08-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/259,227
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-01-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2,1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 876
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2687
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 850
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de LA secuencia
artificial: Cebador degenerado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgnttyytng cntggggnga rcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebadores degenerados
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<222> (3)
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<223> a, t, c, o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (6)
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<223> a, t, c, o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgngcncgrt trtarcancc ngg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm34
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murine sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murine sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2577
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8194
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1251)..(1300)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(1951)..(2000)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Descripción de secuencia artificial:
Secuencia consenso de la familia de T1R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t o r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> f o l
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r, q o p
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> s, p o v
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> v, e, r, k o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a o e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> w o l
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r, h o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia consenso de la familia de T1R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> l o q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> e, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n, r o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r o e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r o k
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c, g o f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> v, l o i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> f o l
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a o s
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m o l
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3563
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
Claims (15)
1. Una secuencia aislada de ácido nucleico que
codifica un polipéptido del receptor gustativo T1R1 que tiene al
menos una identidad de secuencia del 90%, al menos el 95%, al menos
el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con el
polipéptido contenido en la SEC ID Nº: 17.
2. La secuencia aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 1 que codifica el polipéptido contenido en la SEC ID
Nº: 17.
3. La secuencia aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 1 que comprende la secuencia de ácido nucleico
contenida en la SEC ID Nº: 15 ó 16.
4. La secuencia aislada de ácido nucleico de
T1R1 aislada de cualquiera de las reivindicaciones
1-3 que está unida operativamente a un promotor
regulable o a un promotor constitutivo.
5. Un vector que contiene una secuencia de ácido
nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-4, que se selecciona preferiblemente del grupo
que consiste en vectores de mamíferos, vectores de insectos,
vectores bacterianos, vectores de levaduras, vectores retrovirales,
vectores bacteriófagos, plásmidos lineales circulares, moléculas de
ácido nucleico que son capaces de integrarse en el genoma de una
célula deseada.
6. Una célula hospedadora que se ha transformado
o transfectado con una secuencia aislada de ácido nucleico de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4 o un
vector de acuerdo con la reivindicación 5, que se selecciona
preferiblemente del grupo que consiste en células procariotas,
células de mamífero, células de levadura, células de insecto,
células de anfibio, células vegetales y células fúngicas.
7. La célula hospedadora de la reivindicación 6
que es una célula humana.
8. La célula hospedadora de la reivindicación 6
que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, células
CHO, células HeLa y células HEK-293.
9. La célula hospedadora de la reivindicación 6
que es una célula cultivada o un explante.
10. Un polipéptido aislado de T1R codificado por
la secuencia aislada de ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
11. Un ensayo para identificar un compuesto que
modula la transducción gustativa que comprende:
- (i)
- poner en contacto un polipéptido de T1R1 de acuerdo con la reivindicación 10 con un supuesto compuesto modulador gustativo; y
- (ii)
- detectar si dicho compuesto se une específicamente a dicho polipéptido de T1R1.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El ensayo de la reivindicación 11 en el que
dicho polipéptido de T1R1 se expresa en una célula o en una
membrana celular.
13. El ensayo de la reivindicación 11 en el que
dicho polipéptido de T1R1 está comprendido en un soporte de fase
sólida.
14. El ensayo de la reivindicación 11 en el que
dicho polipéptido de T1R1 está en una solución.
15. El ensayo de la reivindicación 11 en el que
dicho T1R1 está unido a polipéptido verde fluorescente.
