DE102006037581A1

DE102006037581A1 - Citrusal-Duftstoffrezeptoren

Info

Publication number: DE102006037581A1
Application number: DE102006037581A
Authority: DE
Inventors: Hanns Hatt
Original assignee: Symrise AG
Current assignee: Symrise AG
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2008-02-14
Also published as: WO2008017598A2; WO2008017598A3

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängsnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren.
Seit der Entdeckung der für olfaktorische Rezeptoren (Duftstoffrezeptoren) codierenden DNA-Sequenzen (Gene) sind zahlreiche Aspekte im Zusammenhang mit diesen Rezeptoren noch immer ungeklärt. Zwar kann der Fachmann mit einiger Sicherheit anhand charakteristischer Merkmale – beispielsweise Zugehörigkeit zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, Hypervariabilität in den Transmembran-Domänen III, IV, V und VI – zwischen DNA-Sequenzen von Duftstoffrezeptoren und solchen Sequenzen, die nicht für einen Duftstoffrezeptor codieren, unterscheiden. Damit ist jedoch noch nichts substantiell über die Regulation der Duftstoffrezeptor-Expression bekannt; insbesondere ist unbekannt, in welchem Gewebe und in welcher Stärke ein vermutetes Duftstoffrezeptor-Gen exprimiert wird; ferner ist nicht vorhersagbar, welche Substanzen an den von diesem Gen codierten Duftstoffrezeptor spezifisch binden können, sei es als Agonist (Aktivator) oder als Antagonist (Inhibitor).
Duftstoffrezeptor-Gene von Vertebraten lassen sich zwar durch degenerierte PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verhältnismäßig leicht subklonieren (Mombaerts, Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors, Nat. Rev. Neurosci. 5(2004), 263–278). Es hat sich jedoch bisher als sehr schwierig herausgestellt, einem isolierten Duftstoffrezeptor einen zugehörigen, von dem Rezeptor nachweisbaren Duftstoff (Liganden) zuzuordnen. Beispielsweise vergingen sieben Jahre zwischen der ersten funktionalen Beschreibung eines Duftstoffrezeptor-Gens und der Angabe seines zugehörigen Duftstoff-Liganden (Zhao et al., Functional expression of a mammalian odorant receptor; Science 279(1998), 237–242). Bisher ist erst bei zwei menschlichen Duftstoffrezeptor-Genen eine Zuordnung entsprechender Duftstoffe zu Duftstoffrezeptoren gelungen:
Wetzel et al (The Journal of Neuroscience, 1999: 7426–7433) beschreiben die funktionelle Expression des menschlichen hOR17-40 Rezeptor-Proteins. Es konnten nur zwei als Agonisten wirkende Substanzen bestimmt werden, nämlich Helional und Heliotropylaceton. Diese Substanzen lösen eine Aktivierung des Rezeptors aus, die sich in einer vorübergehenden Erhöhung des cytosolischen Ca²⁺-Spiegels niederschlägt, wenn der Rezeptor funktionell in HEK293-Zellen exprimiert wird. Antagonisten, also Substanzen, die eine Rezeptor-Aktivierung durch einen oder mehrere Agonisten spezifisch und reversibel verhindern können, wurden nicht gefunden. Spehr et al (Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis; Science 299(2003), 2054–2058) wiederum konnten die Bindung von Bourgeonal an einen weiteren menschlichen Duftstoffrezeptor (hOR17-4) und die antagonistische Wirkung von n-Undecanal auf diese Ligandenbindung nachweisen.
Die funktionelle Expression von Duftstoffrezeptor-Genen in heterologen Systemen ist jedoch trotz ständigen Bemühens der Fachwelt bisher nicht zuverlässig gelungen (Mombaerts, a.a.O.). Ferner ist es nach wie vor nicht möglich, anhand der DNA-Sequenz bzw. der Rezeptor-Aminosäuresequenz Vorhersagen darüber zu treffen, welche Substanzen als Agonisten oder Antagonisten wirken können. Beispielsweise sind Befunde, die anhand von Testikulargeweben von Mäusen gewonnen wurden, kaum auf andere Spezies übertragbar, da Spermazellen anfällig für zufällige Genexpression sind und in Spermien gefundene Duftstoffrezeptor-Gene schwer den übrigen Duftstoffrezeptor-Genfamilien zugeordnet werden können (Vanderhaeghen et al, Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species; Genomics 39 (1997), 239–246).
Es besteht daher ein großer Bedarf, weitere Duftstoffrezeptoren zu finden, funktionell zu exprimieren und die jeweils wirksamen Agonisten und Antagonisten zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wird deshalb ein Expressionssystem angegeben umfassend eine Zelle, die einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei

a) der Duftstoffrezeptor heterolog in Bezug auf die Zelle ist oder
b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.