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US7309577B2 (en) * | 2001-03-07 | 2007-12-18 | Senomyx, Inc. | Binding assays that use the T1R1/T1R3 (umami) taste receptor to identify compounds that elicit or modulate umami taste |
US7368285B2 (en) * | 2001-03-07 | 2008-05-06 | Senomyx, Inc. | Heteromeric umami T1R1/T1R3 taste receptors and isolated cells that express same |
US20080244761A1 (en) * | 2001-03-07 | 2008-10-02 | Senomyx, Inc. | T1r hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds |
US6955887B2 (en) | 2001-03-30 | 2005-10-18 | Senomyx, Inc. | Use of T1R hetero-oligomeric taste receptor to screen for compounds that modulate taste signaling |
US7301009B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-11-27 | Senomyx, Inc. | Isolated (T1R1/T1R3) umami taste receptors that respond to umami taste stimuli |
US7803982B2 (en) | 2001-04-20 | 2010-09-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | T1R3 transgenic animals, cells and related methods |
WO2002086079A2 (en) * | 2001-04-20 | 2002-10-31 | Mount Sinai School Of Medicine | T1r3 a novel taste receptor |
DK2327985T3 (en) | 2001-06-26 | 2016-09-05 | Senomyx Inc | H1 Oligomeric T1R Taste Receptors and Cell Lines Expressing the Receptors, and Their Use to Identify Taste Compounds |
EP2003451B1 (en) * | 2001-06-26 | 2012-05-30 | Senomyx, Inc. | T1r1-t1r3 hetero-oligomeric umami taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of umami taste compounds |
WO2003004992A2 (en) | 2001-07-03 | 2003-01-16 | The Regents Of The University Of California | Mammalian sweet and amino acid heterodimeric taste receptors |
US20040029789A1 (en) * | 2001-07-05 | 2004-02-12 | Anderson David W. | Novel proteins and nucleic acids encoding same |
US7314725B2 (en) | 2001-07-20 | 2008-01-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Phenylthiocarbamide (PTC) taste receptor |
WO2003025137A2 (en) | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Irm, Llc | Sweet taste receptors |
CA2486423A1 (en) * | 2002-05-20 | 2003-12-11 | Tvd Taste Virtual Dimensions, Inc. | Antibodies and their use for the modulation of taste sensation |
US7579453B2 (en) | 2003-06-19 | 2009-08-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Dapartment Of Health And Human Services | Variants of human taste receptor genes |
RU2006106920A (ru) * | 2003-08-06 | 2007-09-20 | Синомикс Инк. (Us) | Гетеро-олигомерные вкусовые рецепторы t1r, клеточные линии, которые экспрессируют указанные рецепторы и вкусовые соединения |
US20050244810A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-11-03 | Egan Josephine M | Taste signaling in gastrointestinal cells |
US20050106571A1 (en) * | 2003-10-02 | 2005-05-19 | The Regents Of The University Of California | Mammalian T1R3 sweet taste receptors |
US20060045953A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-03-02 | Catherine Tachdjian | Aromatic amides and ureas and their uses as sweet and/or umami flavor modifiers, tastants and taste enhancers |
WO2006068745A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Cargill, Incorporated | Methods for determining cellular response to stimuli |
TW200638882A (en) * | 2005-02-04 | 2006-11-16 | Senomyx Inc | Molecules comprising linked organic moieties as flavor modifiers for comestible compositions |
CA2597134C (en) * | 2005-02-04 | 2015-05-26 | Senomyx, Inc. | Compounds comprising linked heteroaryl moieties and their use as novel umami flavor modifiers, tastants and taste enhancers for comestible compositions |
WO2006113422A2 (en) | 2005-04-13 | 2006-10-26 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services | Human sweet and umami taste receptor variants |
US7851006B2 (en) | 2005-05-23 | 2010-12-14 | Cadbury Adams Usa Llc | Taste potentiator compositions and beverages containing same |
US7851005B2 (en) | 2005-05-23 | 2010-12-14 | Cadbury Adams Usa Llc | Taste potentiator compositions and beverages containing same |
CN101179943B (zh) | 2005-05-23 | 2013-06-26 | 卡夫食品环球品牌有限责任公司 | 填充液体的咀嚼型胶基糖组合物 |
MX2007014632A (es) | 2005-05-23 | 2008-01-24 | Cadbury Adams Usa Llc | Composiciones potenciadoras del sabor y productos comestibles de goma de mascar yconfiterias que contienen las mismas. |