Ausgangspunkt hierbei war die unter der Bezeichnung OR7A5 veröffentlichte Nucleinsäuresequenz (EMBL Accession-Nummer BC104809; vgl. Strausberg et al., Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26):16899–16903 (2002)) des für den Rezeptor codierenden Gens (Gensequenz) eines menschlichen Duftstoffrezeptors. Eine synonyme Bezeichnung ist OR19-17 (wegen der Nomenklatur siehe Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics (1994), 229-235). Der Rezeptor gehört zu der eingangs beschriebenen Klasse von Proteinen, die zur Superklasse der G-Protein-gekoppelten Proteine mit sieben vermuteten Transmembrandomänen gehören. Da nunmehr die funktionelle Expression dieses Rezeptors erstmals gelungen ist, wurde es auch möglich, Substanzen zu finden, die als Agonist oder Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden können; hierzu unten mehr.
Der Fachmann erkennt, dass auch ein Protein, das einen Proteinabschnitt mit einer von der Sequenz von OR7A5 abweichenden Aminosäuresequenz besitzt, ein Duftstoffrezeptor mit der im weiteren Verlauf beschriebenen Duftstoff-Ligandenspezifität sein kann. Die Erfolgsaussichten, einen funktionalen Rezeptor zu erhalten, insbesondere einen Duftstoffrezeptor, ist in der Gruppe der Proteine mit einem Abschnitt mit homologer Aminosäuresequenz zu OR7A5 höher als in der Gruppe der Proteine ohne oder mit nur geringer Homologie zur Sequenz dieses Duftstoffrezeptors. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend auch ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors. Die Transmembrandomäne III beginnt bei Aminosäure 99 und die Transmembrandomäne VI endet bei Aminosäure 259 des vollständigen OR7A5-Proteins. Besonders bevorzugt sind dabei solche Proteine, die einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäuren Unterschied zu einem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors besitzen. Die Aminosäure-Sequenzhomologie kann zweckmäßigerweise mit Hilfe des EMBOSS:water-Programms (Algorithmus von Smith und Waterman (1981), Identification of common molecular subsequences, J. Mol. Biol. 147:195–197) berechnet werden (Gap open penalty: 10.0; Gap extension penalty: 0.5; Blosum62-Matrix). Das Programm berechnet einen "Similarity"-Prozentwert, dieser ist das Maß der Homologie. Ein "Similarity"-Prozentwert von 80% bedeutet also im Sinne dieser Erfindung eine Sequenzhomologie von 80%.
Erfindungsgemäß wird zudem ein Fusionsprotein angegeben a) umfassend die Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäuren Unterschied zu dem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors, wobei b) der Abschnitt gemäß a) zwischen den Transmembrandomänen I und VI hOR17-40 (Wetzel et al., s.o.) angeordnet ist und zwischen der Transmembrandomäne I aus hOR17-40 und der Transmembrandomäne III gemäß a) eine weitere funktionale Transmembrandomäne angeordnet ist. Zum Herstellen und zur Verwendung solcher Fusionsproteine wird sich der Fachmann insbesondere an der Beschreibung der WO 2004-033496A1 orientieren, deren Inhalt in soweit in Bezug genommen wird. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein erleichtert insbesondere das Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems.
Soweit in dieser Beschreibung von einem Rezeptor oder erfindungsgemäßen Rezeptor gesprochen wird, ist damit der OR7A5-Rezeptor, ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein der oben beschriebenen Art gemeint, soweit nicht im jeweiligen Textzusammenhang klar ein anderes angegeben ist.
Wird der Rezeptor als heterologes Protein in einer Wirtszelle exprimiert – auch hierzu unten mehr –, so ist es möglich, dass die Transkription und/oder Translation bestimmter Nucleinsäure-Codons bzw. Codon-Abfolgen effizienter vonstatten geht als die Transkription und/oder Translation anderer Codons bzw. Codon-Abfolgen. Hieraus kann sich eine Präferenz für bestimmte Aminosäuren und/oder Aminosäureabfolgen ergeben. Es ist nunmehr bevorzugt, wenn einige oder alle Aminosäuren des Rezeptors, für die keine Präferenz der Wirtszelle besteht, durch solche Aminosäuren ersetzt sind, für die eine Präferenz der Wirtszelle besteht. Ferner kann es vorteilhaft sein, eine Protease-Schnittstelle durch einen Aminosäureaustausch, -deletion oder -insertion zu entfernen.
Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Fusionsprotein, das ferner einen oder mehrere weitere Proteinabschnitte umfasst. Hierbei kann es sich insbesondere um Signalpeptide wie die "5HT₃-Sequenz" (vergleiche C. H. Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)) handeln, die den Transport und den funktionellen Einbau in die Zellmembran erleichtert. Anstelle oder neben der "5HT₃-Sequenz" können jedoch auch andere Signalpeptide verwendet werden, insbesondere solche, die einen intra- und/oder interzellulären Transport des Fusionsproteins steuern oder erleichtern.
Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass der Rezeptor spezifisch an Verbindungen der nachfolgenden Formel (I) bindet:
wobei
R¹ und R² unabhängig voneinander H oder CH₃ bedeuten,
X gleich H, CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet und
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie entweder eine Einfach- oder eine Doppelbindung bedeutet und
die Gruppe -C(O)X an eines der Kohlenstoffatome gebunden ist, die mit dem Rest R¹ bzw. R² verknüpft ist.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend ein Rezeptor, der geeignet ist zum spezifischen Binden an eine Verbindung der Formel (I).
Unter einer spezifischen Bindung im Sinne dieser Erfindung wird eine Bindung verstanden, die – vereinfacht gesagt – nach einer Art Schlüssel-Schloss-Prinzip funktioniert. Insbesondere bindet der Rezeptor eine Substanz bzw. bindet eine Substanz an den Rezeptor dann spezifisch, wenn die Substanz bei Applikation auf mehrere Moleküle des Rezeptors bei niedrigen Konzentrationen, vorzugsweise bei Konzentrationen kleiner als 10 mM besonders bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 1 mM, insbesondere bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 100 μM, mit großer Wahrscheinlichkeit immer wieder im gleichen Bereich des Rezeptors bindet. Das Ergebnis einer solchen spezifischen Bindung kann insbesondere eine – vorzugsweise reversible – nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung begrenzte Konformationsänderung des Rezeptors sein.
Ferner wird unter einem Agonisten im Sinne der Erfindung eine Substanz verstanden, die durch ihre spezifische Bindung an den Rezeptor eine über diese bloße Bindung hinausgehende chemische Reaktion auslöst. In ihrem natürlichen Umfeld stehen Rezeptoren nicht chemisch unvermittelt neben anderen Zellbestandteilen, sondern stehen in Wirkverbindung mit weiteren Teilen zumindest einer Signaltransduktionskaskade, wie sie beispielsweise durch G-Proteine vermittelt wird. Durch das spezifische Binden eines Agonisten werden solche Rezeptoren von einem inaktiven in einen aktiven Zustand überführt, dies geht gewöhnlich einher mit einer nicht im wesentlichen auf den Ort der Agonisten-Bindung begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors und schlägt sich in einem Einschalten der Signaltransduktionskaskade nieder, erkennbar beispielsweise an einem Anstieg der cytosolischen Konzentration von Ca²⁺, cAMP, cGMP und/oder Inositol-Triphosphat oder der Änderung des ATP/ADP-Quotienten. Die Konformationsänderung des Rezeptors, und auch das Einschalten der Signaltransduktionskaskade, ist eine über die bloße Bindung des Agonisten hinausgehende chemische Reaktion. Agonisten im Sinne dieser Erfindung bezogen auf den Rezeptor sind insbesondere die Verbindungen der Formel (I).
Im Sinne der Erfindung ist ein Antagonist eine Substanz, die zwar spezifisch von einem Rezeptor gebunden wird, jedoch das spezifische Binden eines Agonisten an den Rezeptor erschwert. Das spezifische Binden des Antagonisten führt, anders als bei einem Agonisten, nicht zum Einschalten einer Signaltransduktionskaskade, wenn der Rezeptor Teil einer solchen, durch das spezifische Binden eines Agonisten eingeschalteten Signaltransduktionskaskade ist. Insbesondere kann eine durch das spezifische Binden eines Agonisten hervorgerufene Konformationsänderung des Rezeptors beim spezifischen Binden eines Antagonisten ausbleiben.
Insbesondere wurde eine Bindung des Rezeptors an die Verbindungen der Formeln A (umfassend A1 und A2), Formeln B (umfassend B1 und B2), Formeln C (umfassend C1 und C2), Formeln D (umfassend D1 und D2), Formeln E (umfassend E1 und E2) und Formeln F (umfassend F1 und F2) gefunden:

wobei jeweils X die oben genannte Bedeutung hat.
Bevorzugt sind dabei die Verbindungen der Formeln B1 und B2 und deren Mischungen, insbesondere solche Verbindungen der Formeln B1 und B2, in denen X jeweils H bedeutet. Besonders bevorzugt ist die Verbindung der Formel B1 mit X=H.
Neu sind folgende Substanzen:
Verbindungen der Formel A2, in der X = OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel B2, in der X = OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel C1, in denen X = CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel C2, in denen X = CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel D1, in denen X = CH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel D2, in denen X = CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel E1, in denen X = OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel E2, in denen X = OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel F1, in denen X = H, CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet,
Verbindungen der Formel F2, in denen X = H, CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet.
In Anlehnung an US 2,842,598 können die Verbindungen der Formel (I) über eine Diels-Alder Reaktion eines 1,3-Diens der Formel (II) und einer α,β-ungestättigten Carbonylverbindung der Formel (III) erhalten werden, wie das folgende Reaktionsschema verdeutlichen mag:
wobei die gestrichelte Linie, R¹, R² und X jeweils die oben angegebene Bedeutung haben.
Als Edukt der Formel (II) wird vorzugsweise Myrcen (7-Methyl-3-methylen-1,6-octadien) eingesetzt (die gestrichelte Linie in den Formeln (I) und (II) steht dann für eine Doppelbindung).
Als Edukte der Formel (III) werden vorzugsweise Acrolein, Methacrolein oder Crotonaldehyd eingesetzt, wobei die Edukte der Formel (III) auch in-situ generiert werden können.
Die Verbindungen der Formel C, D und F (d.h. solche, für die in Formel (I) die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet), können beispielsweise mittels partieller Hydrierung aus den Verbindungen der Formel A, B und E (d.h. solche, für die in Formel (I) die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet) synthetisiert werden. Beispielsweise können Verbindungen der Formeln A1 und A2 bzw. B1 und B2 mittels partieller Hydrierung (gegebenenfalls unter Anwendung einer Schutzgruppe für die Carbonylfunktion, wie beispielsweise einer Acetalisierung oder Ketalisierung) in Verbindungen der Formeln C1 und C2 bzw. D1 und D2 überführt werden (siehe auch Angew. Chem. 2000, 112, 3106–3138).
Verbindungen der Formel A1 und A2, in denen X jeweils H bedeutet, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Namen Precyclemone B.
Verbindungen der Formel B1 und B2, in denen X jeweils H bedeutet, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Namen Vertomugal, Myrac aldehyde oder Citrusal.
Verbindungen der Formel C1 und C2, in denen X jeweils H bedeutet, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Namen Vernaldehyd.
Die Verbindungen der Formel (I), insbesondere die Verbindungen der Formeln A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 und F2 und namentlich die oben als neu bezeichneten Substanzen der Formel (I), werden erfindungsgemäß angegeben als Duftstoffe. Sie sind geeignet zum spezifischen Binden an einen Rezeptor wie oben beschrieben, insbesondere an ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein und zum Auslösen einer Signaltransduktionskaskade wie oben beschrieben. Ferner hat sich gezeigt, wie unten näher ausgeführt wird, dass Verbindungen der Formel (I) die Ca2+-Konzentration in einer den beschriebenen Rezeptor exprimierenden Zelle steigern und die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums erhöhen können.
Erfindungsgemäß wird deshalb auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Verbindungen der Formeln A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 und F2 und namentlich der oben als neu bezeichneten Substanzen der Formel (I), gelehrt

a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen 111 bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert,
c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums,
d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz.

Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems ist es zweckmäßig, ein Gen für den Rezeptor durch einen Vektor in eine Wirtszelle einzuführen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird deshalb ein Vektor angegeben, der einen Nucleinsäure-Abschnitt umfasst, der für einen Rezeptor nach einem der vorherigen Aspekte der Erfindung codiert, also ein Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für a) einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein. Ein solcher Vektor erleichtert es, eine für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierende Nucleinsäure zu klonieren. Der Vektor kann auch ein sogenannter suicide-Vektor sein, insbesondere ein solcher, der die Integration des für den Rezeptor codierenden Nucleinsäure-Abschnitts in das Genom der Wirtszelle ermöglicht.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein Expressionsvektor. Solche Vektoren ermöglichen die Transkription und Translation des im Vektor enthaltenen, für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierenden Nucleinsäureabschnitts, wenn der Vektor in eine geeignete Wirtszelle eingebracht wird. Geeignete Wirtszellen sind insbesondere solche aus Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis-Oocyten und menschliche HEK293-Zellen sowie CHO- (Chinese Hamster Ovary), COS- (Afrikan Green Monkey Kidney), BHK- (Syrian Baby Hamster Kidney) und PC12-(Rat Adrenal Phenochromocytoma)-Zellen, wobei HEK293-Zellen besonders bevorzugt sind.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem umfasst wie eingangs angegeben eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor überexprimiert. Unter "überexprimieren" wird dabei jeder Vorgang verstanden, in dessen Folge der Rezeptor über das für die jeweilige Wirtszelle unter natürlichen Bedingungen maximal erreichbare Genexpressionsniveau hinausgehend vorliegt. Dabei kann der Rezeptor insbesondere auch ein für die Wirtszelle heterologer Rezeptor sein. Stellt die betreffende Wirtszelle normalerweise keinen erfindungsgemäßen Rezeptor her, so findet eine Überexpression im Sinne der Erfindung bereits dann statt, wenn sie (erstmals) überhaupt einen solchen Rezeptor herstellt. Besonders bevorzugt sind dabei solche Wirtszellen, die neben der funktionellen Expression des Rezeptors auch die für eine vom Rezeptor durch die Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade notwendigen Elemente bereitstellen.
Zweckmäßigerweise handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Säugerzelle, wobei die Wirtszelle insbesondere auch eine entartete Säugerzelle sein kann. Ein Beispiel hierfür ist die auf humane embryonale Nierenzellen zurückgehende Zellinie HEK293 (s. Graham et al., J. Gen. Virol. (1977): 59-72).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Komplex angegeben, wobei der Komplex ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, sowie daran spezifisch gebunden, eine Verbindung der Formel (I) umfasst, insbesondere der Formel A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2.
Ein solcher Komplex ist besonders vorteilhaft dazu geeignet, die Wechselwirkungen zwischen dem Rezeptor und einem Agonisten und/oder einem möglichen Antagonisten zu untersuchen. Dabei kann es sich bei dem Antagonisten um einen reversiblen oder irreversiblen handeln. Wenn der Rezeptor mit einer Signaltransduktionskaskade in Wirkverbindung steht, so ermöglicht das Herstellen eines solchen Komplexes aus Rezeptor und Agonist das Einschalten oder Aktivieren der entsprechenden Signaltransduktionskaskade. Das Herstellen eines Rezeptor-Antagonisten-Komplexes ermöglicht es in diesem Fall, das Einschalten der Signaltransduktionskaskade auch bei Vorliegen des Agonisten zu verhindern. Weitere vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten eines Komplexes aus Rezeptor und Agonist oder Antagonist sind unten beschrieben. Besonders bevorzugt sind dabei die Komplexe aus einem erfindungsgemäßen Rezeptor und Myracaldehyd (Verbindung der Formel B1 mit X=H). Diese bilden sich schon bei geringen Konzentrationen an Myracaldehyd.
Insbesondere wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Biosensor angegeben, umfassend

a) einen erfindungsgemäßen Rezeptor und
b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung einer Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor, vorzugsweise einer Verbindung der Formel A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2.

Der Fachmann kann die zum Nachweisen der Bindung des Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I) und insbesondere der Formel A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, C2, E1, E2, F1 oder F2, an den Rezeptor geeigneten Mittel je nach der Art des gewählten Rezeptors leicht auswählen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Biosensor eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor exprimiert, also a) einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert, und in der der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. Durch das spezifische Binden des Agonisten an den Rezeptor wird ein Rezeptor-Agonist-Komplex wie soeben beschrieben hergestellt. Dabei kann es zu einer nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung des Agonisten begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors kommen. Durch diese Konformationsänderung oder auf andere Weise löst der Rezeptor nach der Bindung des Agonisten die Signaltransduktionskaskade aus. Diese wiederum erzeugt ein messbares Signal, beispielsweise in Form einer Erhöhung der cytosolischen Ca²⁺-Konzentration. Anstelle der cytosolischen Ca²⁺-Konzentration kann auch der Konzentrationsanstieg oder der Konzentrationsabfall einer anderen Substanz, insbesondere eines second messegers wie cAMP, cGMP, IP₃ und dergleichen gemessen werden. Der Fachmann kann anhand der vom Rezeptor durch die spezifische Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade leicht eine geeignete Substanz zum Nachweisen dieser Bindung auswählen, deren Konzentration oder Konformation sich entsprechend der spezifischen Bindung des Agonisten an den Rezeptor ändert.
Ein solcher Biosensor ist insbesondere vorteilhaft dazu geeignet, weitere Rezeptoren zu suchen. Dazu wird der Fachmann zunächst ein Expressionssystem bereitstellen, in dem der vermutete Rezeptor funktionell exprimiert wird. Auf das Expressionssystem werden vermutete Agonisten appliziert und eine gegebenenfalls hierdurch ausgelöstes Signal des Biosensors gemessen. Wenn eine Substanz ein Biosensor-Signal auslöst und dieses Signal nicht auch in den natürlichen Zellen des Expressionssystems (also Zellen, die nicht zu einem Expressionssystem verändert wurden) auftritt, so wird vom Expressionssystem tatsächlich ein Rezeptor für diese Substanz exprimiert.
Ebenfalls wird erfindungsgemäß eine Sonde zum Nachweisen einer Nucleinsäure angegeben, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Eine solche Sonde ist zweckmäßigerweise eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA oder eine, vorzugsweise einzelsträngige, DNA, wobei die Nucleinsäure mit einer Nucleinsäure hybridisieren kann, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Bevorzugte Sonden besitzen die Sequenz SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder eines 12–30, vorzugsweise 15–20 Aminosäuren langen Ausschnitt der Sequenzen SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4. Die Nucleinsäure ist verbunden mit einer nachweisbaren Markierung, beispielsweise mit einer Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Farbmarkierung, einer radioaktiven Markierung oder einem Enzym, das die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts katalysiert. Anstelle einer solchen nachweisbaren Markierung kann die Sonde auch an einen Feststoff, beispielsweise an Metallpartikel wie magnetische Beads, gekoppelt sein (gegebenenfalls über einen Linker).
In diesem Zusammenhang wird erfindungsgemäß gelehrt, eine Nucleinsäure, vorzugsweise eine Sonde wie zuvor beschrieben, zum Nachweisen einer Nucleinsäure, die für ein Fragment eines Rezeptors codiert, zu verwenden. So können zum einen weitere Rezeptoren mit gleicher oder ähnlicher Aminosäuresequenz wie der erfindungsgemäße Rezeptor gefunden werden. Dabei wird die Sonde unter vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nucleinsäuren einer zu untersuchenden Zelle in Kontakt gebracht, um ein Hybridisieren der Sonde an eine dieser entsprechenden Wirts-Nucleinsäure zu ermöglichen, falls eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Je weniger stringent die Hybridisierungsbedingnungen sind, desto weniger ähnlich können die Nucleinsäuren sein, die mit der Sonde hybridisieren. Nach dem Hybridisieren werden die mit der Sonde hybridisierten Nucleinsäuren aufgereinigt und sequenziert.
Soll mit der Sonde nur die Anwesenheit von Nucleinsäuren, die für ein Fragment eines Rezeptors codieren, nachgewiesen werden, so reicht es aus, diese Nucleinsäuren – vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen – mit der Sonde in Kontakt zu bringen, um ein Hybridisieren der Sonde an die entsprechende Nucleinsäure zu ermöglichen, wenn eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Dabei ist es zweckmäßig, wenn die Nucleinsäure, die mit der Sonde nachgewiesen werden soll, an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise in einem Gel oder auf einem Nylonfilter. In diesem Fall ist das Hybridisieren der Sonde an die nachzuweisende Nucleinsäure leicht dadurch nachweisbar, dass die Sonde – vermittelt durch die nachzuweisende Nucleinsäure – ebenfalls an den festen Träger gebunden ist und bei Durchführen eines Waschschrittes im wesentlichen nicht vom festen Träger abgewaschen wird. Dem Fachmann sind derartige Nachweisverfahren als Southern- oder Northern-Blot bekannt.
Primer zum Amplifizieren einer für OR7A5 codierenden Nucleinsäure sind mit den Sequenzen SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 angegeben.
Zudem wird erfindungsgemäß angegeben, einen erfindungsgemäßen Rezeptor zu verwenden zum Nachweisen und/oder spezifischen Binden einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2. Dadurch werden die oben beschriebenen Komplexe erzeugt, die die oben genannten Vorteile besitzen.
Eine besonders bevorzugte Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2 besteht darin, die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums zu beeinflussen. Es hat sich herausgestellt, dass auch Spermien Rezeptoren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung exprimieren und chemokinetische Reaktionen zeigen, die durch die Bindung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere Myracaldehyd, ausgelöst werden können. Die Agonisten, also Verbindungen der Formel (I), insbesondere der A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, können daher auch dazu verwendet werden, die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien zu erhöhen. Die Zugabe eines Antagonisten zu Spermien führt dazu, dass die beschriebenen Effekte – bei gleichbleibender Agonistenkonzentration – entweder nicht oder nicht in dem sonst üblichen Maße eintreten.
Dementsprechend wird erfindungsgemäß auch ein Arzneimittel angegeben, insbesondere ein Kontrazeptivum oder empfängnisförderndes Arzneimittel, umfassend als Agonist eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), insbesondere der A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, insbesondere in einer kontrazeptiven oder empfängnisfördernden Menge. Die eine oder mehrere Verbindung(en) der Formel (I) können dabei insbesondere als pharmazeutisch verträgliches Salz der jeweiligen Verbindung der Formel (I) vorliegen. Unter einem Arzneimittel wird dabei jedes Mittel verstanden, das zur Vorbeugung, Diagnose oder zur Behandlung eines körperlichen Zustandes eines Menschen und/oder Tieres eingesetzt wird. Arzneimittel im erfindungsgemäßen Sinne können daher insbesondere Arzneimittel gemäß § 1 des Arzneimittelgesetzes sein, aber auch Medizinprodukte gemäß § 3 des Medizinproduktegesetzes, jeweils in ihrer am 01. August 2002 geltenden Fassung. Ein solches Arzneimittel nutzt die mit der oben beschriebenen Verwendung von Agonisten und Antagonisten erzielbaren Vorteile. Neben den Agonisten und/oder dem Antagonisten umfasst das Arzneimittel zweckmäßigerweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Anstelle des Agonisten oder Antagonisten selbst kann das Arzneimittel auch eine Vorstufe des Agonisten bzw. Antagonisten umfassen, die im menschlichen und/oder tierischen Körper zu einem Agonist bzw. Antagonist umgesetzt wird.
Bei einem kontrazeptiv wirkenden Arzneimitteln kann es besonders zweckmäßig sein, einen Antagonisten – bevorzugt einen den Rezeptor irreversibel hemmenden Antagonisten – im oder auf dem menschlichen Körper, vorzugsweise in der Scheide, dem Uterus und/oder dem Eileiter freizusetzen, um dort gegebenenfalls vorhandenen Spermien die Orientierung hin zu einer gegebenenfalls vorhandenen Eizelle zu erschweren. Dies kann durch ein Intravaginalpräparat erfolgen, aus dem der Antagonist freigesetzt wird. Ebenfalls möglich ist es, ein Präservativ mit einem Antagonisten – wiederum bevorzugt einem irreversiblen – zu versehen, beispielsweise zu imprägnieren oder zu beschichten, so dass der Antagonist bei bestimmungsgemäßer Verwendung des Präservativs freigesetzt wird.
Bei einem empfängnisfördernden Arzneimittel kann es insbesondere vorteilhaft sein, einen oder mehrere Agonisten – gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Substanzen – im Eileiter und/oder Uterus freizusetzen, um Spermien mit einer niedrigen Geißelschlagfrequenz zu beschleunigen.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Antagonist gegen das spezifische Binden eines Agonisten der Formel (I), insbesondere der A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H zum Beeinflussen der Geruchswahrnehmungsfähigkeit eines Menschen und/oder eines Tieres verwendet. Die Verwendung eines Antagonisten ermöglicht es auf einfache Weise, die Geruchswahrnehmungsschwelle für einen oder mehrere Agonisten bei Mensch und/oder Tier anzuheben, so dass der betreffende Agonist weniger leicht gerochen wird. Dies kann insbesondere in den Fällen sinnvoll sein, in denen ein Agonist einen störenden Geruch entwickelt, jedoch nur mit unverhältnismäßig hohem Aufwand aus der Luft oder einem anderen Trägermedium entfernt werden kann.
Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Expressionssystems wird ein Verfahren angegeben, das die Schritte umfasst:

a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors in eine Zelle, und
b) Einstellen von Bedingungen, so dass der Nucleinsäureabschnitt des Vektors, der für den Rezeptor codiert, in der Zelle exprimiert wird.

Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Expressionssystem und damit den erfindungsgemäßen Rezeptor und gegebenenfalls auch einen erfindungsgemäßen Biosensor herzustellen. Der erfindungsgemäße Rezeptor kann aus den Zellen des Expressionssystems weiter aufgereinigt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR7A5-Rezeptors, eines Duftstoffrezeptor smit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen eine gegebenenfalls in der Probe enthaltene Verbindung der Formel (I) spezifisch an den Rezeptor bindet, und
c) Überprüfen, ob eine Verbindung der Formel (I) eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.

Der Rezeptor kann insbesondere in Form eines Expressionssystems bereitgestellt werden, in dem der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. In diesem Fall kann eine spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor durch das Einschalten der betreffenden Signaltransduktionskaskade überprüft werden, während das spezifische Binden des Antagonisten durch das Ausbleiben eines solchen Einschaltens der Signaltransduktionskaskade bei Anwesenheit einer Verbindung der Formel (I) überprüft werden kann. Ein solches Expressionssystem kann jedoch auch künstlich nachgebildet werden, indem der Rezeptor und die übrigen Bestandteile der Signaltransduktionskaskade in vitro zusammengestellt werden.
Der Rezeptor kann jedoch auch als aufgereinigtes Protein vorliegen, das an die Oberfläche eines festen Trägers, insbesondere einer Metalloberfläche, gebunden ist. In diesem Fall kann sich durch das spezifische Binden einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten an den Rezeptor eine physikalische Oberflächeneigenschaft ändern. Dies kann beispielsweise die Änderung der Oberflächen-Plasmon-Resonanz sein, wie sie in einem Biacore-Verfahren bestimmt werden kann.
Ebenfalls möglich ist es, den Rezeptor und/oder eine Verbindung der Formel (I) und/oder einen Antagonisten mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu versehen und die durch die spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) und/oder des Antagonisten an den Rezeptor hervorgerufene Änderung der Fluoreszenz zu bestimmen.
Insbesondere kann der Rezeptor als Fusionsprotein mit einem green fluorescent protein-(GFP-)-Anteil vorliegen, so dass sich die Fluoreszenz des Fusionsproteins bzw. des GFP-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten entsprechend ändert. Dem Fachmann sind solche Untersuchungsverfahren unter der Bezeichnung "FRET-Assays" (Fluorescence resonance energy transfer assays) bekannt. Auf vergleichbare Weisekann der Rezeptor auch als Fusionsprotein mit einem Luciferase-Anteil vorliegen, so dass sich die Lumineszenz des Fusionsproteins bzw. des Luciferase-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung eines Agonisten und/oder eines Antagonisten ändert ("BRET-Assay").
Dabei ist insbesondere ein Verfahren zum Nachweisen des Antagonisten in einer Probe bevorzugt, das folgende Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR7A5-Rezeptors, eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.