TW200715993A (en) * | 2005-06-15 | 2007-05-01 | Senomyx Inc | Bis-aromatic amides and their uses as sweet flavor modifiers, tastants, and taste enhancers |
US20110097741A1 (en) * | 2006-04-20 | 2011-04-28 | Jay Patrick Slack | Partial t1r2 nucleic acid sequence, receptor protein and its use in screening assays |
DK3235811T3 (en) | 2006-04-21 | 2018-11-12 | Senomyx Inc | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF OXALAMIDS |
EP2015638A4 (en) * | 2006-04-28 | 2010-09-29 | Redpoint Bio Corp | TRIARYL-SUBSTITUTED IMIDAZOLE DERIVATIVES AND THEIR USE AS TASTE INHIBITORS |
WO2008008224A2 (en) * | 2006-07-10 | 2008-01-17 | Duke University | Sour taste receptor compositions and methods |
WO2008060576A2 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-22 | Redpoint Bio Corporation | Spicematrix technology for taste compound identification |
US8633186B2 (en) | 2007-06-08 | 2014-01-21 | Senomyx Inc. | Modulation of chemosensory receptors and ligands associated therewith |
US9603848B2 (en) * | 2007-06-08 | 2017-03-28 | Senomyx, Inc. | Modulation of chemosensory receptors and ligands associated therewith |
US7928111B2 (en) * | 2007-06-08 | 2011-04-19 | Senomyx, Inc. | Compounds including substituted thienopyrimidinone derivatives as ligands for modulating chemosensory receptors |
GB0713297D0 (en) * | 2007-07-10 | 2007-08-15 | Cadbury Schweppes Plc | Chocolate compositions having improved flavour characteristics |
WO2009018467A2 (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Bio-sensing nanodevice |
DK2323997T3 (en) | 2008-07-31 | 2017-12-11 | Senomyx Inc | METHODS AND INTERMEDIATES FOR THE MANUFACTURE OF SWEET TASTE AMPLIFIERS |
WO2010014813A2 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Senomyx, Inc. | Compositions comrpising sweetness enhancers and methods of making them |
WO2010014903A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed olfactory receptor-based microsurface plasmon polariton detector |
WO2011011292A2 (en) * | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Verdezyne, Inc. | Combinatorial methods for optimizing engineered microorganism function |
US8795977B2 (en) | 2009-12-02 | 2014-08-05 | Conopco, Inc. | Method for screening a potential modulator compound of a taste receptor |
US9000054B2 (en) | 2010-08-12 | 2015-04-07 | Senomyx, Inc. | Method of improving stability of sweet enhancer and composition containing stabilized sweet enhancer |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
CN103635096B (zh) | 2011-04-29 | 2016-08-17 | 洲际大品牌有限责任公司 | 被包封的酸、其制备方法及包括所述被包封的酸的咀嚼型胶基糖 |
EP2742350B1 (en) | 2011-08-08 | 2019-10-30 | The Coca-Cola Company | Cell lines comprising endogenous taste receptors and their uses |
US9254099B2 (en) | 2013-05-23 | 2016-02-09 | Medibotics Llc | Smart watch and food-imaging member for monitoring food consumption |
US9536449B2 (en) | 2013-05-23 | 2017-01-03 | Medibotics Llc | Smart watch and food utensil for monitoring food consumption |
US9042596B2 (en) | 2012-06-14 | 2015-05-26 | Medibotics Llc | Willpower watch (TM)—a wearable food consumption monitor |
US9442100B2 (en) | 2013-12-18 | 2016-09-13 | Medibotics Llc | Caloric intake measuring system using spectroscopic and 3D imaging analysis |
US9456916B2 (en) | 2013-03-12 | 2016-10-04 | Medibotics Llc | Device for selectively reducing absorption of unhealthy food |
US10314492B2 (en) | 2013-05-23 | 2019-06-11 | Medibotics Llc | Wearable spectroscopic sensor to measure food consumption based on interaction between light and the human body |
PE20150626A1 (es) | 2012-08-06 | 2015-05-29 | Senomyx Inc | Modificador del sabor dulce |
JO3155B1 (ar) | 2013-02-19 | 2017-09-20 | Senomyx Inc | معدِّل نكهة حلوة |
US9067070B2 (en) | 2013-03-12 | 2015-06-30 | Medibotics Llc | Dysgeusia-inducing neurostimulation for modifying consumption of a selected nutrient type |
US9011365B2 (en) | 2013-03-12 | 2015-04-21 | Medibotics Llc | Adjustable gastrointestinal bifurcation (AGB) for reduced absorption of unhealthy food |