Der Fachmann erkennt, dass die Schritte b) und c) gleichzeitig oder in einer beliebigen Reihenfolge nacheinander durchgeführt werden können, vorausgesetzt, dass Schritt c) vor oder gleichzeitig mit Schritt d) durchgeführt wird. Insbesondere können folgende Verfahrensausführungen zweckmäßig sein:
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst der erfindungsgemäße Rezeptor bereitgestellt. Hierzu kann sich der Fachmann der Möglichkeiten bedienen, die oben für ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweisen eines Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I), und/oder Antagonisten beschrieben wurden. Anschließend wird der Rezeptor mit der gegebenenfalls antagonistenhaltigen Probe in Kontakt gebracht. Dabei werden solche Bedingungen eingestellt, unter denen ein Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden könnte, so er denn in der Probe vorhanden ist. Nach dem Inkontaktbringen mit dem Antagonisten wird der Rezeptor mit einem Agonisten in Kontakt gebracht. Hierbei werden die Bedingungen so eingestellt, dass der Agonist an den Rezeptor spezifisch binden kann, wenn kein Antagonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Abschließend wird überprüft, ob der Agonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass das Einschalten einer Signaltransduktionskaskade überprüft wird, mit der der Rezeptor in Wirkverbindung steht. Wenn der Agonist an den Rezeptor gebunden hat, dann liegt der Antagonist wahrscheinlich nicht in einer Konzentration in der zu untersuchenden Probe vor, bei der er das spezifische Binden des Agonisten verhindern könnte. Insbesondere kann es möglich sein, das Maß der Agonistenbindung an den Rezeptor zu bestimmen und hieraus – gegebenenfalls nach einer entsprechenden Kalibrierung – auf die Konzentration des Antagonisten in der zu untersuchenden Probe zu schließen.
In einer bevorzugten Abwandlung des Verfahrens wird der Rezeptor zuerst mit dem Agonisten und anschließend mit der den Antagonisten gegebenenfalls enthaltenden Probe in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann aus der Abnahme des Maßes, in dem der Agonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, auf die Anwesenheit des Antagonisten und gegebenenfalls auch auf dessen Konzentration in der zu untersuchenden Probe geschlossen werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und der Beispiele näher erläutert, ohne dass diese den Schutzbereich der Patentansprüche einschränken sollen.
1 zeigt die spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch Myracaldehyd.
Beispiel 1: Spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch Myracaldehyd
HEK293-Zellen wurden transient mit einem Vektor transfiziert, der für OR7A5 codierte Zum Herstellen des Vektors wurde das Gen für OR7A5 mit den Primern SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO: 2 amplifiziert, mit der Restriktionsnuklease EcoR V verdaut und das erhaltene Fragment in die entsprechende Schnittstelle des Vektors pCDNA3 (Invitrogen, USA) kloniert.
Das verwendete Transfektionsprotokoll in diesem und den folgenden Beispielen entspricht dem der WO 2004/033496 A1 , auf deren Inhalt, insbesondere auf deren Beispiele 3 bis 13, in soweit verwiesen wird.
HEK293-Zellen unter Standardbedinungen in DMEM (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbour 1982) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und 2 mM L-Glutamin gehalten. Die Transfektion erfolgte durch Calciumphosphat-Präzipitation. Etwa 1 h vor Beginn der Transfektion wurde das Medium durch 2 ml frisches DMEM ersetzt. Zur Transfektion wurden 100 bis 200 μl des Transfektionsreagens zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen mit frischem PBS⁺⁺ (2.7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 0,9 mM CaCl₂, 0,48 mM MgCl₂, pH 7,3–7,5) gewaschen und erneut mit frischem DMEM kultiviert. Zur Calcium-Darstellung wurde das DMEM drei Tage nach der Transfektion durch übliche Ringer-Lösung ausgetauscht. Als Indikator der Calcium-Konzentration wurde Fura2 (Molecular Probes) nach Anleitung des Herstellers verwendet.
1 zeigt eine repräsentative Abbildung einer Ca²⁺-Verteilung in den transfizierten HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wurden mit einem Vektor transfiziert, der für OR7A5 codiert. Etwa 5% der transfizierten Zellen zeigten eine signifikante Zunahme des intrazellulären Calciumgehalts nach Zugabe von Myracaldehyd.
Beispiel 2: Spezifität von Spermien-Duftstoffrezeptoren
HEK293-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Vektoren transfiziert, die für OR7A5 oder OR1D2 codierten. Die transfizierten Zellen wurden auf ihre Reaktion auf verschiedene Substanzen hin untersucht.
2 zeigt in Teilbild a, dass die Wirkung von Myracaldehyd ("Myrac") nicht durch vorherige Verabreichung von n-Undecanal verringert wird, stattdessen kommt es nach wie vor bei Verabreichung von Myracaldehyd zu einer vorüebrgehenden signifikanten Erhöhung des intrazellulären Ca²⁺-Gehalts.
In den Teilbildern b und c der 2 ist gezeigt, dass OR1D2-transfizierte Zellen mit einer Erhöhung des intrazellulären Ca²⁺-Gehalts nur bei Verabreichung von Bourgeonal reagieren, nicht aber bei Verabreichung von Myracaldehyd. Die Wirkung von Bourgeonal kann zudem durch vorherige oder gleichzeitige Verabreichung von n-Undecanal verringert werden. Zu den Wirkungen von n-Undecanal auf OR1D2 findet der Fachmann nähere Informationen in der WO 2004/033496A1 , deren Inhalt in soweit in Bezug genommen wird.
Die stärkste Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts von OR7A5-transfizierten HEK293-Zellen wurde erhalten bei Verabreichung von Myracaldehyd, PI-21788 (Verbindung der Formel A1 mit X=H) und Vernaldehyd.
Beispiel 3: Beeinflussung des Verhaltens von Spermien
Die Reaktion von Spermien auf Myracaldehyd wurde untersucht wie in Beispiel 17 der WO 2004/033496A1 für Bourgeonal beschrieben, wobei jedoch frische Spermaproben statt gefrorener Spermaproben verwendet wurden.
Die Reaktionen von Sperma auf Myracaldehyd und wurde (a) durch computerassisted video motion analysis (CAVMA) gemessen, um Veränderungen in der Schwimmgeschwindigkeit (Spermaaktivierung) zu detektieren, und (b) in einem flat capillary-Assay um eine Chemotaxis in der Nähe einer Diffusionsmaterialquelle zu untersuchen. Für jede Test- oder Kontroll-Behandlung wurden fünf wiederholte Experimente unter Verwendung von Sperma der fünf Spender durchgeführt. Die Daten der Bioassays wurden statistisch durch Ein-Weg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung eines post-hoc Scheffé-Tests (R. W. Day and G. P. Quinn, Ecol. Monogr. 59, 433–463 (1989)) analysiert. Eine Bonferroni-Korrektur wurde zum Angleichen der α-Levels für multiple Vergleiche verwendet.