US9804157B1 (en) | 2013-03-15 | 2017-10-31 | Senomyx, Inc. | Screening assays to identify compounds which modulate T1R associated taste modalities which eliminate false positives |
US9529385B2 (en) | 2013-05-23 | 2016-12-27 | Medibotics Llc | Smart watch and human-to-computer interface for monitoring food consumption |
US9826662B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-11-21 | General Electric Company | Reusable phase-change thermal interface structures |
US10660571B2 (en) * | 2013-12-19 | 2020-05-26 | Kent State University | Thermochromic fabrics utilizing cholesteric liquid crystal material |
CN106170488B (zh) | 2014-02-12 | 2020-09-18 | 弗门尼舍公司 | 用于取代的1-苄基-3-(1-(异噁唑-4-基甲基)-1h-吡唑-4-基)咪唑烷-2,4-二酮的合成的改进方法 |
WO2015163905A1 (en) | 2014-04-25 | 2015-10-29 | General Mills, Inc. | Food products having sweetness enhancer |
JP6383704B2 (ja) * | 2015-07-02 | 2018-08-29 | 日立オートモティブシステムズ株式会社 | 電池制御装置 |
EP3814344A1 (en) | 2018-08-07 | 2021-05-05 | Firmenich Incorporated | 5-substituted 4-amino-1h-benzo[c][1,2,6]thiadiazine 2,2-dioxides and formulations and uses thereof |
EP3693975A1 (en) | 2019-02-06 | 2020-08-12 | Tata Consultancy Services Limited | System and method for evaluation of at least one potential tastant from a plurality of tastants |
WO2021150686A1 (en) | 2020-01-22 | 2021-07-29 | Firmenich Incorporated | High-sensitivity detection of gpcr activity and uses thereof |
BR112022025416A2 (pt) * | 2020-06-25 | 2023-01-24 | Mycotechnology Inc | Proteína doce de trufa |
CN116554350B (zh) * | 2023-04-26 | 2024-01-09 | 之江实验室 | 基于人类甜味受体蛋白的生物传感器及其应用 |
Family Cites Families (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US788470A (en) * | 1903-06-16 | 1905-04-25 | Edouard Jehn | Changing mechanism for picture-exhibitors. |
US1733847A (en) * | 1927-03-11 | 1929-10-29 | Variety Fire Door Company | Door-latch retainer |
JPS5825980B2 (ja) | 1976-02-12 | 1983-05-31 | ヤマサ醤油株式会社 | サイクリックヌクレオチドの定量法 |
US4391904A (en) | 1979-12-26 | 1983-07-05 | Syva Company | Test strip kits in immunoassays and compositions therein |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US4517288A (en) | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
US4661768A (en) * | 1983-09-14 | 1987-04-28 | Johnson Service Company | Capacitance transducing method and apparatus |
US5506337A (en) | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
CA1291031C (en) | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
US5010175A (en) | 1988-05-02 | 1991-04-23 | The Regents Of The University Of California | General method for producing and selecting peptides with specific properties |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
JP3501286B2 (ja) | 1989-12-22 | 2004-03-02 | アプライド リサーチ システムズ,エーアールエス ホールディング ナームロゼ ベノートスハップ | 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法 |
US5272071A (en) | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
WO1991012650A1 (fr) | 1990-02-09 | 1991-08-22 | Asulab S.A. | Micromoteur electrostatique a champ radial realise par microfabrication photolithographique et procede de realisation d'un tel micromoteur |
IE66205B1 (en) | 1990-06-14 | 1995-12-13 | Paul A Bartlett | Polypeptide analogs |
US5650489A (en) | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
US5401629A (en) | 1990-08-07 | 1995-03-28 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal |
JPH06509702A (ja) | 1991-04-05 | 1994-11-02 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 匂い物質受容体およびその使用 |
US6270989B1 (en) | 1991-11-05 | 2001-08-07 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and delivery |
US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
NZ245015A (en) | 1991-11-05 | 1995-12-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
US5288514A (en) | 1992-09-14 | 1994-02-22 | The Regents Of The University Of California | Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support |
US6664107B1 (en) | 1993-05-26 | 2003-12-16 | Ontario Cancer Institute, University Health Network | CD45 disrupted nucleic acid |
US5426039A (en) | 1993-09-08 | 1995-06-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol |
CA2171206A1 (en) * | 1993-09-20 | 1995-03-30 | Peter Josef Flor | Human metabotropic glutamate receptor subtypes (hmr4, hmr6, hmr7) and related dna compounds |