Zur Untersuchung der Spermien-Aktivierung wurden Bioassays für die Schwimmgeschwindigkeit bei 37 °C durchgeführt. Spermien wurden sanft einer Kontroll- oder Testlösung einheitlicher Konzentration zugefügt. Die Bilder von Spermien (3,0 × 10³ Zellen/ml) wurden dann unter Verwendung einer Videokamera (NEC Modell TI 23A), die auf einem Olympus IX70-Lichtmikroskop montiert war, bei 90-facher Vergrößerung aufgenommen. Um mögliche Artefakte durch Reibungskräfte zu minimieren, besaß die Kamera eine 100 μm Feldtiefe und fokussierte auf eine Region, die annäherend 2 mm von der nächsten Oberfläche entfernt war. Videobilder von Spermien wurden mit 30 Bildern/Sekunde digitalisiert und über 10-Sekundenintervalle unter Verwendung eines CAVMA-Systemes (Motion Analysis Corporation, Modell VP 320, Expert Vision und Benutzter-Software), verbunden mit einer Sun SPARC 2 Computer-Arbeitsstation bearbeitet (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439–1450 (2002)). Die Schwimmgeschwindigkeit wurde auf einer Bild-zu-Bild-Basis bestimmt und danach über jeden einzelnen zurückgelegten Weg gemittelt. Um zu vermeiden, sich horizontal anstatt vertikal bewegende Zellen zu messen, wurden kurze Wege mit weniger als 11 Bildern verworfen, bei denen sich die Spermien um mehr als 20 % in ihrer scheinbaren Größe veränderten.
Zur Untersuchung der Spermien-Chemotaxis wurden Kammern mit vier getrennten Kompartimenten verwendet, wobei die Kapillar-Methode von Adler (J. Adler, Science 153, 708–716 (1966); J. Adler, Journal of General Microbiology 74, 77–91 (1973)) modifiziert wurde. Jedes Kompartiment bestand aus zwei durch einen Kanal verbundenen Vertiefungen. Die Spermienproben (10⁶ Zellen/ml) wurden jeweils in den Vertiefungen vorgelegt. Ein flaches 6 μl-Mikrokapillarröhrchen (Drummond Scientific Co.), das entweder Test- oder Kontrolllösung enthielt, wurde in den Kanal eingeführt, wobei seine beiden Enden die frischen Spermien-Suspensionen innerhalb der zwei Vertiefungen berührten. Nach vier Stunden Inkubation bei 37 °C wurden die Inhalte jeder Kapillare in die Vertiefung eines Toxoplasmose-Objektträgers transferiert, hitzefixiert und mit 0,1 Acridin-Orange 1 Minute lang gefärbt. Zellzählungen wurden dann unter Verwendung eines Olympus-BH2-Mikroskopes, das für Phasenkontrast- und Epifluoreszenz-Applikationen ausgerüstet war (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439–1450 (2002); C. C. Gee and R. K. Zimmer-Faust, Journal of Experimental Biology 200, 3185–3192 (1997)), bei 67-facher Vergrößerung durchgeführt.
Zur Bestimmung der Chemoattraktion von Spermien wurde 10^–6, 10^–7, 10^–8 oder 10^–9 M Myracaldehyd getestet. Während der Durchführung der Chemotaxis-Bioassays wurde das Spermienverhalten innerhalb eines Bereiches von 300 μm vor jeder Kapillarspitze 30 Sekunden lang auf Video aufgenommen. Die Videoaufnahme begann 10 bis 15 Minuten nach dem Experimentbeginn, um die Bildung eines chemischen Gradienten zu ermöglichen. Die Spermien-Orientierung zum Gradienten hin wurde unter Verwendung von CAVMA quantifiziert. Durch Anwendung zirkulärer Statistiken wurde die mittlere Vektorlänge (r) und die Schwimmrichtung berechnet, um das Bewegungsmuster der untersuchten Spermien zu beschreiben. Der Winkel der Spermienorientierung wurde in Bezug auf einen Ursprung angegeben, der als die kürzeste Verbindung zwischen jeder individuellen Zelle und der Kapillarenspitze (0°) definiert wurde. Um zu bestimmen, ob die Zellbewegung innerhalb des chemischen Gradienten nicht-zufällig war, wurde jede mittlere Ausrichtung mit einer uniformen zirkulären Verteilung unter Verwendung eines unimodalen Rayleigh-Tests (J. H. Zar, Biostatistical Analysis (1984)) verglichen.
Die Spermien reagierten (vgl. 3) auf Myracaldehyd in einer Dosisabhängigen Weise, indem sie erhöhte Schwimmgeschwindigkeiten und Chemotaxis in Kapillar-Assays zeigten. Die 3 stellt diese Ergebnisse graphisch dar, wobei die Werte Mittelwerte und Standartabweichung mit aus den Rohdaten berechneten Regressionsgeraden sind. Ab einer Konzentration von 10 nM erhöhte Myracaldehyd die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien. Weiterhin zeigte Myracaldehyd für Spermien einen chemotaktischen Effekt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung einer Substanz der Formel (I)
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander H oder CH₃ bedeuten, X gleich H, CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ bedeutet und die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie entweder eine Einfach- oder eine Doppelbindung bedeutet und die Gruppe -C(O)X an eines der Kohlenstoffatome gebunden ist, die mit dem Rest R¹ bzw. R² verknüpft ist a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors, b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors exprimiert, c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums, d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz.
Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei X= OC₂H₅ ist,
wobei X= OC₂H₅ ist,
wobei X=CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ ist;
wobei, wenn die Verbindung die Formel D1 hat, X=CH₃ oder OC₂H₅ ist, und, wenn die Verbindung die Formel D2 hat, X=CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅;
wobei X= OCH₃ oder OC₂H₅ ist; und
wobei X=H, CH₃, OCH₃ oder OC₂H₅ ist;
Expressionssystem umfassend eine Zelle, die einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei a) der Duftstoffrezeptor heterolog in bezug auf die Zelle ist oder b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.
Expressionssystem nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine gegebenenfalls entartete Säugerzelle ist.
Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors.
Nucleinsäure bestehend aus oder umfassend die Sequenz SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4.
Verwendung einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 6 oder einer Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO 3 zum Nachweisen eines Nucleinsäureabschnitts codierend für einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors.
Biosensor zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, umfassend a) ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 3 oder 4, und b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung der Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems.
Arzneimittel umfassend eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes der jeweiligen Verbindung, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge.
Verwendung eines OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors zum Nachweisen und/oder zum Binden an eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1.
Verfahren zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 3 bis 4, b) Inkontaktbringen des Expressionssystems mit einer Probe, die gegebenenfalls eine besagte Verbindung der Formel (I) enthält, und c) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems gebunden hat.
Verfahren zum Nachweisen eines Antagonisten eines OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen des erfindungsgemäßen Rezeptors, b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet, c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I), um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.