IL108205A0 (en) | 1993-12-28 | 1994-04-12 | Yeda Res & Dev | Olfactory genes and receptors |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5593853A (en) | 1994-02-09 | 1997-01-14 | Martek Corporation | Generation and screening of synthetic drug libraries |
US5691188A (en) | 1994-02-14 | 1997-11-25 | American Cyanamid Company | Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor |
US5539083A (en) | 1994-02-23 | 1996-07-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis |
US5525735A (en) | 1994-06-22 | 1996-06-11 | Affymax Technologies Nv | Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds |
US5549974A (en) | 1994-06-23 | 1996-08-27 | Affymax Technologies Nv | Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof |
WO1996039154A1 (en) | 1995-06-06 | 1996-12-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5985662A (en) | 1995-07-13 | 1999-11-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense inhibition of hepatitis B virus replication |
AU1118197A (en) | 1995-11-09 | 1997-05-29 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Novel sperm receptors |
US5874243A (en) | 1997-03-28 | 1999-02-23 | Smithkline Beecham Corporation | OLRCC15 receptor |
US5993778A (en) | 1997-05-07 | 1999-11-30 | Firestein; Stuart J. | Functional expression of, and assay for, functional cellular receptors in vivo |
US5940153A (en) * | 1998-04-03 | 1999-08-17 | Motorola, Inc. | Display assembly having LCD and seal captured between interlocking lens cover and lightpipe |
FR2780405B1 (fr) | 1998-06-25 | 2001-12-28 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux recepteurs olfactifs et leurs utilisations |
IL140979A0 (en) * | 1998-07-28 | 2002-02-10 | Univ California | Nucleic acids encoding a g-protein coupled receptor involved in sensory transduction |
WO2000006693A1 (en) | 1998-07-28 | 2000-02-10 | Victoria Ann Heslop | A digester |
AU764180B2 (en) | 1998-07-28 | 2003-08-14 | Regents Of The University Of California, The | Nucleic acids encoding a G-protein coupled receptor involved in sensory transduction |
WO2000006692A1 (en) | 1998-07-28 | 2000-02-10 | Canadian Inovatech, Inc. | Methods and compositions for inhibiting microbial growth in wine |
CN1317044A (zh) | 1998-07-28 | 2001-10-10 | 加利福尼亚大学董事会 | 编码与感觉转导有关的蛋白质的核酸 |
US7402400B2 (en) | 2001-07-03 | 2008-07-22 | Regents Of The University Of California | Mammalian sweet taste receptors |
US6106555A (en) | 1998-12-15 | 2000-08-22 | Av Healing Llc | Method for tissue fixation |
ATE445335T1 (de) | 1998-12-23 | 2009-10-15 | Sinai School Medicine | Hemmstoffe zur unterdrückung des bitteren geschmacks |
US6558910B2 (en) | 1999-09-10 | 2003-05-06 | The Regents Of The University Of California | SF, a novel family of taste receptors |
EP1214343A2 (en) | 1999-09-10 | 2002-06-19 | The Regents Of The University Of California | T2r taste receptor family |
US20030036089A1 (en) | 1999-12-20 | 2003-02-20 | Applera Corporation | Isolated human G-protein coupled receptors, nucleic acid molecules encoding human GPCR proteins, and uses thereof |
EP2143796A3 (en) * | 2000-02-29 | 2010-03-17 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 1983, 52881, 2398, 45449, 50289, and 52872, G protein-coupled receptors and uses therefor |
TW201006846A (en) | 2000-03-07 | 2010-02-16 | Senomyx Inc | T1R taste receptor and genes encidung same |
US6608176B2 (en) | 2000-03-31 | 2003-08-19 | University Of Miami | Taste receptor for umami (monosodium glutamate) taste |
WO2001077676A1 (en) | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Senomyx, Inc. | T2r taste receptors and genes encoding same |
CA2406999A1 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Warner-Lambert Company | Gene and sequence variation associated with sensing carbohydrate compounds and other sweeteners |
JP2004513614A (ja) * | 2000-06-16 | 2004-05-13 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | Gタンパク質結合受容体 |
TW201022287A (en) | 2001-01-03 | 2010-06-16 | Senomyx Inc | T1R taste receptors and genes encoding same |
US7368285B2 (en) | 2001-03-07 | 2008-05-06 | Senomyx, Inc. | Heteromeric umami T1R1/T1R3 taste receptors and isolated cells that express same |
US7309577B2 (en) | 2001-03-07 | 2007-12-18 | Senomyx, Inc. | Binding assays that use the T1R1/T1R3 (umami) taste receptor to identify compounds that elicit or modulate umami taste |
US7301009B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-11-27 | Senomyx, Inc. | Isolated (T1R1/T1R3) umami taste receptors that respond to umami taste stimuli |
US20080244761A1 (en) | 2001-03-07 | 2008-10-02 | Senomyx, Inc. | T1r hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds |
US7763431B1 (en) | 2001-03-07 | 2010-07-27 | Senomyx, Inc. | Binding assays that use the T1R2/T1R3 (sweet) taste receptor to identify compounds that elicit or modulate sweet taste |
US6955887B2 (en) | 2001-03-30 | 2005-10-18 | Senomyx, Inc. | Use of T1R hetero-oligomeric taste receptor to screen for compounds that modulate taste signaling |
DK2327985T3 (en) | 2001-06-26 | 2016-09-05 | Senomyx Inc | H1 Oligomeric T1R Taste Receptors and Cell Lines Expressing the Receptors, and Their Use to Identify Taste Compounds |
EP2003451B1 (en) | 2001-06-26 | 2012-05-30 | Senomyx, Inc. | T1r1-t1r3 hetero-oligomeric umami taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of umami taste compounds |
WO2003004992A2 (en) | 2001-07-03 | 2003-01-16 | The Regents Of The University Of California | Mammalian sweet and amino acid heterodimeric taste receptors |
WO2003025137A2 (en) | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Irm, Llc | Sweet taste receptors |
US7459577B2 (en) * | 2001-11-08 | 2008-12-02 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Production processes for triorganomonoalkoxysilanes and triorganomonochlorosilanes |
US7208290B2 (en) * | 2001-12-14 | 2007-04-24 | Senomyx, Inc. | Methods of co-expressing umami taste receptors and chimeric Gα15 variants |
US7107837B2 (en) * | 2002-01-22 | 2006-09-19 | Baxter International Inc. | Capacitance fluid volume measurement |
US7441104B2 (en) | 2002-03-30 | 2008-10-21 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Parallel subword instructions with distributed results |
US9314194B2 (en) * | 2002-04-19 | 2016-04-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
US20070142748A1 (en) * | 2002-04-19 | 2007-06-21 | Ajay Deshmukh | Tissue penetration device |
JP2006515157A (ja) | 2002-07-29 | 2006-05-25 | セノミックス、インコーポレイテッド | 新規な苦味受容体t2r76の同定 |
WO2004069191A2 (en) * | 2003-02-03 | 2004-08-19 | Senomyx Inc. | Identification of t1r and t2r modulators |
RU2006106920A (ru) | 2003-08-06 | 2007-09-20 | Синомикс Инк. (Us) | Гетеро-олигомерные вкусовые рецепторы t1r, клеточные линии, которые экспрессируют указанные рецепторы и вкусовые соединения |
US7906627B2 (en) | 2003-08-06 | 2011-03-15 | Senomyx, Inc. | Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors |
US20050106571A1 (en) | 2003-10-02 | 2005-05-19 | The Regents Of The University Of California | Mammalian T1R3 sweet taste receptors |
EP1680014A4 (en) * | 2003-10-14 | 2009-01-21 | Pelikan Technologies Inc | METHOD AND APPARATUS PROVIDING A VARIABLE USER INTERFACE |
US7351213B2 (en) * | 2004-04-15 | 2008-04-01 | Roche Diagnostics Operation, Inc. | Integrated spot monitoring device with fluid sensor |
US20060045953A1 (en) | 2004-08-06 | 2006-03-02 | Catherine Tachdjian | Aromatic amides and ureas and their uses as sweet and/or umami flavor modifiers, tastants and taste enhancers |
TWI399228B (zh) * | 2006-07-21 | 2013-06-21 | Alcon Inc | 低黏性的眼科與耳鼻喉科裝置材料(二) |
US20080047764A1 (en) * | 2006-08-28 | 2008-02-28 | Cypress Semiconductor Corporation | Temperature compensation method for capacitive sensors |
US20090061456A1 (en) | 2007-08-30 | 2009-03-05 | Allard William J | Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells |
US7936111B2 (en) | 2008-08-07 | 2011-05-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Apparatus for generating electrical energy and method for manufacturing the same |
TWI552751B (zh) | 2011-06-20 | 2016-10-11 | H 朗德貝克公司 | 投予4-((1r,3s)-6-氯-3-苯基-二氫茚-1-基)-1,2,2-三甲基-哌及其鹽用於治療精神分裂症的方法 |
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